Resumo Biotecnologia

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Engenharia Genética F2 
 
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I - CLONAGEM MOLECULAR 
A clonagem molecular é uma técnica de extrema importância a 
nível da Engenharia Genética que permite selecionar uma cópia 
de uma região específica do genoma e produzi-la em 
quantidades ilimitadas. 
As bactérias contêm plasmídeos, os quais podem ser usados 
como vetores de clonagem. Chamamos então vetor 
plasmídico a pequenas moléculas circulares de DNA 
derivadas de plasmídeos naturais de bactérias. 
Para proceder à clonagem: 
1) Identificar DNA que nos interessa para o processo e extraí-lo do organismo dador. 
2) Fragmentar o DNA que queremos clonar, e cortar os plasmídeos a usar como vetor, 
utilizando as mesmas enzimas de restrição, o que vai permitir compatibilidade de 
extremidades. 
 As enzimas de restrição são endonucleases que tornam o DNA em cadeia 
simples, cujas extremidades têm cadeias específicas complementares com 
outras extremidades que tenham sido formadas pela mesma enzima. 
3) Devido à especificidade do corte é possível o emparelhamento por complementaridade 
de bases entre o fragmento de DNA e o plasmídeo. 
4) A ligação dos quatro extremos é feita por annealing e pela enzima DNA ligase, obtendo-
se assim um novo plasmídeo recombinante. 
 Annealing – as extremidades dos fragmentos de DNAs em cadeia simples unem-
se numa ligação fraca por pontes de hidrogénio. 
 A ligase – enzima que forma ligações fosfodiéster fortes entre os nucleótidos dos 
vários fragmentos. 
5) O plasmídeo recombinante é introduzido numa bactéria hospedeira por transformação 
(ou conjugação ou transdução) que o vai encarar como DNA plasmídico normal e replica-
o de igual forma como o resto do seu material genético, sendo assim possível criar 
milhões de cópias desse plasmídeo (por hereditariedade, ou seja, as células-filhas 
também o vão ter). 
6) Selecionar os transformantes das células-
filha que não ficaram com o plasmídeo por 
erros na replicação, e preservação e posterior 
utilização dos mesmos. 
 
Este processo não ocorre com 100% de sucesso, 
sendo isso, na verdade, bastante raro. É então 
necessário selecionar os plasmídeos que ficaram 
recombinados corretamente. 
Geralmente com o fragmento de DNA a clonar é 
colocado ainda no plasmídeo um gene que confira 
resistência a um antibiótico (por exemplo, a informação 
genética adicionada pode codificar uma proteína que 
degrada o antibiótico). Para selecionar os plasmídeos 
recombinantes basta submeter as bactérias ao dito 
antibiótico e selecionar aquelas que sobrevivem – 
significa que possuem o plasmídeo recombinante. 
Podemos então dizer que em clonagem molecular, a matéria-prima é 
composta por DNA insert, vetor e hospedeiro. 
 
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ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 
Não são, como se possa pensar, um produto de laboratório, embora sejam de extrema 
importância em Engenharia Genética! 
As enzimas de restrição são endonucleases que existem nas bactérias como mecanismo de 
defesa que as protege de agressões de outros DNAs externos, impedindo que estes a 
transformem, sendo que cada bactéria tem a sua própria enzima de restrição. Estas atuam 
restringindo/ cortando os ácidos nucleicos infeciosos. 
Elas existem nas células sempre associadas a sistemas de modificação: enzimas de 
modificação – metilases – as quais colocam resíduos de metilo nos locais que são 
reconhecidos pelas enzimas de restrição no DNA celular para que este não seja afetado pelas 
enzimas de restrição erradamente, ou seja, protegem o DNA próprio da célula para que não seja 
destruído juntamente com o viral. 
G | AATTC 
 
 
As enzimas de restrição cortam sempre num local específico de uma sequência específica, que 
são próprios de cada enzima. Numa sequência de nucleótidos (sempre escrita na direção 5’3’) 
pode-se representar o local do corte feito pela enzima de restrição de várias maneiras. 
Vamos usar o exemplo da sequência utilizada acima, sendo que a enzima atua entre o nucleótido 
G e os dois As – sequência e locais SEMPRE reconhecidos pela enzima Eco RI. 
5′𝐺↓𝐴𝐴𝑇𝑇𝐶3′ 
𝐺:𝐴𝐴𝑇𝑇𝐶 
𝐺|𝐴𝐴𝑇𝑇𝐶 
𝐺𝑉𝐴𝐴𝑇𝑇𝐶 
NOTA: As enzimas de restrição cortam sempre as duas cadeias da molécula de DNA, fazendo 
com que as extremidades fiquem em cadeias simples. 
 
 
NOMENCLATURA DAS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 
As enzimas de restrição são tipicamente identificadas por 3 letras que representam, 
respetivamente, o género, a espécie e a estirpe, e ainda 1 número que simboliza a ordem da 
descoberta. São exemplos: 
 Hpa I / Hpa II: Haemophilus parainfluenza 
 Eco RI / Eco RII: Escherichia coli R 
 
Local de atuação da enzima de restrição. 
Caso um dos outros ácidos nucleicos 
estivesse metilado, a enzima de restrição já 
não reconhecia o seu local e não atuava. 
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TIPOS DE ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO 
Tipo I 
São complexas, multiméricas e combinam sistema de restrição e modificação, sendo que os 
mesmos complexos enzimáticos reconhecem uma sequência de DNA e modificam-na e cortam-
na. 
 Como não queremos as células modificadas não nos interessam nesta área. 
 Cortam o DNA de forma random a partir da sequência de reconhecimento. 
 
Tipo II 
Estão são as enzimas de restrição utilizadas em laboratório, sendo as únicas tecnologicamente 
interessantes porque são pequenas, diversificadas e fáceis de manipular. 
 Reconhecem sequências palindrómicas: 
sequências em que a complementar é igual à 
original, mas em sentido contrário, ou seja, 
como as cadeias são antiparalelas, lidas na 
mesma direção são iguais. Estas podem ser: 
 Contíguas (GAATTC): ganham uma 
estrutura particular – estrutura 
cruciforme – a qual é reconhecida 
pelas enzimas de restrição. 
 Não contínuas (GCCNNNNNNGGC): 
também adquirem a estrutura 
cruciforme mas não são úteis para a 
Engenharia Genética. 
 Cortam em posições bem definidas, 
frequentemente dentro ou na periferia (muito próximo) da sequência de reconhecimento. 
 Têm apenas atividade de endonuclease e não de modificação das células. 
 
Tipo III 
 São grandes e combinam também restrição e modificação. 
 Cortam fora da sequência de reconhecimento e raramente têm digestões completas. 
 Não são interessantes para a Engenharia Genética. 
 
Tipo IV 
 São grandes e combinam também restrição e modificação. 
 Cortam fora das sequências de reconhecimento e estas são contíguas ou descontínuas. 
 Não são interessantes para a Engenharia Genética. 
 
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TIPOS DE EXTREMIDADES OBTIDAS PELAS ENZIMAS 
As enzimas de restrição hidrolisam as ligações nucleotídica fosfodiéster entre o grupo fosfato e 
grupo hidroxilo, gerando uma extremidade 3’-OH e uma extremidade 5’-P. 
 Se o local de clivagem não é no centro, a 
enzima gera extremos coesivos (“sticky 
ends”), que podem emparelhar com outros 
fragmentos digeridos pela mesma enzima. 
Estes extremos são mais fáceis de ligar pois 
a clivagem é assimétrica e ficam bases 
desemparelhadas – formam-se extremidades 
de cadeia simples. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Se o local de clivagem é no centro, a enzima gera extremos 
cegos (“blunt ends”) pois a clivagem é simétrica. Não são 
interessantes na área da Engenharia Genética e 
Recombinação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Enzimas correlacionadas 
Isosquizómeros: são enzimas que reconhecem a mesma sequência palindrómica mas uma 
gera extremos cegos e outra gera extremos coesivos que, por isso, não são compatíveis. 
 Xma I (C|CCGGG) / Sma I (CCC|GGG) 
 Hpa II (C|CGG) / Msp I (C|CGG ; C|C*GG) 
 
Isocaudómeros: são enzimas que reconhecem sequências palindrómicas diferentes mas geram 
extremos coesivos compatíveis que se ligam. 
 Bam HI (G|GATCC) / Sal 3 AI (|GATC)  O extremo compatível é GATC. 
 
 
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO “MAIS ÚTEIS” 
As enzimas de restrição “mais úteis” são aquelas que… 
 Reconhecem sequências palindrómicas. Reconhecem um nº de bases par – há enzimas que reconhecem nº de bases ímpar, mas 
não são interessantes na área da Engenharia Genética. As mais úteis são aquelas que 
reconhecem 4 ou 6 bases (é mais fácil encontrar sequências mais pequenas), pois as 
que reconhecem mais bases são muito específicas e só são aplicadas em processos em 
que conhecemos exatamente a sequência de nucleótidos. 
 4 bases: gera fragmentos estatísticos de 256 nucleótidos (nts). 
 6 bases: gera fragmentos estatísticos de 4096 nts. 
 Geram extremos coesivos 
 Reconhecem sempre a mesma sequência particular 
 Têm uma grande capacidade de digerir o DNA 
 Têm elevada pureza enzimática e elevada atividade específica. 
 
 
MAPAS DE RESTRIÇÃO 
Os mapas de restrição são uma compilação do número, ordem e distância entre os locais de 
corte de uma enzima de restrição ao longo de um segmento de DNA clonado. 
 As unidades do mapa são expressas em pares de bases (ou para distâncias mais longas 
em pares de kilobases). 
 Geralmente o mapeamento é a primeira etapa para caracterizar um DNA desconhecido. 
* 
Digestões simples: DNA digerido por apenas uma enzima de restrição. Faz-se uma 
determinação relativa das orientações dos fragmentos no DNA linear. 
Digestões múltiplas: DNA digerido por mais de uma enzima de restrição. Determinam-se as 
posições dos fragmentos de DNA produzidos pelas enzimas por eletroforese. 
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Quando se faz uma digestão 
simples apenas se sabe em quantos 
fragmentos de DNA surgem da 
digestão com um determinado 
enzima, o que corresponde com o nº 
de locais de atuação das enzimas 
de restrição. Contudo, há diversas 
hipóteses dos locais de corte. 
 Se for um DNA circular e 
tiver apenas um local de 
corte, vai resultar num 
fragmento que é o 
plasmídeo original. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para saber os locais de corte exatos 
tem-se de fazer uma múltipla digestão 
(neste caso dupla). Com esta 
informação somos capazes de 
construir um mapa de restrição. 
 
