Aula 1 - Espectrofotometria

Prévia do material em texto

O problema do Ki-Suco de uva
Quantas colheres de Ki-Suco de 
uva foram usadas em cada copo?
Se errar a resposta vai ter de 
tomar o último copo!! 
Espectrofotometria no UV/Visível
2022 – Quadrimestre Suplementar
Profa. Ana Carolina S. S. Galvão
ana.galvao@ufabc.edu.br
BC0308 - Bioquímica: Estrutura, Propriedade e Funções de Biomoléculas
mailto:ana.galvao@ufabc.edu.br
“Uma boa maneira de “cutucar” moléculas é com radiação eletromagnética (luz)”
Espectrofotometria
A espectrofotometria faz parte da classe dos métodos analíticos que baseiam-se na interação
da matéria com a energia radiante.
A espectrofotometria é um método de análise
baseado em medidas de absorção de radiação
eletromagnética nas regiões UV e Visível por
entidades químicas (moléculas e íons) !
Espectrofotometria
Espectro Eletromagnético
A espectrofotometria óptica mede a 
energia absorvida em comprimentos de 
onda da luz visível ou ultravioleta
(Espectrofotometria UV-VIS)
Espectrofotometria
O que acontece com uma molécula quando ela absorve energia?
As consequências da absorção de energia eletromagnética por uma molécula/íon dependem do
comprimento de onda utilizado. No caso da espectrofotometria óptica as moléculas são expostas
a comprimentos de onda localizados na região ultra violeta (UV) ou visível e a energia absorvida
promove transição eletrônica.
Espectrofotometria
Transição Eletrônica
Quando uma molécula é irradiada com luz UV ou visível pode ocorrer transição eletrônica.
A transição eletrônica ocorre quando a molécula absorve energia e um elétron é excitado
deixando o orbital que ocupa no estado fundamental e passando a ocupar um orbital de maior
energia.
Elétron no ESTADO FUNDAMENTAL
Elétron no ESTADO EXCITADO
UV / Visível
Espectrofotometria
Transição Eletrônica
Quando o elétron alcança o estado excitado a tendência é que volte para o estado fundamental.
Ao voltar para o estado fundamental
parte da energia absorvida mantem-se na
molécula e parte é refletida.
Consequentemente, a luz refletida tem
menor intensidade (menos energia) que a
luz incidente inicialmente.
Elétron no ESTADO FUNDAMENTAL
Elétron no ESTADO EXCITADO
Espectrofotometria
Quando uma molécula é irradiada com luz UV ou visível pode ocorrer transição eletrônica.
Nem todos as frequências (comprimentos de onda) são capazes de excitar os elétrons de uma
molécula. Cada molécula apresenta um ou mais comprimentos de onda capazes de excitar os
elétrons enquanto nos demais comprimentos de onda a molécula não é excitada.
Através de um ESPECTRO DE ABSORÇÃO obtemos informação sobre quais comprimentos de
onda são capazes de excitar os elétrons de uma molécula fazendo com que ela absorva energia.
Espectrofotometria
Espectro de Absorção
Espectro de absorção da riboflavina (vitamina B2)
Através do espectro de absorção da riboflavina
observamos que esta molécula é excitada (absorve luz)
em comprimentos de onda do espectro dentro do UV e
visível. Repare que cada comprimento de onda tem
diferente capacidade de ser absorvido pela
riboflavina. Os comprimentos de onda mais eficientes
em excitar a molécula estão ao redor de 260 nm (UV),
370 e 450 nm (luz visível).
Espectrofotometria
Espectro de Absorção
Picos de absorção da riboflavina:
260 nm (UV)
370 nm (violeta)
450 nm (azul)
Se irradiarmos a riboflavina com luz UV (ao redor de
260 nm), violeta (ao redor de 370 nm) ou azul (ao redor
de 450 nm) esta vitamina será excitada e mostrará
grande absorção de luz.
Espectrofotometria
O espectro de absorção de uma molécula é a sua “identidade”. Cada molécula tem seu próprio
espectro de absorção e conhece-lo nos permite identificar uma molécula. Por isso podemos dizer
que a espectrofotometria é uma técnica qualitativa (veremos posteriormente que a
espectrofotometria também pode ser usada como uma técnica quantitativa!).
Espectro de Absorção
Azul de Metileno
Espectros de Absorção
Riboflavina
O espectro de absorção de uma molécula 
reflete a sua estrutura
Mas e o problema do Ki-Suco? 
O que tem espectrofotometria a ver com isso?
Quantas colheres de Ki-Suco de uva foram usadas em cada copo?
Se errar a resposta 
vai ter de tomar o 
último copo!! 
A absorção de cada copo de ki-Suco será proporcional à sua 
concentração (número de colheres / copo) !!!
https://phet.colorado.edu/sims/html/beers-law-lab/latest/beers-law-lab_en.html
https://phet.colorado.edu/sims/html/beers-law-lab/latest/beers-law-lab_en.html
Mas e o problema do Ki-Suco? 
