O parasita Trichomonas

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1. INTRODUÇÃO 
 
1.1- O parasita 
 
 Trichomonas vaginalis é um protozoário flagelado, parasita do trato urogenital e 
agente etiológico da tricomoníase na espécie humana, doença sexualmente transmissível 
(DST) de caráter mundial. Esse parasita constitui a mais prevalente causa não viral de 
DST (Swygard, 2004). Sua morfologia vária em tamanho e forma, com a média de 
comprimento e largura de 10 e 7 μm, respectivamente (Petrin, et al., 1998). Possui cinco 
flagelos, quatro estão localizados na porção granular basal anterior, o quinto flagelo é 
incorporado à membrana ondulante do parasito (Arroyo, et al., 1993). Os flagelo e a 
membrana ondulante estão relacionados à sua mobilidade. Em condições desfavoráveis 
de crescimento, o T. vaginalis pode internalizar seus flagelos e assumir aspecto 
arredondado. Muitos acreditam que estas formas sejam pseudocistos, mas é mais 
provável que sejam formas degeneradas do parasito (Honinberg, 1990). 
 Condições fisioquímicas alteram a morfologia do parasito. Em cultura axênica 
o parasita tende a adotar uma forma mais uniforme, semelhante à pêra ou oval (fig.1 A), 
quando aderido a células epiteliais vaginais possui aparência amebóide (fig. 1 B). O 
citoesqueleto do T. vaginalis deve auxiliá-lo nessas modificações morfológicas, 
diferentes moléculas de actina e tubulina já foram descritas na sua composição 
(Cappuccinelli et al., 1987). Três grandes estruturas fibrilares foram visualizadas no 
parasito: a costa, o corpo parabasal e o axóstilo, que devem funcionar como âncora no 
epitélio vaginal. Seu núcleo está localizado na porção anterior, como em outros 
eucariotos e é circundado por um envelope nuclear poroso. Grânulos de glicogênio 
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estão presentes no T. vaginalis e podem ser observados por microscópio eletrônico 
(Honigberg & King, 1964). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1: (A) T. vaginalis observado em meio de cultura. Flagelos e Axóstilo são claramente 
visíveis. (B) Morfologia amebóide do T. vaginalis aderido a células epiteliais. 
Fonte: Departamento de Medicina e Microbiologia da Universidade de Ottawa, Canadá. Dino 
Petrin, 1998. 
 
 
 O T. vaginalis não possui mitocôndria, é anaeróbico e aerotolerante. Possue 
hidrogenossomos, organelas estruturalmente semelhantes à mitocôndria, que possuem 
membrana interna e externa, uma vesícula periférica observada como um 
compartimento distinto, cujo conteúdo e morfologia são aparentemente diferentes do 
restante da organela. Essa vesícula apresenta-se com uma superfície lisa e poros com 20 
nm de diâmetro. Possuem partículas intramembranosas (Benchimol, 2000), mas faltam-
lhes cristas, citocromos e são desprovidos de material genético (Attardi et al., 1988). 
Sugere-se que sua morfologia pode ser alterada em conseqüência de modificações no 
tratamento durante as observações ou como expressão de seu estado metabólico 
 
 
A B 
 
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(Benchimol, 2000). O hidrogenossomo é importante no metabolismo de carboidratos e 
no controle da tricomoníase, os metronidazólicos, utilizados no tratamento, são drogas 
que necessitam ser ativados pela piruvato-ferrodoxina oxidoredutase, enzima presente 
nessa organela (Kulda et al., 1993; Quon et al., 1992). 
O que se conhece a respeito do metabolismo deste protozoário é baseado em 
evidências bioquímicas. O T. vaginalis exibe uma grande adaptação metabólica, talvez 
por habitar um ambiente que passa por constantes variações fisico-químicas, como 
variação hormonal, viscosidade do meio, pH, potencial de oxido-redução, presença de 
sangue e outros microorganismos (Quon, et al., 1994). 
Em relação ao seu metabolismo, alguns aminoácidos são encontrados em maior 
quantidade no T. vaginalis, e estes aminoácidos podem manter o crescimento do 
protozoário quando submetido a condições limitantes de carboidratos. O metabolismo 
de carboidratos segue a via clássica de Embden-Meyerhoff-Parnas, sendo que o piruvato 
é colocado para o interior do hidrogenossomo aonde é catabolizado, produzindo mais 
ATP. De forma interessante, na ausência de oxigênio, um dos produtos finais é a 
produção de hidrogênio molecular (H2). No entanto, já se verificou que o 
hidrogenossoma não é essencial para o crescimento do parasita. O que vale destacar no 
seu metabolismo do protozoário é que o T. vaginalis é incapaz de sintetizar lipídeos e 
nucleotídeos, ficando totalmente dependente de seu hospedeiro. O metabolismo de 
lipídeos influencia diretamente na sobrevivência do parasita e na produção de 
glicolipídeos em sua superfície celular do parasita, importantes na sua relação com o 
hospedeiro (Beach, et al.,1991). Baseado em evidências bioquímicas, o parasita tem 
transportadores específicos para nucleotídeos e enzimas que fazem a reciclagem de 
nucleotídeos e lipídeos (Quon, et al., 1994). 
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1.2- A tricomoníase 
 
 Doença infecciosa do trato urogenital, descrita pela primeira vez por Donné em 
1836, atualmente sua incidência é de aproximadamente 250–350 milhões de novas 
infecções por ano (World Health Organization, 2001; Weinstock et al., 2004). Essa alta 
incidência pode ser atribuída ao aumento das atividades sexuais e múltiplos parceiros e 
à ausência de sintomatologia por parte das pacientes, além da falta de acessos aos 
sistemas de saúde. A patologia é mais freqüente no sexo feminino, e tem no sexo oposto 
o grande disseminador da infecção na população humana, podendo os assintomáticos 
aumentar essa incidência em mais 50%. Há também observações de que pode ser 
transmitida através de fômites (roupas íntimas, roupa de cama ou água) o que confere 
infecção em crianças e pessoas virgens (Escheban, 1983). 
A tricomoníase apresenta uma variedade de formas clínicas, estendendo-se 
desde assintomáticas até graves vaginites. A inflamação é irritante e severo, atingindo a 
vulva, vagina ou cérvix uterina (Grodstein, et al., 1993). Além de causar a predisposição 
ao câncer cervical (Zhang and Begg, 1994; Yap et al., 1995; Zhang et al., 1995; Viikki 
et al., 2000). Caracterizada pelo recrutamento de células inflamatórias no local da 
infecção, a tricomoníase aumenta as chances de aquisição do HIV numa relação sexual 
(Laga et al., 1994; Gram et al., 1992 Wasserheit, 1992; Sorvillo & Kerndt, 1998; 
Sorvillo et al., 2001). É estimado que cerca de 24% das infecções por HIV estejam 
diretamente relacionadas a infecções por T. vaginalis (Mundodi, et al., 2004). Dessa 
forma, o controle da tricomoníase e outras DSTs tem implicação epidemiológica no 
controle da AIDS. As pacientes assintomáticas somadas aos homens portadores 
preocupam a respeito da disseminação da doença, e a falta de imunidade protetora leva 
a recidivas (Petrin et al., 1998). 
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O quadro clínico da infecção aguda revela uma vulvovaginite difusa devido à 
produção de uma leucorréia em excesso de mau odor, de coloração branca à esverdeada 
exteriorando-se da vagina (figura 2A) e ainda apresentar-se com aspecto fermentativo 
bolhoso (Honinberg, 1990) como observado na figura 2B. São observados na vagina e 
mucosa cervical hiperemia do tecido com pequenos pontos hemorrágicos, referidos 
como “strawberry appearance” (Fouts, et al., 1990). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2 - Vulvovaginite difusa. (2A) Leucorréia em excesso de coloração branca à esverdeada 
exteriorando-se na vulva. (2B) Leucorréia apresentando aspecto fermentativo bolhoso. 
 
A literatura registra que a tricomoníase está associada à diminuição da 
fertilidade, na população masculina os sintomáticos raros podem desenvolver infecções 
urinárias (uretra, epidídimo, próstata) (Hoffman et al., 2003) e infertilidade (Honigberg, 
1990; Krieger, 1995). Nas gestantes, pode implicar em predisposição à ruptura 
prematura das membranas placentárias com parto prematuro ou nascimento de fetos 
com peso abaixo do desejado (Coth, 1990; Heine et al.,1993; Zhang et al., 1994). Este 
efeito é mais pronunciado na tricomoníase bovina pelo parasito correlatoA 
B 
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Tritrichomonas foetus, causador de importante doença venérea em bovinos, levando à 
infertilidade e abortos (Corbeil, et al., 1995). 
Assim, a tricomoníase também tem um aspecto veterinário de interesse 
econômico, dado o cruzamento intensivo de animais selecionados, a manipulação da 
fertilização in vitro, e a clonagem animal. Nesse contexto, em 1991 Speer e 
colaboradores estimaram uma perda anual de 650 milhões de dólares apenas pela 
indústria de carne norte-americana, situação que se agravou nos últimos anos. 
 O diagnóstico desenvolvido nos programas de saúde é realizado inicialmente 
pela história clínica com análise de sintomas, em seguida confirmado por testes 
laboratoriais de citologia à fresca ou fixada. No entanto, possui baixa sensibilidade 
(Martin et al. 1963; Mc Cann, 1974). Outras opções de diagnóstico da doença incluem a 
cultura do T. vaginalis em meio seletivo seguido de posteriores análises microscópicas 
(Diamond, et al., 1995), e técnicas moleculares de diagnóstico com a extração de DNA 
e amplificação de regiões ribossômicas do parasita por PCR. Estas regiões são 
escolhidas por serem repetitivas no genoma e altamente conservadas (Briselden & 
Hiller, 1994; Van der Schee et al., 1999). A sensibilidade e especificidade dos métodos 
de diagnóstico por PCR têm se mostrado satisfatório e superiores às técnicas 
tradicionais (Lobo et al., 2002). 
 O tratamento usual da tricomoníase é feito com o uso oral ou local de drogas 
tipo nitroimidazólicos, como o α-β-hidroxietil-2-metil-5-nitroimidazol, derivado 
nitroimidazólico do antibiótico azomicina de Streptomyces, denominado de 
metronidazol (Flagyl, nome comercial), entre outras. Do ano de sua descoberta, 1959, 
vários outros derivados nitroimidazólicos foram produzidos, mas todos apresentam a 
mesma via de ação. Significa dizer que a resistência química ao tratamento contra um 
composto será ampliada a todos. Na verdade, o metronidazol não é uma droga 
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específica ao T. vaginalis, mas atua em vários agentes patogênicos anaeróbicos, entre 
bactérias, protozoários e helmintos. No entanto, para exercer uma ação citotóxica, o 
metronidazol que é ministrado como uma pró-droga na forma inativa, deve ser ativado. 
O grupo nitro é reduzido em reações que se sucedem no interior dos hidrogenossomos 
das células dos agentes patogênicos, daí o radical iônico nitro torna-se citotóxico, 
quebrando as fitas de DNA do patógeno. Em síntese, o próprio patógeno ativa a 
toxicidade da droga (Quon et al., 1994). 
No T. vaginalis, esta ativação ocorre no interior de uma organela, o 
hidrogenossomo, pela enzima piruvato-ferrodoxina oxidoredutase (PFO). A resposta é 
rápida, cessando a mobilidade e divisão celular em 1 h, levando mais aproximadamente 
7 h para a morte do parasita em cultura celular. No entanto, ao longo das últimas 
décadas, o uso único e contínuo do metronidazol vem causando o surgimento de 
resistência genética ao tratamento(Quon et al., 1994). Basicamente, o parasita diminui a 
síntese de PFO ou outras enzimas que participam da ativação da droga, tornando-se 
mais resistente. Atualmente, estima-se que 5% dos isolados clínicos de T. vaginalis 
tenham algum nível de resistência ao metronidazol Também há outros fatores 
fisiológicos do próprio hospedeiro que dificultam o tratamento: a baixa concentração de 
zinco no plasma, baixa absorção da droga, distribuição insuficiente da droga para o 
ambiente vaginal, inibição da droga por bactérias presentes na vagina. 
 Não há alternativas para o tratamento das formas resistentes, pois os outros 
derivados nitroimidazólicos têm o mesmo mecanismo de ação. Tenta-se alternar os 
esquemas terapêuticos, aumentando a dosagem e o tempo de tratamento. A gestação 
representa outro desafio ao tratamento. Embora os efeitos colaterais do metronidazol 
sejam amenos, mas por atravessar a barreira placentária, o tratamento oral só é realizado 
após o segundo trimestre gestacional. A cura da trichomoníase com o uso tópico do 
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creme vaginal no primeiro trimestre da gestação é de apenas 50%. Deve-se enfatizar que 
a infecção prolongada pode levar a complicações gestacionais, como dito anteriormente. 
Também, a lactante deve abster-se da amamentação por 24 h após a administração de 2 
g, em dose única, de metronidazol (Land et al., 1999). Deste modo, as dificuldades e 
resistências fisiológicas do paciente ao tratamento, e essencialmente a resistência 
genética do parasita ao metronidazol, permitem a sugestão para o desenvolvimento de 
novas drogas. 
 