 
 
 
 
 
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LIGAÇÃO DOS FRAGMENTOS 
 Annealing: as extremidades dos fragmentos de DNAs em cadeia simples unem-se 
numa ligação fraca por pontes de hidrogénio. 
 Ligase: enzima que forma ligações fosfodiéster fortes entre os nucleótidos dos vários 
fragmentos. 
 
OUTRAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS 
 Fosfatase alcalina: enzima remove grupo fosfato da extremidade 5´ das moléculas de 
DNA. 
 DNase I: enzima que degrada DNA em dupla cadeia por hidrolisação interna das 
ligações fosfodiéster. 
 E. coli exonuclease III: enzima que remove nucleótidos dos extremos 3’-OH de 
moléculas de DNA. 
 
 
DNA INSERT 
O genoma de um organismo é demasiado extenso comparativamente com os genes isolados e, 
por isso, é necessário primeiramente saber o local de síntese da proteína de interesse (que 
pretendemos produzir), para que possamos obter o DNA do gene que a codifica. Vejamos então 
o exemplo da albumina humana (HSA). 
A albumina humana é sintetizada no fígado e depois é secretada. Vamos ter então de recolher 
células hepáticas e extrair-lhes ou o DNA; ou o mRNA (que representa menos de 1% do RNA 
total da célula) por identificação de caudas poli-A. Dentre este mRNA estará o mRNA percursor 
da albumina. 
 A percentagem de DNA codificante é cerca de 1%, daí o mRNA ser 1%. 
 Apenas o mRNA codificante das histonas é que não tem cadeias poli-A 
O mRNA extraído usando-se a técnica de cromatografia com oligo(dT). Os oligo(dT) têm uma 
sequência de Ts que reconhecem as caudas poli-A, emparelhando e capturando o mRNA, o qual 
é depois lavado e desnaturado para retirar da coluna (voltando depois a renaturar). 
Por fim, aplica-se a transcriptase reversa e dNTPs para obter o respetivo cDNA, usando como 
primer o oligo(dT) ou poli-U. Este cDNA é espontaneamente de cadeia simples, mas forma uma 
2ª cadeia porque o RNA dobra-se sobre si mesmo. 
 O cDNA já está processado (não possui intrões nem sequências de controlo da 
expressão) e por isso pode-se usar para clonar genes eucariotas em hospedeiros 
procariotas, pois a região codificante é contígua. No entanto, caso se use hospedeiros 
eucariotas, é melhor usar o gene nuclear em vez do cDNA. 
 O cDNA não tem controlo de transcrição. 
Contudo, para ser clonado, o cDNA tem de ser linearizado primeiro. Em seguida junta-se 
linkers, ATP e a enzima ligase para que o cDNA fique com caudas de linkers, os quais são 
adaptadores sintetizados quimicamente, compostos por sequências palindrómicas reconhecidas 
por enzimas de restrição à nossa escolha. Após o tratamento com a enzima de restrição 
geram-se extremos coesivos e ficamos com o fragmento de DNA prontos a clonar. 
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Faz-se depois um screening dos clones de cDNA para pesquisar a sequência que nos interessa, 
o que se faz a partir de eletroforese, comparação das dimensões dos fragmentos, avaliação da 
atividade de enzima eventualmente expressa, hibridação molecular, etc.. 
Para isolar um gene de interesse, não se conhecendo o mapa de restrição começa-se por fazer 
uma digestão parcial do DNA com enzimas de restrição, de modo a obter as sequências de 
interesse. Esta digestão gera muito mais fragmentos do que a digestão completa, e além disso 
assegura que, caso haja local de corte no fragmento de interesse (como é o caso da albumina), 
conseguimos obter fragmentos inteiros, o que não seria possível com uma digestão completa 
(e por isso nunca se faz). 
No caso da albumina, o gene 
em que se insere tem 3 locais 
de corte por enzimas de 
restrição, incluindo um a meio 
do fragmento correspondente à 
albumina humana. Numa 
digestão completa, formaria 4 
fragmentos distintos, cortando 
ainda o fragmento de interesse. 
Com digestão parcial consegue-
se obter 7 possibilidades 
diferentes de corte, duas das 
quais não têm o fragmento da 
albumina cortado, sendo esses 
que se vão aproveitar. 
Para fazer uma digestão parcial tem-se: 
1) Fazer dois tubos: um com uma certa quantidade de DNA e com enzima de restrição 
(10µg de DNA + 10 unidades de enzima de restrição); outro com a mesma quantidade 
de DNA e sem enzima de restrição (10µg de DNA + 0 unidades de enzima de restrição). 
a. Usa-se enzima de restrição de 6 bases que corta a cada ~4000 nucleótidos. 
b. O primeiro corresponde a 100% de digestão e o outro a 0% de digestão. 
2) Fazer vários tubos com diferentes volumes dos tubos de (1), ficando assim com um 
gradiente de corte. Num destes tubos vamos conseguir obter o nosso fragmento de 
interesse inteiro. 
a. Poderia colocar-se o mesmo volume e incubar durante tempos diferentes, mas 
é um método mais trabalhoso e por isso geralmente não se faz. 
 
 
 
 
3) Fazer eletroforese. Sabendo previamente o tamanho da sequência de interesse, através 
das bandas e dos marcadores de peso molecular conseguimos obter o nosso fragmento. 
a. Quanto mais tempo e maior for a concentração da enzima de restrição, mais 
fragmentos surgem e maior a sua separação no gel. 
A B C 
100% 
0% 
1 2 3 
3 2 1 
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VETORES 
Os vetores são veículos possíveis de serem usados em clonagem, existindo imensas 
possibilidades de escolha. Para escolher o vetor mais apropriado deve-se ter em conta: 
 O tipo de hospedeiro. 
 O tamanho do DNA insert, uma vez que há vetores que suportam uma larga gama de 
tamanhos do mesmo, mas há uns têm uma capacidade mais reduzida e apenas 
suportam fragmentos mais pequenos. No quadro abaixo pode-se ver a comparação 
entre vários vetores e a sua capacidade (em kb) de receber o DNA insert. 
 
 
 
 
 
 O número de clones (N) necessário obter, tendo em conta 
a dimensão do DNA insert, a dimensão total do genoma e a 
representatividade pretendida (f será a relação entre as 
dimensões), havendo fórmulas matemáticas que fazem esta 
estimativa entre a relaçãoe a probabilidade da existência de 
uma sequência (P), que é 1 em 1 milhão. 
𝑁 =
ln(1 − 𝑃)
ln(1 − 𝑓)
 
 
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TIPOS DE VETORES DE CLONAGEM 
Plasmídeos de referência 
 Os plasmídeos são moléculas de DNA de cadeia dupla, circulares que existem em 
bactérias e no núcleo de alguns eucariotas. 
 Replicam-se independentemente da célula. 
 São os vetores mais importantes 
 Têm dimensão variável entre alguns kb e 100kb (ou mais); e pode transportar até 10kb 
de DNA. 
O primeiro plasmídeo a surgir foi o pBR322, fabricado por 
dois mexicanos. Este possui origem de replicação de E. coli, 
dois genes de resistência a antibióticos (ampR para 
resistência à ampicilina e tetR para resistência à tetraciclina) 
e locais para reconhecimento específico por enzimas de 
restrição (EcoR I, BamH I e Pst l, Hind III e Sal I). O DNA 
insert é colocado no plasmídeo por substituição de um dos 
genes de resistência. Após a transformação da bactéria e 
reprodução, os hospedeiros são selecionados por 
resistência ao antibiótico, sendo as não resistentes aquelas 
que não têm o plasmídeo clonado. Das resistentes, apenas 
as que sobrevivem num meio com apenas um dos antibióticos e morrem em meios com o outro 
estão clonadas porque têm um gene de resistência substituído, uma vez que as que não morrem 
em nenhum têm o plasmídeo inteiro sem estar clonado. Atualmente já não se usa este plasmídeo 
porque não é viável para fragmentos maiores. 
Entretanto surgiu o pUC19 também com uma origem de 
replicação, mas com apenas um gene de resistência a 
antibióticos (o ampR) e com um gene de expressão da 
enzima β-galactosidase (lacZ), dentro do qual existe um 
MCS (com vários locais de corte reconhecidos por cerca 
de 20 enzimas, nomeadamente os que também haviam 
em pBR322). A seleção das bactérias neste caso é feita 
por resistência à ampicilina tal como no pBR322, mas 
das sobreviventes vai-se conseguir distinguir entre as que têm o gene de interesse e as outras 
consoante a coloração das suas colónias aquando do crescimento em meio com IPTG e x-gal. 
As colónias são então brancas se as bactérias tiverem o gene e azul caso contrário, sendo o azul 
a hidrólise do x-gal pela enzima β-galactosidase, com colaboração do IPTG. No caso de bactérias 
com DNA insert no MCS, vai haver uma inativação do gene produtor desta enzima, e assim não 
há hidrólise do meio e as colónias tornam-se brancas. Este é o plasmídeo mais usado. 
* 
Para ser um vetor de clonagem, o plasmídeo tem então de ter algumas características gerais: 
 Uma região reconhecida como origem de replicação (ORI) pelo hospedeiro para que se 
possa multiplicar independentemente dos cromossomas bacterianos. 
 Plasmídeos mais pequenos aproveitam as enzimas de replicação de DNA do 
hospedeiro, enquanto plasmídeos maiores podem transportar genes 
codificantes das suas próprias enzimas. 
 Um gene que permita a seleção do hospedeiro (ex.: gene de resistência a antibiótico). 
 Uma região polylinker ou local de clonagem múltipla (MCS – Multiple cloning site) 
reconhecida por enzimas de restrição à escolha, tendo de ser as mesmas usada para 
cortar o DNA insert, para que os extremos sejam compatíveis. 
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 O MCS é um pequena fragmento de DNA que contém vários locais de restrição. 
Em vez de haver vários locais de restrição espalhados ao longo do plasmídeo, 
juntam-se todos num mesmo local. 
 Os locais de corte correspondem a nucleótidos com sequências palindrómicas 
(que se lê de igual maneira de trás para a frente, e de frente para trás). 
 
