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Clique para editar o estilo do título mestre Clique para editar o estilo do subtítulo mestre * * * ENZIMAS Engª. Química Gisanara Dors Estágio de Docência * * * ENZIMAS - HISTÓRICO Catálise biológica início séc. XIX digestão da carne: estômago; digestão do amido: saliva. Década de 50 Louis Pasteur - concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura era catalisada por “fermentos” = enzimas. Eduard Buchner (1897) extratos de levedo podiam fermentar o açúcar até álcool; enzimas funcionavam mesmo quando removidas da célula viva. * * * ENZIMAS - HISTÓRICO James Sumner (1926) Isolou e cristalizou a urease; Cristais eram de proteínas; Postulou que “todas as enzimas são proteínas”. John Northrop (década 30) Cristalizou a pepsina e a tripsina bovinas; Década de 50 – séc. XX 75 enzimas isoladas e cristalizadas; Ficou evidenciado caráter protéico. Atualmente + 2000 enzimas são conhecidas. * * * ENZIMAS Definição: Catalisadores biológicos; Longas cadeias de pequenas moléculas chamadas aminoácidos. Função: Viabilizar a atividade das células, quebrando moléculas ou juntando-as para formar novos compostos. Com exceção de um pequeno grupo de moléculas de RNA com propriedades catalíticas, chamadas de RIBOZIMAS, todas as enzimas são PROTEÍNAS. * * * ENZIMAS – PROTEÍNA Classificação proteínas Proteínas globulares Proteínas fibrosas Estrutura das proteínas Primaria Secundaria Terciária Quaternária ENZIMAS Proteínas globulares Estrutura terciária Proteínas com alto peso molecular, maioria entre 15 a 1000 Kilo Daltons Unit (KD) OBS: 1 Dalton = 1 unidade de peso molecular (AMU) * * * ENZIMAS – ESTRUTURA * * * ENZIMAS – CARACTERÍSTICAS GERAIS Apresentam alto grau de especificidade; São produtos naturais biológicos; Reações baratas e seguras; São altamente eficientes, acelerando a velocidade das reações (108 a 1011 + rápida); São econômicas, reduzindo a energia de ativação; Não são tóxicas; Condições favoráveis de pH, temperatura, polaridade do solvente e força iônica. * * * ENZIMAS Comparação das enzimas com catalisadores químicos. * * * ENZIMAS – NOMENCLATURA Século XIX - poucas enzimas identificadas - Adição do sufixo ”ASE” ao nome do substrato: * gorduras (lipo - grego) – LIPASE * amido (amylon - grego) – AMILASE - Nomes arbitrários: * Tripsina e pepsina – proteases * * * ENZIMAS – NOMENCLATURA 1955 - Comissão de Enzimas (EC) da União Internacional de Bioquímica (IUB) nomear e classificar. Cada enzima código com 4 dígitos que caracteriza o tipo de reação catalisada: 1° dígito - classe 2° dígito - subclasse 3° dígito - sub-subclasse 4° dígito - indica o substrato * * * ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO Classificação das enzimas segundo a Comissão de Enzimas. * * * ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO Classificação das enzimas segundo a Comissão de Enzimas. * * * ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO Subclasses * * * ENZIMAS – NOMENCLATURA ADP + D-Glicose-6-fosfato ATP + D-Glicose IUB - ATP:glicose fosfotransferase E.C. 2.7.1.1 2 - classe - Transferase 7 - subclasse - Fosfotransferases 1 - sub-subclasse - Fosfotransferase que utiliza grupo hidroxila como receptor 1 - indica ser a D-glicose o receptor do grupo fosfato Nome trivial: Hexoquinase * * * ENZIMAS – CATALISADORES Aceleram reações químicas Ex: Decomposição do H2O2 * * * ENZIMAS – CATALISADORES Não são consumidos na reação * * * ENZIMAS – CATALISADORES Atuam em pequenas concentrações 1 molécula de Catalase decompõe 5 000 000 de moléculas de H2O2 pH = 6,8 em 1 min Número de renovação = n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única molécula de enzima em uma dada unidade de tempo. * * * ENZIMAS – CATALISADORES Não alteram o estado de equilíbrio Abaixam a energia de ativação; Keq não é afetado pela enzima. Não apresenta efeito termodinâmico global