1.3- A patogênese 
 
 Este parasita apresenta boa adaptação ao trato geniturinário, o que leva às 
lesões epiteliais com várias resultantes patológicas. A origem da patologia deve ser 
múltipla, mas devemos ressaltar a importância dos seguintes eventos que contribuem 
para o desencadeamento de processos inflamatórios, ulcerações e metaplasia tecidual ao 
nível da vulva, vagina e/ou cérvix uterina: a adesão célula-célula, hemólise, secreção de 
proteinases, CDF (Cell Detaching Factor) que promove a descamação epitelial (Lopez 
et al., 2000; Alderete et al., 1994; Arroyo et al., 1992; Costa e Silva Filho et al., 1989; 
Fiori et al., 1993; Krieger et al., 1983). O T. vaginalis também é capaz de evadir-se do 
sistema imunológico (Alderete et al., 1992; 1995; Demes et al., 1988; khoshman et 
al.,1994). 
 Não se conhece muito a respeito da fisiologia e dos mecanismos patogênicos 
da doença, mas já foi demonstrado que a citoaderência do parasito ao epitélio escamoso 
vaginal é o primeiro passo para o processo infeccioso (Alderete et al., 1988), o que 
caracterizaria sua ação citolítica como contato dependente. A aderência depende da 
fluidez da membrana e do próprio metabolismo do protozoário, pois ocorre grande 
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redução na aderência quando há diminuição da temperatura e quando o parasita é 
tratado com acetato de iodo e metronidazol, ambos inibidores do seu metabolismo 
(Honinberg et al., 1990). 
 Interações específicas entre receptores e ligantes devem estar envolvidas na 
mediação da aderência, foi observado que quando ligantes são removidos é necessária 
uma nova síntese das proteínas ligante para a manutenção da adesão (Honinberg et al., 
1990). Diferentes proteínas ligantes foram identificadas e envolvidas no processo de 
citoadesão do parasita e denominas adesinas (Arroyo et al., 1992; Alderete et al., 1998; 
Lehker et al., 1991). 
Existe relação direta entre os níveis de citoaderência, a expressão de adesinas de 
superfície (Arroyo et al., 1992) e sua ligação a receptores de células epiteliais vaginais 
(Garcia et al., 2003). Dentre elas, quatro proteínas de superfície, AP65, AP51, AP33 e 
AP23, participam da interação do parasita com a superfície de células epiteliais vaginais 
(Alderete and Garza, 1985; Arroyo et al.,1992; Garcia et al., 2003), e glicoproteínas de 
superfície como a AP120 que possui identidade com a enzima hidrogenossomal 
piruvato-ferrodoxina oxidoredutase (Moreno-Brito, et al. 2005). AP 65, AP51 e AP33 
são membros da família multigênica de proteínas com identidade a proteínas do 
hidrogenossomo (Alderete et al., 1988; O’Brien et al., 1996; Engbring & Alderete, 
1998). AP65 possui identidade com a enzima málica de decarboxilação (Alderete et al., 
1995; 1998; Hrd e Müller, 1995; O’Brien et al., 1996). 
 Os genes que codificam as adesinas são regulados em nível transcricional pelo 
ferro (Arroyo et al., 1995; Lehker et al., 1991, Moreno-Brito et al., 2005). E suas 
expressões são dependentes de tempo, temperatura e pH (Alderete et al., 1988). A 
compreensão da patogenicidade do T. vaginalis requer um bom entendimento da 
interação do parasita com o hospedeiro já que sua citoaderência, via interação de 
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adesina-receptor, é bastante complexa, envolvendo atividade de proteinases, a 
transdução de sinal e a regulação mediada pelos fatores ambientais (Arroyo et al., 1995; 
Lehker et al., 1991). 
 As cisteíno-proteasessão necessárias para a ativação de moléculas de adesão 
na superfície do protozoário, como comprovado em testes com a utilização de inibidores 
de cisteíno-proteases (Arroyo & Alderete, 1989). O citoesqueleto, também está 
envolvido nesse processo, pois observou-se que na presença de fatores inibidores de 
polimerização dos microfilamentos do citoesqueleto ocorre a inibição na adesão do 
parasita (Arroyo & Alderete, 1989). 
 Mecanismos independentes de contato célula-célula também desempenham 
um papel significativo na patogênese da tricomoníase. A descamação epitelial da 
mucosa vaginal provocada durante a infecção aguda pelo T. vaginalis pode ser resultado 
da ação de uma glicoproteína de 200 Kda secretada pelo parasita, a CDF – Cell 
Detaching Factor. Essa glicoproteína foi identificada em filtrados de células livres 
(Garber, 1989; Pindak, 1986). Níveis de CDF estão correlacionados com a severidade 
da vaginite. O aumento na produção de CDF está associado com o aumento da 
severidade da doença (Garber, et al, 1990). Quatro fatores demonstram a relação entre 
CDF e a patogenicidade da tricomoníase: 
 - O Pentatrichomonis hominis, uma espécie não patogênica ao homem, não 
exibe atividade CDF; 
 - O pH ótimo de ação da CDF coincide com o pH ótimo de ação do parasito 
sobre o hospedeiro, aproximadamente 6; 
 - O nível de CDF está relacionado ao grau de severidade dos sintomas clínicos 
de vaginite durante a infecção por T. vaginalis; 
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 - O nível de CDF diminui na presença de β-estradiol, melhorando os sintomas 
clínicos da vaginite, coincidindo com o fato de que o agravamento dos sintomas 
acontece no período da menstruação, quando os níveis de estrógeno estão mais baixos. 
 Anticorpos locais e específicos, subtipos G e A, têm sido identificados nas 
secreções cervico-vaginal na maioria das mulheres infectadas e em alguns homens 
infectados. A imunoglobulina A pode dificultar a aderência do patógeno, mas 
aparentemente tem muito pouco ou nenhum efeito no T. vaginalis. É sugerida a 
existência de anticorpos naturais produzidos contra a microbiota vaginal e que reagem 
de maneira cruzada com o T. vaginalis. Esses anticorpos podem aumentar a lise 
mediada pelo complemento (Honinberg et al., 1990), ou atuarem como opsoninas (Saio 
et al., 1991). A ligação de algumas proteínas do hospedeiro com a superfície do parasita 
pode ser um mecanismo pelo qual os fatores imunes do hospedeiro são neutralizados 
(Peterson et al., 1982). Moléculas dos hospedeiros podem mascarar ambos os 
componentes do próprio hospedeiro ou do parasita requeridos pela lise mediada pelo 
complemento. 
 Foi demonstrado que o T. vaginalis possui vários mecanismos de evasão do 
sistema imune do hospedeiro (Provenzano & Alderete, 1995). Um deles é a existência 
de diversas cisteíno-proteases secretadas pelo patógeno que degradam a IgG, IgM e a 
IgA, permitindo a sobrevivência do organismo à resposta dos anticorpos (Min et al., 
1998; Provenzano & Alderete, 1995). O mecanismo de degradação de imunoglobulinas 
foi também observado em diferentes protozoários: Giardia lamblia, Entamoeba 
histolystica, Schistosoma mansoni, Dirofilaria immitis, Faciola hepática, Spirometra 
mansoni (Parenti, 1989; Kelsall & Ravdin, 1993; Auriault et al., 1991; Tamashiro et al., 
1987; Kong et al., 1994). Especialmente proteinases thiol de Giardia lamblia e cisteíno-
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proteases de Entamoeba histolystica degradam IgA humanas (Parenti, 1989; Kelsall & 
Ravdin, 1993). 
Cisteíno-proteases degradam os componentes do complemento, permitindo o 
escape do parasita da lise celular desencadeada pela cascata protéica do sistema 
complemento (Alderete et al., 1995), caracterizando um outro mecanismo de evasão do 
sistema imunológico. Além de estarem relacionadas ao rompimento do citoesqueleto de 
eritrócitos (Fiori et al., 1997). Deste modo, cisteíno-proteases de trichomonídeos 
apresentam um importante papel na patogenicidade do parasita (Hernandez-Gutierrez et 
al., 2004). Estão envolvidas nos mecanismos de virulência, auxiliando na invasão da 
camada mucosa (Lehker & Sweeney, 1999), na citoaderência (Arroyo & Alderete, 
1989, 1995; Mendoza-Lopez et al., 2000), na citotoxicidade (Alvarez-Sanchez et al., 
2000; Arroyo & Alderete, 1995; Min et al., 1997) e na hemólise (Dailey et al., 1990). 
 O parasita secreta uma grande quantidade de antígenos altamente imunogênicos. 
Observa-se uma liberação contínua desses antígenos o que leva a neutralização de 
anticorpos e linfócitos T citotóxicos que seriam prejudiciais ao parasita, sendo este um 
mecanismo inteligente que despista a atenção do sistema imunológico (Alderete et al., 
1984). 
 