Bacteriófago λ – Fagos 
 São vírus que infetam especificamente as bactérias. 
 É o mais usado depois do plasmídeo, e o mais usado pelos bancos celulares/genómicos 
(que trabalham geralmente com 20kb). 
 O genoma tem dimensão de 49kb e pode aceitar até 25kb de DNA insert. 
O bacteriófago tem uma região do seu DNA codificante 
de uma proteína não utilizável que por isso pode ser 
substituída pelo DNA insert, o que é feito por 
recombinação de ambos os DNAs e reconstrução do 
vírus, com o apoio de enzimas de restrição e ligases. 
A sequência de DNA recombinado vai então ser 
repartida para integrar o bacteriófago – a sequência tem 
de ser cortada pelos locais COS (extremos coesivos) – 
e no final forma uma molécula de DNA circular. 
 A parte substituída corresponde a qualquer uma 
que não seja necessária para sua replicação no 
laboratório. 
 A substituição desta parte permite integrar DNA 
insert maior. 
 Os locais COS permitem colocar uma grande 
molécula de DNA dentro da cabeça do fago, que 
de outra maneira não seria possível. 
O fago depois liga-se à membrana das bactérias e injeta 
o DNA recombinante no interior, sendo este replicado de 
forma independente ao genoma do hospedeiro, e 
recorrendo normalmente a enzimas codificadas pelo 
próprio DNA recombinante – ciclo lítico. O uso de vírus líticos (inativando a sequência de DNA 
que promove o ciclo lisogénico por integração no cromossoma da célula) são mais vantajosos 
porque permitem a libertação dos vírus da célula e sua propagação para as células vizinhas, 
tendo uma taxa de produção da nosso produto de interesse muito elevada; ao passo que um 
vírus lisogénico fica na fase latente em poucas células, e não se propaga. 
 
Cosmídeos 
 São híbridos entre plasmídeo e bacteriófago – combinação de vetor plasmídico com local 
COS que permite a inserção de DNA na cabeça de fago . 
 Têm uma elevada eficiência de transformação devido ao seu lado virião. 
 Possibilita a inserção se fragmentos maiores, relativamente aos plasmídeos e aos 
bacteriófagos, podendo transportar até 45kb. 
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Primeiro este vetor vai comportar-se como plasmídeo: corta-se o DNA na zona do polylinker, 
dando origem ao genoma do fago, com local COS. 
O genoma fágico vai juntar-se 
aos fragmentos de DNA a 
clonar, formando cadeias 
concatenadas. Estas cadeias 
vão depois ser cortadas na 
zona COS para poderem ser 
integradas no bacteriófago. 
A sua principal vantagem é 
serem menos suscetíveis à 
degradação por nucleases do 
que o DNA de cadeia simples 
dos vírus. A inserção da 
extremidade COS vai permitir o circular do DNA. Os COS, embora se possam encontrar 
naturalmente em genomas de vírus e também aí circularizem o DNA, contudo os cosmídeos 
podem ser trabalhados em laboratório sem exigir manipulação de vírus. 
 
YACs – Yeast Artificial Chromosome 
 São os menos usados 
 A grande vantagem destes vetores é permitirem clonar sequências de DNA muito 
grandes, até 2000kb. 
As leveduras são organismos eucariotas que possuem cromossomas circulares, os quais se 
podem reproduzir em laboratório de modo a possuírem DNA que nos interesse produzir, sendo 
posteriormente multiplicados em leveduras (ou algumas bactérias). Os YACs são circulares e 
vão ter um local reconhecido por enzimas de restrição, formando assim dois braços (esquerdo e 
direito) em cujas extremidades se encontram telómeros para proteção do DNA linear da 
degradação por nucleases, e entre os quais é inserido o nosso DNA de interesse. 
 No braço esquerdo vai ainda constar, além do telómero, o 
centrómero – local de ligação das fibras do fuso acromático que 
garante distribuição correta do cromossoma pelas células-filha 
durante a divisão celular –, 1 gene de resistência à ampicilina 
(ampR), uma origem de replicação de E.coli (porque é onde são 
construídos, manipulados e amplificados), uma ARS (sequência 
para replicação autónoma) e 1 marcador genético de auxotrofia 
para o triptofano (marcador de seleção metabólico). 
 No braço direito vai ainda constar, além do telómero, 1 marcador 
genético de auxotrofia para o uracilo (marcador de seleção 
metabólico) 
Enquanto nos procariotas se acrescentam genes de resistência a antibióticos, nos eucariotas 
utilizam-se marcadores metabólicos de auxotrofia, permitindoa seleção de hospedeiros por 
crescimento em meios pobres na substância para a qual os marcadores são específicos 
(triptofano e uracilo). As leveduras que conseguirem crescer nestes meios são as transformadas 
com os YACs. 
Tem os elementos 
necessários para um 
cromossoma funcional 
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NOTA: Além destas características é ainda essencial que o vetor possua um local de terminação 
da transcrição. 
O gene de seleção por auxotrofia é essencial pois aquando da replicação o fuso acromático só 
se liga a uma certa quantidade de cromossomas. Ao adicionar o YAC, o numero de cromossomas 
torna-se superior à quantidade de fusos acromáticos e o nosso recombinante vai assim competir 
com os cromossomas da própria levedura. Desta forma vamos ficar com leveduras recombinadas 
e outras não, tendo-se de selecionar as de interesse com estratégias que permitam aumentar a 
estabilidade do nosso gene, tornando-o mais vantajoso, como é o caso da seleção por auxotrofia. 
 
 
LIGAÇÃO DO DNA INSERT AO VETOR 
Começa-se por usar a mesma enzima de restrição (ou isocaudómeros ou exonuclease para 
extremidades cegas) para preparar o DNA insert (obtido a partir do mRNA da proteína ou do 
gene nuclear) e o vetor de clonagem, como foi visto anteriormente, recorrendo-se a digestões 
parciais (não é necessário em DNA insert obtido por cDNA). 
 Se em vez de extremos coesivos se gerarem extremos cegos, é necessário 
compatibilizar as extremidades usando linkers. 
 O plasmídeo pode ter vários locais reconhecidos pelas enzimas de restrição, mas não 
queremos o DNA insert em todos eles, por isso não nos interessa uma digestão 
completa. Para obter um plasmídeo inteiro e linearizado é necessário uma digestão 
parcial, escolhendo-se depois o fragmento cortado no local onde interessa colocar o DNA 
insert. 
Após isto é preciso ter cuidado na ligação das extremidades, porque tanto os vetores como os 
DNAs podem voltar a fechar-se, devido à proximidade das suas extremidades, ou então unir-se 
de forma incorreta – há uma série de diferentes combinações possíveis mas apenas uma é do 
nosso interesse. Isto acontece porque se usa a enzima ligase para unir os extremos 3’-OH aos 
extremos 5’-P, num processo dependente de ATP. Contudo, ela não sabe quais os extremos do 
plasmídeo e quais os do DNA insert. 
Para impedir que o vetor feche recorre-se à enzima fosfatase que desfosforila os extremos 5’ do 
plasmídeo (a ligase não vai unir dois extremos OH), permitindo assim que este ligue apenas a 
DNA insert, embora uma das cadeias, como não tem P, não vai ficar ligada – nicks. Este método 
não impede no entanto a ligação entre inserts e sobre eles próprios, embora essa situação não 
seja tão grave porque não se conseguem replicar. 
As ligações corretas entre vetor e DNA insert vão depois ser colocadas no hospedeiro, e este 
deteta os nicks e repara-os. 
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TRANSFORMAÇÃO DOS HOSPEDEIROS 
EXPERIÊNCIA DE GRIFFITH’S (1928) 
Nesta experiência estudou-se a bactéria Streptococus pneumoniae que provoca pneumonia no 
ser humano e é, geralmente, letal nos ratos. Para tal foram usadas duas estirpes, com diferentes 
graus de virulência. 
 A estirpe S, de virulência normal, é coberta por uma cápsula polissacarídea, o que 
confere uma aparência lisa às células. Se forem injetadas nos ratos, estes contraem 
pneumonia e acabam por morrer. 
 A estirpe R, um tipo mutante não virulento, que não é coberta por cápsula, o que torna o 
seu aspeto rugoso. Se forem injetadas nos ratos, estes sobrevivem e permanecem 
saudáveis  As células não são letaisr para os ratos. 
Fervendo as células S elimina-se o seu DNA (“morrem”) e resta apenas a cápsula da bactéria. 
Se esta for injetada nos ratos, eles sobrevivem e permanecem saudáveis, concluindo assim que 
não é a cápsula que é patogénica. Contudo, adicionando-lhe novamente DNA, a bactéria volta a 
ser patogénica. 
Injetou-se então uma mistura de 
células S (mortas pelo calor) e 
células R (vivas) nos ratos, os 
quais contraíram a doença e 
morreram. Foram ainda 
encontradas células vivas do tipo 
S no sangue dos ratos mortos. 
Isto é explicado pelo facto de 
células R adquirirem a cápsula 
das células S, apesar destas 
estarem mortas – Houve 
transformação das células 
mortas S pelo conteúdo das 
células R, o que vai alterar o 
fenótipo da bactéria, uma vez que 
esta ganha genes codificantes da 
cápsula, o que a torna patogénica. 
O Princípio da Transformação Genética diz que bactérias com fenótipo alterado terão o seu 
genótipo também alterado. 
 
 
MECANISMOS DE TRANSFORMAÇÃO NATURAL 
O DNA é físico-quimicamente estável e por isso dificilmente se quebra em fragmentos pequenos, 
o que representa uma dificuldade acrescida na sua incorporação pelas células uma vez que a 
parede bacteriana não permite a passagem do DNA inteiro. Desta forma, o material genético vai 
ter de entrar na célula por transporte ativo como se fosse para alimentação, ou seja, através de 
orifícios perto dos flagelos ou cílios. 
O DNA é então assim incorporado e, sendo estes locais de grande ocorrência de exonucleases, 
degradado. Contudo, pelas exonucleases 3’ e 5’ terem diferentes velocidades de atuação e 
 Engenharia Genética F2 
 
15 
 
dependendo da disponibilidade de cada uma das extremidades, vai haver uma das cadeias que 
é mais rapidamente degradada do que outra. A cadeia simples mais lentamente degradada tem 
assim possibilidade de chegar perto do DNA celular e incorporar o genoma da bactéria. 
 Este é um procedimento extremamente raro, que em termos estatísticos é nulo, mas que 
na prática ocorre. 
 