O que tem espectrofotometria a ver com isso?
Mas como medir a absorção do Ki-Suco?
A absorção de cada copo de ki-Suco será proporcional à sua concentração
(número de colheres / copo) !!!
Mas como irradiar os copos com Ki-Suco?
(fonte de luz, seleção de luz em comprimento de onda específico)
Precisaremos de um espectrofotômetro!!!
Espectrofotômetro
https://youtu.be/WJH8wGq5BZQ
https://youtu.be/EYRmnC7RdNQ
Alguns vídeos mostrando o uso de espectrofotômetro
https://www.youtube.com/watch?v=R4ZT3g2-Ryg
https://youtu.be/WJH8wGq5BZQ
https://youtu.be/EYRmnC7RdNQ
https://www.youtube.com/watch?v=R4ZT3g2-Ryg
Luz 
monocromática
Detecta luz transmitida e 
fornece o valor como 
transmitância ou absorbância
Espectrofotômetro
Foi dito anteriormente que o espectrofotômetro é capaz de quantificar a luz absorvida
(energia) por uma molécula, como o Ki-Suco por exemplo. O que absorbância e transmitância
tem a ver com isso?
A absorbância nos fornece a quantidade de luz (energia) absorvida pela molécula!
O espectrofotômetro é capaz de detectar a luz refletida pela substância, calcular a
transmitância e, a partir dela, calcular a absorbância.
Transmitância (T)
Absorbância (A)
Voltando ao problema do Ki-Suco ... 
Agora que sabemos como funciona um espectrofotômetro podemos então irradiar e medir a
absorbância dos copos de Ki-Suco. Vamos lá!!
Procedimentos
1. Colocar uma alíquota de cada copo de Ki-Suco em cubetas.
Exemplos de cubetas Cubetas com Ki-Suco
Voltando ao problema do Ki-Suco ... 
Procedimentos
2. Colocar uma das cubetas com Ki-Suco no espectrofotômetro.
3. Selecionar luz de qual comprimento de onda deseja incidir na amostra.
Qual comprimento de onda?
Lembre-se da aula de espectrofotometria que cada molécula
apresenta um ou mais comprimentos de onda onde absorve luz
com eficiência. Para sabermos quais são esses comprimentos de
onda devemos conhecer o espectro de absorção da molécula.
Voltando ao problema do Ki-Suco ... 
Obtendo o espectro de absorção do Ki-Suco
Para obtermos o espectro de absorção do Ki-Suco pegamos qualquer uma das amostras e
medimos sua absorbância. No caso do nosso exemplo vamos fazer um espectro de absorção no
UV/VIS, ou seja, com comprimentos de onda que vão desde o ultravioleta até o visível do
espectro eletromagnético.
λ (nm) Absorbância
260 0,002
262 0,003
264 0,004
700 0,015
Voltando ao problema do Ki-Suco ... 
Obtendo o espectro de absorção do Ki-Suco
λ (nm) Absorbância
260 0,002
262 0,003
264 0,004
700 0,015
Ki-Suco tem pico de absorção em ± 500 nm
Espectro de Absorção do Ki-Suco
Procedimentos
1. Colocar uma alíquota de cada copo de Ki-Suco em cubetas.
Voltando ao problema do Ki-Suco ... 
2. Colocar uma das cubetas com Ki-Suco no espectrofotômetro.
3. Selecionar luz de qual comprimento de onda deseja incidir na amostra (500 nm).
4. Medir a absorbância de cada amostra em 500 nm.
Cubetas com Ki-Suco
Voltando ao problema do Ki-Suco ... 
A500nm = 0,02 A500nm = 0,03 A500nm = 0,06 A500nm = 0,50
Repare que a absorbância aumenta com o aumento da tonalidade da cor indicando que a concentração de
Ki-Suco (número de colheres) aumenta da amostra da esquerda para a amostra da direita.
Repare que o valor da absorbância é expresso na ausência de unidade (adimensional).
Voltando ao problema do Ki-Suco ... 
A500nm = 0,02 A500nm = 0,03 A500nm = 0,06 A500nm = 0,50
Finalmente, conseguimos atribuir um valor (absorbância) a cada tonalidade de Ki-Suco!!
Mas isso ainda não respondeà pergunta: quantas colheres
(qual a concentração) de Ki-Suco foram usadas em cada copo?
Voltando ao problema do Ki-Suco ... 
Para determinarmos quantas colheres (concentração) 
de Ki-Suco foram usadas para fazer cada copo 
precisaremos utilizar a Lei de Lambert-Beer!!!
2020 – Quadrimestre Suplementar
Profa. Ana Carolina S. S. Galvão
ana.galvao@ufabc.edu.br
BC0308 - Bioquímica: Estrutura, Propriedade e Funções de Biomoléculas
Lei de Lambert-Beer
mailto:ana.galvao@ufabc.edu.br
Para entender a Lei de Lambert-Beer !
https://phet.colorado.edu/sims/html/beers-law-lab/latest/beers-law-lab_en.html
https://phet.colorado.edu/sims/html/beers-law-lab/latest/beers-law-lab_en.html
ESTADO FUNDAMENTAL
ESTADO EXCITADO
Lei de Lambert-Beer
Para entendermos a Lei de Lambert-Beer precisamos recordar o que acontece com uma
molécula quando é irradiada com uma luz de comprimento de onda capaz de provocar transição
eletrônica.
