01 Bioquímica clinica

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01 Bioquímica Clínica
INTRODUÇÃO Á BIOQUIMICA CLÍNICA
INTRODUÇÃO
Neste conteúdo vamos explorar o laboratório das análises clínicas com ênfase na bioquímica clínica, setor de grande destaque no laboratório de análises clínicas. Estima-se que existam mais de 400 tipos diferentes de exames realizados nesse departamento, abrangendo:
· Exames simples e muito convencionais, como dosagem de sódio.
· Exames de amostras “dinâmicas”, como teste de tolerância à glicose.
· Exames mais complexos, como a identificação de metabólitos intermediários.
Teremos uma noção da grandeza do processamento das amostras e a importância do controle de qualidade. Também precisamos contemplar, de maneira geral, a composição física dos laboratórios, pois a todo momento surgem equipamentos mais modernos e automatizados; porém, se soubermos os conceitos principais de física e química e os fundamentos e as noções básicas dos principais métodos nos quais eles se baseiam, compreenderemos mais facilmente o funcionamento desses equipamentos e será mais fácil operar as máquinas e seus sistemas e correlacionar as unidades e escalas utilizadas nos resultados.
A maior parte dos testes bioquímicos pode ser dividida em dois grandes nichos:
· O primeiro tem por base a utilização da luz, como nos métodos fotométricos, a partir dos quais as reações são monitoradas pelo consumo dos substratos ou pela interferência dos produtos formados.
· O segundo se baseia na separação dos compostos de uma amostra devido à diferença de carga elétrica e com influência do tamanho dos diferentes componentes a serem analisados, sendo muito empregado para avaliação de proteínas e isoenzimas, como no método eletroforético.
Ao final do conteúdo, você conseguirá ter uma visão ampla do funcionamento de um laboratório e poderá aplicar esse conhecimento ao longo dos seus estudos. Vamos começar?
MÓDULO 1
Analisar as etapas dos processos pré-analíticos, analíticos e pós-analíticos dos exames realizados, do processo de controle de qualidade laboratorial, bem como os erros e suas respectivas causas
ETAPAS DO EXAME CLÍNICO
Os laboratórios de análises clínicas são divididos em setores específicos, de acordo com o tipo de exame clínico que realizam. São eles:
Fluxograma dos setores que compõem o laboratório de análises clínicas.
Independentemente do setor, é fundamental compreender quais são as etapas da realização de um exame clínico. Com base nesse esquema, conseguimos ver de forma ampla o fluxo do processamento, e se torna clara a necessidade de existência, aplicação e disseminação do controle de qualidade, a fim de identificar e minimizar possíveis influências de fatores intrínsecos e extrínsecos nas diferentes etapas. Além disso, com o controle de qualidade é possível verificar a exatidão e precisão dos testes oferecidos, para se ter segurança e confiabilidade nos resultados gerados e nos laudos liberados.
A realização de um exame clínico é potencialmente sujeita a muitos erros ao longo do processo, e é de suma importância que se consiga identificar e compreender os pontos mais passíveis de erro(s), a fim de que possamos minimizar os efeitos. Para isso, categorizamos o processamento em três fases: pré-analítica, analítica e pós-analítica.
PRÉ-ANALÍTICA, ANALÍTICA E PÓS-ANALÍTICA
Pré-analítica - Antes da análise ser realizada.
Analítica - Durante a realização do exame.
Pós-analítica - Fase que contempla o processamento dos dados e sua interpretação.
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello. Etapas da realização de um exame clínico.
FASE PRÉ-ANALÍTICA
A fase pré-analítica é iniciada na consulta, começando na prescrição e nas orientações do médico solicitante, passando pela entrevista e pelo preenchimento dos dados no laboratório, e depois pela escolha do aparato correto para o procedimento. Finaliza-se na fase instrumental da realização do teste solicitado, como mostrado no esquema a seguir:
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.Fluxograma de fatores pré-analíticos.
Dentre os itens anteriores, podemos destacar alguns pontos que são de responsabilidade do profissional que irá coletar a amostra. Clique para conhecê-los:
IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL
A identificação deverá ocorrer diante do paciente, ou os dados podem ser conferidos com o paciente antes da coleta. Caso o material seja coletado e chegue ao setor de recepção de amostra em um tubo sem identificação, ele deverá ser desprezado imediatamente.
