Determinação de cafeína em bebidas por CLAE - 2020

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Escola Técnica estadual
 Júlio de Mesquita
Cleberson Batista
Guilherme Valeriano
Gustavo Figueiredo
Determinação de cafeína em bebidas por cromatografia liquida de alta resolução
Orientador: Me. Edna Aparecida Faria de Almeida
Coorientador: Esp. Magali Canhamero
Santo André
2020 
Cleberson Batista
Guilherme Valeriano
Gustavo Figueiredo
Determinação de cafeína em bebidas por cromatografia liquida de alta resolução
Trabalho de conclusão de curso apresentado à ETEC Júlio de Mesquita como parte dos requisitos exigida para a conclusão do curso de técnico em química
Orientador: Me. Edna Aparecida Faria de Almeida
Coorientador: Esp. Magali Canhamero 
Santo André
2020
Resumo:
A determinação da cafeína em diversas matrizes é importante por conta de se tratar da droga psicoativa mais ingerida no mundo. Sua determinação pode ser feita através de duas metodologias pré-estabelecidas pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, a espectrofotometria uv-vis e a cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE). As metodologias utilizando a cromatografia são as mais utilizadas para essa análise além de ser uma das mais utilizadas em diversas áreas, a química forense, química alimentar, química ambiental são algumas áreas químicas que utilizam dessa técnica contudo, também está presente em outras áreas de atuação como farmácia, biomedicina e outras. Visando a alta demanda dessa análise no mercado de trabalho, percebeu-se a necessidade de incluir sua prática em centro de ensinos através de uma metodologia que proporcionasse resultados rápidos com pouco gasto monetário para que pudesse ser aplicada durante aulas, proporcionando uma experiencia para a formação de profissionais capacitados a atuarem com análises instrumentais.
Palavras-chave: Cafeína, Cromatografia, HPLC, Metodologia, Validação, Análise instrumental.
Abstract:
The determination of caffeine in differents matrices is important, because the compound is the most ingested psychoactive drug of the world. This determination can be done through two methodologies, pre-established by the Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply, uv-vis spectrophotometry and high-performance liquid chromatography (HPLC). The methodologies using chromatography are the most used for this analysis. Forensic chemistry, food chemistry, environmental chemistry,pharmacy, biomedicine, are some areas that use this method. Aiming at the high demand of this analysis in the job market, it was realized the need to include this practice on a teaching center through a methodology that would provide quick results with low price so that it could be applied during classes, providing an experience for training professionals to work with instrumental analysis.
Key Worlds: Coffeine, Chromatography, HPLC, Methodologie, Validation, Instrumental analysis.
Figuras
Figura 1 - Estrutura molecular da cafeína	8
Figura 2 - Estrutura molecular do grupo Xantinas	8
Figura 3 - Estrutura molecular da Adenosina	9
Figura 4 - Capa e figuras 31 a 36 e 91 a 102 do livro: A química da coloração III de F. F. Runge de 1850.	11
Figura 5 - Componentes de um cromatógrafo.	15
Figura 6 - Curva de calibração da cafeína nas concentrações 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 120,0 e 160,0 mg.L-1.	27
Figura 7 - Cromatograma de uma amostra de café diluída 10 vezes. Condições: fase móvel água:metanol (40:60) (v/v), injeção de 10 µL e uma coluna cromatográfica C18.	29
Tabelas
Tabela 1 - Classificação dos métodos cromatográficos em coluna.	13
Tabela 2 - Resultados das corridas exploratórias.	25
Tabela 3 - Dados para construção da curva de calibração.	27
Tabela 4 - Resultado obtido na curva para o teste de linearidade.	28
Tabela 5 - Dados obtidos na análise de exatidão.	30
Tabela 6 - Resultados obtidos pelos dois analistas para três níveis de concentrações diferentes, bem como o valor do Teste F para grau de 95%.	31
Equações
Equação 1 - Taxa de recuperação.	18
Equação 2 - Método dos Mínimos Quadrados.	20
Equação 3 - Determinação do LOD.	21
Equação 4 - Determinação do LOQ.	21
Sumário
1.	Introdução:	8
2.	Revisão bibliográfica	10
2.1.	História da cromatografia	10
2.2.	Classificação da Cromatografia.	12
2.3.	Interações intermoleculares e polaridade das substâncias	16
2.4.	Relação FM X FE X Analito	17
2.5.	Parâmetros cromatográficos	18
2.5.1.	Exatidão	18
2.5.2.	Seletividade/Especificidade	19
2.5.3.	Linearidade	19
2.5.4.	Robustez	20
2.5.5.	Precisão	20
2.5.6.	Limite de detecção e quantificação	21
5.	Metodologia	23
6.	Parâmetros para a escolha do Método Analítico	24
7.	Resultados	26
7.1.	Curva de calibração	26
7.2.	Linearidade	28
7.3.	Seletividade	28
7.4.	Limite de Detecção	29
7.5.	Limite de Quantificação	30
7.6.	Exatidão	30
7.7.	Precisão	30
8.	Considerações Finais:	32
9.	Perspectivas futuras:	32
10.	Referências	33
Introdução
A cafeína (Figura 1), denominada em outros países como teína, Guaranina, Mateína e entre outros, é um composto natural presente em mais de 60 espécies de plantas. No nosso cotidiano está altamente presente em nossa dieta, podendo ser encontrada principalmente em bebidas e derivados de cacau, por conta dessa representatividade é considerada a substância estimulante de maior consumo à nível mundial. Outro meio onde encontram-se essa substância são nos medicamentos, geralmente combinados com outro princípio ativo, nesse caso não necessitam de prescrição médica. (Lozano, Ricardo, 2007)
Tendo sua fórmula molecular de C8H10N4O2, pertencendo ao grupo dos alcaloides derivados das Xantinas (Figura 2), que por sua vez são derivados das bases nitrogenadas púricas. Recebe a seguinte nomenclatura: 1,3,7-Trimetilxantina. (Lozano, Ricardo, 2007)
Figura 1 - Estrutura molecular da cafeína
Figura 2 - Estrutura molecular do grupo Xantinas
No organismo humano a cafeína é absorvida pelo suco gástrico intestinal rapidamente após a sua ingestão. Por sua semelhança molecular com as bases púricas esse composto funciona como um antagonista competitivo, impedindo que a base nitrogenada adenina, presente na adenosina (Figura 3) possa se ligar ao seu receptor e exercer sua função inibidora do excesso de neurotransmissores. Com a cafeína presente no meio e ela se ligando ao receptor ocorrerá o efeito contrário ao esperado, liberando em excesso os neurotransmissores dopamina, noradrenalina, serotonina, entre outros. (Lozano, Ricardo, 2007)