ENERGIA ENERGIA
Quando uma molécula é irradiada com uma luz de
comprimento de onda (no UV ou VIS) capaz de provocar
transição eletrônica uma parte da energia incidente é
absorvida pela molécula. Desta maneira, a luz refletida tem
menos energia que a luz que incidiu na molécula.
Desta maneira ... Quanto mais moléculas a luz incidente
encontrar em seu caminho mais energia ela perde (maior a
absorbância da solução que contem a molécula)!
Abs = 0,15 Abs = 0,30
Concentração
1 M
Concentração
2 M
Absorbância é proporcional a concentração
A = x. C
1 cm 2 cm
Concentração
1 M
Concentração
1 M
Abs = 0,15 Abs = 0,30
Absorbância é proporcional a concentração e ao caminho óptico (largura da cubeta)
A = x. C. l
Lei de Lambert-Beer
A = x. C. l
A = ε. C. l
Absorbância
(adimensional)
Absortividade Molar
ou
coeficiente de extinção molar
(cm-1 . L. mol-1)
Concentração
(mol . L-1)
Caminho Óptico
(cm)
Lei de Lambert-Beer
A = x . C . l
No exemplo, o caminho óptico era 1 cm
A = x . C . 1
A = x . C
Se aumentamos a concentração, aumentamos a absorbância. 
Se diminuímos a concentração, diminuímos a absorbância. 
Absorbância e concentração são variáveis!
A = x . C
Veja o que acontece se chamarmos a absorbância (A) de variável “y”, a 
concentração (C) de variável “x” e x de constante “a”
y = x . a
ou
y = a.x
Y xa
A = a .C 
y = a . x
Lei de Lambert-Beer
A
b
s
(n
m
)
Concentração (mol.L-1)
tg α = coeficiente angular = a
.α
Voltando ao problema do Ki-Suco ... 
A500nm = 0,02 A500nm = 0,03 A500nm = 0,06 A500nm = 0,50
Considerando que as amostras tiveram a absorbância medida numa cubeta de 1 cm se aplicarmos
a Lei de Lambert-Beer teremos:
A = a.C
0,02 = a.C
0,03 = a.C 0,06 = a.C 0,50 = a.C
A = x . C . l
1
A = x . C
Voltando ao problema do Ki-Suco ... 
Repare que agora, para determinarmos 
a concentração, precisamos saber o 
valor do “a” (absortividade).
Como descobrir o valor do “a” ?
Faça uma curva-padrão com sucos de concentração (número de colheres)
conhecidas!
Curva-padrão
Uma curva-padrão é obtida através de um gráfico que correlaciona os valores de absorbância (A)
de amostras de concentração (C) conhecidas.
Obtendo a equação da reta obtida com a
curva padrão descobriremos o valor de
“a” (absortividade) !!
Voltando ao problema do Ki-Suco ... 
Procedimentos para obter uma curva-padrão de Ki-Suco
1. Prepare copos de Ki-Suco com quantidade de colheres diferentes (concentrações diferentes).
2. Meça a absorbância de cada amostra em um comprimento de onda onde o Ki-Suco tenha grande
capacidade de absorção (como vimos antes, o Ki-Suco tem pico de absorção em 500 nm). A
primeira amostra deve ser composta apenas por água e sua absorbância será usada para
“zerar” o espectrofotômetro.
3. Construa um gráfico correlacionando a absorbância (500 nm) com a concentração (número de
colheres).
4. Obtenha a reta que passa pelo maior número de pontos (linha de tendência).
5. Determine a equação da reta obtida. O coeficiente angular da reta é a absortividade (“a”).
Voltando ao problema do Ki-Suco ... 
A
b
so
rb
ân
ci
a 
(5
0
0
 n
m
)
Concentração (n° colheres)
y = 0,02x
A500 = 0,02 . C
Absortividade 
(a)
Voltando ao problema do Ki-Suco ... 
A absortividade (a) do Ki-Suco é 0,02. Para calcular a concentração dos copos basta apenas inserir
o valor de “a” nas equações abaixo e fazer o cálculo !
0.02 = 0,02 . C 0.03 = 0,02 . C 0.06 = 0,02 . C 0.50 = 0,02 . C
Conseguimos !!!
Espera, espera, espera!
Eu tenho mais uma perguntinha ....
Concentração (n° colheres)
Se pela Lei de Lambert-Beer sabemos
que a curva padrão origina uma reta
então porque esses últimos pontos não
estão formando uma reta??
A
b
so
rb
ân
ci
a 
(5
0
0
 n
m
)
Estude o tema “desvios da
Lei de Lambert-Beer” !!!