G não é afetada pela enzima. * * * ENZIMAS – COMPONENTES DA REAÇÃO Substrato se liga ao SÍTIO ATIVO da enzima * * * ENZIMAS – SÍTIO ATIVO Região da molécula enzimática que participa da reação com o substrato. Pode possuir componentes não protéicos:cofatores. Possui aminoácidos auxiliares e de contato. * * * ENZIMAS – COFATOR Algumas enzimas que contêm ou necessitam de elementos inorgânicos como cofatores * * * ENZIMAS – COENZIMAS Maioria deriva de vitaminas hidrossolúveis Classificam-se em: - transportadoras de hidrogênio - transportadoras de grupos químicos Transportadoras de hidrogênio * * * ENZIMAS – COENZIMAS Transportadoras de grupos químicos * * * ENZIMAS – LIGAÇÃO ENZIMA - SUBSTRATO Emil Fischer (1894): alto grau de especificidade das enzimas originou Chave-Fechadura , que considera que a enzima possui sitio ativo complementar ao substrato. * * * ENZIMAS – LIGAÇÃO ENZIMA - SUBSTRATO Koshland (1958): Encaixe Induzido , enzima e o o substrato sofrem conformação para o encaixe. O substrato é distorcido para conformação exata do estado de transição. * * * ENZIMAS – ATIVIDADE ENZIMÁTICA Enzyme Commission: “uma unidade (U) de atividade é a quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1 micro mol de substrato ou a formação de 1 micro mol de produto por minuto”. Expressa: U = micro moles produto/minuto Atividade específica = U/mg de proteína Enzima pura, condições que permita a velocidade da reação seja máxima o substrato [S] de modo a permitir que toda a enzima [E] [ES]. V = K[E] = K[ES] * * * ENZIMAS – ATIVIDADE ENZIMÁTICA Fatores que alteram a velocidade de reações enzimáticas: - pH; - temperatura; - concentração das enzimas; - concentração dos substratos; - presença de inibidores. * * * ENZIMAS – INFLUÊNCIA DO PH O efeito do pH sobre a enzima deve-se às variações no estado de ionização dos componentes do sistema à medida que o pH varia. Enzimas grupos ionizáveis, existem em ≠ estados de ionização. * * * ENZIMAS – INFLUÊNCIA DO PH A estabilidade de uma enzima ao pH depende: - temperatura; - força iônica; - natureza química do tampão; - concentração de íons metálicos contaminantes; - concentração de substratos ou cofatores da enzima; - concentração da enzima. * * * ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA temperatura dois efeitos ocorrem: a taxa de reação aumenta, como se observa na maioria das reações químicas; a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica. Enzima temperatura ótima para que atinja sua atividade máxima, é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma atividade cte. por um período de tempo. * * * ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA O efeito da temperatura depende: - pH e a força iônica do meio; - a presença ou ausência de ligantes. Acima desta temperatura, o velocidade de reação devido a temperatura é compensado pela perda de atividade catalítica devido a desnaturação térmica. * * * ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA Ea Lei de Arrehenius Ea pode ser determinada medindo-se a cte de velocidade da reação em ≠ temperaturas. Curva A: gráfico usual. Curva B: o gráfico mostra uma variação definida na inclinação, se em determinada temperatura, uma etapa ≠ se torna limitante da velocidade. Curva C: uma queda brusca na curva indica inativação enzimática. * * * ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA [E] Velocidade de transformação do S em P qtidade de E. Desvios da linearidade ocorrem: Presença de inibidores na solução de enzima; Presença de substâncias tóxicas; Presença de um ativador que dissocia a enzima; Limitações impostas pelo método de análise. Recomenda-se: Enzimas com alto grau de pureza; Substratos puros; Métodos de análise confiável. * * * ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA [S] [S] varia durante o curso da reação à medida que S é convertido em P. Medir Vo = velocidade inicial