1.4- Hemólise 
Em relação aos eventos fisiopatológicos na interação parasita/hospedeiro, vale 
ressaltar a hemólise, um evento que contribui para o desencadeamento de processos 
patológicos capazes de caracterizar variações nos fenótipos de virulência do T. 
vaginalis. Há relação direta entre a patogenicidade e a hemólise provocada pelo 
parasita, também coincidindo com a evolução clínica da doença, aonde os sintomas são 
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fortemente registrados em sincronia com a menstruação, momento de maior 
disponibilidade de eritrócitos (Wilson & Britigan, 1998; Dailey et al.,1990; Krieger et 
al., 1993). Considerando a vagina um micro-ambiente pobre em nutrientes para o 
desenvolvimento de microrganismos, a lise de eritrócitos deve ser um importante 
mecanismo para a nutrição do parasita (Cohen, et al., 1994). Os nutrientes mais críticos 
são o ferro, lipídeos e nucleotídeos (Lehker, et al., 1990). Os dois últimos são vitais, 
dado a incapacidade do parasita de sintezá-los de novo. 
No entanto, há grande controvérsia a respeito do mecanismo indutor de hemólise 
dentre os parasitas da família Trichomonadidae. De Carli et al. (1996) sugeriram que o 
processo hemolítico não ocorre devido à secreção de hemolisinas e/ou outras proteases 
ao meio, que desempenham um papel diverso e importante na virulência do parasita, 
mas sim devido à relação de contato entre o parasito e os receptores de superfície 
eritrocitária. 
Hemolisinas são toxinas protéicas produzidas e secretadas por bactérias 
patogênicas e por diferentes organismos. Sua ação ocorre diretamente sobre a 
membrana citoplasmática do eritrócito provocando danos imediatos. As injúrias na 
membrana levam a alteração na sua permeabilidade seletiva e a completa destruição 
celular (Wooldridge & Williams, 1993). Hemolisinas têm sido sugeridas como fator de 
virulência em muitos protozoários patogênicos, incluindo Trypanossoma congolense 
(Tizard et al., 1977), Trypanossoma brucei (Huan et al., 1975), Entamoeba histolystica 
(López-Revilia et al., 1980), Leishmania amazonensis (Noronha et al., 1994) e 
Trichomonas Tenax (Nagao et al., 2000). O protozoário Entamoeba histolytica também 
pode provocar citólise de maneira similar por meio de produção de amoebapores 
(Leippe et al., 1994; Leippe, 1997). 
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Na tentativa de caracterizar o processo hemolítico, diferentes autores o 
descreveram como contato-dependente e dependente de energia. Dailey et al. (1990) 
analisaram o processo in vitro em condições que mimetizam o pH vaginal durante a 
infecção e descreveram interações entre as superfícies do parasita e do eritrócito. De 
Carli et al. (2002) demonstraram a adesão do T. vaginalis à superfície do eritrócito e o 
mecanismo de fagocitose relacionado ao processo hemolítico (Figura 3). A fagocitose 
ocorre com um primeiro contato de uma projeção do corpo do parasito semelhante a 
pseudópodes, nomeados lobopodia e filopodia (figura 3A) e ocorre por meio de 
“sucção”. Após 90 min. de incubação o eritrócito é internalizado pelo parasita (figura 
3C e 3D) e rompido. Rendón-Maldonado et al. (1998) observaram duas formas de 
fagocitose de eritrócitos por T. vaginalis. Primeiro envolvendo o mecanismo de sucção, 
com elongação da membrana do eritrócito e internalização através de um estreitocanal 
endocítico, enquanto o segundo processo ocorre com a emissão de porções fagocíticas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3: Interações contato dependente entre T. vaginalis e eritrócitos observados com 
microscópio eletrônico de varredura. T – parasito, AF – flagelo anterior, AX – axóstilo, PF – 
A 
 
B 
C D 
 
 
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filopodia (pseudópode), UM – membrana ondulante, E – eritrócito. (A) Contatos dos flagelos 
anteriores e projeções do corpo do parasito com o eritrócito. (B) Fagocitose do eritrócito pelo T. 
vaginalis, após 60 min. de incubação. (C e D) Fagocitose do eritrócito pelo T. vaginalis, após 90 
min. de incubação. Em D, membrana ondulante em evidência. 
Fonte: Laboratório de Parasitologia clínica, Faculdade de farmácia – Universidade 
católica do Rio Grande do Sul. Iveli Rosset, 2002. 
 
Mendonça-Lopes et al. (2000) descreveram a participação de uma protease de 
30 Kda (CP30) no processo hemolítico e seu envolvimento na citoaderência do parasita 
ao eritrócito. Sua atividade proteolítica foi inibida por leupeptina, um inibidor de 
cisteíno-proteases, que também reduz a adesão do parasita em 80%. Além disso, 
isolados de T. vaginalis com baixo nível de citoaderência tem baixa ou nenhuma 
atividade dessa cisteíno-protease (Arroyo et al., 1995). Essa proteinase é secretada na 
vagina durante a infecção e é capaz de degradar algumas proteínas da matrix 
extracelular, fibronectina, colágeno IV e hemoglobina, além de sua localização na 
superfície celular ser condizente com seu papel na citoaderência (Mendonça-Lopes et 
al., 2000). Esses dados sugerem a relação entre a atividade proteolítica de CP30 e a 
citoaderência, bem como permite sua caracterização como um fator de virulência do T. 
vaginalis. 
Em contrapartida, relatou-se que a hemólise provocada pelo T. vaginalis pode 
ocorrer num processo independente de contato, com a participação de proteases, aonde 
um fator hemolítico, é secretado e induz a lise do eritrócito através de um mecanismo de 
formação de poros na membrana citoplasmática (Fiori et al., 1996 e Pindak et al., 
1993). 
Diferentes trabalhos apresentam as proteínas líticas, fosfolipases e lipases, como 
potenciais proteínas envolvidas no processo hemolítico. Análises de extratos de T. 
vaginalis identificaram um fator lítico que hidrolisa lipídeos e fosfolipídios, além de 
lisar células epiteliais e eritrócitos, e hidrolisar lipossomos in vitro, o que sugere que 
 16
esse fator lítico contenha atividade de lipase ou fosfolipase. Estudos revelaram que o 
fator lítico especificamente hidrolisa fosfatidilcolina, um dos componentes da 
membrana celular e substrato de todos os tipos de fosfolipases - PLA, PLB, PLC e PLD. 
(Lubick et al., 2003). 
McGregor et al. (1992) relatou níveis aumentados de atividade de fosfolipases 
A2 em secreções vaginais de mulheres com diferentes infecções sexualmente 
transmissíveis incluindo a tricomoníase, e sugeriu a contribuição destas enzimas na 
patogênese das doenças. Em adição, fosfolipases de bactérias como Staphylococcus 
aureus e Clostridium perfringen, são bem conhecidas por causar lise de células 
hospedeiras e hemólise (Menestrina et al., 1990, Snijder et al., 2000; Songer et al. 
1997). Recentemente foi apresentado fosfolipases produzidas por vários protozoários 
parasitos como Naegleria fowleri (Barbour et al., 2001), Toxoplasma gondii (Cassaing 
et al., 2000), Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma brucei brucei (Shuaibu et 
al., 2001) e Trypanosoma cruzi (Wainszelbaum et al., 2001), e com a capacidade de 
causar danos ao tecido hospedeiro. Testes de inibição de fosfolipases em Plasmodium 
falciparum demostraram sua participação na lise de eritrócitos (Roggwiller et al., 1998). 
Frações subcelulares de T. vaginalis foram apresentadas por produzirem 
hemólise em eritrócitos de rato e humanos e tiveram sua atividade inibida pelo inibidor 
de fosfolipídios Rosenthal (Vargas-Villarreal et al., 2003). Esses trabalhos demonstram 
que fosfolipases estão relacionadas ao processo hemolítico e podem aumentar o 
processo inflamatório da tricomoníase com a lise de células epiteliais, além de 
demonstrar que o T. vaginalis pode causar efeitos citopatológicos sem a necessidade de 
contato com as células alvo. 
Petrin et al. (1998) resumem a hemólise provocada pelo T. vaginalis em um 
processo de três passos: i. Uma interação específica ligante-receptor entre o parasita e o 
 17
eritrócito; ii. Ligação de proteínas do tipo perforina (provavelmente cisteíno-proteases) 
que formariam poros nas membranas eritrocitárias, proteases com ação de “detergente” 
nos componentes da membrana, ou ainda peptídeos citolíticos; iii. Desligamento do 
parasita seguido da lise celular. 
De qualquer forma, a atividade hemolítica está correlacionada com a virulência 
(Krieger et al., 1983). Dailey et al. (1990) detectaram uma importante variação de 
atividade hemolítica entre isolados do parasita. 
A atividade hemolítica também foi estudada em Trichomonas tenax, parasita da 
cavidade bucal humana encontrado em pessoas sem higiene bucal ou com doenças 
periodontais, é isolado de glândulas submandibulares infectadas, fluidos pleurais ou 
fluidos broncoalveolares. Sua atividade hemolítica foi atribuída a dois tipos de 
hemolisina encontrados em frações livres de células: uma cisteíno-protease e um fator 
lipídico (Nagao et al., 2000). Contrariamente, foi demonstrado que Trichomonas 
gallinae, protozoário do trato digestivo superior de diferentes grupos de aves, 
especialmente columbiformes (pombos), provoca hemólise por um mecanismo 
dependente de contato (De Carli et al., 1996), análises de microscopia eletrônica 
revelam os parasitas fagocitando os eritrócitos (De Carli et al., 2000). T. gallinae possui 
uma atividade hemolítica de 91 a 96% contra eritrócitos humanos de todos os grupos 
sanguíneos, e são capazes de lisar eritrócitos de rato, galinha, cavalo, boi e ovelha. Não 
foi identificada nenhuma hemolisina neste parasita (De Carli et al., 2000). Por outro 
lado, foi observado em testes in vitro que o Tritrichomonas suis, parasita que ocorre na 
cavidade nasal, estômago, ceco, colon e ocasionalmente no intestino delgado de porcos 
domésticos, não provoca a hemólise de eritrócitos suínos e humanos (De Carli et al., 
1994). 
 