LOCAL DE PUNÇÃO
Caso o paciente esteja internado com sonda parenteral, o acesso para coleta de material deverá ocorrer no lado oposto. Além disso, precisa ser relatado se o sangue teve origem capilar, venosa ou arterial, pois alguns parâmetros podem ter valores de referência diferentes.
TEMPO DE GARROTEAMENTO
O tempo ideal para manter o garroteamento no paciente é de aproximadamente 1 minuto. Não pode, em hipótese alguma, garrotear o paciente antes de separar e identificar o material a ser utilizado, pois o garroteamento prolongado pode trazer alterações aos resultados, como interferência na dosagem de colesterol e triglicerídeos (pois são compostos grandes que ficam retidos no espaço intravascular).
USO ADEQUADO DO MATERIAL
A escolha dos tubos adequados, assim como a sequência de coleta, é de suma importância, pois os aditivos presentes nos tubos anteriores podem contaminar os tubos seguintes. Também é importante respeitar os volumes e as recomendações dos fabricantes.
Imagem: Shutterstock.comSequência de tubos para coleta, segundo a Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).
VOCÊ SABIA
Dependendo da conduta pré-analítica do profissional, a amostra poderá ser invalidada e desprezada. Como, por exemplo, se:
· A amostra estiver hemolisada ou coagulada.
· O armazenamento e o transporte forem inadequados.
· A amostra recebida estiver fora do prazo máximo para processamento.
· A amostra estiver mal identificada.
· A coleta for realizada no tubo errado.
Vale destacar que a amostra a ser coletada vai depender do estado do paciente e do exame solicitado. Para os exames bioquímicos, podemos utilizar as amostras de sangue, urina, fezes, saliva, escarro, LCR (líquido cefalorraquidiano), líquido pleural, líquido ascítico, líquido sinovial (das articulações), entre outros. No entanto, as amostras de sangue e de urina normalmente são as primeiras opções, devido à facilidade da coleta e de processamento.
Agora que já sabemos em quais condições devemos rejeitar as amostras de sangue, como devemos proceder com as outras amostras biológicas?
De maneira geral, os critérios são bem parecidos: falta de informação sobre a procedência, assim como o dia e a hora em que a coleta foi realizada; embalagens inadequadas, com ou sem derramamento da amostra; amostra não rotulada ou sem identificação; volume inadequado da amostra; amostra incompatível com o exame solicitado.
Imagem: Shutterstock.com
Serão descartadas as amostras de urina coletadas há mais de 2 horas sem refrigeração; com presença de fezes ou de corpos estranhos; e as amostras coletadas em recipientes diferentes do padronizado para uso em laboratório.
Imagem: Shutterstock.com
As amostras de fezes serão rejeitadas caso venham contaminadas com urina; ou caso apresentem corpos estranhos; em frascos inadequados.
ATENÇÃO
Para entender melhor como deve ser o procedimento de coleta das amostras biológicas, quais são os preparos necessários e outras informações relevantes, não deixe de ler o material Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial: Coleta e preparo de amostras clínicas, presente no “Explore +”.
FASE ANALÍTICA
A fase analítica contempla basicamente a fase instrumental/experimental no laboratório, em que devemos ter atenção com o uso de equipamentos e/ou kits e controle de qualidade de reagentes e procedimentos. Diferentemente da fase pré-analítica, na fase analítica o foco é totalmente voltado para o exame.
Com base nisso, a padronização de todos os processos envolvidos é de suma importância para se obter e manter a qualidade dos testes realizados, pois, com todo processopadronizado, facilita-se a detecção das fontes de erros, para que se possa tentar evitá-los e aprimorar a realização do exame sem intercorrências, concomitante ao cumprimento de requisitos exigidos pela legislação.
Durante essa fase, conseguimos perceber o avanço tecnológico de automação nos laboratórios de ponta; com isso, tem-se uma melhoria na reprodutividade dos dados obtidos, um aumento da produtividade e um ambiente de trabalho mais seguro para o profissional quanto à manipulação das amostras biológicas, que sempre devem ser consideradas “possivelmente contaminantes”.
Foto: Shutterstock.comA tecnologia nos laboratórios.