da reação. [E] = cte. [S] pequenas Vo linearmente. [S] maiores Vo por incrementos cada vez menores. Vmax [S] Vo insignificantes. Vmax é atingida E estiverem na forma ES e a [E] livre é insignificante, então, E saturada com o S e V não com de [S]. * * * ENZIMAS – CINÉTICA ENZIMÁTICA Victor Henri (1903): E + S ES 1913 Leonor Michaelis -Enzimologista Maud Menten - Pediatra E + S K1 K-1 ES Kp E + P Etapa rápida Etapa lenta * * * ENZIMAS – CINÉTICA ENZIMÁTICA Cinética Enzimática Determinar as constantes de afinidade do S e dos inibidores; Conhecer as condições ótimas da catálise; Ajuda a elucidar os mecanismos de reação; Determinar a função de uma determinada enzima em uma rota metabólica. * * * ENZIMAS – CINÉTICA ENZIMÁTICA * * * ENZIMAS – CINÉTICA ENZIMÁTICA Afinidade da enzima ao substrato. Km depende: aspectos específicos do mecanismo de reação; n° de passos da reação; velocidades relativas dos passos individuais. * * * ENZIMAS – CINÉTICA ENZIMÁTICA Vmax: Vmax = Kp[Et] Vmax = K3[Et] * * * Enzimas – ordem da reação Quando a formação de P for proporcional à [S] a velocidade da reação é de 1a ORDEM Quando a velocidade da reação independe da [S] a reação é de ORDEM ZERO [S] [S] <<Km v = Vmax v = K[S] [S] [S]>>Km * * * ENZIMAS – MÉTODOS GRÁFICOS Gráfico dos Recíprocos de Lineweaver-Burk * * * ENZIMAS – MÉTODOS GRÁFICOS Gráfico de Eadie-Hofstee * * * ENZIMAS – MÉTODOS GRÁFICOS Gráfico de Hanes-Woolf * * * ENZIMAS – MÉTODOS GRÁFICOS Gráfico da equação integrada de Michaelis-Menten * * * ENZIMAS – INIBIÇÃO ENZIMÁTICA Qualquer substância que reduz a velocidade de uma reação enzimática. * * * ENZIMAS – INIBIÇÃO COMPETITIVA Inibidor competitivo concorre com o S pelo sitio ativo da E livre. I análogo não metabolizável, derivado de um S verdadeiro, S substituto da E ou um P da reação. Km aparente da enzima * * * ENZIMAS – INIBIÇÃO COMPETITIVA Michaelis-Menten Lineweaver-Burk * * * ENZIMAS – INIBIÇÃO COMPETITIVA 1- sem inibidor 2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1] * * * ENZIMAS – INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA Inibidor não-competitivo se liga reversivelmente, aleatória e independentemente em um sítio que lhe é próprio. * * * ENZIMAS – INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA E + S ES E + P EI + S EIS KS KI K2 KI KS Lineweaver-Burk Michaelis-Menten * * * ENZIMAS – INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA 1- sem inibidor 2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1] * * * ENZIMAS – INIBIÇÃO INCOMPETITIVA Inibidor incompetitivo se liga reversivelmente, em um sítio próprio, ao complexo ES. I não tem semelhança estrutural com o S I favorece a formação do ES Km e Vmax da enzima * * * ENZIMAS – INIBIÇÃO INCOMPETITIVA KI Lineweaver-Burk Michaelis-Menten * * * ENZIMAS – INIBIÇÃO INCOMPETITIVA 1- sem inibidor. 2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1] * * * ENZIMAS – INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL I se combina com um grupo funcional, na molécula da E, que é essencial para sua atividade. Podem promover a destruição do grupo funcional Forma-se uma ligação COVALENTE entre o I e a E. Vmax parte da E é completamente removida do sistema e Km permanece a mesma. * * * ENZIMAS – INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL Graficando Vmax vs a quantidade total de E adicionada ao meio de reação em presença de I. * * * ENZIMAS – ENZIMAS REGULATÓRIAS Não obedecem a cinética de Michaelis-Menten. Controlam a etapa limitante em uma cadeia de reações enzimáticas. Tem sua atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a determinados sinais, moléculas sinalizadoras (pequenos metabólicos ou cofatores). Classes de enzimas reguladoras: Enzimas alostéricas; Enzimas reguladas pela modificação covalente reversível. * * * ENZIMAS – ENZIMAS REGULATÓRIAS Enzimas alostéricas Funcionam através da ligação não-covalente e reversível de um metabólito regulador chamado modulador; Moduladores podem ser inibidores ou ativadores; São maiores e mais complexas, possuem duas ou mais cadeias polipeptídicas. Enzimas reguladas pela modificação covalente reversível Grupos químicos são ligados covalentemente e removidos da enzima reguladora por enzimas ≠, podem ser: fosfato, adenosina monofosfato, grupos metil, etc. * * * ENZIMAS – ENZIMAS REGULATÓRIAS 1- Comportamento tipo Michaelis-Menten. 