 18
1.5- A fisiologia do ferro 
 
 O elemento ferro participa em várias funções na fisiologia dos protozoários 
parasitas como metabolismo energético, síntese de DNA e RNA, detoxificação de 
radicais livres (Wilson & Britigan, 1998). 
 No Trichomonas vaginalis, além destas funções, o ferro: 
- Torna-se importantíssimo no metabolismo anaeróbico do parasita; 
- Aumenta sua virulência; 
- Aumenta a atividade de enzimas hidrogenossomais do parasito; 
- Afeta a taxa de crescimento; 
- Modifica a expressão de vias de adesinas podendo proporcionar a citoaderência; 
- Afeta a ligação de fibronectinas pelo parasita; 
- Modifica os perfis protéicos imunogêncos do parasita; 
- Induz a expressão de proteinases que especificamente degradam C3, removendo-as 
da superfície do parasita impedindo a ação efetora do complemento e de 
imunoglobulinas (Alderete et al., 1995). 
 A aquisição de ferro leva ao aumento da atividade enzimática do parasita 
(Peterson & Alderete,1984). O ferro é, na verdade, um regulador da expressão de vários 
genes, a regulação transcricional tem sido implicada como um dos maiores mecanismos 
reguladores na modulação da expressão de certos fenótipos de virulência do T. 
vaginalis, bem como mecanismos imunológicos, em resposta a mudanças na 
suplementação de ferro (Lehker et al., 1991). 
 A aquisição do ferro torna-se possível principalmente pela lise dos eritrócitos. 
Como já relatado, o eritrócito é uma fonte de nutrientes importante para a sobrevivência 
do parasita, considerando a vagina um micro-ambiente pobre em nutrientes para o 
 19
desenvolvimento de microrganismos (Cohen et al., 1984).A lise de eritrócitos deve ser 
um importante mecanismo para a nutrição do parasita. 
 Foi descrita a associação de várias proteínas do plasma do hospedeiro, 
incluindo proteínas com sítios de ligação ao ferro, com a superfície do T. vaginalis 
(Peterson & Alderete, 1984). Transferrina e Lactoferrina são duas proteínas, com alta 
afinidade para íons ferro (Aisen et al., 1980), que estão envolvidas no seqüestro de ferro 
das células hospedeiras. Transferrina é encontrada predominantemente no plasma, 
enquanto lactoferrina é produzida pela superfície de células da mucosa e encontrada no 
leite, semêm, secreções cervicais, grânulos leucocíticos polimorfonucleares (Masson et 
al., 1986). O acúmulo de ferro e o aumento na atividade destas enzimas estão 
associados com a ligação de íons ferro por receptores do T. vaginalis (Peterson & 
Alderete, 1984). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 20
2. HIPÓTESE E OBJETIVOS 
 
 
 Sabendo que a fisiologia do parasito e seus mecanismos patogênicos não 
foram bem elucidados, bem como não se tem conhecimento de quais genes 
especificamente regulam o metabolismo e controlam a virulência do parasito, o 
entendimento das vias metabólicas e de patogenicidade do Trichomonas vaginalis é um 
importante fato para o desenvolvimento de novas estratégias de intervenção química ou 
imunoprofilática. Além de existirem controvérsias no que diz respeito ao processo 
hemolítico do T. vaginalis, acreditamos que a hemólise e o papel do ferro no 
metabolismo do parasita seja uma via importante para caracterizar genes e proteínas que 
tenham posterior interesse como alvos de novas drogas e vacinas. Assim a hipótese 
deste trabalho é que existam diferentes genes envolvidos no processo hemolítico do 
parasito e que estes genes são diferentemente expressos quando o parasito está na 
presença ou na ausência de ferro. Desta forma, este trabalho tem como objetivo geral a 
identificação de genes candidatos à hemólise provocada pelo T. vaginalis utilizando 
como estratégia a construção de biblioteca de cDNA e a busca de genes hemolíticos 
baseados na função detectada in vitro em clones bacterianos. 
 
 Os objetivos específicos incluem: 
• Construção de biblioteca de cDNA. 
• Busca por transcritos correspondentes aos genes candidatos ao processo 
hemolítico por varredura funcional da biblioteca de cDNA. 
• Seqüenciamento dos clones e busca dos transcritos completos. 
 21
• Busca de similaridade, homologias, inferência de funções e estruturas em banco 
de dados. 
• Verificação da influência do ferro na regulação da transcrição dos genes 
candidatos por experimentos de hibridização em Northern blot. 
• Verificação do número de cópias dos genes identificados por experimentos de 
hibridização em Southern blot. 
• Análise in vitro do padrão hemolítico de diferentes isolados de T. vaginalis. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 22
3. MATERIAL E MÉTODOS 
 
3.1- Coleta do material biológico 
 
A coleta do material biológico foi realizada no serviço de Ginecologia dos 
Postos de Saúde da Região Norte do Distrito Federal, que perfizeram um total de 15 
postos. No período de março a dezembro de 2001, com coleta intensa e no período de 
março a dezembro de 2002 a estratégia utilizada foi a “abordagem” aos pacientes de 
retorno, cuja infecção já havia sido detectada. Além das coletas feitas nos postos, 
coletou-se urina proveniente do HRAN e do Hospital Dia. 
O material coletado pelo ginecologista constituiu-se de duas colheitas com suabe 
vaginal estéril, uma delas foi introduzida num tampão de extração (tabela 1) para a 
purificação do DNA e a outra inoculada em 2 mL de meio de cultura Diamond – TYM 
(tabela 2). 
 
Tampão de Extração 
Componentes 
TRIS pH 8,0 10 mM 
EDTA pH 8,0 0,1 M 
SDS 0,5% 
Temperatura de estocagem 15-30ºC 
Sambrook & Russel, 2001. 
 
 Tabela 1- Composição do tampão de extração de DNA a partir de suabes. 
 
 
 
 23
Meio Diamond (TYM) pH 6,2 
Componentes g/1000mL 
Triptone 22,2 
Extrato de Levedo 11,12 
Maltose 5,52 
L-Cisteína 1,10 
Ácido Ascórbico 0,22 
K2HPO4 0,88 
KH2PO4 0,88 
Temperatura de estocagem 4ºC 
Sambrook & Russel, 2001. 
 
 Tabela 2- Composição do meio Diamond para cultura de Trichomonas vaginalis. 
 
3.2- Cultura dos isolados 
 
 O parasito foi cultivado em meio Diamond – TYM (tabela 2) complementado 
com 10% de soro fetal bovino, 1000 U de penicillina-G e 1 mg de sulfato de 
estreptomicina por mL de meio, a 36 ºC por 7 dias (Diamond, 1986). O meio de cultura 
foi trocado diariamente, o crescimento em condições estéreis permitiu a axenização de 
vários isolados do parasita que foram utilizados no estudo. 
 Foram feitas três alíquotas de cada isolado. Em duas delas houve privação de 
ferro, preparando o meio com a adição de 50 μM de 2,2-Dipiridil (Sigma Chemical Co.) 
no primeiro dia e de 75 μM de 2,2-Dipiridil depois de 24 horas, a partir de uma solução 
estoque na concentração de 10 mM. Em apenas uma das alíquotas sem o ferro, depois 
de 48 horas da adição de Dipiridil, o meio de cultura foi suplementado com solução de 
sulfato de amônio ferroso na concentração final de 250 μM, a partir da solução estoque 
 24
100X de sulfato de amônio ferroso com 5 mM de ácido sulfosalicílico (Crouch & 
Alderete, 2001; Alderete, 1999). E a terceira alíquota permaneceu com soro fetal 
bovino. 
 A estocagem dos parasitas foi feita no próprio meio de cultura com soro fetal 
bovino acrescentado de 10% de DMSO e imediatamente congelandos a -80 °C, 
temperatura em que são mantidos. 
 
3.3 - Extração de RNA 
 
Ao alcançar aproximadamente 106-107 parasitas por mL realizou-se a extração 
do RNA do parasito. O RNA total foi extraído das três alíquotas com a utilização do 
Tiocianato de Guanidina – TRIZOL (Invitrogen – cat. nº 15596-026). As células em 
suspensão foram centrifugadas e o sobrenadante desprezado e então lisadas com 1 mL 
TRIZOL para cada 5-10 × 106 células com repetidas pipetagens. 
Fase de separação - As amostras homogenizadas foram incubadas por 5 min de 
15 a 30°C para a completa dissociação de complexos protéicos. Adicionados 0.2 mL de 
clorofórmio para cada 1 mL de TRIZOL, agitados rapidamente por 15 seg. e foram 
incubadas a temperatura ambiente por 2 a 3 min. As amostras foram centrifugadas a 
12000 x g por 15 min. a 4 °C. Após a centrifugação pode-se observar uma fase 
vermelha correspondente ao fenol / clorofórmio, uma fase intermediária com proteínas, 
e uma fase aquosa superior, onde permanece o RNA. 
Precipitação do RNA – A fase aquosa foi transferida para um novo tubo de 
2mL e adicionado 1 mL isopropanol e as amostras incubadas a temperatura ambiente 
por 10 min. e foram centrifugadas a 12000 x g por 10 minutes a 4 ºC. O RNA 
precipitado é freqüentemente visível após a centrifugação em um pellet. 
 25
Lavagem do RNA – O sobrenadante foi removido e o pellet lavado com 1 mL 
de etanol 75% e centrifugado a 10000 x g por 5 min. 4 °C e o sobrenadante descartado. 
Ressuspensão do RNA – Depois do pellet de RNA estar completamente seco 
foi completamente dissolvido com 100 μL de H2O tratada com Dietil Pirocarboneto 
(DEPC) 0,1% e armazenado a -80 ºC. 
 Todo o material utilizados na extração do RNA e H2O-DEPC foram 
preparados previamente com uma solução de 0,1% de DEPC e autoclavados após 24 
horas para eliminação de RNAse. 
 Ao final das extrações, obteve-se três amostras de RNA do parasito, quando 
crescido na presença de ferro, quando crescido na ausência de ferro e uma terceira 
amostra de parasitos crescidos em meio suplementado somente com soro fetal bovino. 
 
3.4 – Análise e quantificação do RNA total 
 
 A qualidade do RNA total extraído foi analisada em gel de agarose 
desnaturante, observando-se duas bandas correspondentes ao RNA ribossomal e rastro 
correspondente aos RNAs transportador e mensageiro. A quantificação do RNA total 
foifeita em espectofotômetro GeneQuant pro DNA/RNA Calculator (Amersham 
Pharmacia) com OD – 260-280 nm. (Sambrook et al., 1989). 
 
 3.4.1 - Gel desnaturante para RNA (100 mL) 
 
1 g de agarose foi dissolvida em 70 mL de H2O/DEPC 0,1% aquecida e 
adicionados 10 mL de MOPs 10X (tabela 3) e 20 mL de formaldeído, misturados e 
incubados por aproximadamente 1 h para solidificar. 
 26
 
 
 
 
 
 
 
 Tabela 3- Composição do tampão MOPs 10X , para uso com RNA em geral. 
 
Desnaturação dos RNAs 
Para cada 1 μL de RNA diluído em 9 μL de H2O/DEPC 0,1% foi adicionado 1 
μL de MOPs 10X, 3,5 μL de formaldeído e 10 uL de formamida. As amostras foram 
desnaturadas a 65 ºC por 10 min. e colocadas imediatamente no gelo. Foram 
adicionados 2 μL de tampão de carregamento 10X e 0,25 μL de brometo de etídeo (10 
mg/mL) (RNAse Free) e mantidos sempre no gelo. 
 
3.5 - Purificação de mRNA 
 
A purificação do mRNA foi feito com a utilização de colunas de oligo-dT 
(Amersham Pharmacia). 
 
