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O Doenças causadas por parasitas. Diagnósticos laboratoriais de infecções Parasitárias Prof. Jussara Aguiar Prof. Paulo Preto Bacharel em Farmácia Rita de Cássia Alves Ferreira RA:31010006745; Adriana Aparecida Rodrigues RA: 31010007173; Curso: Farmácia 5°semestre Abril, 2022. UNIESI 1. Introdução Giardia sp. é um protozoário que parasita o intestino, tanto de animais como de humanos. O principal fator de contaminação é a ingestão de água contaminada (NASCIMENTO, 2009). É responsável por aproximadamente 1 bilhão de casos de diarreia que ocorrem no mundo. Existem vários métodos para o diagnóstico de Giardia, e a escolha varia de acordo com a sensibilidade e a especificidade desejada. O diagnóstico pode ser feito pela visualização direta dos cistos nas amostras de fezes (HUBER, 2003) ou pela visualização de trofozoítos que podem ser encontrados nos exames coprológicos diretos, porém como são muito frágeis, serão encontrados em casos de fezes diarreicas (NASCIMENTO, 2009). Os testes indiretos de diagnósticos estão sendo mais difundidos devido a sua alta sensibilidade e os mais utilizados são os testes de imunoabsorção de antígenos parasitários solúveis, tais como ELISA (NASCIMENTO, 2009) e PCR real time. O parasita pertence a ordem Diplomonadida, tem motilidade ativa e se multiplica no intestino (NASCIMENTO, 2009) O trofozoíta é piriforme, bilateral, simétrico e mede aproximadamente 10-12 µm de comprimento por 5-7 µm de largura. Possui quatro pares de flagelos e uma estrutura ventral encontrada exclusivamente no gênero Giardia, chamado disco ventral ou disco adesivo, estrutura que permite adesão do parasita no intestino. O cisto de Giardia é oval, mede de 8-12 µm de comprimento e 7-10 µm de largura e possui uma parede exterior de glicoproteína que denota a forma cística. Possui dois a quatro núcleos, flagelos axonêmicos, alguns ribossomas e fragmentos dos discos ventral (NASCIMENTO, 2009). Existem vários genótipos diferentes de Giardia spp., porém todos são visualmente idênticos na microscopia óptica (TROUT, 2006) O ciclo evolutivo se dá em dois estágios: forma cística e forma trofozoítica. A contaminação ocorre pela ingestão de água ou alimentos contaminados pela forma cística. Os trofozoítos são liberados no intestino onde ocorre a fissão binária, onde algumas formas se fixam na mucosa do intestino e outras evoluem a cistos que são eliminados nas fezes . Segundo PEARSON(2004), a contaminação pode ser fecal-oral, pela ingestão direta de fezes contaminadas, pela ingestão de alimentos e água contaminados ou por fômites contaminados. Figura 1: Ciclo de vida de Giardia ssp. A técnica mais utilizada para visualização dos cistos é a flutuação em sulfato de zinco a 33%, porém é uma técnica pouco sensível se realizada uma única vez, demonstrando sensibilidade de até 70% devido à liberação de cistos nas fezes ser intermitente (PEARSON, 2004). Quando o número de análises de fezes é triplicado, essa sensibilidade pode passar de 90% (PEARSON, 2004). Existem várias razões para a dificuldade no diagnóstico desse parasito. Muitos “pseudoparasitas” como debris e restos de plantas, podem ser confundidos com Giardia por técnicos menos experientes. Em exames de fezes contendo muco, podem ser encontrados trofozoítos, identificados através de exame direto acrescido de uma gota de lugol para facilitar a visualização. Caso não se observe a presença de trofozoítos no exame direto, um exame de flutuação com solução de sulfato de zinco com densidade de 1.18 a 1.20 deve ser realizado, pois essa é a técnica de eleição para diagnóstico de cistos de Giardia. Para o tratamento da giardíase sintomática, pode-se usar tinidazol, metronidazol ou nitazoxanida. Resistência e falhas do tratamento podem ocorrer com qualquer um deles. O tinidazol é tão eficaz quanto o metronidazol, mas o tinidazol é mais bem tolerado e administrado como dose única desta maneira: • Adultos: 2 g, por via oral, 1 vez • Crianças: 50 mg/kg (máximo de 2 g), por via oral, 1 vez. Metronidazol pode ser administrado como a seguir: • Adultos: 250 mg por via oral 3 vezes ao dia por 5 a 7 dias • Crianças: 5 mg/kg por via oral 3 vezes ao dia por 5 a 7 dias O melhor meio de contaminação de Giardia spp. é através de água e alimentos contendo cistos. O uso de água filtrada, fervida e a desinfecção de áreas contaminadas diminuem a possibilidade de infecção por esse flagelado e outros parasitas gastrintestinais (PEARSON, 2004). No Brasil é encontrada para venda uma vacina chamada Giardia Vax que auxilia na eliminação dos cistos, diminuindo a contaminação do ambiente, diminui o potencial zoonótico da doença e garante imunidade por um ano (PEARSON, 2004). 