Vale destacar que, mesmo com toda a tecnologia empregada, podem e vão existir variações nos resultados obtidos, e de maneira geral podem ser classificadas em dois grupos: variações biológicas e variações analíticas.
A performance do exame é avaliada quanto à precisão e exatidão; e com base na sensibilidade e na especificidade.
VARIAÇÕES BIOLÓGICAS E VARIAÇÕES ANALÍTICAS
As variações biológicas estão relacionadas com o histórico do paciente (como abordado no tópico “Fase pré-analítica”) e serão minimizadas pela adequação dos valores de referência, seja de gênero, idade ou ciclo hormonal.
As variações analíticas precisam ser minimamente controladas e avaliadas, pois dependendo do grau de variação, a performance do exame pode ser comprometida, invalidando seu resultado.
Você sabe o significado desses termos?
· Precisão – Avalia o quão próxima uma medição está da outra, independentemente do valor de referência.
· Exatidão – Avalia o quão próxima uma medida está em relação ao referencial, independentemente se está próxima ou não de outra medição.
No esquema a seguir, as medidas são representadas pelas bolas azuis e o referencial é o centro do alvo. No gráfico as medidas estão em azul e o valor de referência é a linha tracejada.
	PRECISO E NÃO EXATO
	PRECISO E EXATO
	NÃO PRECISO E EXATO
	NÃO PRECISO E NÃO EXATO
E sobre os termos abaixo, você sabe o significado?
· Sensibilidade – É a capacidade que o teste tem de identificar como positiva a amostra que de fato é positiva, ou seja, os resultados positivos verdadeiros.
· Especificidade – É a capacidade que o teste tem de identificar como negativa a amostra que de fato é negativa, ou seja, os resultados negativos verdadeiros.
Sensibilidade × especificidade.
Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
Para conferir esses parâmetros que acabamos de ver, normalmente realizam-se controles internos e externos para que possamos detectar, avaliar e minimizar os erros, sejam eles sistemáticos ou aleatórios.
SISTEMÁTICOS OU ALEATÓRIOS
Entenda melhor sobre os erros:
Erros sistemáticos são aqueles que possuem sempre a mesma direção; as fontes normalmente são oriundas no equipamento, em sua calibração ou no operador. Erros sistemáticos são responsáveis pela inexatidão.
Erros aleatórios são imprevisíveis para mais ou para menos, não sendo possível detectar seu valor; as fontes são as variabilidades analíticas. Erros aleatórios são responsáveis pela imprecisão.
CONTROLE INTERNO
O controle interno é o que chamamos de controle intralaboratorial. A realização dos testes das amostras-controle deve ser diária. A sua realização é bem simples, uma vez que seus valores de referência sejam conhecidos.
A amostra-controle normalmente deve ser passada antes de iniciar a rotina e, em alguns casos, pode ser passada novamente de maneira simultânea às amostras dos pacientes, assim conseguimos monitorar a precisão dos resultados obtidos. Com isso, podemos criar alertas, para prevenir que um exame sem a qualidade requerida seja liberado, e/ou para indicar a necessidade de ações corretivas e de repetição do exame.
Mas como obter esses alertas na prática laboratorial? Uma das técnicas utilizadas para analisar os padrões avaliados é pelo gráfico de Levey-Jennings.
Como obter os resultados do controle interno pelo gráfico de Levey-Jennings?
Primeiramente é importante saber como é o gráfico de Levey-Jennings. Nele, temos uma “linha do tempo” da dosagem do parâmetro a ser analisado. A cada dia deverá ser realizada uma leitura da solução ou amostra-controle. O valor mensurado deverá ser plotado no gráfico. Veja ao lado.
Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
Qual é a informação que estamos buscando nesse gráfico?
Estamos querendo ver como flutua a dosagem do parâmetro de interesse ao longo do tempo, pois com isso vemos a performance do teste; ou seja, se o teste está com uma boa precisão e exatidão. Para isso, realizamos três diferentes avaliações ao longo do tempo, clique para conhecer cada uma.
AVALIAÇÃO DIÁRIA
Verifica se o resultado está dentro ou fora dos limites estabelecidos. Essa verificação é importante para identificarmos se a bateria de exames está dentro dos limites estabelecidos.
AVALIAÇÃO SEMANAL
Verifica se há uma tendência, algum desvio ou perda de exatidão e/ou perda de precisão.