Preparo das colunas Celulose-Oligo-dT 
As colunas de Celulose-Oligo-dT foram misturadas por inversão várias vezes, 
tiveram seus lacres superiores e inferiores removidos e foram acopladas em um suporte 
suspensas e secas sob ação da gravidade. Foi adicionado no topo de cada coluna 1 mL 
MOPs 10X 
Componentes g/100 mL 
(0,2M) MOPs 4,185 
(20mM) Acetato de sódio 0,164 
(10mM) EDTA 0,372 
Temperatura de estocagem 15-30ºC 
Sambrook & Russel, 2001. 
 27
de tampão com alta concentração de sal e a coluna foi novamente seca, então foram 
adicionados mais 1 mL do mesmo tampão. As colunas preparadas foram adaptadas em 
tubos de 15 mL. 
 O RNA total foi dissolvido em 1 mL de tampão de eluição (tabela 7) aquecido a 
65 ºC por 5 min. e imediatamente colocados no gelo, foi adicionado 0.2 mL de tampão 
de amostra e gentilmente misturados. Ao topo de cada coluna foi adicionado 1,25 mg de 
RNA total com o intuito de se recuperar aproximadamente 25 μg de mRNA, assumindo 
que 2% do RNA total é poliadenilado. As colunas foram centrifugadas a 2000 x g por 2 
min., adicionados 0,25 mL de tampão com alta concentração de sal (tabela 4) e 
centrifugadas a 2000 x g por 2 min. Essa lavagem é repetida com o mesmo tampão e as 
colunas centrifugadas novamente. Usando os mesmos padrões de centrifugação, as 
colunas foram lavadas três vezes com alíquotas de 0,25 mL de tampão com baixa 
concentração de sal (tabela 5). O tampão coletado foi descartado e acoplado dentro do 
tubo de 15 mL, um tubo de 2 mL. Para a eluição do mRNA, as colunas foram lavadas 
quatro vezes com alíquotas de 0,25 mL de tampão de eluição (tabela 7) pré-aquecido a 
65 ºC e centrifugadas a 2000 x g por 2 min. depois de cada aplicação. O material 
recuperado foi colocado no gelo, adicionado 0,2 mL de tampão de amostra (tabela 6) 
gelado e então aplicado em uma segunda coluna nova de Celulose-Oligo-dT e todo o 
processo repetido. 
Ao mRNA recuperado foi adicionado 100 μl de tampão de amostra (tabela 6), 10 
μl de solução de glicogênio ( 5-10 mg/mL) e 2,5 mL de etanol gelado, a amostra foi 
misturada e incubada a -20 °C por duas horas, o mRNA foi precipitado por 
centrifugação a 4 ºC por 10 min. (12000 x g), o sobrenadante foi descartado e o pellet 
ressuspendido em H2O/DEPC e então estocado a –80 °C. 
 28
Tampão com alta concentração de sal 
Componentes 
TRIS-HCl pH 7,4 10 mM 
EDTA 1 mM 
NaCl 0,5 M 
Temperatura de estocagem 4 ºC 
Okayama, et al. 1987; Sambrook, et al. 1989. 
 
 Tabela 4- Composição do tampão com alta concentração de sal 
utilizado para a purificação de mRNA. 
 
Tampão com baixa concentração de sal 
Componentes 
TRIS-HCl pH 7,4 10 mM 
EDTA 1 mM 
NaCl 0,1 M 
Temperatura de estocagem 4 ºC 
Okayama, et al. 1987; Sambrook, et al. 1989. 
 
 Tabela 5- Composição do tampão com baixa concentração de sal 
utilizado para a purificação de mRNA. 
 
Tampão de amostra 
Componentes 
TRIS-HCl pH 7,4 10 mM 
EDTA 1 mM 
NaCl 3 M 
Temperatura de estocagem 4 ºC 
Okayama, et al. 1987; Sambrook, et al. 1989. 
 
 Tabela 6- Composição do tampão de amostra para a purificação de 
mRNA. 
 
 
 
 
 29
Tampão de eluição 
Componentes 
TRIS-HCl pH 7,4 10 mM 
EDTA 1 mM 
Temperatura de estocagem 4 ºC 
Okayama, et al. 1987; Sambrook, et al. 1989. 
 
 Tabela 7- Composição do tampão de eluição para a purificação de 
mRNA. 
 
 
3.6- Síntese das Bibliotecas de cDNA 
 
 Frações de mRNA purificado foram utilizadas para a construção de duas 
bibliotecas de cDNA desenvolvidas a partir de transcritos completos corretamente 
orientados para a expressão transiente em linhagem específica de Escherichia coli sobre 
o controle do promotor lac. Uma biblioteca foi clonada em bacteriófago λ TriplEx 2 
(Clontech) e a outra em plasmídeo pSport 1 (Invitrogene). 
 
3.6.1 – Bacteriófago λ TriplEx 2 
 
 Para a construção da biblioteca de cDNA clonada em bacteriófago λ TriplEx 2, o 
cDNA foi sintetizado utilizando um protocolo baseado em PCR para gerar cDNAs de 
tamanhos completos, de acordo com o kit SMARTTM cDNA Library Construction Kit 
(Clontech). Um oligonucleotídeo (dT) modificado inicia a reação de síntese de primeira 
fita e o oligonucleotídeo SMART serve como um curto molde para estender a região 5’ 
do mRNA. Observe na figura abaixo, após a enzima transcriptase reversa estender a 
 30
região 5’, a atividade terminal transferase da enzima adiciona uns poucos nucleotídeos, 
desoxicitidinas na região 3’ do cDNA. O oligonucleotídeo SMART, que possui uma 
seqüência oligo G em seu terminal 3’, anela com as desoxicitidinas adicionadas, criando 
um molde estendido para a enzima que continua amplificando o final do 
oligonucleotídeo, resultando em cDNAs com completo terminal 5’ e a seqüência 
complementar do oligonucleotídeo SMART, que funciona como um oligonucleotídeo 
ancora para futuras amplificações. 
 
 
 
 
Figura 4: Passos para a síntese de cDNA com base em PCR e clonagem no 
Bacteriófago λ TriplEx 2. 
 
 31
 3.6. 1.1 - Síntese da primeira fita de cDNA 
 
 Os seguintes reagentes foram combinados em um tubo de 0,2 mL: 3 μL de 
mRNA (3 μg de mRNA), 1 μL de SMART oligonucleotídeo (10 μM) (5’-
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG -3’) e 1 μL PCR 
Primer (10μM) (5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N_1N -3’, N = 
A, G, C ou T; N_1 = A, G ou C), incubados a 72 ºC por 2 min. e colocados 
imediatamente no gelo. Foram adicionados os seguintes reagentes: 
 2 μL Tampão de primeira fita 5X (250 mM TRIS – pH 8.3, 30 mM MgCl2, 375mM KCl) 
 1 μL DDT (dithiothreitol; 20 mM) 
 1 μL dNTP Mix (10mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 
 1 μL PowerScript Reverse Transcriptase 
 A reação foi incubada a 42 °C por 1 hora e a colocada no gelo para o término da 
síntese da primeira fita de cDNA. 
 
 3.6.1.2 - Amplificação do cDNA por LD-PCR ( Longa distância) 
 
 Foram combinados os seguintes componentes na reação, num volume final de 
100 μL: 
 2 μL Primeira fita de cDNA 
 80 μL H2O destilada 
 10 μL Tampão 10X “Advantage” 2 PCR (50 % Glycerol, 15 mM Tris-HCl (pH 8.0), 
75 mM KCl, 0.05 mM EDTA) 
 2 μL dNTP Mix 50X 
 2 μL PCR Primer (10μM) (5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N_1N 
-3’, N = A, G, C ou T; N_1 = A, G ou C) 
 32
 2 μL 50X “Advantage” 2 Polimerase Mix 
 
A amostra foi submetida ao seguinte programa no termociclador GeneAmp PCR 
Systems 9700 (Applied Biosystems) : 
 
 
95 °C – 2 min – 95 °C – 15 seg 68 °C – 6 min 
 
 
 3.6.1.3 - Digestão com Proteinase K 
 
 Foi adicionado a 50 μL de cDNA amplificado (2 μg) e 2 μL de proteinase K (20 
μg/μL), misturado e incubado a 45 °C por 20 min.. Adicionados 50 μL de H2O 
deionizada e foi acrescido 100 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico nas seguintes 
proporções - 25:24:1. A reação foi misturada continuamente por 2 min. e foi 
centrifugada a 12000 x g por 5 min. para a separaçãodas fases. Apenas a fase aquosa 
foi transferida para outro tubo e adicionados 10 μL de acetato de sódio, 1,3 μL de 
glicogênio (20 μg/μL) e 260 μL de etanol 95% em temperatura ambiente, e 
imediatamente centrifugado a 12000 x g por 20 min. em temperatura ambiente. O 
sobrenadante foi descartado e o pellet lavado com etanol 80%, e ressuspendido com 79 
μL de H2O deionizada. 
 
 3.6.1.4 - Digestão com Sfi I 
Ao cDNA ressuspendido com H2O, foi adicionado e misturados 10 μL de 
tampão Sfi I 10X, 10 μL enzima Sfi I (20 unidades/μl) e 1 μL de BSA 100X. A reação 
24 X
 33
foi incubada a 50 °C por 2 horas. E adicionados 100 μL de fenol: clorofórmio: álcool 
isoamílico nas seguintes proporções - 25:24:1. A reação foi misturada continuamente 
por 2 min. e foi centrifugada a 12000 x g por 5 min.. À fase aquosa foi adicionado 10 
μL de acetato de sódio 7,5 M e 260 μL de etanol 95% em temperatura gelado, e 
imediatamente centrifugado a 12000 x g por 10 min. O sobrenadante foi descartado, o 
pellet lavado com etanol 80% e seco. 
 
3.6.1.5 - Cromatografia por exclusão molecular 
 
Para diminuir a variação de tamanhos entre os cDNA sintetizados e retirar 
fragmentos Sfi, o cDNA sintetizado foi ressuspendido com 100 μL de tampão TEN (10 
mM Tris-HCl – pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 25 mM NaCl) e mantido no gelo. 
A coluna de cromatografia cDNA Size Fractionation Columns (Invitrogen) foi 
misturada por inversão várias vezes, seus lacres superiores e inferiores foram removidos 
e a coluna foi acoplada em um suporte suspenso e retirada a solução sob ação da 
gravidade. Foi adicionado 0,8 mL de tampão TEN no topo da coluna e esperado que ela 
secasse completamente, este processo foi repetido mais três vezes. O cDNA foi 
colocado ao topo da coluna, o efluente coletado no tubo 1 e adicionado 100 μL de 
tampão TEN na coluna, o efluente foi coletado no tubo 2. Adicionando novamente 
subseqüentes alíquotas de 100 μL de tampão TEN, foi coletado uma única gota em 
cada tubo, até o vigésimo tubo. 
Usando uma pipeta, o volume de cada tubo foi medido e anotado, e então 
calculado o volume acumulado eluído. Foram selecionadas as seis ultimas alíquotas que 
antecedem o volume acumulado de 550 μL e unidas em um tubo e seu volume 
 34
mensurado. Foi adicionado 5 μL de tRNA de levedura e 0,5 volumes de NH4OAc 10 M, 
seguindo por 2 volumes de etanol absoluto gelado e imediatamente centrifugado a 
12000 x g por 20 min.. O sobrenadante foi removido e o pellet lavado com etanol 70% 
gelado. centrifugado por 2 min. a 12000 x g e o sobrenadante removido. O pellet seco 
foi dissolvido em 10 uL de tampão TEN. 
 
3.6.1.6 - Ligação do cDNA no vetor λTriplEx2 
 
 
 ....GGCCNNNNNGGCC.... 
 ....CCGGNNNNNCCGG.... 
 