2. OBJETIVOS Identificar laminas que positivem para diagnóstico de giardiase . Conhecer quanto profissional, quais são os sinais e sintomas que a pessoa infectada com amebíase apresenta, quais são os meios de tratamento para a doença, saber indicar ao paciente a correta profilaxia. 3. Metodologia Procedimentos abaixo para correta preparação de lâmina através das fezes do paciente infectado foram baseadas em pesquisas realizadas no site do Instituto federal de Santa Catarina, referenciado nas referências. I. Receber as fezes em recipiente adequado. II. As amostras devem ser correta e completamente identificadas com: O nome do paciente; idade, número de identificação do laboratório; hora da coleta e hora da chegada da amostra ao laboratório. As instruções, sobre a coleta de fezes devem ser claras e passadas ao paciente. É importante verificar se o paciente as entendeu, pois é na coleta adequada que se inicia a qualidade do exame parasitológico. III. Para um trabalho rotineiro em Parasitologia é recomendável que se realize três exames parasitológicos em dias alternados. IV. Todos os parasitas observados devem ser relatados pelo nome científico, incluindo gênero e espécie e, quando possível, o estágio que estão. Também, deverão constar os métodos executados e a consistência das fezes. V. Rejeitar fezes contendo meio de contraste para Raios X (sais de bário), somente colher as fezes 5 a 10 dias após a ingestão de sais de bário. VI. Não administrar purgativos tais como: óleo mineral, óleo de castor ou supositórios, porque é impossível pesquisar protozoários. EXAME MACROSCÓPICO Procedimentos • Observar a consistência da amostra. Fezes moles ou líquidas sugerem a possível presença de trofozoítos de protozoários intestinais. Cistos de protozoários são encontrados com mais frequência em fezes formadas. Ovos e larvas de helmintos podem ser encontrados tanto em fezes líquidas quanto em fezes formadas. • Examinar a amostra fecal com auxílio de um palito (sorvete) para verificar a presença de outros helmintos adultos. Verificar presença de muco, sangue ou vermes adultos. EXAME MICROSCÓPICO É recomendável, como rotina, o emprego de 03 procedimentos distintos • a) Exame direto a fresco, para observação dos movimentos do trofozoito, • b) Técnicas de concentração de parasitas • c) Um esfregaço de fezes com coloração permanente; I. Colocar duas a três gotas de salina a 0,85% em uma lâmina de vidro. II. Tocar com a ponta de um palito em vários pontos das fezes, transferindo uma pequena porção para a lâmina de microscopia. III. Espalhar as fezes, fazendo um esfregaço e examinar ao microscópio. A espessura do esfregaço não deve impedir a passagem de luz. Este método é indicado principalmente para a pesquisa de trofozoitos de protozoários em fezes diarreicas recém emitidas; IV. Para a identificação de cistos de protozoários e larvas de helmintos corase a preparação com Lugol. O uso de lamínula é facultativo.4. Desenvolvimento Imagem 2: lâmina de giardia. Fonte: UFRGS, 2020. Podemos identificar na imagem cisto de giardia lamblia . Imagem 3: lâmina de giárdia Fonte: UFRGS, 2020. Na imagem podemos identificar Trofozoíto de giardia lamblia. Imagem 4: lâmina de giárdia Fonte: UFRGS, 2020. Na imagem podemos identificar o Trofozoíto de Giardia lamblia. 5. Conclusão Através do trabalho realizado, verificou se que a gíardia é uma doença que pode se caracterizar de forma assintomática e sintomática. As técnicas para a preparação das laminas, anexadas ao final do trabalho, apresentam uma complexidade e, por demonstrarem certos riscos de contaminação biológico, deve se atentar para não consumir alimentos e ingerir líquidos enquanto estiver ocorrendo a manipulação dos analisáveis. A doença Giardiase, A contaminação ocorre pela ingestão de água ou alimentos contaminados pela forma cística. Os trofozoítos são liberados no intestino onde ocorre a fissão binária, onde algumas formas se fixam na mucosa do intestino e outras evoluem a cistos que são eliminados nas fezes. 