Transformação com DNA livre: quando uma bactéria morre e liberta o seu DNA, este pode ser 
incorporado por outras bactérias envolventes, caso o recombinante lhe permita adquirir 
características vantajosas em termos de sobrevivência (é o que acontece com as bactérias 
hospitalares). 
 
 
 
 
Transformação com plasmídeo: o plasmídeo é captado pela 
bactéria, havendo transformação da mesma. É um processo que 
ocorre pouco mas quando ocorre, o DNA não é degradado pelas 
exonucleases, uma vez que estas não conseguem atuar em DNA 
circular. Isto garante uma maior estabilidade ao material genético, 
embora dificulte de certa forma a sua transmissão. 
 É esta que se usa em laboratório. 
 
Transdução – utilização de vírus: transferência de DNA de uma célula para outra através de 
um vetor viral (vírus bacteriófago). Os vírus são compostos de proteínas (que constituem a sua 
cápsula) e ácidos nucleicos, mas não têm organelos celulares que lhes permitam a sua 
reprodução, pelo que para realizar esse processo, é necessário a sua entrada em bactérias e o 
uso do teu seu ATP e organelos. Existem 3 métodos de entrada do DNA (ou RNA) viral nas 
bactérias: 
1) Injeção do material genético (modo direto)  Apenas o 
material genético do vírus é fundido na membrana celular, 
permanecendo a parte proteica no lado externo. 
 
2) Fusão do envelope viral  Funde-se com a membrana 
celular e o genoma do parasita invade a célula. 
 
3) Endocitose  O vírus consegue “enganar” os recetores 
químicos da membrana celular, que vão promover a fixação 
do vírus, que é englobado por invaginações da membrana. 
 
 Engenharia Genética F2 
 
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Uma vez dentro da bactéria, o DNA viral pode prosseguir duas vias: 
Ciclo lítico: as funções normais da bactéria são interrompidas na presença do material 
genético viral, que prossegue imediatamente para replicação. Durante a replicação ocorre 
simultaneamente a síntese de proteínas suas que constituirão a cápsula que vai envolver os 
ácidos nucleicos, formando novos vírus. Isto acaba por provocar lise celular e libertação de 
inúmeros vírus funcionais, que vão, por sua vez, atacar outras células. 
 
Ciclo lisogénico: combina-se com o DNA da célula hospedeira e vai ser replicado juntamente 
com o genoma celular– fase dormente (não produz viriões). Nesta fase a sequência de DNA 
viral está reprimida e é como se nem lá estivesse. Se a bactéria for exposta a um fator que 
diminua a ação do repressor, o DNA viral deixa de estar “adormecido” e o DNA da células 
hospedeira começa a tentar reparar-se, expulsando o DNA viral. O vírus fica então ativo e 
prossegue para o ciclo lítico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A transdução pode então basear-se em ambos os ciclos, classificando-se em transdução 
generalizada e transdução específica: 
A generalizada baseia-se no ciclo lítico, durante o qual pode haver incorporação de DNA 
bacteriano aleatório nos novos vírus formados, o qual vai depois infetar outra bactéria. Aqui, 
o DNA da bactéria “doadora” incorpora o DNA da 
bactéria “recetora” (transduzida), sendo 
replicado juntamente com ele. 
A específica baseia-se no ciclo lisogénico, no 
final do qual a bactéria segue o caminho lítico. 
Quando isso acontece o DNA bacteriano (no 
qual está incorporado o viral) é cortado para 
formar novos vírus. Caso este corte seja 
defeituoso, juntamente com o fragmento viral 
poderá vir um pequeno fragmento de DNA 
bacteriano, que vai ser incorporado no vírus e 
libertado, podendo infetar outras bactérias, que 
ficam transduzidas, tal como na generalizada. 
Todavia, neste caso, os genes transferidos só 
podem ser aqueles imediatamente adjacentes ao 
fragmento de DNA viral. 
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17 
 
Geralmente o DNA viral é injetado na bactéria (método direto), e o que se pretende é que o vírus 
seja não lítico e que integre o seu DNA no genoma da célula, ou seja, que siga o ciclo lisogénico 
e não destrua as células. 
 O vírus lisogénico não é muito rentável em laboratório. 
 A desvantagem deste método geral da transdução é a possibilidade de os vírus serem 
patogénicos. 
 
Conjugação (F+ e Hfr): transferência de material genético entre duas 
células, organismos ou bactérias, envolvendo o contacto entre elas mas 
continuando ambos os organismos a existir separadamente – ocorre com 
muita frequência. 
Este fenômeno foi descoberto através de duas variedades geneticamente 
diferentes da bactéria E. coli, que foram cultivadas juntas. Uma das 
bactérias doa o DNA e a outra recebe-o. A capacidade de doar DNA está 
ligada à presença do plasmídeo F (de fertilidade): as bactérias F+ são 
doadoras e as F- são recetoras. 
1) Forma-se o pilus, que une as células e se vai retraindo até surgir 
um “canal de interligação” entre elas  O par de células fica 
estabilizado. 
2) O plasmídeo F é separado em dois, e uma das partes migra para 
a célula F-. A parte que fica na célula F+ é automaticamente 
replicada. 
3) Ocorre replicação da parte que fica na célula F-. 
4) Completa-se a transferência de DNA e as células separam-se. 
A doação de DNA faz-se então por troca de plasmídeos. Contudo, a incorporação do fator F pelo 
genoma da bactéria não é controlada tecnologicamente, acabando por não ser muito útil. 
Por vezes, uma pequena parte do DNA cromossómico une-se ao plasmídeo e é também 
transferido, podendo sofrer recombinação com o cromossoma da bactéria recetora. Isto aumenta 
a variabilidade genética da população bacteriana e também permite adaptação ao meio. As 
bactérias que possuem os plasmídeos recombinados chamam-se Hfr (High Frequency of 
Recombination). 
 Não é adequada para uso tecnológico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
NOTA: Juntamente com o gene F, 
passa-se o gene R que é o de 
interesse tecnológico, o qual confere 
uma característica vantajosa em 
termos evolutivos, como por exemplo 
resistência a antibiótico 
 Engenharia Genética F2 
 
18 
 
Transposão: transferência de genes de uns cromossomas para outros, resultando na inibição 
ou ativação de outros genes – movimentação de partes móveis de DNA de uma região do 
genoma para outra. 
 Do ponto de vista tecnológico são usados, mas têm a dificuldade de nunca se saber 
onde vão ser incorporados, acabando por não interessar muito (não se usam). 
 Podem resultar em doença ou variabilidade genética. 
 Permite que o ambiente de expressão mude. 
Inicialmente temos um plasmídeo que contém o 
transposão (Tn), que corresponde ao gene 
“amovível”, e o cromossoma-alvo, ambos com 
estrutura circular. Estes vão sofrer um corte por 
enzima de restrição e tornar-se lineares, e 
simultaneamente vai haver duplicação do Tn, e 
o gene fica com um transposão em cada 
extremidade. Após isto haverá cointegração do gene-dador no cromossoma-alvo, adquirindo o 
recombinante no final estrutura circular. Durante este processo há disrupção dum gene no 
cromossoma-alvo no meio do qual é colocado o gene com os transposões. 
Os transposões vão depois emparelhar e recombinar, o que leva à libertação de ambos os 
plasmídeos, ficando um transposão em cada. No final vamos então ter o transposão inicial e 
cromossoma-alvo com o transposão inserido. 
 
 
 
 
 
 
 
 
MECANISMOS DE TRANSFORMAÇÃO ARTIFICIAL 
Em células bacterianas (como a E. coli) geralmente recorre-se a transformação artificial, para 
preparar bactérias competentes. Contudo, este processo é bastante improvável de acontecer 
devido à ação das enzimas de restrição que impedem a transformação das bactérias. Para 
aumentar a probabilidade podem ser feitos dois tratamentos: 
 Tratamentos químicos com cálcio, manganésio, etc., nos quais se exausta 
energeticamente as bactérias, tornando-as competentes para receber o DNA (as 
bactérias são modificadas), após a inserção do qual se fornecem condições às bactérias 
para elas recuperarem. 
 O Ca e o Mn constituem pequenas moléculas que entram passivamente nas 
células, tendo estas de os excretar por transporte ativo usando mecanismos de 
iões bivalentes. Se administrarmos grandes concentrações destas moléculas, a 
bactéria fica esgotada energeticamente. 
 A administração de Ca aumenta a eficiência de recombinação em 106 
(ou seja, por cada µg de DNA tem-se 106 recombinantes), e se este for 
associado ao Mn, a eficiência sobe para os 108. 
 
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19 
 
 Tratamentos físicos como a eletroporação, processo no qual se submete as bactérias 
a uma corrente elétrica que altera a estrutura celular sem destruir o organismo, abrindo 
orifícios que permitem a passagem do material genético. Para tal é necessário uma 
corrente rápida e potente, tendo de se controlar bem estes parâmetros (se o tempo for 
demasiado pequeno, os orifícios fecham demasiado rápido). Este é o tratamento de 
eleição, embora seja dispendioso. 
 Aumenta a eficiência de transformação para 1010. 
 Transdução: não sendo propriamente um tratamento para aumentar a eficiência de 
transformação, pode constituir um método de transformação artificial. 
 
 
Em células eucariotas também se usam mecanismos de transformação artificial, tais como: 
 Gene gun: dispositivo que dispara DNA a alta velocidade e induz a entrada física deste 
na célula. Já não se usa. 
 Microinjeção; Eletroporação; Infeção viral 
* 
Os elementos genéticos passíveis de ser usados na transformação artificial são os plasmídeos 
(replicação independente), os episomas (livres ou integrados) e os transposões (integrados 
inespecificamente) e vírus (com ciclo parcialmente extracelular). 
Em todo o caso, o DNA que queremos transformar tem de apresentar uma vantagem seletiva 
que no caso das bactérias consiste na resistência a um antibiótico, enquanto nas células 
eucariotas trata-se de uma vantagem metabólica (como foi visto nos YACs). 
 