AVALIAÇÃO MENSAL
Recalcula uma nova média e desvio-padrão com os últimos valores mensurados.
Na prática, como iniciamos o registro do controle interno para confecção do gráfico?
Assim que o aparelho que realizará as dosagens bioquímicas é instalado ou calibrado pelo técnico responsável, a solução controle (Default tooltip) é passada e o aparelho é ajustado para que o valor mensurado seja igual ou próximo ao indicado pelo fabricante da solução.
Vamos construir juntos um gráfico para verificação da dosagem de glicose? Acompanhe o passo a passo descrito a seguir, clicando nas setas.
Foto: Shutterstock.com
O técnico irá passar a solução de glicose com concentração conhecida no aparelho. Vamos supor que a concentração seja de 80mg/dL. Ele irá ajustar todos os parâmetros do aparelho para que o resultado obtido dessa dosagem gere um valor de 80mg/dL.
Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
Uma vez feito esse ajuste e que o aparelho esteja calibrado e liberado para uso, a leitura da amostra-controle será diária e a referência da média adotada como padrão inicial será asetada na calibração.
Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
A cada dia uma nova dosagem da amostra-controle (80mg/dL de glicose) será realizada.
A cada dia uma nova dosagem da amostra-controle (80mg/dL de glicose) será realizada.
Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
Com o passar dos dias, teremos um gráfico completo.
Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
Ao final dos primeiros 20 dias, poderemos obter uma análise crítica quanto à precisão, exatidão e tendência do equipamento avaliado em relação à amostra-controle utilizada. A dosagem será compilada e avaliada quanto aos desvios-padrão dos pontos mensurados.
80MG/DL
Prezado aluno: É importante que você saiba que as normas preconizadas pelo INMETRO estabelecem que as unidades de medida devem estar separadas dos números por um espaço. No entanto, limitações tecnológicas nos fazem juntar algumas das unidades aos números para tornar o entendimento do nosso material didático mais fácil. Assim, se você encontrar número e unidades juntos, saiba que foi feito para melhorar a sua visualização, mas que relatórios técnicos e demais materiais escritos por você devem seguir o padrão internacional de separação dos números e unidades.
O que fazer caso seja detectada alguma alteração na avaliação do gráfico Levey-Jennings?
Para delinear quais atitudes devem ser tomadas, normalmente seguimos as Regras de Westgard, que preveem direcionamentos nos mais variados casos. Os mais comuns são:
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de MelloFluxograma das regras de Westgard. s = desvio padrão.
Vamos entender melhor essa regra, interpretando os gráficos, dos casos mais comuns, de Levey-Jennings pela Regra de Westgard. Clique nas setas abaixo.
Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
1:3s: Uma medição do controle excede ±3 desvios padrões. Normalmente indica erros aleatórios.
Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
1:2s: Uma medição do controle excede o limite (±2s). Normalmente indica um alerta para as próximas medições.
Gráfico:Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
2:2s: Duas medições consecutivas do controle excede o limite (±2s). Normalmente é correlacionada a erro sistêmico.
Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
R:4s: Duas medições consecutivas do controle possuem diferença de 4 pontos. Normalmente é correlacionada a erro aleatório.
Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
4:1s: Quatro medições consecutivas do controle excedem o mesmo limite de ±1s. Normalmente indica erro sistêmico.
Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
10 média: Dez medições consecutivas do controle acima ou abaixo da média. Normalmente indica erro sistêmico intenso.
Quais são os limites de variações estabelecidos?
De maneira geral, a variação aceitável é de ±2 desvios-padrão (SD ou S) da média calculada ou informada, ficando de forma não consecutiva. A critério do laboratório, aceita-se 1 ponto mensurado fora desse limite estabelecido de ±2 desvios-padrão, pois o intervalo de confiança é de 95%.
Quando se tem mais de cinco pontos consecutivos se aproximando dos limites ±2 desvios-padrão, é um forte indicativo de perda de exatidão, que pode ser por erro sistêmico. Normalmente, sugere-se que as análises sejam suspensas e que o possível erro seja corrigido antes de liberar os resultados.
Quando se identifica mais de cinco pontos mensurados beirando os limites de ±2 desvios-padrão alternadamente, é um forte indicativo de perda de precisão, que pode ser por erro aleatório.