6. Referências NASCIMENTO, Fabiana Barbosa do. Giardíase – revisão literária. Universidade federal do rio grande do sul. 2009 PEARSON, Richard D. Giardíase. MD, University of Virginia School of Medicine. Disponível: https://www.msdmanuals.com/pt-br/profissional/doen%C3%A7as- infecciosas/protozo%C3%A1rios-e- microspor%C3%ADdiosintestinais/giard%C3%ADase. Acessado em: 09 de abril de 2022 Parasitologia práticas. UFRGS. 2020. Disponível em: http://www.ufrgs.br/parasite/siteantigo/Imagensatlas/Protozoa/Giardialamblia.ht m. Acesso em : 08 de abril de 2022. 1 Roteiro para aula prática de Técnicas Parasitológicas 1. Introdução Exame de fezes ou exame coproparasitológico Laboratório de coproparasitologia ⚫ Riscos específicos no Laboratório de Parasitologia Clínica - Manipulação de Fezes – Ingestão de ovos de helmintos ou cistos de protozoários – Penetração cutânea de larvas – Contaminação com outros agentes infecciosos presentes ⚫ Adoção de regras de biossegurança NB-2. – Utilização de avental e luvas de látex – Evitar comer, beber, fumar, utilizar cosméticos e manipular lentes de contato – Descontaminar a superfície de trabalho ⚫ As precauções devem ser tomadas mesmo para manipulação de amostras em solução fixadora (ex. formalina) Fatores considerados na coleta: ➢ tipo de recipiente utilizado para colheita; ➢ idade da amostra; ➢ volume de material; ➢ utilização de medicamentos interferentes. Coleta das fezes: recomendações As fezes, diarreicas ou não, devem ser recolhidas em recipiente limpo e seco, de boca larga e vedação hermética. A coleta deve ser realizada diretamente no frasco ou em papel limpo e transferida imediatamente para o frasco. A coleta não deve ser feita do vaso sanitário ou do solo. Quantidade ideal de amostra por frasco (coletor universal): 20 a 30 g. Colher 3 amostras em dias alternados (Alguns parasitas apresentam intermitência na eliminação das formas parasitárias. Ex. Giardia lamblia ) 2 Não contaminar com urina Não ingerir medicamentos antibióticos, antidiarreicos, hidróxido de magnésio, bário e óleo mineral. Se ocorrer, aguardar de 7 a 14 dias. Amostras com conservante ou fixador podem reunir fezes colhidas em dias alternados no mesmo frasco ou em frascos diferentes. A última coleta deve, preferencialmente, ser colhida em frasco sem conservante. As amostras encaminhadas ao laboratório devem vir acompanhadas da requisição médica e devem trazer informações no frasco como: nome do paciente, número de identificação, idade, data e horário da colheita, nome do médico (opcional). Preservação das amostras: Refrigeração (3-5ºC): ➢ preservação de ovos e cistos por vários dias ➢ larvas de Strongyloides stercoralis e de ancilostomídeos podem sofrer alterações morfológicas, assim como trofozoítas de protozoários. ➢ Formaldeído 5% ➢ MIF (mertiolato-iodo-formaldeído) ➢ SAF (acetato de sódio-ácido acético-formaldeído) ➢ APV (álcool polivinílico) ➢ Schaudinn ➢ Para oocistos de coccídeos: formaldeído 10% ou bicromato de potássio Análise Macroscópica São analisadas características como consistência, cor e odor. ➢ Escala de Bristol para classificação das fezes: 3 2. Atividade prática 2.1. Técnica de Hoffman, Pons e Janer ou Lutz Princípio: Detecção de ovos pesados de helmintos Fundamento: Sedimentação espontânea Substância enriquecedora: Não possui 4 Utilização: inquéritos epidemiológicos, principalmente em áreas esquistossomóticas. A técnica de Hoffman, Pons e Janer ou Lutz ou método de sedimentação espontânea consiste basicamente na mistura das fezes com água, sua filtração por uma gaze cirúrgica (ou parasitofiltro) e manutenção em repouso, formando uma consistente sedimentação dos restos fecais ao fundo do cálice. Uma alíquota do sedimento é pipetada sobre lâmina, é feito um esfregaço e observado em microscópio. Este método detecta a presença de ovos nas fezes, principalmente os pesados, após coloração com lugol. Diversas variações são realizadas nessa técnica a fim de promover a visualização de mais formas evolutivas, dada a praticidade da técnica. Após 24 horas de sedimentação, cistos de protozoários e larvas de helmintos também podem ser encontradas com maior facilidade. Essa é a técnica mais utilizada rotineiramente em laboratórios clínicos. Materiais: - Cálice de sedimentação - Gaze - Palito de madeira - Frasco de borrel ou copos descartáveis - Lâmina e lamínula - pipetas pasteur - Lugol Técnica: 1) Tomar 2 a 4 gramas de fezes e desmanchar em frasco de borrel contendo água com auxílio de um bastão de vidro ou plástico; 2) Coar a emulsão por meio de gaze dobrada em 4 ou uma tela de plástico ou metal limpa, para dentro de um cálice de sedimentação cônico; 3) Completar o volume do cálice acrescentando mais água e misturando bem o conteúdo; 4) Deixar sedimentar por 2 horas; 5) Com uma pipeta Pasteur, retirar pequena amostra de sedimento do vértice do cálice, colocá-la sobre uma lâmina e cobrir com lamínula. Não é necessário corar os ovos, mas se houver interesse em reconhecer também os cistos de protozoários, juntar um pouco de lugol. 2.2. Técnica de Willis Princípio: Detecção de ovos leves de helmintos Fundamento: Flutuação Substância enriquecedora: Solução saturada de Cloreto de sódio 5 A técnica de Willis baseia-se em duas características dos ovos a serem analisados. A primeira é a densidade, pois corpos menos densos tendem a flutuar sobre uma solução salina densa. Sendo assim, quanto menos densos os ovos, melhor sua separação por meio dessa técnica, que utiliza uma solução saturada de cloreto de sódio de densidade alta para induzir a flutuação dos ovos até a superfície. Os ovos na superfície entrarão em contato com a face inferior de uma lâmina de vidro, devido a outra característica desses ovos, o tigmotropismo. Corpos com esta propriedade tendem a aderir a superfícies sólidas após um contato físico com elas. Juntando essas duas características a técnica de Willis permite fixar ovos pouco densos de uma amostra fecal em uma lâmina, por meio de sua flutuação sobre uma solução muito densa. Esses ovos são então observados microscopicamente. É um método de grande eficiência, que por conta da purificação facilita a observação ao microscópio. Pode ser utilizado para observar qualquer estrutura pouco densa, podendose fazer modificações no método de forma a deixar a solução mais ou menos densa, para que ele se torne mais específico ou abrangente.Deve-se ter o cuidado ao escolher essa solução para que ela não prejudique os ovos que se deseja observar, alterando-os morfologicamente. Materiais: - Copos de café ou tampa de frasco de borrel -Solução saturada de NaCl - Palito de madeira -Lâmina e lamínula -Lugol Técnica: 1- Colocar 10g de fezes na tampa do frasco de Borrel ou no próprio recipiente onde estão as fezes. 2- Homogeneíza-las com um pouco de solução saturada de sal (NaCl). 3- Completar o volume até a borda do frasco. 4- Colocar na boca do frasco uma lâmina, que deverá estar em contato com o líquido. 5- Deixar em repouso por 10 minutos. 6- Findo esse tempo, retirar rapidamente a lâmina, deixando a parte molhada voltada para cima. 7- Corar com Lugol, cobrir com lamínula e examinar com objetiva 10x. 2.3. Análise e identificação de parasitas em pool de fezes humanas 1- Pingar uma gota do sedimento do pool de fezes humanas na lâmina. 2- Acrescentar uma gota de lugol. 6 3- Homogeneizar com a lamínula 4- Ler no microscópio na objetiva de 10x e confirmar a morfologia dos parasito na de 40x. Como ler a lâmina: 3. Relatório de aula prática O relatório deverá ser elaborado a partir da observação dos parasitos encontrados nas técnicas de Hoffman e Willis e também no pool de fezes. No pool de fezes podem ser encontrados todos os helmintos de eliminação fecal estudados. Em seu relatório você deve desenhar os parasitos encontrados e escrever: - o nome das espécies observadas; - a forma evolutiva; - uma característica específica que confirma a espécie observada. REFERÊNCIAS: CHIEFFI, P. P. Parasitoses intestinais: diagnóstico e tratamento. São Paulo: Lemos Editorial, 2001. DE CARLI, G. A. Parasitologia clínica: seleção de métodos e técnicas de laboratório para o diagnóstico das parasitoses humanas. 2ª ed. São Paulo: Atheneu, 2007. REY, L. Bases da Parasitologia médica. Rio de Janeiro –2º ed. -: Guanabara-Koogan, -1992. VERONESI, R. Doenças Infecciosas e Parasitárias – 7.ed.- Rio de Janeiro : Guanabara Koogan, 1982. Prof. Jussara Aguiar Prof. Paulo Preto 1. Introdução 2. OBJETIVOS 3. Metodologia 4. Desenvolvimento Imagem 3: lâmina de giárdia Imagem 4: lâmina de giárdia 5. Conclusão 6. Referências 1. Introdução 2. Atividade prática