Figura 3 - Estrutura molecular da Adenosina
Por conta do excesso da excreção de noradrenalina os efeitos da ingestão da cafeína resultam em uma sensação de alerta, reduzindo a sensação de fadiga, mantendo por mais tempo o estado de atenção, mesmo quando privado do sono e aumenta a capacidade atlética e intelectual além de constatar um efeito analgésico por conta da serotonina. (Mandal, Ananya, 2019)
Percebe-se efeitos em outras áreas do organismo por conta dessa característica da cafeína como o estímulo ao sistema respiratório dilatando os brônquios, aumento da pressão arterial e do ritmo cardíaco, melhor rendimento físico por conta da vasodilatação muscular. Por um lado negativo, essa molécula é capaz também de aumentar os níveis de colesterol e triglicérides do organismo, além de apresentar riscos à gestação podendo gerar um aborto espontâneo quando ingerido em excesso durante a gravidez. (Mandal, Ananya, 2019)
Por se tratar de uma droga psicoativa pode vir a causar uma tolerância orgânica pela cafeína fazendo com que o indivíduo tenha que ingerir doses maiores da substancia para suprir a necessidade do corpo, gerando uma dependência que pode vir a causar sintomas maléficos por conta de sua abstinência. (Mandal, Ananya, 2019)
Por conta desses cenários causados pela ingestão excessiva da cafeína e por uma preocupação com a saúde através da dieta adotou-se a DIRECTIVA 2002/67/CE DA COMISSÃO de 18 de julho de 2002 pelos países da união europeia que diz que todos os alimentos que tiverem como ingrediente a cafeína, sendo excluídos os produtos à base de café e chás, devem ter em seu rotulo o valor determinado da substancias, tendo o limite máximo de150 mg/L. (Byrne, David, 2002)
 Tendo em vista a importância da determinação da cafeína em bebidas o ministério da agricultura, pecuária e abastecimento (MAPA) determina, através da INSTRUÇÃO NORMATIVA No 24, DE 8 DE SETEMBRO DE 2005 que a análise possa ocorrer por dois métodos: Espectrofotometria uv-vis e cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE). (Maciel, Gabriel, 2005)
A partir dessa análise, esse trabalho vem discutir o uso da técnica de determinação de cafeína em bebidas por CLAE como prática para o ensino de cromatografia liquida em centros técnicos de ensino
Revisão bibliográfica
História da cromatografia
O século XX é considerado por muitos cientistas como o “século da cromatografia” pois nesse período foram feitas as primeiras descobertas na área. (Pacheco, Sidney et al., 2014)
No século 19 alguns cientistas utilizaram diferentes sólidos para fazer um tipo de “filtração”, fracionando líquidos, enquanto outros fizeram esse fracionamento em papel. O início das separações realizadas em papel no ano de 1834 se deve ao químico alemão F. F. Runge (1794 – 1867), ele foi o primeiro a fazer uso da separação de pigmentos em papel com fins analíticos, com aplicação na indústria têxtil. Lançou dezenas de livros com as suas experiencias em papel de filtro assim como podemos ver no livro “A química da coloração III” (Figura 4), ele ficou fascinado com a capacidade que o papel tinha em separar os pigmentos, principalmente as de tons mais escuros, onde eram difíceis de se identificar em solução. (Pacheco, Sidney et al, 2014)
Figura 4 - Capa e figuras 31 a 36 e 91 a 102 do livro: A química da coloração III de F. F. Runge de 1850.
Fonte: (Pacheco, 2014)
Em 1897 David Talbot Day (1859 – 1915) demonstrou que frações de petróleo quando passadas através de terra Fuller se fracionavam (Ciola, Remolo, 1998, p. 1).
Esse processo hoje é conhecido como “análise frontal”, mas na época ainda não era chamado de cromatografia, mesmo com o processo permitindo com que eles fizessem a distinção das diferentes fontes da amostra do petróleo. (Collins, Carol H., 2006, p. 9).
O termo cromatografia só ficou conhecido no mundo a partir do século 20 por causa dos trabalhos do botânico russo Michael Semenovich Tswett (1872 – 1919). Em 1903 apresentou seus primeiros estudos sobre o assunto, definindo, anos mais tarde, corretamente o processo e dando-lhe também o nome. Todo o seu trabalho é praticamente voltado ao estudo dos pigmentos vegetais, principalmente a clorofila, já que ele acreditava ser uma mistura de substâncias. Nesse aspecto ele empregou métodos físicos que, operando à temperatura ambiente, pudessem separar os componentes (Ciola, Remolo, 1998, p. 1).
Em suas pesquisas Tswett, desenvolveu o método que hoje chamamos de cromatografia líquido-sólido, onde ele fez testes em um tubo de vidro contendo um sólido orgânico ou um inorgânico. Testados mais de cem sólidos ele chegou à conclusão de que os melhores foram carbonato de cálcio, inulina (um polissacarídeo) e Alumina, para fazer a separação dos pigmentos extraídos das folhas de plantas. 
A separação se deu pela passagem da solução do extrato em um líquido (fase móvel) apolar e que na sua interpretação as substâncias mais atraídas pelo solido dentro do tubo (fase estacionaria), forçava as substâncias menos atraídas a percorrer uma maior distância no tubo. Assim ele identificou o mecanismo utilizado em seu processo de separação como o de adsorção, então introduzindo para o mundo da ciência a palavra cromatografia. A origem desta palavra é interessante, pois assume-se que ela vem do grego, onde “chroma” significa cor, e “graphe” que significa escrever. (Ciola, Remolo, 1998, p. 1). 
Classificação da Cromatografia
A cromatografia pode ser dividida basicamente em 2 tipos, a planar e a em coluna. A cromatografia planar consiste em uma fase estacionaria colocada em placa plana ou em poros de um papel, já a cromatografia em coluna, como o próprio nome diz, utiliza-se de uma coluna para alocar a fase estacionária, é o método mais utilizado e pode ser dividida em três grupos segundo a sua fase móvel, como mostra a tabela 1. (Mariano, Renan S., 2018)
Tabela 1 - Classificação dos métodos cromatográficos em coluna.
	Classificação geral (fase móvel)
	Método específico
	Fase estacionária
	Tipo de equilíbrio
	