Quando mais de seis pontos mensurados estão de maneira crescente ou decrescente em direção aos limites estabelecidos, é um forte indicativo de tendência, ou seja, quando os pontos vão em uma mesma direção pouco a pouco, sem ter variações bruscas de desvio-padrão, indicando assim uma tendência de subir ou descer em relação à média.
Quando uma leitura de amostra-controle é rejeitada, dependendo do caso, é indicado fazer uma diluição/preparação de uma alíquota de amostra-controle; assim como deve-se realizar uma limpeza do equipamento, ajuste da temperatura ambiente (caso o equipamento exija alguma faixa específica para um bom funcionamento), e então repete-se a dosagem do parâmetro.
Caso persista a discrepância do parâmetro medido, a recomendação inicial é abrir um novo lote de amostra-controle, pois dependendo de sua composição, poderá ser por perda de viabilidade, contaminação, precipitação etc. Caso o problema continue com a nova amostra-controle, seria enquadrado como uma “não conformidade”, e o recomendado seria inutilizar a máquina momentaneamente e recalibrar o equipamento e/ou chamar a assistência técnica, para avaliar o motivo da falta de precisão e/ou exatidão encontrado.
 SAIBA MAIS
Cabe ressaltar que, caso seja necessária uma recalibração e/ou manutenção técnica no aparelho, os parâmetros do aparelho utilizados como referências devem ser “resetados”. Assim, a indicação é que se comece um novo gráfico de Levey-Jennings e aguarde pelo menos 20 medições para obter uma análise crítica do aparelho.
ATENÇÃO
Quando o equipamento passa por uma recalibração, utilizamos o controle interno para saber o novo valor de referência para o equipamento, ou ajustamos o equipamento para que a média daquela medida se mantenha. O que será acompanhado ao longo dos dias é a variação após a calibração/compensação. Por esse motivo, é importante começar um novo gráfico, pois a média pode ser bem diferente do gráfico antes da calibração/compensação.
O registro de não conformidades, tomadas de decisão e dos seus respectivos resultados deve ser anotado em caderno de registro de controle de qualidade da máquina, ou em algum documento similar previsto na gestão de qualidade do laboratório.
VOCÊ SABIA
Os laboratórios estão cada vez mais automatizados, dinâmicos e interfaceados, otimizando o processamento e diminuindo o tempo de liberação dos resultados, assim como aumentando gatilhos de alerta de possíveis erros ocorridos durante a fase analítica. Uma checagem que vem ganhando espaço do laboratório clínico é a checagem delta (Delta Check). Tal checagem é um mecanismo de comparação eletrônica de resultados anteriores (realizados em outra data) do mesmo paciente a fim de avaliar os níveis de variação entre os resultados e classificar se tais alterações são biologicamente possíveis.
Controle externo
O controle externo é o que chamamos de controle interlaboratorial, comparando os resultados obtidos com a média dos laboratórios participantes do mesmo controle.
A realização é a partir dos ensaios de proficiência, no qual o laboratório recebe periodicamente alíquotas de materiais que são enviados para vários laboratórios simultaneamente.
O laboratório realiza a testagem e envia os resultados obtidos para a empresa que enviou a(s) amostra(s).
Esta irá agrupar, avaliar e enviar os relatórios detalhados com os resultados obtidos e os valores esperados.
A partir desse controle, o laboratório terá subsídios para garantir que seus resultados representam um valor bem próximo ao real, dentro da variabilidade permitida.
Vale destacar que deve ser feita a realização do controle de qualidade interno e externo de todos os testes realizados no laboratório, independentemente se possui caráter qualitativo, quantitativo e/ou semiquantitativo. Caso o laboratório não consiga adquirir as amostras-controle, seja por questões financeiras ou por indisponibilidade comercial, deverá recorrer a formas alternativas indicadas para o caso na literatura. No caso de controle externo, algumas empresas disponibilizam kits comerciais específicos para o teste, porém aceitam validar testes que utilizem os reagentes da rotina em vez do kit comercial específico, desde que sejam respeitadas as especificações. No caso de controle interno do teste, para validar os resultados podemos utilizar amostras previamente avaliadas e com resultados conhecidos, como amostras sabidamente positivas ou negativas para determinada reação. Caso a amostra usada como controle positivo não apresente resultado positivo, o teste precisa ser refeito.