 
SELEÇÃO DOS HOSPEDEIROS RECOMBINANTES 
Já vimos atrás como funciona a seleção dos hospedeiros recombinantes para o caso dos 
plasmídeos pBR322 e pUC19. 
Também já vimos que, juntamente com o plasmídeo recombinado (com insert) que nos interessa, 
podem surgir outras moléculas como: 
1) Plasmídeo com insert invertido (insert colocado ao contrário no plasmídeo que, mesmo 
sendo recombinante, não vai exprimir o produtodesejado), com fragmento do insert. 
com múltiplos inserts ou com fragmentos contaminantes. 
 No caso de pUC19, nenhuma destas moléculas vai exprimir a β-galactosidade, 
mas também não têm interesse. 
2) Plasmídeo fechado sobre si mesmo, direto ou invertido. 
 No caso de pUC19, estes vão exprimir a β-galactosidade, sendo descartados. 
3) Plasmídeo recircularizado que consiste num plasmídeo mutado 
 No caso do pUC19 não exprime a β-galactosidade. 
4) Fragmentos diversos recombinados ou não sem plasmídeo – são irrelevantes. 
 
A eficiência de transformação é calculada pelo 
nº de recombinantes a dividir pelas µg de DNA. 
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20 
 
Em pUC19, o caso 4) é eliminado pelo antibiótico e o caso 2) é eliminado aquando do teste com 
o meio IPTG+x-gal (substrato cromogénico) porque forma colónias azuis, sendo 
automaticamente descartados. O problema serão todos os plasmídeos recombinados que não 
exprimem a β-galactosidade, tendo de selecionar-se entre eles, o do nosso interesse (com o 
insert direto). Para tal recorre-se uma seleção específica. 
Resumindo, temos portanto uma seleção em duas fases: 
1) Uso de marcadores genéticos com possibilidades transformantes, tais como: substratos 
cromogénicos (IPTG/x-gal), inativação por inserção (β-galactosidase) e 
complementação de mutações definidas. 
2) Seleção específica por hibridação com sondas moleculares de ácidos nucleicos ou por 
seleção imunológica (baseada na expressão das proteínas) 
Como teste de confirmação, no final, podem ser usadas várias tecnologias de análise dos genes 
clonados como: tradução in vitro de mRNAs, mapas de restrição, técnicas de blotting (Southern, 
Northern, Western, Dot-blot) e sequenciação. A última corresponde à forma mais fidedigna de 
conhecer o recombinante. 
 
 
HIBRIDAÇÃO MOLECULAR: uso de sondas nucleotídicas com o seu DNA marcado 
radioactivamente (caiu em desuso por ser prejudicial à saúde) ou por luminescência, o qual 
hibrida com as bactérias transformadas e liga-se por complementaridade ao insert, sendo este o 
processo mais usado. As sondas usadas consistem: 
 No próprio DNA do insert, o qual é marcado e desnaturado, ficando em cadeia simples, 
e assim consegue hibridar com a bactéria. 
 Num plasmídeo pré-existente específico que pode ser um fragmento conhecido ou uma 
sequência correspondente a regiões conservadas entre proteínas de várias espécies. 
 No DNA total do dador do insert, o que só é possível se o DNA não for do próprio 
organismo. 
 cDNA do dador do insert, que tem um tamanho menor do que o DNA total e vai fazer um 
screening apenas dos RNAs em expressão. 
 Oligonucleótidos artificiais ou fragmentos de PCR, mas só podem ser usados 
conhecendo a sequência do insert. 
 Os oligonucleótidos são difíceis de desenhar por se basearem no código 
genético que é degenerado, sendo feitas com base na sequência de 
aminoácidos da proteína codificada pelo gene-alvo: se não soubermos ao certo 
o tripleto (a sequência de DNA complementar ao gene-alvo) temos de pôr todas 
as combinações de aminoácidos possíveis (pois um aminoácido pode ser 
codificado por vários tripletos) – vamos ficar com muitas (demasiadas) 
sequências para combinar com o insert. 
A marcação das sondas, por sua vez, pode ser feita de três maneiras: 
Random printing: é a técnica mais usada e consiste em desnaturar por calor o DNA da 
sonda. Em seguida são adicionados oligonucleótidos que hibridam em ambas as cadeias e 
funcionam como primers. Por ultimo junta-se DNA polimerase I (Klenow, ou seja, sem 
atividade de exonuclease), 3 dNTPs normais e 1 marcado. Vão então formar-se cadeias em 
que um nucleótido está marcado e pode ser detetado por Southern blotting. 
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21 
 
Nick-translation: é semelhante ao 
random printing, mas aos poucos está 
a ser substituída pelo mesmo. Nesta 
técnica submete-se o DNA da sonda 
à ação da DNase que promove a 
formação de uma abertura em cada 
uma das cadeias (em extremos 
opostos). O DNA é depois incubado 
com DNA polimerase I (que além de 
polimerase 5’3’, tem também ação 
de exonuclease) e dNTPs radioativos. Assim a polimerase liga-se à extremidade 3’-OH 
proporcionada pelo primer e vai remover a restante cadeia de DNA original, e sintetizar uma 
nova cadeia (complementar à adjacente) com os nucleótidos radioativos disponíveis. 
Marcação terminal: é uma técnica que já não se usa, mas que consiste na marcação num 
dos extremos (3’ ou 5’) com 32P radioativo que permite a deteção da sonda. 
 
 
SELEÇÃO IMUNOLÓGICA 
Deteção da proteína recombinante: faz-se um screening 
da proteína por imunodeteção (western blotting). 
Deteção da atividade proteica: verifica-se se a proteína 
está a desempenhar as duas funções, ou seja, se há 
reação enzimática. 
Identificação de fenótipo: consiste em observar as características fenotípicas (metabólicas) 
resultantes da expressão da proteína codificada pelo insert por complementação funcional. 
 
 
MAPAS DE RESTRIÇÃO: conhecendo o mapa de restrição do DNA insert para determinada 
enzima, podemos fazer uma digestão parcial e assim descobrir se na amostra usada existem 
fragmentos com tamanho idênticos ao insert. Pode assim, ser útil na seleção específica de 
recombinantes. 
 
BLOTTING 
Southern blotting 
Após uma eletroforese em gel de agarose para separar os fragmentos de DNA, para que se 
consiga ligar uma sonda ao DNA-alvo, este deve estar em cadeia simples, o que é conseguido 
por desnaturação. Contudo, o gel da eletroforese derrete com o aumento da temperatura, e por 
isso é necessário primeiro transferir o DNA para uma membrana, para que se possa aplicar a 
sonda. Isto é feito da seguinte forma: 
 
Contudo, a proteína pode apresentar 
mutações ou folding errado, e por isso 
estes métodos não são muito usados, 
embora nem todos os clones sejam iguais 
e possa haver proteínas com folding 
adequado entre as outras. A baixa 
frequência de clones selecionáveis torna 
o método pouco vantajoso. 
 Engenharia Genética F2 
 
22 
 
1) Põe-se uma folha de nylon ou microcelulose 
por cima do gel de eletroforese. 
2) A folha de nylon é coberta por muito papel 
absorvente e um peso no topo (0,5kg). 
3) Estas camadas são todas colocadas em cima 
de papel absorvente em forma de ponte, cujas 
pontas são mergulhadas numa solução 
alcalina. 
Este procedimento vai permitir a migração do gel para 
a folha de nylon (de nitrocelulose) por capilaridade – o 
papel absorvente “puxa” o líquido e arrasta os 
fragmentos de DNA, que ficam na folha de nylon – 
Transferência por Southern (por isso se dá o nome 
de Hibridação de Southern). 
Para que os fragmentos de DNA fiquem bem fixos à membrana de nylon, submete-se a mesma 
a uma temperatura de 120oC durante 30min ou a luz UV. 
Em seguida: 
 
 
 
 
A temperatura elevada vai permitir a ligação química entre a sonda e o gene-alvo. Para depois 
estudar o gene em causa é necessário realizar nova eletroforese para isola-lo. 
* 
Hibridação em colónias: pode-se usar uma técnica semelhante ao Southern blotting em colónias, 
mas no qual não é necessário recorrer à eletroforese, pois a técnica é aplicada in situ. Assim, as 
células são transferidas para uma membrana (equivalente à folha de nylon) e depois provoca-se 
a lise celular e a desnaturação do DNA, bem como a sua ligação à membrana. O DNA é depois 
hibridado in situ com a sonda, que se liga apenas ao DNA de interesse, identificando-o. 
 
Northern blotting 
Processo muito semelhante ao Southern blotting, mas no qual se usa RNA em vez de DNA. 
Contudo, é preciso ter muito cuidado quando o RNA é tratado. 
1) Eletroforese de RNA (o RNA também tem carga negativa). 
2) Fragmentos de RNA tratados com formaldeído para desnaturar. 
3) Transferência para membrana – Northern. 
4) Hibridação com sonda. 
Exemplo de aplicação: quando queremos saber onde está o mRNA e uma extração total de RNA. 
 
Coloca-sea folha de nylon 
num saco com solução de 
hibridação e a sonda, 
fechamo-lo e colocamo-lo 
em banho de água a 60oC. 
Enrolamos a folha de nylon num 
fraco cilíndrico com a solução 
de hibridação e a sonda, que vai 
a um forno que roda. 
OU 
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23 
 
Western blotting ou immunoblotting 
Para detetar uma proteína particular numa mistura utilizam-se anticorpos como sondas. Começa-
se por desnaturar as proteínas com SDS e depois aplica-las a um gel de eletroforese de 
poliacrilamida. Para poder aplicar os anticorpos tem-se de transferir as proteínas para uma 
membrana, mas como a poliacrilamida torna o gel mais compacto do que a agarose, esta 
transferência tem de ser feita por transferência elétrica, aplicando uma corrente elétrica. 
Após isto os anticorpos são administrados (podem ser radioativos) que se vão ligar 
especificamente aos antigénios, revelando qual nossa proteína de interesse. 
 