	
	
	
	Cromatografia em fase gasosa
	Gás-Líquido
	Líquido adsorvido ou ligado a uma superfície sólida
	Partição entre gás e líquido
	
	
	
	
	
	Gás-Sólido
	Sólido
	Adsorção
	Cromatografia Líquida
	Líquido-líquido (fase quimicamente ligada)
	Líquido adsorvido ou ligado a uma superfície sólida
	Partição entre líquidos imiscíveis
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	Líquido-sólido
	Sólido
	Adsorção
	
	Troca iônica
	Resina de troca iônica
	Troca iônica
	
	
	
	
	
	Exclusão por tamanho
	Líquidos dos interstícios de um sólido polimérico
	Partição/exclusão
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	Afinidade
	Grupo específico ligado a uma superfície sólida
	Partição entre um líquido na superfície e líquido da fase móvel
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	Cromatografia com fluido supercrítico
	 
	Espécies orgânicas ligadas a uma superfície sólida
	Partição entre fluído supercrítico e espécies líquidas ligadas à superfície
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
 Fonte: (MARIANO - 2018).
O emprego de altas pressões na cromatografia foi o que determinou o primeiro nome dessa técnica, “High Pressure Liquid Chromatography – HPLC”, para diferenciá-la da cromatografia em coluna, que hoje conhecemos como cromatografia líquida clássica. Com o passar dos anos, novas descobertas e técnicas implantadas na cromatografia fizeram com que o P de Pressure foi substituído por Perfomance e traduzido para o português como cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), porém para muitos a sigla “HPLC” deve ser conservada, pois ela é empregada internacionalmente. A HPLC tornou-se uma ferramenta analítica indispensável. Os laboratórios criminais e os programas de televisão policiais e forenses, como CSI, CSI Miami, Crossing Jordan e Law and Order, frequentemente empregam a HPLC no processo de obtenção de evidências criminais (SKOOG et al, 2009; Ciola, Remolo, 1998). 
A HPLC para seu funcionamento, utiliza-se de altas pressões para fazer com que o solvente passe pela coluna fechada, já que ela pode conter partículas extremamente pequenas de cerca de 1 a 10 micrometros, reduzindo os espaços para passagem do solvente. Essas partículas podem ser sílica ou alumina, que são os compostos mais utilizados como fase estacionária (FE) na HPLC por serem compostos que não se dissolvem nos solventes utilizados, sendo assim, não degradam a coluna com facilidade. (Collins, Carol H., 2006)
Basicamente um equipamento de HPLC (Figura 5), possui um amostrador (automático ou manual), um sistema de distribuição de solvente (bomba isocrática ou gradiente), uma válvula de injeção da amostra, uma coluna de alta pressão e um detector. (Ciola, Remolo, 1998; Collins, Carol H., 2006)
Figura 5 - Componentes de um cromatógrafo.
 