 
 
 
Figura 5: (A) Seqüência do sítio de restrição da enzima Sfi I. (B) Sítio de ligação 
assimétricos formados pela digestão com Sfi I do vetor λTriplEx 2 
 
 
O vetor λTriplEx 2 possui sítios de ligação assimétricos formados pela digestão 
com Sfi I (A & B, figura 5), coincidentes com os terminais 5’ e 3’ do cDNA 
respectivamente, o que permite a clonagem direcional dos cDNAs. O cDNA sintetizado 
e purificado foi ligado no vetor combinando os seguintes reagentes, para um volume 
final de 50 μL: 
A 
B 
 35
 1 μL cDNA 
 1 μL Vetor λTriplEx2 (Sfi A e B – 0,5 ug/ ul) 
0,5 μL Tampão de ligação (500mM Tris-HCl – pH 7.8, 100mMMgCl2, 100mM DTT, 
0,5mg/mL BSA) 
0,5 μL ATP (10 mM) 
0,5 μL T4 DNA Ligase (400 unidades/ ul ) 
1,5 μL H2O deionizada 
A reação foi incubada a 16 °C por 12 horas. 
 
3.6.1.7 - Empacotamento do vetor 
 
Foi utilizado para o empacotamento o extrato Gigapack III XL (Stratagene). O 
extrato foi estocado a -80 °C e imediatamente após a retirada de uma alíquota foi 
adicionado 2 μL de cDNA ligado ao vetor (0,5 μg) ao extrato. A reação foi misturada e 
incubada a 22 °C por 2 horas, logo adicionados 500 μl de tampão SM (tabela 8) e 20 μL 
de clorofórmio, o tubo foi agitado e centrifugado, o sobrenadante contem os fagos de 
interesse. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Tabela 8- Composição do tampão SM para empacotamento e 
amplificação da biblioteca de cDNA clonada em bacteriófago. 
 
Tampão SM 
Componentes g/1000 mL 
NaCl 5,8 
MgSO4.7H2O 2,0 
1 M Tris – HCL pH 7,5 50 mL 
2% Gelatina 5 mL 
Temperatura de estocagem 4 ºC 
Sambrook & Russel, 2001. 
 36
 
3.6.1.8 - Preparo da bactéria hospedeira 
 
A linhagem XL1-blue de Escherichia coli foi crescida em placa com LB-ágar / 
tetraciclina (10 mg/mL) (tabela 9) a 37 °C e inoculada em 50 mL de meio LB (tabela 
10) suplementado com 0,2% de maltose e 10mM de MgSO4. A cultura foi incubada 
com agitação de 240 x g a 37 °C até atingir OD600 = 1,0, medida em espectofotômetro 
Ultrospec 310 pro (Amersham Phermacia), e centrifugada a 4000 x g por 10 min. O 
sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido em 25 mL de MgSO4 10 mM 
estéril e estocado a 4 °C. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 9 - Composição do meio LB-ágar / tetraciclina para 
cultivo de bactérias. 
 
Meio LB-ágar / tetraciclina 
Componentes g/1000 mL 
NaCl 10 
Triptona 10 
Extrato de Levedo 5 
Ágar 15 
Tetraciclina (10mg/mL) 1.5 mL 
Temperatura de estocagem 15-30°C 
Sambrook & Russel, 2001. 
 37
 
 
 
 
 
 
Tabela 10 - Composição do meio LB para cultivo de bactérias. 
 
3.6.1.9 - Plaqueamento da biblioteca de cDNA 
 
 As células preparadas com MgSO4 10 mM estéril foram diluídas para OD600 = 
0,5 e adicionados 1 μL da reação final empacotada para cada alíquota de 200 μL de 
XL1-Blue. Os inóculos foram incubados a 37ºC por 15 min. e adicionados a cada 
alíquota 3 mL de NZY Top-ágar (tabela 11) a 48°C, rapidamente vertidos em placas de 
petri com meio NZY-ágar (tabela 12) e incubados por 10 horas a 37ºC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 11- Composição do meio NZY Top-ágar para plaqueamento 
da biblioteca de cDNA. 
 
Meio LB – pH 7.0 
Componentes g/1000 mL 
NaCl 10 
Triptona 10 
Extrato de Levedo 5 
Temperatura de estocagem 15-30°C 
Sambrook & Russel, 2001. 
Meio NZY Top-ágar - pH 7.5 
Componentes g/1000 mL 
NaCl 5 
MgSO4.7H2O 2 
Extrato de Levedo 5 
Cazeina Hidrolizada 10 
Agar 7 
Temperatura de estocagem 15-30°C 
Sambrook & Russel, 2001. 
 38
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Tabela 12- Composição do meio NZY-ágar para plaqueamento da 
biblioteca de cDNA. 
 
 
3.6.1.10 - Amplificação da Biblioteca de cDNA 
 
Com os plaques visíveis, foi adicionado as placas sobre o NZY Top-ágar 5 mL 
de tampão SM e incubados a 4 °C com leve agitação, para que os fagos se difundissem 
no tampão SM. Após 24 horas de incubação o tampão SM com os fagos foi recolhido e 
adicionado clorofórmio na concentração final de 5%. Misturado, incubados por 15 min. 
em temperatura ambiente e centrifugados a 2000 x g por 10 min. Os resíduos foram 
removidos e ao sobrenadante foi adicionado 7% de DMSO. Foram feitas alíquotas de 2 
mL e estocados a -80 °C. 
 
 
3.6.2 – Plasmídeo pSport 1 
 
Meio NZY-ágar - pH 7.5 
Componentes g/1000 mL 
NaCl 5 
MgSO4.7H2O 2 
Extrato de Levedo 5 
Cazeina Hidrolizada 10 
Ágar 15 
Temperatura de estocagem 15-30°C 
Sambrook & Russel, 2001. 
 39
Para a construção da biblioteca de cDNA clonada em plasmídeo pSport 1, o 
cDNA foi sintetizado utilizando o kit SuperScript Plasmid System with GatewayTM 
Technology for cDNA Synthesis and Cloning (Invitrogen), seguindo os passos 
apresentados na figura abaixo: 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6- Passos da síntese de cDNA para biblioteca clonada em plasmídeo pSport 1. 
 
3.6.2.1 - Síntese da primeira fita 
 
2 μL do adaptador iniciador Not I (0,5 μg/μl) (5’- GACTAGTTCTAGATCGCG 
 40
AGCGGCCGCCC -3’) foi misturado em um tubo de 0,2 mL com 5 uL de mRNA (5 
μg) obtidos como descrito no item 5.5, e incubados a 70 °C por 10 min. para a 
desnaturaçãodo RNA. Após a incubação os seguintes reagentes foram combinados no 
mesmo tubo: 
 4 μL Tampão de primeira fita 5X (250 mM Tris-HCl – pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM 
Mgcl2) 
 2 μL 0.1 M DTT 
 1 μL dNTP Mix (10mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 
 1 μL H2O 
 5 μL SuperScript II Transcriptase Reversa (200 unidades / μl) 
 A reação foi incubada por 1 hora a 37 °C e a síntese da segunda fita continuou 
imediatamente após o intervalo de incubação. 
 
 
 3.6.2.2 - Síntese da segunda fita 
 
 A reação foi mantida no gelo e adicionados os regentes na seguinte ordem, para 
um volume final de 150 μl: 
 91 μL H2O-DEPC 
 30 μL Tampão de segunda fita 5X (100 mM Tris-HCl – pH 6.9, 450 mM KCl, 23mM 
MgCl2, 0.75 mM β-NAD+, 50 mM (NH4)2SO4) 
 3 μL dNTP Mix (10mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 
 1 μL E. coli DNA Ligase (10 unidades / μl) 
 4 μL E. coli DNA Polimerase I (10 unidades / μl) 
 41
 1 μL E. coli RNase H (2 unidades / μl) 
 A reação foi incubada por 2 horas a 16°C e adicionados 2 μL de T4 DNA 
polimerase (10 unidades / μl), a incubação foi prolongada por mais 5 min.. Seguindo com a 
reação para o gelo e adicionando 10 μL de 0,5 M de EDTA. Os resíduos de reagentes 
foram retirados adicionando Fenol: clorofórmio: Álcool isoamílico (25:24:1), 
misturados e centrifugados a 12000 x g por 5 min. para separação das fases. A fase 
aquosa contendo o cDNA foi removido para o um novo tubo, adicionados 70 μl de 
7,5M de NH4OAc e 0,5 mL de etanol absoluto gelado, a reação foi misturada e 
imediatamente centrifugada em temperatura ambiente por 20 min. a 12000 x g. O 
sobrenadante foi removido e o pellet lavado com 0,5 mL de etanol 70% gelado. 
 
 3.6.2.3 - Ligação dos adaptadores Sal I 
 
 Os adaptadores são oligômeros duplos curtos com uma terminação 5’ de 4 bases 
que compõem o sítio de restrição Sal I, auxiliam na clonagem direcional do cDNA e 
com apenas um de seus oligômeros fosforilados permite a eliminação de auto ligação 
dos adaptadores durante a ligação do cDNA, são constituídos da seguinte seqüência,: 
 5’- TCGACCCACGCGTCCG – 3’ 
 3’- GGGTGCGCAGGC – 5’ 
 
 O cDNA sintetizado foi ligado aos adaptadores adicionando os seguintes 
reagentes e incubado a 16°C por 16 horas. 
 25 μl H2O-DEPC 
 10 μl Tampão T4 DNA Ligase 5X (250 mM Tris-HCl – pH 7.6, 50 mM MgCl2, 5 mM 
DTT, 25% PEG 8000) 
 42
 10 μl Adaptadores Sal I (1 μg / μl) 
 5 μl T4 DNA Ligase (1 unidade / μl) 
Os resíduos de reagentes foram retirados adicionando Fenol: Clorofórmio: 
Álcool isoamílico (25:24:1), misturados e centrifugados a 12000 x g por 5 min. para 
separação das fases. A fase aquosa contendo o cDNA foi removido para o um novo 
tubo, adicionados 70 μl de 7,5M de NH4OAc e 0,5 mL de etanol absoluto gelado, a 
reação foi misturada e imediatamente centrifugada em temperatura ambiente por 20 
min. a 12000 x g. O sobrenadante foi removido e o pellet seco após ter sido lavado com 
0.5 mL de etanol 70% gelado. 
 
3.6.2.4 - Digestão com Not I 
 
O pellet foi dissolvido com 41 μl de H2O-DEPC e adicionados 5 μl de tampão 
REact 3 (Invitrogen) e 4 μL de enzima Not I (15 unidades/μl) e incubados por 2 horas a 
37°C. Os resíduos da digestão foram retirados com o mesmo procedimento descrito 
acima após a ligação dos adaptadores. 
Para retirar resíduos de adaptadores, fragmentos Not I e diminuir a variação de 
tamanhos entre os cDNA sintetizados, O cDNA sintetizado foi dissolvido com 100 μL 
de tampão TEN (10 mM Tris-HCl – pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 25 mM NaCl), mantido no gelo e 
purificado em coluna de cromatografia cDNA Size Fractionation Columns (Invitrogen) 
exatamente como descrito no item 3.6.1.5. 
 
 
 
 43
 3.6.2.5 - Ligação do cDNA no vetor Psport 1 
 
O vetor pSPORT 1 pode ser usado para expressar os genes clonados pela 
indução do promotor lac, o vetor contém um única cópia do gene repressor lac. A 
transcrição dos insertos pelo promotor é efetivamente reprimida, a menos que o 
promotor seja induzido por 1mM de IPTG (Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo), a 
seqüência lacOPZ’ presente no vetor permite a seleção de clones positivos com análise 
branco / azul das colônias. Além de possuir uma região com múltiplos sítios de restrição 
presentes nas extremidades 5’ e 3’ do inserto que flexibilidade na digestão unidirecional 
do DNA (figura 7). 
 
