ERROS NA LEI DE LAMBERT E CROMATOGRAFIA

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ERROS NA LEI DE LAMBERT-BEER: É importante que a formação do cromófrogo seja estável. Usar meios muito concentrados, pois a intensidade da cor faz com que o aparelho não detecte pequenas alterações na concentração. Nas soluções mais diluidas, há linearidade entre a concentração e absorbância, com a cor mais intensa, não capta diferenças nas concentrações.
COMPONENTES DO ESPECTROFOTOMETRO: O que muda nos aparelhos é o feixe simples ou duplo feixe (esse divide o feixe de luz em 2 ramificações: uma coloca o branco na célula, e zera toda vez que troca amostra, eles são mais funcionais quando há comparação com o branco, em reações enzimáticas, por exemplo). No de feixe simples tem que tirar o branco, zerar o aparelho e colocar a amostra. 
· Fontes de luz – Deotério ou hidrogênio – comprimeto de onda na região do UV e tungstênio para vísivel. A lampada de deotério é comprada por horas de uso, quando vai utilizando, as horas são computadas e deixa de funcionar. A de tungnstênio tem uma durabilidade muito maior. Tem que ser estável (sem variação de intensidade, por que senão lê como sendo absorbância da amostra, o ideal é ligar estabilizador de voltagem), tem que ter durabilidade e baixo custo.
· Seletor de c. de onda ou monocromador – O comp de onda pode ser selecionado por prisma ou reticuladores (conjunto de espelhos). 
· Local da amostra – cubetas – vidro, quartzo e acrílico. As de quartzo são mais utilizadas para análise de UV (pode ser para visível também, mas é mais caro, limita para UV), porque é de alta pureza. De vidro são mais amplamente utilizadas para visível. As de acrílico tem uma limitação: não pode utilizar ácido forte, base forte, porque agride a cubeta e dificulta a leitura de absorbância e transmitância e lê o “fosco do vidro”. Se for reagente aquoso, pode utilizar. A vantagem da de acrílico, são as cubetas de volume reduzidos, pode ser feita para amostra de pouca quantidade (1mL é suficiente). Tem também as cubetas cilindricas, tem 1cm de raio e diferentemente dos tubos de ensaio, que não tem espessura de vidro padronizada. A vantagem é poder fazer a reação no interior da cubeta.
· Detector – Arranjo de diodos, detecta em todos os comprimentos de onda. 
· Amplificador – que da registro visual ou em gráfico, por exemplo. Da resposta da leitura feita.
EXERCÍCIO: Para uma amostra de água, contendo corante carcinogênico, para evitar o descarte incorreto no meio ambiente, a amostra foi tratada com adosrvente e e filtrada, para poder ser descartado, foi avaliado por espectrofotometria, de forma que a concentração do corante seja correta. (completar da foto e anotar os resultados).
CROMATOGRAFIA
método físico-químico de seperação, que se fundamenta na separação deiferencial de componentes de uma mistura.
 Migra diferencialmente, por conta das interações distintas com a fase móvel, que pode ser um gás, liquído ou fluido super-crítico (substância (geralmente um gás), que a pressão e temperatura específica, se torna crítico, qualquer alteração, muda de estado, se tornando liquído ou gasoso, como o CO2) , e a fase estacionária, que pode ser colocada sobre coluna ou superfície sólida. A cromatografia possibilita grande combinação de fases estacionárias e móveis e faz com que a técnica seja extremamente versátil e de grande amplitude de aplicação. Identificação de compostos de uma mistura, purificação de compostos e isolar alguns compostos. 
A quantificação só é feita com condições controladas. A separação de compostos depende da interação das moléculas entre as duas fases, isso pode ser calculado através do coeficiente de partição (razão entre a concentração do composto da fase estacionária, sobre a concentração na fase móvel, quanto mais interage com a fase estacionária, maior é o coeficiente de partição e mais eficiente é a separação. O importante é o tanto que o composto interage com a fase estacionária, pois mais eficiente é a separação. Mas esse composto não pode ficar ligado na fase estacionária e devem interagir a níveis diferentes, para migrar de forma diferencial, então, o coeficiente de partição tem um limite. 
TIPOS DE CROMATOGRAFIA
FORMA FÍSICA DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO- Tem dois tipos: em coluna (pode ser liquida, gasosa ou super-crítica) e planar (papel e em camada delgada). 
 FASE MÓVEL - Na gasosa (gasosa e gasosa de alta resolução). Na cromatografia líquida tem a clássica e de alta eficiência (no equipamento). A super-crítica é quando é um fluído super-crítico.
 FASE ESTACIONÁRIA – Sólida, liquída (é usada em HPLC, mas é pouco utilizado porque as duas fases são liquídas, os dois liquídos tendem a fazer com que as fases se percam, são muito utilizadas na gasosa, porque não a perda), ou quimicamente ligada. 
 FORMA DE SEPARAÇÃO:
 ADSORÇÃO – separação por diferentes afinidades dos compostos por um suporte sólido, então, é atração do composto com o suporte, apenas, como na CCD.
 POR PARTIÇÃO – A separação é feita por diferença de solubilidade, então, tem que ter fase estacionária liquída, pois os compostos tem que ter solubidade diferencial, em fase estacionária liquída, como na cromatografia em papel. 
 TROCA IÔNICA – principal ferramente é através do pH, pois dita a carga da maioria das moléculas, com carga maior de hidrogênio, as cargas positivas são favorecidas. É uma forma de interagir as cargas e promover a separação.
BIOAFINIDADE - mais específica, pois é uma afinidade biológica, uma enzima com substrato, por exemplo, anticorpo com antígeno. 
EXCLUSÃO MOLECULAR – A separação é feita pelo tamanho. Utilizadas para separar compostos com tamanhos diferenciados, como diferentes proteínas, por exemplo, que tem pesos moleculares distintos. 
OBSERVAÇÃO: No interior do cromatógrafo, seja ele liquído ou gasoso, consegue controlar a temperatura e fluxo da fase móvel. Nesses casos, consegue fazer análise quantitativa (dosar quantidade de composto), cromatografia instrumental.