Fonte: (Salatino, 2016)
A coluna de separação é considerada o coração do sistema cromatográfico, uma vez que é responsável pela separação dos componentes presentes na amostra. As colunas de cromatografia líquida (CL) podem se degradar com muita facilidade na presença de partículas sólidas ou bolhas de gases presentes no solvente, por isso recomenda-se a utilização de solventes ultrapuros livres de particular sólidas, e para evitar bolhas recomenda-se a desgaseificação do solvente. Para inserir a amostra segue-se o mesmo procedimento. Caso necessário as amostras devem ser centrifugadas e filtradas antes de serem inseridas no sistema (Collins, Carol H., 2006).
Uma fase móvel ideal deveria possuir ao menos alguns requisitos: solubilizar completamente todos os componentes da amostra, apresentar baixa reatividade, viscosidade e toxicidade além de estar disponível em elevado grau de pureza e, quando possível, baixo custo. Em HPLC dificilmente utilizaremos apenas um solvente para fazer separações, pois isso dependera muito do que ouquais compostos se deseja analisar, pois cada composto reagirá de maneira diferente com a FE e a FM, então temos que levar em conta a força de eluição do solvente e a seletividade dentro da faixa de solventes empregadas na técnica. (Lanças, 2009).
Podemos ter dois tipos de fases móveis, isso dependera muito de qual fase estacionária se utiliza, vejamos como exemplo a sílica. Para se determinar qual fase móvel usar em relação a sílica, deve-se observar a cadeia alifática ligada a sílica. Se ao final dessa cadeia tiver um grupo polar, tem-se então a cromatografia em fase normal, onde a fase estacionária é polar a fase móvel deve ser apolar ou menos polar que a fase estacionária. Caso a cadeia alifática seja apolar, então temos a cromatografia em fase reversa, onde a fase estacionária é apolar e a fase móvel deve ser polar ou menos apolar que a fase estacionária, quanto maior a cadeia ligada a sílica mais apolar será a fase estacionária e maior será o fator de retenção. Dentre as fases estacionárias a mais utilizada está a Octadecilsilano (C18), uma fase estacionária de baixa polaridade, utilizada na fase reversa além dos grupos octil (C8) e fenil (C6) (Collins, Carol H., 2006). 
Com relação à detecção de sinais em cromatografia líquida, os detectores espectrofotométricos UV-Vis são os mais utilizados, pois a maioria dos solutos absorve radiação ultravioleta. (Harris, 2013)
Interações intermoleculares e polaridade das substâncias
Tendo em vista que a metodologia se baseia em cromatografia de coluna liquida por partição e sabendo que o processo de separação ocorre por meio das interações de polaridade dos solventes temos que fazer uma relação entre a polaridade das moléculas e as interações intermoleculares, uma vez que as afinidades das moléculas são determinadas pelas forças intermoleculares de atração. Sendo assim, quando dizemos que uma substância é dissolvida por outra ou que uma tem afinidade com a outra, estamos dizendo que as forças de atração entre elas são as mesmas. (Richter, Robert; Pirola, Camillo, 2019)
Essas forças de atrações são conhecidas também como forças de Van Der Waals e são representadas pelas atrações de tipo Dipolo-Dipolo, Íon-Dipolo, Dipolo-Íon induzido, Dipolo-Dipolo induzido e força de dispersão. A força Dipolo-Dipolo é resultante das interações de duas moléculas polares, quando essas moléculas se aproximam ocorre uma força de atração eletrostática entre o lado carregado positivamente de uma molécula com o lado negativo da outra. Podemos perceber essa força nas ligações de hidrogênio que ocorrem quando o hidrogênio, parte comumente positiva, se aproxima de outro elemento que tenha a eletronegatividade muito superior ao dele, como é o caso do F, O e N, gerando uma alta força de atração eletrostática. (Richter, Robert; Pirola, Camillo, 2019)
A interação íon-dipolo ocorre quando uma molécula polar se aproxima de um íon, se o íon for um cátion a molécula ira interagir com o seu polo mais carregado (parte negativa), e se o íon for um ânion a molécula interagirá com o polo menos eletronegativo (parte positiva). No caso das interações íon-dipolo induzido e dipolo- dipolo induzido o princípio é o mesmo com a diferença de que um o momento dipolo é induzido por um íon e no outro é induzido por uma molécula polar, essa indução ocorre pois, quando uma molécula apolar se aproxima de um desses agentes indutivos eles farão que os elétrons da substância apolar se desloquem no sentido contrário à forca eletrostática de atração, criando um momento dipolo na molécula apolar. (Richter, Robert; Pirola - Camillo, 2019)
Por fim temos a força de dispersão, a única interação possível entre moléculas apolares. Ocorre quando os elétrons presentes nas nuvens eletrônicas estão desigualmente distribuídos gerando um momento dipolo mínimo, porém responsável por interagir com outras moléculas apolares, induzindo nelas outros momentos dipolo, por conta dessa característica é conhecida também como dipolo induzido-dipolo induzido. (Richter, Robert; Pirola, Camillo, 2019)
Relação FM X FE X Analito
Após discutirmos a relação entre a polaridade das moléculas e as interações iremos discutir como essa propriedade está presente na análise proposta, uma vez que ela se dá por uma cromatografia de partição em fase reversa, sendo assim a separação depende da maior afinidade dos solutos nas fases móvel ou estacionária. (Cecchi, Heloisa, 2003)
Quando utilizamos uma fase estacionaria com grupo funcional apolar, como é o caso da coluna recheada de octadecilsilano (C18), a interação que ocorrerá entre o analito e a FE será menos intensa do que a do analito e a fase móvel, uma vez que fase estacionária apresentam características mais apolares, enquanto a fase móvel, constituída de metanol e água, apresentará características mais polares e a cafeína por conta da diferença de eletronegatividade do carbono com os heteroátomos, apresenta características polares (Richter, Robert; Pirola, Camillo, 2019) 
Sendo assim, quando o analito passar pela coluna a tendência é que ele sofra uma retenção por parte do octadecilsilano, contudo essa retenção não será permanente, será apenas uma aproximação da molécula de cafeína devida à diferença de carga das moléculas, visto que a cafeína é considerada uma molécula polar. À medida que a FM passa pela coluna ela ainda tem força suficiente para arrastar o analito. Quando alteramos a concentração da FM, podemos torná-la mais polar ou apolar, como a fase móvel é constituída, em sua maior parte por água, ao acrescentarmos maiores quantidades de metanol diminuímos sua polaridade, tornando-a mais semelhante à polaridade do analito, fazendo com que haja uma maior interação entre a FM e a cafeína. (Meyer, Veronika, 2004)
Parâmetros cromatográficos
1.1.1. Exatidão
A exatidão é definida como a concordância entre o valor considerado como real do analito com o valor que será obtido no processo analítico. Os principais métodos propostos para o estudo da exatidão são baseados no uso de material de referência certificado (RMC) para que seja feita a comparação do método proposto com o método da referência. Os RMC são os materiais preferíveis para a determinação da exatidão, já que por serem certificados tendem a seguir padrões internacionais. (Filho, Oscar B, 2003)
Este parâmetro é mensurado na taxa de recuperação, que é definida como a quantidade da substância de interesse que está presente ou adicionada no material teste que pode ser extraída ou quantificada. (Silva, Débora S, 2017)
Sua porcentagem é calcula pela seguinte fórmula:
Equação 1 - Taxa de recuperação.
	 Recuperação (%) = (valorobtido / valoradicionado) x 100%
Quando se pretende validar um método e não se faz uso de um RMC, não se tem um valor tido como verdadeiro, então a exatidão é mais difícil de se determinar, assim um valor precisa ser utilizado como verdadeiro. A exatidão pode ser expressa em termos do erro absoluto ou erro relativo. (Skoog, 2008)
1.1.2. Seletividade/Especificidade
A seletividade e especificidade estão relacionadas entre si, e é o primeiro parâmetro que se leva em conta em um método exploratório de validação completa ou parcial. Especificidade é a habilidade de avaliar o analito em questão na presença de componentes que possam causar interferência na análise, e seletividade refere-se ao método utilizado para detectar vários analitos com capacidade de distinção entre eles. O teste de especificidade pode ser realizado ao comparar as medidas de uma amostra fortificada e não fortificada que contenha os possíveis interferentes com uma solução da amostra padrão. (Viana, José, 2017; Sousa, Diana, 2018)
No caso de métodos cromatográficos, deve ser comprovada a pureza cromatográfica do sinal do analito, exceto para produtos biológicos. Para fazer a detecção seletiva, alguns pontos importantes devem ser levados em consideração, por exemplo, as propriedades espectrais (comprimento de onda UV), espectro de massa, reações e reconhecimento molecular. (Sousa, Diana, 2018; Ciola, Remolo, 1998)
1.1.3. Linearidade
É definidacomo a capacidade que determinada metodologia analítica tem em confirmar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito da amostra selecionada, dentro de um intervalo especificado. Ela é obtida por padronização e formulada como uma expressão matemática usada para calcular a concentração do analito. Para essa determinada expressão é necessário se obter um coeficiente de correlação estatisticamente próximo a 1 (R²) e um coeficiente angular maior que zero. Os valores de R² > 0,99 são considerados aceitáveis. O coeficiente angular é diretamente ligado a sensibilidade da curva de calibração, já que quanto maior o coeficiente angular, mais sensível será a curva de calibração. (Silva, Débora S., 2017; Sousa, Diana, 2018)
Para a determinação da linearidade do método, é necessário que seja feita a construção de uma curva de calibração pelo método dos mínimos quadrados. (Sousa, Diana, 2018)
Equação 2 - Método dos Mínimos Quadrados.
	
Em que: y – Resposta (área do pico do cromatograma).
 x – Concentração do analito.
 b – Ordenada na origem.
 a – Declive da curva de calibração.
1.1.4. Robustez
A robustez de um método, é a medida observando a capacidade de não sofrer alteração sob as menores e estudadas variações nos parâmetros do determinado método. Ela deve ser considerada durante a fase de desenvolvimento do método pois depende do tipo de processo utilizado. (Sousa, Diana, 2018)
No caso da cromatografia, tais avaliações podem ser feitas através de pequenas variações na temperatura de forno, fluxo e/ou concentração da fase móvel, variações no pH, análises em dias diferentes e alterações na coluna. Se ao fazer essas pequenas alterações e ainda sim os resultados obtidos estiverem de acordo com os parâmetros de exatidão, precisão e seletividade, podemos considerar que este método é robusto e tais alterações podem ser incorporadas ao método proposto. (Viana, José, 2017)
1.1.5. Precisão
A precisão é avaliada como a proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma mesma amostra feita pelo mesmo método. A precisão é geralmente expressa como desvio padrão e/ou desvio padrão relativo. Em alguns casos o desvio padrão relativo é o mais utilizado, pois foi normalizado com base na concentração e deste modo ele é praticamente constante ao longo da faixa de interesse. Este parâmetro poder ser avaliado de três maneiras distintas, pela repetibilidade, reprodutibilidade e precisão intermediária. (Silva, Débora S., 2017; Viana, José, 2017) 
Repetibilidade: É obtida pela análise de repetidas vezes que uma amostra preparada por um analista, utilizando um tipo de conjunto experimental e um conjunto de reagentes em um dia. (Viana, José, 2017)
Reprodutibilidade: Expressa a precisão entre os resultados obtidos em diferentes laboratórios e essa ação é importante para avaliar se o método poderá ser utilizado em vários laboratórios. (Silva, Débora S., 2017)
Precisão intermediária: Expressa a habilidade do método em reproduzir os mesmos dados quando as análises são realizadas no mesmo laboratório, porém em dias diferentes, por diferentes analistas e utilizando diferentes equipamentos. (Viana, José, 2017).
1.1.6. Limite de detecção e quantificação
Limite de detecção (LOD) tem por definição que é a menor concentração do analito presente em uma amostra que pode ser detectada pelo equipamento, mas isso não necessariamente significa que ela poderá ser quantificada pelas condições experimentais estabelecidas. Para casos de métodos não experimentais o LOD pode ser definido visualmente como o menor valor de concentração capaz de produzir algum efeito (mudança de cor, turvação etc.) e nos casos de métodos instrumentais como a HPLC, esse limite pode ser determinado com base na equação abaixo:
Equação 3 - Determinação do LOD.
	
Onde “s” equivale ao desvio padrão da resposta, considerado como o valor do desvio padrão do coeficiente linear da equação da reta e “S” é a inclinação, ou o coeficiente angular da curva de calibração. (Silva, Débora S., 2017)
Limite de quantificação (LOQ) tem por definição que é a menor concentração do analito presente na amostra que pode ser detectada e quantificada com precisão e exatidão, de modo que o método utilizado se mantenha adequado para a quantificação, ou seja, se mantenha preciso, linear e exato neste ponto. A determinação do limite de quantificação pode ser realizada utilizando os mesmos critérios considerados para o LOD, utilizando a relação 10:1 através da seguinte formula:
Equação 4 - Determinação do LOQ.
	
Objetivos
Objetivo Geral:
Quantificar o teor de cafeína em bebidas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.
Objetivo Específico:
Validar um método para determinação de cafeína em bebidas por HPLC visando torná-lo mais didático a fim de ser utilizado em centros de ensino.
Materiais
Equipamentos
· Cromatógrafo líquido JASCO com detector uv (ultravioleta) e sistema de bombeamento isocrático;
· Coluna de aço inox contendo octadesilsilano (C18);
· Balança analítica;
· Ultrassom.
Reagentes e soluções
· Metanol HPLC;
· Água deionizada;
· Padrão de cafeína;
· Café em pó;
· Filtro para café.
Metodologia
A metodologia foi dividida em três partes, sendo elas a preparação dos analitos, a preparação das fases móveis e a construção da curva de calibração.
 Para o preparo do analito foi pesado aproximadamente 10g de pó de café de uma marca comercializada em um béquer de 50mL, e após foi medido 100mL de água deionizada com uma proveta, transferido para um recipiente de vidro e depois levado para um forno micro-ondas em potência máxima durante dois minutos. (Collins, 2017; MAPA, 2011)
Com suporte universal, garra de funil, funil de vidro e filtro de papel foi montado um sistema para filtrar o café, o pó de café foi colocado no filtro de papel que já estava no funil e com um béquer de 250mL embaixo, a água foi despejada ainda quente. Após o término da filtração, o béquer com o café foi colocado no ultrassom para ser desgaseificado por vinte minutos. Após esse processo o café foi diluído 10 vezes com auxílio de uma pipeta de 10mL e um balão volumétrico, depois foi avolumado com água deionizada e novamente foi para o ultrassom por mais vinte minutos. (Collins, 2017; MAPA, 2011)
Para verificar qual método era o mais eficiente e econômico, foram preparadas três fases móveis com diferentes concentrações de Metanol.
Para o preparo da primeira fase móvel, foi utilizado uma proveta de 1000mL e transferido 200mL de Metanol HPLC e completado até 1000mL com água deionizada, formando assim uma solução 20:80 metanol:água (v/v). Já no cromatógrafo, depois de ter feito a purga da bomba por 300 segundos e a estabilização da linha de base por aproximadamente 20 minutos, foi feito três corridas exploratórias com um volume de 10uL de amostra de café para identificar o tempo de retenção da cafeína, mudando apenas a vazão de cada corrida, sendo elas: 0,8 mL.min-1; 1 mL.min-1; 1,2 mL.min-1. (Collins, 2017; MAPA, 2011)
A segunda fase móvel foi preparada utilizando uma proveta de 1000mL e transferido 300mL de Metanol HPLC e completado até 1000mL com água deionizada, formando assim uma solução 30:70 metanol:água (v/v). No cromatógrafo foi repetido o mesmo procedimento da fase móvel anterior. (Collins, 2017; MAPA, 2011)
A terceira fase móvel foi preparada utilizando uma proveta de 1000mL e transferido 400mL de Metanol HPLC e completado até 1000mL com água deionizada, formando assim uma solução 40:60 metanol:água (v/v). No cromatógrafo foi repetido o mesmo procedimento da fase móvel anterior. (Collins, 2017; MAPA, 2011)
Após a determinação metodológica foi construída a curva de calibração para o método selecionado. Para tal foi preparada uma solução mãe padrão de 400mg/L de cafeína, na qual foram retirada seis alíquotas de volumes diferentes que foram coladas em balões volumétricos de 10 mL e avolumados com agua deionizada até o menisco, apresentando seis novas soluções com as seguintes concentrações que constituiram a respectivacurva: 10mg/L; 20mg/L; 40mg/L; 80mg/L; 120mg/L; 160mg/L. (MAPA, 2011)
Parâmetros para a escolha do Método Analítico 
Os parâmetros utilizados para a escolha do método analítico foram baseados na possível solução da justificativa do trabalho, sendo ela, a diminuição do tempo de análise em sala de aula e do custo que a análise provoca para a instituição de ensino. Portanto, foi realizada uma análise exploratória com três concentrações diferentes da fase móvel e três vazões diferentes, para assim, identificar qual seria a condição cromatográfica que mais se adequaria com os parâmetros estabelecidos. Pode-se verificar os resultados conforme a tabela 2. 
Tabela 2 - Resultados das corridas exploratórias.
	Concentração da fase móvel 20:80 (v/v) MeOH/H2O
	
	
	
	
	Vazão (mL.min-1)
	 Tempo de retenção (min) 
	Metanol gasto (mL)
	Tempo de Análise (min) 
	0,8
	19,0
	3,44
	21,5
	1,0
	14,0
	3,30
	16,5
	1,2
	12,5
	3,60
	15,0
	
	
	
	
	Concentração da fase móvel 30:70 (v/v) MeOH/H2O
	
	
	
	
	Vazão (mL.min-1)
	 Tempo de retenção (min) 
	Metanol gasto (mL)
	Tempo de Análise (min)
	0,8
	14,7
	4,13
	17,2
	1,0
	11,8
	4,29
	14,3
	1,2
	9,8
	4,43
	12,3
	
	
	
	
	Concentração da fase móvel 40:60 (v/v) MeOH/H2O
	
	
	
	
	Vazão (mL.min-1)
	 Tempo de retenção (min) 
	Metanol gasto (mL)
	Tempo de Análise (min) 
	0,8
	4,5
	2,24
	7,0
	1,0
	3,8
	2,52
	6,3
	1,2
	3,1
	2,69
	5,6
	Fonte: (Autor próprio - 2020).
	
	
	
	Como o objetivo é a diminuição do custo e do tempo de análise, descartamos as concentrações de 20:80 e 30:70 Metanol:H2O, pois apresentaram longo tempo de análise e um gasto muito alto do reagente mais caro da análise: o metanol. A concentração 40:60 Metanol:H2O apresentou curto tempo de análise e pouco gasto do reagente, porém no caso das vazões de 1,0 mL.min-1 e 1,2 mL.min-1, a seletividade não seria efetiva, pois não haveria muita interação do analito com a fase estacionária. A vazão de 0,8 mL.min-1 foi a escolhida para o desenvolvimento do trabalho. O cálculo de tempo de análise foi: Tempo de retenção + 2,50 min (tempo para garantir que não haverá mais nenhum pico posterior ao do analito).
	
Resultados
Foi verificado a linearidade, seletividade, limite de detecção, limite de quantificação, exatidão e precisão, não foi determinada a robustez pois, segundo a resolução da diretoria colegiada - RDC Nº 166, de 24 de julho de 2017, publicada no diário oficial da união nº141, de 25 de julho de 2017 pela ANVISA, esse parâmetro não é necessário para realização de validações parciais de métodos analíticos.
As análises dos dados obtidos foram realizadas tendo como critério de aceitação a resolução citada anteriormente e os cálculos efetuados através do software Microsoft Excel®, a partir desse pressuposto pode haver uma variação nas casas decimais quando comparado aos valores obtidos em calculadora em função do arredondamento efetuado pelo programa.
Curva de calibração
Para a determinação da cafeína por HPLC foi construída uma curva de calibração (Figura 6) a partir de uma solução padrão de cafeína.
Para obtenção dos dados cromatográficos a construção da curva constitui-se das áreas dos picos nas ordenadas e as concentrações de cafeína nas abscissas, com isso foram preparadas soluções nas concentrações de 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 120,0 e 160,0 (mg.L-1), e foram utilizados 4 pontos para cada solução como podemos ver na tabela 3.
Tabela 3 - Dados para construção da curva de calibração.
	Concentração (mg.L-1)
	Área do pico 1
	Área do pico 2
	Área do pico 3
	Área do pico 4
	
	
	
	
	
	
	10
	644788
	635792
	643483
	649441
	
	
	
	
	
	
	
	20
	1345972
	1355289
	1356484
	1353074
	
	
	
	
	
	
	
	40
	2994120
	2987162
	3008740
	2979394
	
	
	
	
	
	
	
	80
	6018616
	6099245
	5977680
	5943928
	
	
	
	
	
	
	
	120
	8880237
	8875232
	8835415
	8744710
	
	
	
	
	
	
	
	160
	11759020
	11602273
	11667564
	11773236
	
	
	
	
	
	
	