 
 
 
 44
 
 
 Figura 7 – Mapa do plasmídeo pSport 1 e região com múltiplos sítio de restrição 
flanqueando o inserto. 
 
 
O cDNA com as extremidades Sal I e Not I foram ligados ao pSport 1 
combinando os seguintes reagentes, adicionado 1 μL de T4 DNA Ligase e incubando 
por 3 horas em temperatura ambiente. 
 4 μl Tampão T4 DNA Ligase 5X (250 mM Tris-HCl – pH 7.6, 50 mM MgCl2, 5 mM 
DTT, 25% PEG 8000) 
 1 μl Vetor pSPORT 1 (50 ng/μl) 
 1 μl cDNA (10ng) 
13 μl H2O-DEPC 
 
3.6.2.6 - Transformação de bactérias E.coli com cDNA por eletroporação e 
análise de eficiência 
 
Para a realização deste procedimento, fez-se o uso de células de E. coli cepa 
DH5α competentes para eletroporação. Estas células foram previamente preparadas 
seguindo o protocolo de Sambook & Russel (2001) e estocadas a -80°C. A ligação foi 
dialisada em membrana de nitrocelulose 0,025μm, 13 mm (Millipore) por 15 min. 
 45
As condições de eletroporação foram: capacitância de 25 μF; resistência de 
200Ω; voltagem de 1.80 KV. O eletroporador utilizado foi Bio-Rad Gene Pulser II. Foi 
aliquotado 1 μl do cDNA ligado no vetor em um microtubo de 1,5 mL que continha 40 
μl de células DH5α eletro-competentes, foi incubado no gelo por 5 min. e então 
tranferido para uma curveta específica para eletroporação, Gene Pulser Curvette (Bio-
Rad). A mensuração da corrente elétrica foi anotada. Em seguida foi adicionado a 
curveta 1 mL de meio de cultura SOC (tabela 13), misturado delicadamente e 
transferido para um microtubo estéril. O tubo contendo o meio SOC (tabela 13) e 
células foi incubado com agitação de 240 x g por 1 hora a 37°C. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 13- Composição do meio SOC utilizado para o crescimento 
de bactérias. 
 
 
Meio SOC 
Componentes g/1000 mL 
NaCl 0,5 
Triptona 2 
Extrato de Levedo 5 
KCl 250 mM 10 mL 
MgCl2 2M 5 mL 
Glicose 1M 20 mL 
O Cloreto de potássio deve ser adicionado após os três primeiros 
componentes terem sido dissolvidos, o cloreto de magnésio 2M e a 
glicose devem ser adicionados somente após a autoclavagem e estes 
esterilizados por filtragem. 
Temperatura de estocagem 4°C 
Sambrook & Russel, 2001. 
 46
Enquanto transcorria o intervalo de incubação, placas de Petri contendo meio 
LB-ágar com ampicilina (100 mg/mL) foram preparadas. Em uma delas foi aplicado 40 
μl de X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-B-D-Galactoside) a 20 mg/mL e 10 μl de 
IPTG (Isopropylthio-B-D-Galactoside) a 200 mg/mL, sendo estes distribuídos no meio 
sólido com auxílio de uma laça de Drigalski e secos. 
Depois da incubação, o meio contendo as células transformadas foi aliquotado, 
em cada placa foi aplicados 50 μL e distribuídos por toda a placa com alça de Drigalski. 
As placas foram mantidas vertidas em estufa a 37° por 12 horas. Este processo foi 
repetido várias vezes, até se obter um total de 100.000 colônias bacterianas. 
Devido a aplicação de IPTG e X-Gal na placa, pôde-se realizar uma análise das 
colônias bacterianas recombinantes, ou seja, possuidoras do inserto de interesse, e assim 
mensurar a eficiência da ligação e transformação. Neste estágio, as colônias bacterianas 
foram analisadas de acordo com sua coloração. Colônias azuis são as que não contêm 
recombinantes ligados e, portanto possuem plasmídeos intactos e que expressam β-
galactosidade ativa (Sambrook & Russell, 2001). Diferentemente, colônias de coloração 
branca são recombinantes, possuindo plasmídeos portadores de insertos. 
 
3.7 - Varredura da Biblioteca de cDNA 
 
Foram realizadas varredurasfuncionais sobre as bibliotecas clonadas em 
bacteriófago λ Triplex 2 e em plasmídeo pSPORT 1, com a utilização de 5 mL uma 
camada constituída de 1,5% de ágar, 5% de hemácias previamente preparadas (item 
3.7.1) e 5 mM de IPTG por placa. Sobre as placas que continham células bacterianas 
infectadas com bacteriófagos, a camada foi adicionada no momento que os placas de 
lise começavam a crescer, aproximadamente entre 9 - 10 horas de incubação a 37°C. A 
 47
mesma camada foi aplicada sobre 105 clones bacterianos oriundos da biblioteca clonada 
em plasmídeo, adicionada depois de aproximadamente 12 horas de incubação a 37º C. 
As placas foram incubadas por mais 6 horas a 37oC, seguindo da incubação facultativa a 
4oC for 16 horas. Os halos claros de hemólise foram observados no intervalo entre a 
retirada da estufa e a incubação à 4ºC. 
 As colônias bactérianas recombinantes circundadas por estes halos 
correspondem aos clones que possuem e expressam genes com atividade hemolítica do 
parasito. Estes serão escolhidos para segunda e terceira análise funcional. Os clones 
recombinantes com origem na biblioteca clonada em bacteriófago, após in vivo-
excision, podem ter seus insertos transferido para o plasmídeo pTriplex 2 (SMARTTM 
cDNA Library Construction) e expandidos para extração do DNA plasmidial 
(Sambrook et al., 1989). 
 Após confirmação da atividade hemolítica em placa, os clones selecionados 
foram inoculados em 5 mL de meio LB (tabela 10) com ampicilina (100mg/mL) para 
miniprep ou alternativamente em 200 mL do mesmo meio para realização de maxiprep 
e incubados a 37 °C sob agitação de 240 x g por 12 horas. 
 
 3.7.1 – Preparo das hemácias 
 
 Para a realização da varredura funcional dos clones hemolíticos foi necessário 
preparar previamente as hemácias utilizadas na camada agar/hemácia/IPTG. Para tanto, 
50 mL de sangue humano fresco tipo O Rh+ foi desfibrinado com auxílio de pérolas de 
vidro em constante agitação em um erlenmeyer estéril com tampa, foi adicionado 100 
mL solução salina gelada (NaCl 0,9%) e centrifugado a 4000 x g por 10 min. em 
centrífuga refrigerada a 4 °C. A fase superior aquosa foi desprezada e a massa de 
 48
hemácias presentes no fundo dos tubos foi lavada com solução salina mais 4 vezes. As 
hemácias foram estocadas a 4 °C por um intervalo máximo de 5 dias e o processo 
repetido de acordo com a demanda de hemácias. 
 
3.8 – Extração de DNA Plasmidial 
 
 Com o intuito de isolar das células bacterianas transformadas os plasmídeos 
portadores dos insertos de interesse, realizou-se purificação dos inóculos de 5 mL 
mencionados acima utilizando o kit Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification 
System (Promega). 
 
 3.8.1 – Maxiprep 
 
 Para se obter maiores quantidades dos plasmídeos de interesse foram feitas 
maxiprep de acordo com Sambrook & Maniats (1989) com as seguintes modificações: 
 - Os 200 mL de inóculo de cada clone foram centrifugado a 4000 x g por 15 
min.; 
 - O sobrenadante desprezado, o pellet ressuspendido em 5 mL de GTE (tabela 
13); 
 - Adicionados 8 mL de solução II (NaOH / SDS) (tabela 14) e incubado por 10 
min. em temperatura ambiente. Sobre a reação foi adicionado 6 mL de KOAc 3M 
(tabela 15) e incubado por 10 min. no gelo; 
 - Centrifugado por 20 min. a 4000 x g em centrífuga refrigerada a 4ºC e 
filtrado; 
 49
 - A solução aquosa foi adicionado 0,6 volumes de isopropanol e incubados por 
10 min. em temperatura ambiente; 
 - Centrifugado por 15 min. a 4000 x g, o sobrenadante foi desprezado e o 
pellet seco após ter sido lavado com etanol 70%; 
 - O pellet foi dissolvido em 1,5 mL de TE (pH8.0) e adicionado a ele 1,5 mL 
de cloreto de lítio gelado e centrifugado por 10 min. a 4000 x g a 4 °C; 
 - O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, adicionados 1 volume de 
isopropanol e centrifugado por 10 min. a 10000 x g em temperatura ambiente; 
 - O pellet foi lavado em etanol 70% e depois de seco dissolvido em 500 μL de 
TE, adicionado 1 μL de RNase e incubado por 30 min. em temperatura ambiente; 
 - Após incubação foi adicionado 500 μL de 13% PEG/1,6M NaCl, misturados 
e centrifugados por 20 min. a 12000 x g a 4 °C; 
 - O pellet seco foi novamente dissolvido em TE e feita uma extração fenol / 
clorofórmio / álcool isoamílico (25:24:1), a fase aquosa foi adicionado 100 μL de 
acetato de amônio 10M e 2 volumes de etanol absoluto gelado; 
 - A reação foi incubada a -80 °C por 20 min., centrifugada a 12000 x g por 20 
min.; 
 - O sobrenadante foi desprezado e o pellet lavado com etanol 70%; 
 - O pellet final foi dissolvido com 500 μL de H2O e estocado a -20°C. 
 
 
 
 
 
 50
GTE 
Componentes mL/500 mL 
20% Glicose filtrada 23 
0,5 M EDTA pH 8.0 10 
1M Tris-HCl pH 7.4 13 
Temperatura de estocagem 4ºC 
Sambrook & Maniats, 1989. 
 
 Tabela 14- Composição da solução GTE utilizada no processo 
de extração plasmidial. 
 
Solução II (NaOH 0,2N / SDS 1%) 
Componentes mL/20 mL 
NaOH 4M 1 
SDS 10% 2 
H2O 17 
Temperatura de estocagem 15-30°C 
Sambrook & Maniats, 1989. 
 
 Tabela 15- Composição da solução II (NaOH 0,2N / SDS 1%) 
utilizada no processo de extração plasmidial. 
 
Acetato de potássio 5M 
Componentes g/500 mL 
KOAc 246.87 
Para KOAc 3M deve-se adicionar 11,5 mL de ácido acético glacial e 
28,5 mL de H2O a 60 mL de KOAc 5M. 
Temperatura de estocagem 4ºC 
Sambrook & Maniats, 1989. 
 
 Tabela 16- Composição da solução Acetato de potássio 5M 
utilizada no processo de extração plasmidial. 
 
 51
 Os plasmídeos isolados foram quantificados em gel de agarose 1%. 
3.9 – Verificação do insertos 
 
 Os plasmídeos foram digeridos com as enzimas Hind III e Kpn I presentes nas 
regiões flanqueadoras dos insertos, e analisado sua liberação em gel de agarose 1 %. 
Foram digeridos 10 μL de plasmídeo (aproximadamente 5 μg) com 0,5 μL de cada 
enzima e 2 μL de tampão One for all (Amersham Pharmacia), para um volume final de 
reação de 20 μL. Incubado a 37°C por 2 horas e as enzimas inativadas incubando a 
reação a 75 °C por 15 min. 
 