2- Comportamento Alostérico. * * * Enzimas Livres versus Enzimas Imobilizadas Imobilizadas Reutilização Maior estabilidade (faixas mais amplas de pH e temperatura) Menor interferência de inibidores e/ou ativadores Livres Instabilidade Rápida perda da atividade catalítica Não podem ser recuperadas ENZIMAS - IMOBILIZADAS * * * A enzima livre é imobilizada em um suporte inerte como vidro poroso, bentonite, etc. O principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um biocatalisador com atividade e estabilidade que não sejam afetadas durante o processo, em comparação à sua forma livre. ENZIMAS - IMOBILIZADAS * * * ENZIMAS - IMOBILIZADAS * * * ENZIMAS - IMOBILIZADAS * * * ENZIMAS - IMOBILIZADAS Propriedades de Enzimas Imobilizadas Efeitos sobre a atividade enzimática: Modificação da estrutura tridimensional; Modificação do microambiente; Fenômenos de difusão no interior do complexo. * * * ENZIMAS - IMOBILIZADAS Medida da atividade: Atividade da enzima imobilizada é mais fraca que a das enzima nativa, mas a estabilidade é maior. Influencia das condições operacionais: pH e temperatura desnaturação parcial ou total da proteína; imobilizada resistem melhor a variações de pH e tratamentos térmicos; Obs: origem da enzima, suporte utilizado e método de fixação * * * ENZIMAS - IMOBILIZADAS Aplicações de Enzimas Imobilizadas Aplicações analíticas: Facilita automatização das cadeias de dosagem e simplifica as manipulações. Biossensores: Imobilização de colinesterase e anticorpos sobre cristal piezelétrico utilizadas na detecção de pesticidas organofosforados; Reatores para análise cromatográfica; Kits para titulações e imunoensaios. * * * ENZIMAS - IMOBILIZADAS Indústria de alimentos: Glicose isomerase fixada para a produção de xaropes com alto teor de frutose; Celulase Conversão de celulose em açúcares solúveis; Imobilização de fermento de pão (Sacharomices cerevisae) álcoois enantiomericamente puros. Uso Industrial: Fonte para produção de penicilinas sintéticas. * * * ENZIMAS - IMOBILIZADAS Lipases imobilizadas: Imobilizadas em organo-gel utilizadas na esterificação do ácido oléico com n-pentanol; Imobilizadas em carvão de coco, bauxita e gel de ágar utilizadas na transformação de óleo de soja em biodisel. Aplicações na medicina: Hidrogel contendo enzimas imobilizadas Substrato presente - conversão enzimática - produto muda a conformação do hidrogel liberação da droga. * * * ENZIMAS - IMOBILIZADAS Em desenvolvimento: Estudos de filtros que utilizam enzimas imobilizadas na superfície do meio filtrante para o tratamento do ar dos ambientes. Recentes avanços na imobilização de enzimas por argilas, utilizadas em bioremediação. Estudos em desenvolvimento: imobilização, estabilização e aplicação da enzima esterase, de rim de porco, na síntese de produtos de interesse farmacêutico. * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES Permitem às indústrias usarem processos mais econômicos, diminuindo o consumo de energia e recursos; mais confiáveis e que poluem menos. São eficientes; Muito específicas; Permite produção segura e ambientalmente amigável. Origem vegetal Origem animal Origem microbiana * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES Proteases Leite: na preparação do leite de soja. Carnes e Peixes: recuperação de proteínas do osso ou espinha. Vinhos: clarificação. Queijo: coagulação da caseína. * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES Lactase Sorvete: prevenção da cristalização da lactose. Leite: estabilização das proteínas do leite em leites congelados por remoção da lactose. Hidrólise da lactose, permitindo o uso por adultos deficientes na lactase intestinal e em crianças com deficiência em lactase congênita. Ração: conversão da galactose em lactose e glicose. * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES -amilase Fermentados: conversão do amido a maltose por fermentação. Remoção da turbidez do amido Cereais: conversão do amido a dextrinas e maltose. Chocolate/cacau: liquefação do amido * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES Peroxidase Deterioração - Frutas: contribui na reação de escurecimento. Polifenoloxidase Chá/Café: desenvolvimento do escurecimento durante o amadurecimento e fermentação. Deterioração - Frutas e Vegetais: reação de escurecimento e perda de vitaminas. * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES Enzimas utilizadas em rações para aves. * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES Tratamento de efluentes Preocupação ambiental desencadeou uma procura por outras alternativas, as chamadas "tecnologias limpas“. Enzimas substituir muitos componentes químicos utilizados nos processos industriais atuais. * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES Enzimas utilizadas em tratamento de efluentes. * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES Industria de álcool; Industria de detergentes; Industria têxtil; Industria de papel e celulose; Curtumes; Produção de ácido cítrico, ácido glutâmico, insulina, vacinas, esteroídes, vitaminas e antibióticos; Bioremediação: de polímeros, de hidrocarbonetos e clorados. * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES Aplicação da Lipase no tratamento de águas residuárias com elevados teores de lipídeos JUSTIFICATIVA Efluentes com teores de gorduras e óleos e que utilizam o processo anaeróbio, a 1° etapa m.o. para degradar as gorduras é a produção de enzimas capazes de hidrolisar os triglicerídeos. Etapa é lenta e nem sempre há m.o. específicos para a produção de lipase não consegue atingir bons resultados. Gorduras se solidificam a baixas temperaturas: formação de uma camada gordurosa sobre as lagoas, caminhos preferenciais e arraste da biomassa. * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES OBJETIVO Viabilizar tecnicamente a aplicação de um pré-tratamento enzimático para remoção de gorduras, utilizando preparações de lipases pancreáticas fornecidas pelas empresas Kin Master (LKM) e Nuclear (LNU). Caracterizar o efluente Caracterizar as propriedades catalíticas das enzimas Testar ≠ tempos de hidrolise na formação de ácidos graxos (2h, 4h, 8h, 12h e 24h) Avaliar o impacto do tratamento enzimático por meio de testes de biodegradabilidade expressa pela formação de metano, DQO e atividade metanogênica. * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES MATERIAIS E MÉTODOS Determinação da Atividade Hidrolítica Substrato:Controle = azeite de oliva Efluente = efluente de indústria de produtos avícolas Tampão e solução enzimática (5mg/mL). Branco Incubados em banho-maria sob agitação Solução de etanol:acetona – parar a reação Ácidos graxos liberados titulados com KOH (0,02M) e indicador fenolftaleína (moles/mg.min) * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES RESULTADOS * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES RESULTADOS * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES RESULTADOS * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES RESULTADOS * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES RESULTADOS * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES RESULTADOS * * * ENZIMAS – APLICAÇÕES RESULTADOS Influência da concentração de substrato na atividade hidrolítica das lipase LKM e LNU
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