Fonte: (Autor próprio, 2020).
Figura 6 - Curva de calibração da cafeína nas concentrações 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 120,0 e 160,0 mg.L-1.
Fonte: (Autor próprio, 2020)
Linearidade
Para realização deste estudo, utilizando-se da curva de calibração criada, foram avaliados os cromatogramas através do coeficiente de correlação quadrático gerado pela curva que pode ser observado na tabela 4.
Tabela 4 - Resultado obtido na curva para o teste de linearidade.
	Substância
	Coeficiente angular
	Coeficiente 
linear
	Coeficiente de correlação 
(R²)
	Critério de aceitabilidade (R²)
	
	
	
	
	
	
	Cafeína
	73871
	-38603
	0,9994
	≥0,990
	
	
	
	
	
	
	
Fonte: (Autor próprio, 2020).
O valor de 0,9994 para o R² comprova a linearidade do método para as análises realizadas e por meio da equação da reta, foram determinadas as concentrações reais das amostras analisadas.
Seletividade
Este estudo é baseado em reconhecer o sinal da cafeína em meio a solução utilizando os mesmos parâmetros para análise. Através de uma solução padrão de cafeína podemos observar qual é o tempo de retenção do composto e comparar com o tempo de retenção das amostras analisadas. Na análise utilizando uma solução padrão o tempo de retenção observado foi de mais ou menos 4,5 minutos sem a presença de picos interferentes. 
A figura 7 mostra o tempo de retenção de uma das amostras injetadas na coluna nas seguintes condições: fase móvel água: metanol (40:60) (v/v), injeção de 10 µL e uma coluna cromatográfica C18, mesmas condições utilizadas nas análises dos padrões.
Figura 7 - Cromatograma de uma amostra de café diluída 10 vezes. Condições: fase móvel água:metanol (40:60) (v/v), injeção de 10 µL e uma coluna cromatográfica C18.
Fonte: (Autor próprio, 2020).
Nessa comparação foi possível observar que a análise da figura 7 apresenta o mesmo tempo de retenção do padrão e apenas um pico nesse tempo, indicando a presença apenas do analito em questão.
Limite de Detecção
Para este parâmetro a determinação foi baseada na curva analítica, sendo calculado através da equação 3.
A partir dos cálculos obtivemos um valor de LOD igual a 4,407 mg.L-1, portanto, essa concentração seria a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porém, não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas.
Limite de Quantificação
Podemos determinar o limite de quantificação através de dois possíveis métodos, sendo eles:
· Através do cálculo da equação 4;
· Considerando o desvio padrão dos brancos de amostra.
Para este trabalho o limite de quantificação foi mensurado através do cálculo da equação 4. O valor obtido de LOQ foi igual a 13,35 mg.L-1 , portanto esse é a menor concentração do analito presente na amostra que pode ser detectada e quantificada com precisão e exatidão.
Exatidão
Os dados de exatidão foram obtidos a partir de um de padrão de cafeína diluída em água deionizada numa concentração de 150 mg.L-1. Foi avaliado o desvio padrão, desvio padrão relativo (parâmetro abaixo de 5%) e grau de recuperação de amostras (parâmetro de recuperação de 80%-120%). Acompanhe os dados na tabela 5.
Tabela 5 - Dados obtidos na análise de exatidão.
	EXATIDÃO
	
	Valor Teórico
	1
	2
	3
	4
	Média
	DESVPAD
	%DPR
	Recuperação
	Análise 1 (mg.L-1)
	150,00
	150,21
	147,58
	147,51
	147,50
	148,20
	1,3428826
	0,91%
	98,80%
Fonte: (Autor próprio, 2020).
Todos os valores obtidos respeitaram os parâmetros estabelecidos, mostrando assim, a exatidão do método analítico desenvolvido.
Precisão
A precisão intermediaria do método sob condições de reprodutibilidade foi mensurada, através da comparação das variâncias das concentrações calculadas a partir de amostras preparadas por dois analistas diferentes em três níveis de diluições distintos, tendo seus fatores de diluições crescentes de 10x, 20x e 40x. A Tabela 6 mostra os resultados obtidos nas análises.
Tabela 6 - Resultados obtidos pelos dois analistas para três níveis de concentrações diferentes, bem como o valor do Teste F para grau de 95%.
	 
	Analista A
	 
	1
	2
	3
	4
	Média
	DESVPAD
	Variância
	Diluição 1 (mg.L-1) x40
	16,04
	16,02
	15,92
	15,99
	15,993
	0,052520
	0,00276Diluição 2 (mg.L-1) x20
	30,48
	30,69
	30,44
	30,53
	30,535
	0,109697
	0,01203
	Diluição 3 (mg.L-1) x10
	73,89
	74,39
	73,65
	74,69
	74,155
	0,471416
	0,22223
	 
	Analista B
	 
	1
	2
	3
	4
	Média
	DESVPAD
	Variância
	Diluição 1 (mg.L-1) x40
	16,03
	15,98
	15,99
	15,91
	15,978
	0,049917
	0,00249
	Diluição 2 (mg.L-1) x20
	31,20
	31,55
	31,15
	31,31
	31,303
	0,178022
	0,03169
	Diluição 3 (mg.L-1) x10
	76,43
	76,37
	77,19
	77,14
	76,783
	0,442822
	0,19609
	 
	Teste F (95%)
	F crítico
	Diluição 1 (mg.L-1) x40
	1,1070
	6,3900
	Diluição 2 (mg.L-1) x20
	2,6337
	6,3900
	Diluição 3 (mg.L-1) x10
	1,1333
	6,3900
Fonte: (Autor próprio, 2020).
Comparando-se as variâncias obtidas das análises de cada analista a partir da hipótese nula de que, ambos valores analisados são iguais (S12=S22) e considerando um nível de confiança de 95%, tem-se que o valor de “F” crítico é de 6,39.
Como obtivemos, nos três níveis de concentrações valores do teste F abaixo do valor crítico, podemos aprovar a hipótese nula, concluindo que as variâncias são estatisticamente iguais, confirmando, portanto, a precisão metodológica.
Considerações Finais
A partir da observação dos parâmetros avaliados para a validação metodológica, o método se apresentou promissor e dentro dos critérios levados em consideração. Na linearidade obteve-se resultados R2 ≥ 0,990 para a curva obtida, mostrando que o método é linear. Para a seletividade, como foi demonstrado pela figura 7 os tempos de retenção do padrão e da amostra analisada mostraram-se iguais permitindo assim, a identificação e a confirmação do sinal gerado. O teste de exatidão foi avaliado a partir da recuperação de uma série de análises de um material de referência, o padrão, em um mesmo nível de concentração, como o valor obtido está dentro do critério, pode-se comprovar a exatidão metodológica. Para a avaliação de precisão foi realizado o teste de repetibilidade onde, para o critério de avaliação foi considerado a hipótese nula de que as variâncias das mesmas concentrações são equivalentes (S12=S22), os valores obtidos encontram-se abaixo do critério estabelecido.
Tendo em vista os objetivos descritos, a importância da determinação da cafeína em bebidas e os parâmetros avaliados, a metodologia atende a proposta de não gastar grandes quantidades de solventes em um curto tempo de análise, apresentando um modo de preparo simples, fácil e dinâmico, mostrando-se dentro dos critérios estabelecidos.
Perspectivas futuras
Determinar a robustez do método; tratar e recuperar o solvente utilizado; determinar o LOD e LOQ pela a curva de calibração do branco da amostra; realizar a determinação em diferentes Matrizes.
Referências
ALVES, Dereck Vitali. DETERMINAÇÃO DE DIOXINAS E FURANOS (PCDD/F) EM GORDURA DE FRANGO. 2019. 44 f. Monografia (Especialização) - Curso de Curso de Análise Instrumental Avançada, Centro de Pós - Graduação Oswaldo Cruz, São Paulo, 2019.
BRASIL, de 10 de setembro de 2005. INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 24. Diário Oficial da União: seção 1, Brasília, DF, ano 2005, n. 181, p. 11, 10 set. 2005.
CECCHI, Heloisa Máscia. FUNDAMENTOS TEÓRICOS E PRÁTICOS EM ANÁLISE DE ALIMENTOS. 2. ed. Campinas: Editora Unicamp, 2003.
COLLINS, Carol H. et al. FUNDAMENTOS DA CROMATOGRAFIA. Campinas: Editora Unicamp, 2006.
COORDENAÇÃO GERAL DE CREDITAÇÃO. DOQ-CGCRE-008: Orientação sobre validação de métodos analíticos. 5 ed. 2016. 31 p.
LOZANO, Ricardo Pardo et al. Cafeína: un nutriente, un fármaco, o una droga de abuso. Adicciones, Mallorca, Espanha, v. 19, n. 3, p. 225-238, 2007.
MANDAL, Ananya. Caffeine Pharmacology. 2019. Disponível em: https://www.news-medical.net/health/Caffeine-Pharmacology.aspx. Acesso em: 16 mar. 2020.
MARIANO, Renan Silva. 2018. DETERMINAÇÃO DE CAFEÍNA EM BEBIDAS ESTIMULANTES POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA E ESPECTROFOTOMETRIA UV-Vis. ACADÊMICO DE QUÍMICA, UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ. Londrina : s.n., 2018.
MEYER, Veronika R. 2004. Pratical High-Performance Liquid Chromatography. New Jersey : John Wiley & Sons, 2004. ISBN: 0-470-09377-3.
MINISTÉRIO DA AGRICULTURA E PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. MANUAL DE MÉTODOS DE ANÁLISES DE BEBIDAS E VINAGRES: Cafeína II. 11 ed. Campinas: Instituto de Tecnologia de Alimentos, 1993. 2 p
MINISTÉRIO DA SAÚDE. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Diretoria Colegiada. RDC N° 166, 24 de julho de 2017. Dispõe sobre a validação de métodos analíticos e dá outras providências. Resolução da diretoria colegiada, Brasília, DF, n. 141, p. 22, 24 jul. 2017.
MORE: Mecanismo online para referências, versão 2.0. Florianópolis: UFSC Rexlab, 2013. Disponível em: http://www.more.ufsc.br/. Acesso em 11/06/2020.
RICHTER, Robert C. et al. MICROWAVE GREEN EXTRACTION. 2. ed. Itália: Milestone Press, 2019.
SALATINO, Maria Luisa. Técnicas básicas de cromatografia. Disponivel em: edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/1842690/mod_resource/content/1/Aula%202%20-%20T%C3%A9cnicas%20de%20cromatografia.pdf. Acesso em 04 de abril. 2020.
SILVA, Andréia de Paula. COMO INICIAR A VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS. In: CONGRESSO E FEIRA DA QUALIDADE EM METROLOGIA, 2006., 2006, São Paulo. Relatório. São Paulo: Remesp, 2006. p. 8-15.
SILVA, Débora Soares da. 2017. OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE UMA METODOLOGIA ANALÍTICA PARA A DETERMINAÇÃO DE PRODUTOS DA CONVERSÃO DA CELULOSE. Instituto de Química e Biotecnologia, Universidade Federal de Alagoas . Tabuleiro do Martins  : s.n., 2017. Dissertação de Mestrado.
SOUSA, Diana Isabel Teixeira. 2018. Validação de Método Analítico por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) de um Medicamento de associação dupla (20mg + 40mg). Faculdade de Ciências e Tecnologia - Universidade Nova de Lisboa. 2018. Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica.
SKOOG, Douglas a. et al. FUNDAMENTOS DA QUIMICA ANALÍTICA; tradução técnica Robson Mendes Matos. 9 ed. São Paulo, 2015.
VIANA, José Lucas Martins. 2017. VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA ANÁLISE DE TRAÇOS DE BIOCIDAS ANTI-INCRUSTANTES DE TERCEIRA GERAÇÃO EM AMOSTRAS DE SEDIMENTOS VIA HPLC-MS. Universidade Federal do Maranhão. São Luís : s.n., 2017.
YRNE, David. DIRECTIVA 2002/67/CE DA COMISSÃO de 18 de julho de 2002 relativa àrotulagem dos géneros alimentícios que contêm quinino e dos géneros alimentícios que contêm cafeína: (texto relevante para efeitos do eee). Jornal Oficial das Comunidades Europeias. Bruxelas, p. 19-29. 18 jul. 2002.
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