3.10 – Sequenciamento automático dos insertos de interesse 
 
 Com a finalidade de obter as seqüências de nucleotídeos dos fragmentos de 
cDNA correspondentes aos candidatos genes hemolíticos, foi realizado o 
sequenciamento automático dos plasmídeos obtidos no item 5.7. Para tanto, utilizou-se 
o kit de sequenciamento DYEnamic ET Terminator Cycle Sequence (Amersham 
Biosciences), os primers reverse M13 e T7 e os primers forward M13 e SP6 e o 
seqüenciador automático Pekin Elmer ABI-Modelo 377. 
 
3.11 – Subclonagens 
 
Nos clones com mais de 1,2 Kb foi necessária a análise de estratégias e 
construção de subclonagens com a utilização de enzimas de restrição, ligação em 
plasmídeos e desenho de primers internos a seqüência para que os transcritos fossem 
completamente seqüenciados. Dentre os clones selecionados como candidatos 
 52
hemolíticos alguns não tinham suas seqüências completas, dois deles não tiveram suas 
regiões centrais seqüenciadas e um terceiro clone tinha sua região 5’ terminal 
incompleta. Os processos de subclonagem dos genes foram realizados antes do genoma 
do T. vaginalis ser seqüenciado e disponibilizado, as seqüências obtidas com as 
subclonagens foram conferidas com os dados depositados em bancos de dados 
(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/tvg/) e os novos clones incompletos obtidos após a 
publicação do genoma do T. vaginalis foram completados por consulta direta. 
 
3.11. 1 - Estratégias utilizadas nas subclonagens: 
 
Clone 1 (6 ant.) – Conhecendo as seqüências das extremidades 3’ e 5’ do gene, 
foi mapeado sítios de restrição que permitiam a retirada da região já seqüenciada para 
que fosse alcançada a região central ainda não seqüenciada, de acordo com o seguinte 
esquema: 
 
 
AA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 AAA 
 
 ATGEco RI 
Kpn I Hind III Eco RI 
Eco RI 
 25 pb 
 
 300 pb 
 
 200 pb 
 
 700 pb 
A 
B 
Hind III Kpn I 
Eco RI 
 
 AAA 
 50 pb 
http://www.tigr.org/tdb/e2k1/tvg/
 53
 
Figura 8 – Esquema de subclonagem com a utilização da enzima Eco RI em seqüência 
específica. A) Cassete contendo o gene completo. B) Cassete contendo a construção com parte 
da região já seqüenciada retirada. Região Azul – plasmídeo pSPORT1 1; Região Rosa – Região 
do gene não seqüenciada e alvo da subclonagem; Região Branca – região gênica seqüenciada 
com primer universais. 
 
 
 Foram feitas digestões com a enzima Eco RI com o intuito de retirar a região já 
conhecida de aproximadamente 525 pbs e religar no vetor a região de 50 pbs que 
antecede a região desconhecida reconstituindo o sítio de Eco RI presente no vetor, como 
observado na figura 8 A. Para tanto, 20 μL dos plasmídeos contendo este gene (10 μg) 
foram digeridos com 1 μL de enzima Eco RI (10 unidades/μL) e 3 μL de tampão REact 
3 , para uma reação de 30 μL de volume final e incubado por 2 horas a 37 °C. A enzima 
foi inativada elevando a temperatura de incubação para 75 °C e mantendo a reação por 
15 min. 
O padrão de bandas obtidas foi analisado em gel de agarose 1%. O plasmídeo 
digerido teve seu volume aumentado com H2O estéril para 100 μL e foi purificado 
adicionando-se 100 μL de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico (25:24:1), foi então 
centrifugado a 12000 x g por 10 min., a fase aquosa foi transferida para outro tubo, 
adicionado 0,2 volumes de acetato de amônio 10 M e 2 volumes de etanol absoluto e 
incubado por 3 horas a -80 °C. A reação foi centrifugada e o pellet seco após ter sido 
lavado com etanol 70% . 
Para ligação dos fragmentos Eco RI no vetor pSPORT 1 utilizou-se todo o 
volume do plasmídeo digerido ressuspendido em 10 μL de H2O combinando os 
seguintes reagentes: 
 54
4 μL Tampão T4 DNA Ligase 5X (250 mM Tris-HCl – pH 7.6, 50 mM MgCl2, 5 mM 
DTT, 25% PEG 8000) 
 2 μL Enzima T4 DNA Ligase (1 unidade /μl) 
 A reação foi incubada em temperatura ambiente por três horas. A ligação foi 
dialisada em membrana de nitrocelulose 0,025μm, 13 mm (Millipore) por 15 min. e a 
transformação de bactérias E.coli por eletroporação foi feita como descrita no 5.6.2.6. 
Os clones brancos obtidos em placa com IPTG/X-Gal foram inoculados em meio LB 
(tabela 10) e tiveram seus plasmídeos purificados com o kit Wizard Plus SV Minipreps 
DNA Purification System (Promega). Os plasmídeos foram então digeridos com as 
enzimas Hind III, Kpn I e Eco RI (como descrito acima e no item 3.9), e apenas os 
clones que apresentavam o padrão esperado de bandas de acordo com a construção 
apresentada na figura 8B foram seqüenciados. 
 
 Clone 2 (15) – Com o objetivo de completar a seqüência interna de 
nucleotídeos de um dos clones, cuja apenas as extremidades 5’ e 3’ foram obtidas com o 
sequenciamento utilizando os primers universais, foram construídos três primers 
internos a seqüência do gene. Uma vez que com o mapeamento de sítios de restrição 
não foi possível a escolha de uma combinação de enzimas para a subclonagem e que 
possibilitasse o sequenciamento da região restante. Assim, estes primers foram 
desenhados com base nas seqüências conhecidas das extremidades 5’ e 3’ do gene: 
primers reverse 1 - 5’-GGGACATTTCTTCCAAGTAA-3’ e 2 - 5’-
CCATTGACAAGAACGGAATTG- 3’ e o primer forward 5’-
ACTTAATCTCTCTGGGCATGG-3’. 
 A seqüência central do gene foi obtida com o sequenciamento do produto de 
PCR obtida com a combinação dos primers reverse 1 e primer forward, clonado no 
 55
vetor pGEM-T-Easy do kit de clonagem Vector System I (Promega). O protocolo 
utilizado na ligação dos produtos no vetor foi aquele recomendado pelo fabricante. A 
seguinte reação de PCR foi feita para a obtenção do fragmento desejado, com um 
volume final de 20 μl: 
 10.5 μl H2O 
 2.0 μl Tampão da enzima (Gibco) 
 2.0 μl dNTP (2,5 mM) 
 1.0 μl primer reverse (5’-GGGACATTTCTTCCAAGTAA-3’) 
 1.0 μl primer forward (5’-ACTTAATCTCTCTGGGCATGG-3’) 
 1.25 μl Cloreto de magnésio (50mM) 
 2.0 μl DNA (0,5 ng/μl) 
 0.25 μl Taq polimerase (5 unidades/μl) 
 
 E submetida ao seguinte programa no termociclador GeneAmp PCR Systems 
9700 (Applied Biosystems) : 
 
 
 
94°C – 5 min. 94°C – 1 min. 58°C – 1 min. 72°C – 1 min. 72°C – 7 min. 8°C - ∞ 
 
 
 
 
 30 X 
 56
 Os plasmídeos contendo a seqüência de interesse foram utilizado para 
transformação de bactérias E.coli por eletroporação foi feita como descrita no 5.6.2.6, 
seguindo com o mesmo procedimento aplicado para a obtenção de seqüência do clone 1. 
 
 Clone 3 (13 ant.) – Neste caso foi necessário completar a região 5’ terminal do 
gene, com a técnica 5’RACE. Para tanto foram desenhados os seguintes primers: GSP1 
– 5’-GCTCCTATAGAAATAGTCTCAACAC -3’, GSP2 – 5’-
TCCAACAGATGGTGGAATTGA-3’, GSP3 – 5’-TCACGAAGATTTGAACAACCT 
G-3’ e GSP4 – 5’-CAACCTGAAAATGCAAATGAT-3’. E utilizados para a síntese da 
seqüência desejada o Kit 5’-RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends 
(Invitrogen) e os primers complementares: Primer Âncora –AAP (5’- 
GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG -3’) e o Primers Universal – 
UAP (5’- CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTAC -3’). O protocolo 
utilizado na preparação da reação foi recomendado pelo fabricante e as seqüências 
ligadas no vetor pGEM-T-Easy. Seguindo com os mesmos procedimentos de preparo 
dos plasmídeos para o sequenciamento. O esquema abaixo ilustra a disposição dos 
primers na seqüência conhecida: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AAAAAA 
------------------------------------------- GSP 1 CCCCC 
Primer Âncora 
 (AAP) 
-------------------------------- GSP 2 
---------------- GSP 3 ou GSP 4 
Primer universal 
 (UAP) 
 57
 
Figura 9 – Síntese da seqüência de cDNA terminal 5’ em esquema 5’-RACE System e 
disposição dos primers na seqüência conhecida. 
 
 
3.12 – Análise computacional das seqüências de DNA obtidas 
 
Depois de realizado o sequenciamento automático dos fragmentos de cDNA do 
Trichomonas vaginalis , as seqüências e os cromatogramas obtidos foram analisados 
com auxílio do programa Package Staden, em busca de intersecção entre as seqüências 
obtidas com os primers reverse e forward, a retirada de bases de baixa qualidade 
inferior a Phred 20, retirada da região de poliadenilação e seqüências de vetor. As 
traduções das seqüências foram feitas com a utilização de ferramentas da bioinformática 
oferecidos pelo ORF Finder - NCBI (http://www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.htmL), 
ferramentas de Blast do TIGR analisando seqüências do Projeto Genoma do T. vaginalis 
(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/tvg/) e Transeq – EBI 
(http://www.ebi.ac.uk/emboss/transeq/). 
Com o objetivo de identificar e caracterizar os genes selecionados, as seqüências 
foram submetidas aos bancos de dados na busca por homologias com seqüências 
descritas e domínios, com a utilização do BLAST 
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi), FASTA (http://www.ebi.ac.uk/Fasta/), 
MPsrch (http://www.ebi.ac.uk/MPsrch/), FFAS 3 (http://ffas.ljcrf.edu/ffas-
cgi/cgi/ffas.pl), BioInfo (http://bioinfo.pl/meta/) e ORFeus-2 
(http://bioinfo.pl/meta/ORFeus-2). 
 As buscas e inferência de funções das proteínas codificadas pelos genes 
canditados hemolíticos foram analisadas com auxílio de ferramentas como InterProScan 
http://www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html
http://www.tigr.org/tdb/e2k1/tvg/
http://www.ebi.ac.uk/emboss/transeq/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi
http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/
http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/
http://ffas.ljcrf.edu/ffas-cgi/cgi/ffas.pl
http://ffas.ljcrf.edu/ffas-cgi/cgi/ffas.pl
http://bioinfo.pl/meta/
http://bioinfo.pl/meta/ORFeus-2
 58
(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/), Scanps (http://www.ebi.ac.uk/scanps/?UniProt), 
PFam (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtmL),