CONJUGAÇÃO BACTERIANA

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CONJUGAÇÃO BACTERIANA 
 
Procedimentos 
• Materiais 
o Cultura de E. coli MM 293 (cultura doadora F+) 
o Cultura E. coli K12 711 (cultura receptora F-) 
o Alça de repicagem 
o Micropipetas calibradas 
o Placas de Petri com meio LB contendo antimicrobianos 
o Frasco de vidro para descartar as ponteiras 
o Béquer com álcool e alça de drigalsky 
o Bico de Bunsen 
o Tubos para diluição (9ml de solução salina 85%) 
o Agitador de vidro tipo vórtex 
o Ponteiras esterilizadas 
• Mistura das Bactérias doadoras e receptoras 
o Ligar bico de Bunsen 
o Agitar as culturas para resuspender as células 
o Transferir uma alíquota de 1,5 ml da cultura das células doadoras 
para um tubo esterilizado (primeiro faz com 1 ml, depois com 0,5 
ml para completar) 
o Transferir para o mesmo tubo 0,5 ml da cultura da bactéria 
receptora 
o Agitar a mistura de conjugação 
o Incubar durante 30 minutos a 37ºC 
• Seleção das bactérias transconjugantes 
o Identificar as placas de Petri com meio LB + Canamicina e ácido 
nalidíxico 
o Em uma placa será colocada alíquota de 0,1 ml. E na outra placa 
será colocada alíquota de 0,2 ml da mistura de conjugação 
o Acender a chama do BB 
o Coletar 0,1 ml com a micropipeta e colocar na placa 1 e espalhar 
as células com uma alça de Drigalsky (spread plate) 
o Fazer a mesma coisa com 0,2 ml na placa 2 
o Incubar a 37ºC por 24 horas 
• Controles 
o Pegar a placa de Petri e dividir no meio com uma linha de caneta. 
Uma parte será das doadoras e a outra parte com receptoras 
o Utilizar 3 placas: uma contendo LB + Canamicina, outra contendo 
LB + ácido nalidíxico, e a terceira com LB + Canamicina + ácido 
nalidíxico 
o Acender a chama do bico de Bunsen 
o Esterilizar a alça de repicagem 
o Realizar na metade das placas marcadas com D uma estria da 
bactéria doadora e na outra metade marcada com R uma estria 
da bactéria receptora 
o Incubar por 24 h a 37ºC 
• Diluições e espalhamento das bactérias doadoras 
o Identificar os tubos com solução salina com diluições de 10-1 a 10-
6 
o Identificar placas de Petri com LB e Canamicina, onde será 
colocada diluição de 10-4 e 10-5 e 10-6 
o Agitar o tubo das células doadoras para resuspender 
o Ligar a chama do BB 
o Retirar uma alíquota de 0,1 ml da suspensão de bactérias 
doadoras 
o Transferir para o primeiro tubo com diluição 10-1 
o Agitar o tubo 
o retirar uma alíquota de 0,1 ml e passar para diluição 10-2 
o agitar o tubo 
o fazer assim para os outros tubos 
o vai transferindo de um tubo para outro, após a agitação 
o no último tubo transfere a alíquota de 0,1 ml da diluição 10-4 para 
a placa 
o espalhar as células com alça de drigalsky 
o retirar uma alíquota de 0,1 ml da diluição 10-5 e transferir para uma 
placa com LB + Canamicina 
o espalhar com alça de drigalsky 
o retirar uma alíquota da diluição 10-6 e transferir para uma placa, 
espalhar 
o incubar as placas em estufa a 37ºC por 24 horas 
 
RESULTADOS 
• Controle: na primeira placa (Km) só cresceu doadora. Na segunda 
placa (Nal) cresceu só a receptora. Na terceira placa (Nal + Km) não 
cresceu nenhuma 
o Isso prova que antes da mistura não havia bactérias resistentes 
aos dois antibióticos 
• Frequência de conjugação: 1,22 x 10-3 % 
• 155 colônias 
• Número de UFC de transconjugantes foi 1550 
• Número UFC da doadora na mistura foi 1,7 x 108 x 0,75 
 
 
AULA SÍNCRONA 
• Mecanismos de transferência de DNA em bactérias: transformação, 
transdução, transdução especializada, conjugação 
• Conjugação ocorre por meio de plasmídeos ou transferência parcial 
do genoma 
• Quem recebe é a célula F- 
• Pode ocorrer pela célula Hfr, plasmídeo integrado ao genoma 
• Plasmídeo R possuem genes de resistência 
• Porque o fator F é essencial para a ocorrência de conjugação? 
o Possui todos os genes que estão envolvidos com a 
transferência dele para outro molécula 
o Exemplo: gene para formação do pílus 
• Como o fator F recombina com o cromossomo? 
o Sequências de elementos transponíveis que serão 
complementares as fitas do cromossomo 
• No experimento foi utilizado bactéria doadora que possui fator F, 
resistente a Canamicina (célula F+) 
• E bactéria receptora resistente ao ácido nalidíxico (célula F-) 
• Como poderia ser explicado o crescimento em LB mais Km e Nal? 
o Na primeira placa só cresce a doadora, resistente ao Km, e na 
segunda placa só cresce a receptora resistente ao Nal. Na 
terceira placa, prova que nenhuma das 2 possuíam genes 
resistentes aos 2. Se crescesse na placa, é porque houve 
célula já resistente aos dois (contaminação, conjugação) 
• 
 
 
 
 
• Utilizando uma doadora F+ é possível transferir genes do cromossomo para 
uma bactéria F-? 
o Não é possível. Transfere plasmídeo, e não genes do cromossomo. Só 
se fosse célula Hfr (possui plasmídeo integrado ao cromossomo, e quem 
recebe será recombinante) 
• 
• Por que multiplica por 0,75? 
o Porque a doadora só representa um quarto da mistura. Diluiu 
concentração de doadoras na mistura 
o 1,5 dividido por 2 é 0,75 
o Volume extra de receptoras 
• Colocar mais doadoras para aumentar frequência de conjugação, porque ela 
tem o fator F