* 
Seleção por expressão: pode-se usar uma técnica semelhante ao Western blotting em colónicas, 
mas no qual não é necessário recorrer eletroforese, pois a técnica é aplica in situ. Assim, as 
células são transferidas para uma membrana (equivalente à folha de nylon) e depois provoca-se 
a lise celular e a ligação das proteínas à membrana. 
A membrana é em seguida tratada com os primeiros anticorpos, depois lava-se (para remover 
aqueles que não ficaram ligados) e é tratada com segundos anticorpos, lavando-se novamente 
no final (para remover os 2os anticorpos que não ficaram ligados). Com a ligação dos anticorpos 
é possível fazer uma seleção in situ dos recombinantes. 
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24 
 
 
 Engenharia Genética F2 
 
25 
 
II - MANIPULAÇÃO DE ORGANISMOS 
MANIPULAÇÃO DE PROCARIOTAS 
Para a expressão de um gene clonado num procariota é necessário um conjunto de elementos: 
 Elementos para transcrição (TATA box, promotor e terminador da transcrição) 
 Sequências para a tradução (RBS (sequência de Shine-Dalgarno), AUG e codão STOP) 
 Elementos para processamento (péptido de sinal para secreção da proteína final se for 
necessário) 
 Não hidrólise do produto – o normal é o organismo degradar a nossa proteína de 
interesse porque ela é-lhe estranha. Para garantir uma maior estabilidade da proteína 
final e diminuir a sua degradação usa-se por exemplo uma proteína de fusão, ou seja, à 
nossa proteína de interesse é acoplada de uma proteína própria do organismo 
hospedeiro. 
 Função biológica do produto pode não ser compatível com o organismo hospedeiro e 
por isso é necessário regular a sua expressão (por exemplo: clonar enzimas de restrição 
de outra bactéria em E. coli pode resultar na degradação do DNA desta). 
Nos procariotas produz-se um mRNA mais simples (relativamente aos eucariotas) e não ocorre 
a sua maturação, ou seja, quando ele é transcrito pode ser logo traduzido. A transcrição e a 
tradução ocorrem no mesmo compartimento, pelo que os processos acabam por ocorrer em 
simultâneo, isto é, a tradução pode começar antes da transcrição estar completa (isto não 
acontece nos eucariotas, pois os processos são separados fisicamente. Excecionalmente 
ocorrerá se existirem no núcleo ribossomas que controlem a qualidade do RNA). 
Assim, o único ponto possível de regulação é, quase exclusivamente, a nível da transcrição. 
 
TRANSCRIÇÃO DIFERENCIAL 
Relaciona-se com a taxa de transcrição que 
ocorre. Se for transcrito muito RNA temos muita 
proteína, enquanto se for transcrito pouco RNA 
temos pouca ou mesmo nenhuma proteína. 
 
 
OPERÕES – PROMOTORES PROCARIÓTICOS 
Contrariamente aos eucariotas, nos procariotas o promotor é reconhecido pelo fator sigma, 
 da RNA polimerase, que se liga a ele e desnatura a dupla hélice de DNA. A polimerase depois 
liga-se à cadeia simples e inicia a síntese de RNA, após libertação do fator sigma. 
Fazendo o alinhamento de várias sequências de genes da E. coli, podemos confirmar que as 
zonas em que há maior nº de nucleótidos em comum são as regiões -35 (TTGACAT) e -10 
(TATAAT). Essas regiões são então chamadas de regiões de consenso. 
NOTA: Podemos ver na imagem que a sequência codificante do gene é a parte a azul (que só 
começará com o codão ATG), mas a transcrição inicia-se antes (em +1), numa região que 
permite a ligação ao mRNA (região 5’-UTR), que embora depois não seja traduzida, é bastante 
importante para a ligação aos ribossomas. 
Sequência de consenso: sequência ideal no gene para interação com 
proteínas de regulação (sejam elas fatores de transcrição ou fatores sigma). 
 
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Os genes dos procariotas são maioritariamente policistrónicos (podem atuar vários ribossomas 
simultaneamente e do mesmo gene podem surgir diferentes proteínas) e a sua regulação é feita 
de forma conjugada por operões, sendo um processo mais simples e apenas a nível da 
transcrição e da tradução. 
 
Operões (cluster): controlam a expressão de vários genes (que não façam sentido ser 
expressos uns sem os outros) – genes policistrónicos – de modo a que esta seja apenas 
“ativada” quando o produto do gene é necessário à célula. 
São constituídos por um gene promotor, um gene operador e os genes estruturais. A estes 
liga-se um 4º gene, o gene regulador, que não faz parte da constituição do operão, mas funciona 
em parceria com. 
 O gene promotor ou promotor próximal é a região (a curta distância do extremo 5’) 
onde a enzima RNA polimerase, responsável pela transcrição dos genes estruturais e 
fatores de transcrição, se liga. 
 O gene operador é o que controla o acesso da RNA polimerase aos genes estruturais, 
regulando a sua transcrição, sendo o local onde se liga a proteína reguladora. 
 Os genes estruturais são onde se encontra codificada a informação genética 
necessária para a formação de certas proteínas. 
 O gene regulador vai ser constantemente transcrito e traduzido, produzindo 
continuamente pequenas quantidades de uma enzima proteica, o repressor. Esta 
enzima pode ser codificada na forma ativa (na qual se vai ligar ao gene operador, 
impedindo a passagem da RNA polimerase proveniente do gene promotor e, 
consequentemente, impedindo a transcrição dos genes estruturais) ou na fase inativa 
(na qual não se liga ao gene promotor, permitindo, assim, a passagem da RNA 
polimerase e a transcrição dos genes estruturais). A cada operão está associado um 
gene regulador que só produz repressores numa das formas, ativa ou inativa, nunca 
alternando entre elas. 
 
 
 
 
 
 
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Promotor lac (lactose) 
 É dos promotores mais usados porque 
é facilmente regulado. 
A lactose é um açúcar usado pelas bactérias 
para obter energia. A E. coli necessita de 
sintetizar três enzimas (proteínas) que ajudem 
no processamento da lactose, para que esta 
possa atravessar a membrana citoplasmática. 
Na ausência de lactose, o gene regulador 
produz um repressor na forma ativa, que se 
liga ao gene operador, impedindo a passagem 
da RNA polimerase e consequentemente a 
transcrição dos genes estruturais. 
Na presença de lactose, esta liga-se ao 
repressor originando uma alteração 
conformacional que o torna inativo, o que vai 
levar à sua desconexão do gene operador, 
permitindo deste modo a passagem da RNA 
polimerase e a transcrição dos genes 
estruturais, após a tradução dos quais serão 
produzidas as enzimas necessárias ao 
metabolismo da lactose, ou seja, para a sua 
degradação em glucose. 
 Quando é adicionada ao meio, a lactose ativa a expressão dos genes – regulação 
positiva. 
 A ligação da RNA polimerase ao promotor lac é fraca e requer frequentemente ativação 
pela CAP (Catabolite Activator Protein). 
Quando a concentração de lactose começa a baixar drasticamente, devido à ação catalítica das 
enzimas (que a metabolizam em glucose e ATP), a lactose desliga-se do repressor, que, ao voltar 
à forma ativa,liga-se novamente ao operador, bloqueando a transcrição do operão, garantindo 
uma poupança de recursos que não são necessários na ausência de lactose. 
Como alternativa pode-se usar IPTG que funciona, analogamente à lactose, como inibidor da 
proteína reguladora. Contudo, este composto não é metabolizável e por isso não gera energia, 
e a expressão dos genes nunca cessa. 
É uma via catabólica em que há produção de energia, e os genes catabólicos são sempre 
regulados pelos níveis energéticos, ou seja, pelos níveis de concentração de ATP e AMP 
cíclico (que são inversamente proporcionais). Assim, como o aumento da glucose leva ao 
aumento de ATP (e diminuição de cAMP), na presença de muita glucose a expressão dos 
genes é inibida porque há demasiada energia. 
NOTA: A célula precisa de um nível de energia elevado para expressar o recombinante, mas 
se for muito elevado não o vai expressar porque não precisa. Por outro lado, se os níveis 
forem muito baixos a célula definha. É por isto preciso encontrar um nível intermediário 
adequado às condições experimentais em que trabalhamos. 
A lactose funciona como um indutor, pois a sua presença ativa o operão. É também por isso 
que se dá o nome de operão/promotor indutível. 
 Engenharia Genética F2 
 
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Se houver tanto lactose como glucose no meio a bactéria não precisa degradar a lactose e por 
isso a expressão dos genes não é ativada – há portanto um duplo controlo do operão lac: 
 Quando não há nem glucose nem lactose no meio, a CAP liga-se mas também o 
repressor se liga, pelo que continua sem haver expressão dos genes estruturais. 
 Quando há glucose e não há lactose no meio, o operão está inativo porque há ligação 
do repressor ao gene operador e ainda porque a CAP não se liga. 
 Quando há glucose e lactose no meio, a CAP não se liga e por isso não há expressão. 
 Quando não há glucose mas há lactose, há ligação da CAP e da RNA polimerase porque 
o repressor é inativado pela lactose. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Concluindo: este promotor é induzido por lactose e IPTG e amplificado pelo cAMP (e depleção 
de glucose). 
 
 
Promotor trp (triptofano) 
 
Os genes estruturais deste operão, quando transcritos e traduzidos, originam enzimas 
necessárias à produção do aminoácido triptofano, sendo que o gene regulador deste operão, 
contrariamente ao que acontecia no operão lac, codifica um repressor na forma inativa. 
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29 
 
Desta forma, quando as concentrações intracelulares deste aminoácido são baixas, o repressor 
inativo, não podendo ligar-se ao gene operador, vai deixar o operão ativo, permitindo a passagem 
da RNA polimerase até aos genes estruturais e a produção das enzimas, levando, assim, ao 
aumento da concentração de triptofano. 
Quando a concentração deste aminoácido é elevada, 
algumas moléculas deste aminoácido ligam-se ao 
repressor, modificando a sua conformação e tornando-
o ativo, pelo que ele se liga ao operador, bloqueando a 
transcrição dos genes estruturais do operão. 
 Se houver cerca de 50% de triptofano no meio 
intracelular há uma atenuação da expressão 
dos genes, sendo que vai haver alguns 
fragmentos de RNA muito pequenos e 
algumas proteínas que não são expressas. Ou 
seja, em alguns casos a transcrição termina 
antes de atingir a sequência em hairpin. 
 
 Como quando está no meio, o triptofano inibe a expressão dos genes estruturais deste 
operão diz-se que faz uma regulação negativa. 
Concluindo: este promotor é induzido por depleção de triptofano e presença de ácido 3-
indolacrílico, e reprimido pela presença de triptofano. 
 
Promotores tac e trc 
Enquanto os promotores lac e trp eram promotores naturais nativos que existem na E. coli, os 
promotores tac e trc são híbridos artificiais feitos em laboratório que não existem na bactéria 
selvagem. Estes vão permitir uma produção 3x superior ao operão trp e 10x superior ao lac. 
Estes vão ter uma região TATAbox (-10) igual à do operão da lactose e uma região CGbox (-35) 
igual à do operão triptofano. Isto vai permitir-lhes ter uma regulação fácil e produzir em grandes 
quantidades como o operão lac e, por outro lado, a capacidade “babosa” do operão trp que é 
constitutivo, ou seja, está constantemente a produzir (a menos que seja reprimido). 
 
 
OPERÕES – PROMOTORES PROCARIÓTICOS FÁGICOS 
Os vírus são parasitas obrigatórios de outras células, sendo os específicos das bactérias 
chamados de bacteriófagos. Os promotores destes bacteriófagos acabam por ser mais fortes 
que os das próprias bactérias, e por isso é que estas são infetadas. 
 
A via anabólica consome energia, sendo uma via que está sempre ativa em contínua 
síntese, e que só para quando não é necessária devido à presença excessiva do seu próprio 
produto. 
A expressão destes genes é constitutiva, ou seja, contante, sendo que o triptofano atua como 
co-repressor. Este operão/promotor diz-se então reprimível. 
 
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Promotor pL: promotor de bacteriófago λ é regulado pela proteína codificada pelo gene CI, a 
qual é termosensível: a 30oC está ativa e liga-se ao promotor impedindo a transcrição dos genes, 
enquanto a 42oC desnatura e fica inativa, havendo expressão do promotor. A expressão dos 
genes estruturais deste promotor leva à formação de viriões. 
O que se faz é clonar em laboratório esta proteína juntamente com o promotor pL no qual está 
inserida a nossa proteína de interesse, em E. coli. Assim, quando se cultiva a bactéria a 30oC 
nada acontece e a bactéria cresce e a biomassa aumenta. A determinada altura, quando 
queremos que a bactéria comece a sintetizar o nosso produto, aumentamos a temperatura para 
42oC. 
 
Promotor pT7: o promotor de bacteriófago T7 é apenas reconhecido pela polimerase fágica T7 
RNA polimerase, e portanto nenhuma polimerase bacteriana o consegue reconhecer. Neste 
sentido, usando este promotor numa bactéria (por ser mais forte) tem-se de clonar também nela 
um gene codificante da polimerase fágica, o qual não precisa de ser muito tempo expresso 
porque a polimerase é extremamente ativa por apenas reconhecer um promotor. 
Desta forma, usa-se o gene lacI que vai codificar uma proteína que ao ligar-se ao promotor do 
gene codificante na polimerase fágica permite a sua expressão, e esta polimerase, por sua vez, 
vai induzir o promotor pT7 e permitir a expressão do nosso gene de interesse. Além da proteína 
lac também se pode usar IPTG para induzir a expressão da polimerase fágica. 
Este promotor pT7 é extremamente potente e permite desencadear um processo catastrófico de 
expressão, aumentando a quantidade de produto de interesse obtido. 
 
 
INDUÇÃO DA EXPRESSÃO/ AUMENTO DA PRODUÇÃO 
Repressores e promotores: quando a molécula repressora é muito forte é muito complicado 
induzir a expressão dos genes. Para solucionar o problema existem várias estratégias que 
podem ser aplicadas como reduzir o nº de cópias do gene codificante da molécula repressora no 
plasmídeo (ou cromossoma) ou aumentar o nº de cópias do gene de interesse. 
Em repressores pouco eficazes, o promotor é leaky, ou seja, está constantemente a exprimir os 
genes estruturais – é constitutivo. Se se quiser reverter a situação pode-se aplicar estratégias 
contrárias às indicadas para o repressor forte. 
 
Temperatura: se aumentarmos a temperatura as proteínas desnaturam e o promotor fica livre 
para poder produzir mais. Para aumentar a temperatura contudo precisa-se de uma fonte de 
calor com temperatura extremamente elevada, caso contrário o processo demora muito tempo. 
Além disso, o consumo energético é muito elevado e são necessários fermentadores especiais. 
É por isso necessário avaliar bem se o processo é economicamente rentável antes de o aplicar. 
 
Detergentes e promotores fágicos: a lactose é um indutor da expressão barato que, no 
entanto, não pode ser utilizada porque é metabolizada e satura o AMP cíclico. A alternativaé 
usar IPTG para exprimir os promotores da lactose que, no entanto, são “fracos” e acaba-se por 
micae
Realce
micae
Realce
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gastar muito dinheiro para exprimir pouco. Por este motivo é que se recorrem a promotores 
fágicos para controlar a expressão dos genes: um exemplo é a regulação em cadeia (trp+pL). 
(trp+pL): coloca-se o gene codificante da proteína CI acoplado a um promotor do triptofano e o 
nosso gene de interesse acoplado a um promotor pL, apenas ativado na ausência da proteína 
CI. À medida que a bactéria cresce vão surgindo cada vez mais promotores pL e por isso são 
necessárias mais proteínas CI para os inibir, basta então fazer crescer a bactéria num meio pobre 
em triptofano e assim o promotor trp ativo vai exprimir a proteína CI que por sua vez inibe o 
promotor pL e consequentemente a transcrição do nosso gene de interesse. 
Para induzir a expressão basta colocar a bactéria num meio rico em triptofano, o qual vai inibir o 
promotor trp e não se expressão a proteína CI. Desta forma, o promotor pL fica livre e o nosso 
gene de interesse é expresso, sem ser preciso um processo dispendioso de aumento de 
temperatura. Usando esta estratégia consegue-se 20% mais conteúdo proteico de interesse, o 
que é muito significativo. 
 
Múltiplas cópias do gene: quanto maior quantidade de genes, maior quantidade de RNA e 
maior quantidade de proteína sintetizada. Isto pode conseguir-se com múltiplas cópias do gene 
em tandem no plasmídeo e/ou com múltiplos plasmídeo em cada célula. Contudo, a relação nem 
sempre é de proporcionalidade direta e os resultados podem não ser os esperados, isto porque 
uma maior quantidade de DNA a expressar pode saturar energeticamente a célula e acabar 
mesmo por ser tóxico. Outra desvantagem é ainda a grande quantidade de cópias favorecer 
processos de recombinação genética entre elas e o aparecimento de mutações, o que diminui a 
estabilidade da proteína final, podendo mesmo obter-se um produto diferente do desejado. 
 
Aumentar a eficiência na tradução: existem duas maneiras fundamentais de aumentar a 
eficiência do processo de tradução para aumentar a produção da nossa proteína de interesse: 
 A distância entre as regiões RBS (Shine-Dalgarno) e AUG (codão de iniciação) 
determina a ocorrência ou ausência de tradução, nomeadamente se estiverem muito 
afastadas o ribossoma desliga-se da cadeia de mRNA, e se estiverem muito próximas 
ele é capaz de não reconhecer o codão de iniciação, não ocorrendo portanto tradução. 
Outro aspeto que influencia é a estrutura secundária do mRNA, a qual determina a 
afinidade para com o ribossoma. 
 Os codões do mRNA devem ser adaptados ao hospedeiro em causa, substituindo-os 
por aqueles que surgem em maior frequência no mesmo, ou seja, aqueles para os quais 
o hospedeiro sintetiza tRNAs complementares. Também se pode induzir a célula a 
sintetizar t-RNAs em falta em vez de alterar-se os codões. 
 As adaptações nos codões são feitas por 
mutagénese dirigida ou por PCR. Na primeira 
muda-se apenas um nucleótido fazendo-se um 
primer de oligonucleótidos abrangente à cadeia de 
mRNA na região onde se quer inserir a mutação, 
mas o local central onde se encontra o nucleótido 
mutado não emparelha. A nova cadeia é depois 
sintetizada por complementaridade com a restante 
cadeia de mRNA. Desta forma vamos ficar com 
uma linhagem de plasmídeos mutada e outra não. 
A primeira permite obter uma grande quantidade 
de plasmídeos mutantes. 
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32 
 
Minimizar precipitação: é muito complicado recuperar uma proteína depois desta precipitar. 
Para minimizar a precipitação podem usar-se proteínas integrais da membrana (como é o caso 
da tioredoxina). 
Folding e secreção apropriados: o folding da proteína pode não ser adequado ao hospedeiro, 
o que dificulta a sua secreção. Para melhorar o folding pode recorrer-se a proteínas DsbC 
(dissulfide bond-forming protein), que estabelecem pontes dissulfídricas entre cisteínas, 
garantindo que a proteína adquire uma estrutura correta. 
Consumos de oxigénio: clonando um gene, por exemplo o da hemoglobina bacteriana, 
juntamente com o nosso recombinante, consegue-se aumentar a capacidade do hospedeiro em 
captar oxigénio necessário às suas funções metabólicas, de modo a fazer face à expressão do 
nosso recombinante (processo que requer funções metabólicas mais exigentes). 
 
 
AUMENTO DA ESTABILIDADE DO NOSSO PRODUTO 
A proteína que recombinamos é um produto extremamente instável por ser estranho ao 
organismo hospedeiro em que é clonada, fazendo este de tudo para a degradar e eliminar. 
Existem, contudo, algumas estratégias para aumentar a estabilidade do nosso produto e, 
consequentemente, a sua durabilidade. 
 
Proteína de fusão: fundir com a nossa proteína uma proteína própria do hospedeiro (por 
exemplo, a β-galactosidase), colocando entre os seus genes uma região (7 aminoácidos) – linker 
de fusão – que funciona, após a expressão, como péptido-sinal reconhecido pelas protéases, 
separando assim no final o produto de interesse da proteína do hospedeiro. Esta proteína “extra” 
vai impedir a formação de corpos de inclusão destinados à destruição da proteína de interesse 
estranha ao organismo. 
Coloca-se primeiro a proteína recombinante ou primeiro a do hospedeiro? Depende da situação, 
tendo de se testar qual o melhor método, pois ambas as proteínas têm de estar na mesma grelha 
de leitura. Este passo pode mesmo afetar a estabilidade final do produto. 
Linker de purificação: além dos linkers de fusão explicados anteriormente, existem também os 
linkers de purificação que permitem recolher a nossa proteína de interesse de entre os restantes 
constituintes da fermentação por cromatografia de afinidade, ficando o nosso produto ligado à 
coluna da fase estacionária. 
 Um exemplo é a expressão de Il2, uma citoquina (proteína) humana do sistema 
imunitário que nunca havia sido possível produzir em bactérias até ser fundida com uma 
proteína bactéria por meio de um linker de fusão. Este linker vai ainda ser útil para 
remover a proteína de interesse do meio de cultura, sendo depois cortado por uma 
peptidase. 
 Outra forma alternativa de conseguir produzir e purificar a nossa proteína de interesse 
numa bactéria é hibridá-la com uma proteína integral de membrana que prende a 
nossa proteína do lado exterior da membrana, não havendo assim uma secreção total 
dela. Isto leva a que a proteína fique relativamente concentrada no fermentador, não 
sendo necessário processar todo o meio de cultura, apenas a biomassa. Contudo, não 
é um método muito rentável. 
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Marcadores seletivos (antibióticos): o uso de antibióticos para manter o gene de interesse à 
escala industrial não é rentável pois além de constituir lixo que depois tem de ser processado, 
tendo um custo relativamente elevado associado, e de promover a ocorrência de bactérias 
resistentes a antibióticos, são reagentes que só por si são muito caros. Existem algumas 
soluções alternativas ao seu uso que são mais vantajosas: 
 Limitar o número de gerações por ciclo de produção evitando assim a perda do 
plasmídeo potenciada por mutações decorrentes dos processos de replicação. Para isto 
é preciso estimar a taxa de perda do plasmídeo de interesse e determinar o ritmo de 
trabalho adequado para eu não haja perda do mesmo. É ainda extremamente importante 
manter uma vigilância da sequência codificante do gene ou proteína durante o processo 
para assegurar que ainda se tem. 
 Integrar o plasmídeo no cromossoma do hospedeiro por recombinação homóloga. 
Contudo, a recombinação tem de ser feita com regiões que não sejam críticas ao 
crescimento do organismo em causa. 
 
Bancos de células: devido às mutações vistas atrás que ocorrem em todos os ciclos de 
replicação dos hospedeiros e que potenciam a perda do nosso gene de interesse, é aconselhávelrecorrer a bancos de células. Nestes bancos começa-se por obter uma célula com as 
características ideais e o nosso recombinante, tendo esta de ser exaustivamente bem 
caracterizada, a qual é depois clonada (faz-se uma cultura em massa) e no final congela-se o 
lote de células, todas com características iguais. 
Faz-se a cultura, congelam-se 1000 ampolas e usa-se uma para fazer outra cultura em massa. 
Desta 2ª congelam-se mais 1000 ampolas e usa-se uma para produção industrial. Desta forma, 
estes bancos vão assegurar 106 ciclos de produção controlados e idênticos, com conservação 
da estabilidade genética do recombinante. Isto assegura disponibilidade contínua de células em 
caso de acidentes ou situações indesejáveis durante o processo de produção industrial do nosso 
recombinante. 
 Embora ocorra variabilidade genética que nunca se consegue erradicar, é sempre 
constante (o número de mutações não aumenta, é sempre constante). 
 
Aminoácido N-terminal: é o aminoácido N-terminal da proteína de interesse que é reconhecido 
e sinalizado com ubiquitina para futura destruição da proteína, podendo-se substitui-lo por um 
com maior tempo de semi-vida, o que aumenta a estabilidade da proteína e o seu tempo de vida. 
 
Célula hospedeira sem proteases: as protéases são o principal motivo de degradação da 
nossa proteína de interesse, e a sua ausência seria um fator impulsionador da estabilidade do 
produto. 
 
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PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO PROCARIÓTICO 
Concluindo, um plasmídeo de expressão procariótico deve ter: 
 Origem de replicação ou local de recombinação com cromossoma (para poder ser 
integrado no genoma do hospedeiro) para que se consiga manter o plasmídeo dentro do 
hospedeiro e se consiga passa-lo à descendência durante a replicação – no primeiro 
caso replica-se independentemente do hospedeiro e no 2º caso, dependentemente. 
 
 MCS (Multi Cloning Site) nas três grelhas de leitura para que se consiga inserir o 
gene de interesse, bem como 3 codões de terminação para a transcrição. 
 
 Promotor forte e regulável para conseguir controlar temporal e quantitativamente a 
expressão do nosso gene recombinante, uma vez que se trata de um objeto estranho ao 
hospedeiro. Quanto maior forte o promotor, maior a quantidade de produto formada, mas 
se for demasiado forte pode saturar energeticamente a célula, daí ser preciso regulação. 
 
 Marcador de seleção que garantem vantagem evolutiva na presença do recombinante, 
para que este seja preservado pelo hospedeiro. Podem usar-se antibióticos (que como 
já vimos apenas são viáveis de usar a escala laboratorial devido aos elevados custos de 
compra e tratamento de efluentes) ou aminoácidos (recorrendo a técnicas de auxotrofia, 
como o triptofano). 
 
 Sequência de péptido-sinal para secreção do produto. 
 
 Sequência de péptido (tag) removível que tanto pode servir para aumentar a 
estabilidade do gene como para melhorar a purificação do produto por cromatografia de 
afinidade. 
 
 Outros elementos relevantes de usar consoante o tipo de proteína recombinante que 
se deseja obter. 
 
 
MANIPULAÇÃO DE EUCARIOTAS 
Embora a transcrição seja um ponto importante na manipulação de organismos eucariotas, 
existem muitos mais pontos passiveis de ser regulados. A mais significativa nos eucariotas até é 
mesmo a nível do processamento pós-traducional que, contrariamente aos procariotas, nestes 
organismos é exaustivo devido à necessidade que a proteína produzida tem em migrar desde o 
local de síntese ao local de atuação. 
 Folding: tal como nos procariotas, o folding da proteína pode não ser adequado ao 
hospedeiro, o que dificulta a sua secreção. Para melhorar o folding pode recorrer-se a 
proteínas DsbC (dissulfide bond-forming protein), que estabelecem pontes dissulfídricas 
entre cisteínas, garantindo que a proteína adquire uma estrutura correta. No entanto, 
estas pontes são mais consistentes nos eucariotas, originando estruturas moleculares 
diferentes. 
 Processamento proteolítico: remoção de fragmentos internos da proteína – splicing. 
 Glicosilação: nos procariotas não ocorre glicosilação, mas nos eucariotas sim, embora 
nem todas as proteínas sejam glicosiladas da mesma forma (depende do organismo em 
causa, o processo é diferente caso se trate de leveduras, insetos ou mamíferos). Apenas 
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35 
 
as proteínas de membrana ou secreção que são sintetizadas no retículo endoplasmático 
sofrem glicosilação, pois são as únicas que passam pelo complexo de Golgi (local onde 
ocorre o processamento), dependendo o grau de glicosilação do tempo que a proteína 
demore a passar esse organelo, ou seja, o tempo que demore a ser secretada até à 
membrana ou para fora dela (embora a glicosilação seja maior nas leveduras). 
 A glicosilação pode ser feita na extremidade O- (por trionina ou serina) ou na 
extremidade N- (por aspargina). 
 Modificação de aminoácidos: por fosforilação, acetilação, etc.. 
 
A transformação consiste na introdução de DNA estranho em bactérias ou leveduras por 
alteração das propriedades de crescimento em células animais. Este ultimo caso pode, contudo, 
levar ao desenvolvimento de tumores, o que limita o seu uso em humanos. À transformação está 
também associada uma alteração do genótipo do hospedeiro com consequente alteração no 
fenótipo. 
 Transfeção: introdução de DNA em células animais. Além do DNA de interesse pode 
haver alteração de outros genes do hospedeiro (alteradas por vírus). 
 
PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO EUCARIÓTICO 
Um plasmídeo de expressão procariótico deve ter: 
 Origem de replicação (2) para E. coli (porque toda a manipulação do DNA tem de ser 
feita em E. coli) e para as células eucariotas em questão. 
 Gene de resistência a antibiótico (não se usa em células eucariotas, mas pode ser 
relevante aquando da manipulação em E. coli) ou que permita seleção metabólica para 
os eucariotas (ESM – marcador de auxotrofia). A este último tem ainda de estar 
associado o seu promotor e terminador para poder ser expresso. 
 MCS ladeado pelo promotor eucariótico e um terminador (essencial porque se a 
transcrição não terminar pode tornar-se tóxica para o organismo). 
 
 
Existem 3 hospedeiros eucariotas mais significativos na recombinação genética (por ordem de 
relevância, usando-se uma apenas quando a anterior não satisfaz os requisitos): saccharomyces 
cerevisiae (levedura alimentar), baculovírus (vírus de insetos) e células de mamíferos. Vamos 
então ver como podemos manipular cada um deles. 
 
SACCHAROMYCES CEREVISIAE 
 Levedura (sistema) unicelular alimentar, genética e fisiologicamente bem conhecido. 
 É um microrganismo GRAS (General Recognized As Safe). 
 Tem um crescimento rápido (embora não tão bom como E. coli) e é pouco exigente 
quanto ao meio. 
 Tem promotores fortes e regulados disponíveis e um processamento pós-tradução 
eucariótico. 
 
 É uma célula pouco secretora, o que constitui uma desvantagem porque geralmente 
quer-se secretar o nosso produto. 
 Mutantes auxotróficos. 
 
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Existem vários promotores para S. cerevisiae disponíveis, tanto constitutivos como indutáveis, 
para utilizar, sendo regulados por diversas maneiras consoante as suas condições de expressão. 
Atualmente já se fazem vários recombinantes nestas leveduras: para vacinas (hepatite B), 
diagnóstico clínico (hepatite C e HIV) e terapia humana (fatores de crescimento e insulina). 
Existem ainda vários tipos de plasmídeos e cromossomas que podem ser usados neste 
organismo. 
 
YEp (episomal): é um episoma que usa uma estratégia idêntica à expressão de plasmídeos em 
procariotas, mas em procariotas. Podem existir na forma livres ou integrados no genoma celular. 
 Divide-se independentemente e não é preciso preocupar com os centrómeros. 
 Têm grande instabilidade principalmente a longo prazo porque não têm estrutura