VOCÊ SABIA
O Programa Nacional de Controle de Qualidade (PNCQ) é considerado o maior provedor dos ensaios de proficiência para realização do controle externo da qualidade obrigatório, segundo a RDC 302:2005 da Anvisa.
FASE PÓS-ANALÍTICA
A fase pós-analítica compreende os procedimentos realizados após a análise técnica da amostra, incluindo cálculos, digitação dos dados, armazenamento da amostra sobressalente, arquivamento dos resultados, revisão e liberação dos laudos, disponibilização dos laudos e avaliação médica.
Os erros encontrados nessa fase, na maior parte dos casos, estão relacionados com letra/número ilegível, conversão de escalas e unidades de medidas, digitação incorreta. Com o avanço da tecnologia e do interfaceamento dos equipamentos com os softwares específicos para laboratórios clínicos, foi percebida uma diminuição significativa nas fontes de erros.
Atualmente, na maioria dos laboratórios, as amostras recebem identificação com códigos de barras, que é automaticamente reconhecida pelas máquinas e interfaceada com as máscaras dos exames solicitados, suprimindo a necessidade de digitação de cada exame solicitado. Apesar de todas as facilidades e benefícios com a transmissão da informação do equipamento diretamente para a máscara do futuro laudo, é preciso estar atento, sempre monitorando e revisando os resultados a serem liberados, pois erros e não conformidades ainda continuam ocorrendo.
Imagem: Shutterstock.comAmostras com código de barra.
Para minimizar tais fontes de erros, recomenda-se que as máscaras dos laudos sejam atualizadas periodicamente e/ou quando houver mudança de equipamento, metodologia ou valores de referência.
É importante haver uma padronização e uma linguagem facilitada ao montar uma máscara de laudo, principalmente em relação à disponibilização dos valores de referência quando estes modificam de acordo com as variações biológicas, como idade, gênero etc. Afinal, a avaliação médica do resultado liberado poderá ser de suma importância para a conduta médica,e se os resultados forem mal interpretados, podem induzir o médico a tomar direcionamentos equivocados.
ACREDITAÇÃO LABORATORIAL
Este é um método de reconhecer e atestar a qualidade dos serviços oferecidos pelos laboratórios, que, após a acreditação laboratorial, recebem um certificado de que atingiram as conformidades exigidas para seu funcionamento ser controlado.
Qual é a importância de ter a acreditação de um laboratório?
De maneira geral, o laboratório que possui acreditação passará mais credibilidade em relação ao serviço prestado, somada a eficiência, qualidade, segurança e eficácia na realização dos exames e no sistema de gestão da qualidade, mantendo o foco na satisfação do cliente (paciente/médico solicitante).
Para um laboratório ser acreditado, ele precisa seguir as normas brasileiras específicas e ter uma rotina de controle de qualidade. Tal rotina precisa incluir desde todos os itens de controle de qualidade interno e externo já discutidos, até o controle de diversas variáveis, como temperatura do ambiente, iluminação, umidade, temperatura das geladeiras e refrigeradores, lotes e validade dos reagentes etc. Com um controle rígido e eficaz, considerando todas essas variáveis, a chance de se alcançar os requisitos para obter a acreditação é muito alta.
ATENÇÃO
Cabe ressaltar que o processo de acreditação é periódico e voluntário, e é outorgado por órgãos credenciados com capacidade para avaliar e comprovar a implementação do sistema de qualidade (organizacional e/ou técnica) no laboratório solicitante. E tais entidades credenciadas precisam ser reconhecidas pela Agência Nacional de Saúde Suplementar (ANS).
Para refletir
Alguns estudos realizados apontam que a fase mais crítica do processamento de um exame é a fase pré-analítica, conforme mostrado na tabela abaixo.
	Tabela 2.1 Distribuição dos erros nas três fases
	
	Pré-analítica
	Analítica
	Pós-analítica
	Plebani et al.
	68%
	13%
	19%
	Lapwort et al.
	62%
	32%
	6%
	Goldschimit et al.
	53%
	23%
	24%
	Nutting et al.
	57%
	13%
	30%
	Stahl et al.
	75%
	16%
	9%
Porcentagem de erros nas três fases de um exame clínico.
BARCELOS; AQUINO, p. 14, 2018.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
Parte superior do formulário
1. AS ETAPAS DA REALIZAÇÃO DE UM EXAME SÃO CLASSIFICADAS EM PRÉ-ANALÍTICO, ANALÍTICO E PÓS-ANALÍTICO. A SEGUIR ESTÃO LISTADAS AS CORRELAÇÕES ENTRE A ATIVIDADE E AS ETAPAS DO EXAME CLÍNICO. ASSINALE A ALTERNATIVA QUE NÃO APRESENTA A CORRELAÇÃO CORRETA.
Coleta do material – fase pré-analítica.
Identificação dos tubos – fase pré-analítica.
Transporte do material coletado – fase pré-analítica.
Processamento dos dados do teste – fase pós-analítica.
Confirmação da identificação dos tubos e do paciente – fase pós-analítica. 
Resposta: A alternativa "E " está correta.
O exame clínico é dividido em três fases: pré-analítica (antes da análise ser realizada); analítica (durante a realização do exame); e pós-analítica (fase que contempla o processamento dos dados e sua interpretação). A confirmação dos dados do paciente e do rótulo dos tubos deve ocorrer na fase pré-analítica; ou seja, antes do exame ser analisado.
Parte inferior do formulário
Parte superior do formulário
2. O GERENTE DO LABORATÓRIO CENTRAL DE ANÁLISES CLÍNICAS SOLICITOU A SEU FUNCIONÁRIO O GRÁFICO DE LEVEY-JENNINGS DO TESTE DE GLICOSE, APRESENTADO A SEGUIR. AO AVALIAR OS 7 PONTOS DA ÚLTIMA SEMANA, ELE SOLICITOU QUE O TESTE FOSSE INTERROMPIDO MOMENTANEAMENTE DEVIDO À:
ELABORADO POR FABIANA VIEIRA DE MELLO.
Perda de precisão.
Perda de exatidão.
Tendência à queda.
Tendência à alta.
Perda de sensibilidade.
Parte inferior do formulário
Resposta: A alternativa "B " está correta.
Ao avaliar o gráfico apresentado, podemos ver que a partir do dia 13 todos os pontos estiveram abaixo da média de referência, indicando uma perda de exatidão. A exatidão avalia o quão próximos da média de referência os pontos estão, enquanto a precisão avalia o quão próximo um ponto está do outro, desconsiderando o valor médio de referência.
MÓDULO 2
Distinguir os diferentes métodos analíticos utilizados em bioquímica clínica, assim como a função e a aplicabilidade dos métodos analíticos abordados na prática laboratorial.
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
Conforme vimos no módulo anterior, os laboratórios de análises clínicas (incluindo o setor de bioquímica clínica) estão cada vez mais automatizados e tecnológicos. Apesar disso, o conhecimento dos princípios básicos dos diferentes métodos empregados continua sendo fundamental, pois em alguns casos será o alicerce para nortear a interpretação dos resultados de forma segura.
Com base nisso, vamos relembrar algumas questões físicas e químicas, explorar os métodos analíticos e correlacioná-los com os testes mais utilizados dentro do laboratório de bioquímica clínica atualmente.
É importante ressaltar que os testes, de maneira geral, podem ser classificados em:
	Classificação
	Característica
	Exemplos
	Qualitativos
	Definem se o resultado da amostra é positivo ou negativo.
	Detecção de glicose na urina.
	Quantitativos
	Têm como resultado valores/números.
	Dosagem de ferro no sangue.
	Semiquantitativos
	Quando a intensidade da positividade reflete em uma grandeza.
	Dosagem de anticorpos com base na titulação.
Dentre as principais técnicas utilizadas nos laboratórios de bioquímica clínica, podemos destacar a espectrofotometria, a colorimetria, a turbidimetria, a nefelometria e a eletroforese. Ao longo do módulo, vamos ver cada uma dessas técnicas e suas aplicações.
MÉTODOS FOTOMÉTRICOS
Diversas técnicas utilizadas em métodos quantitativos possuem como princípio base a fotometria, que consiste na medição de parâmetros da luz correlacionados à emissão, dispersão, absorção, transmissão e reflexão.
Imagem: Shutterstock.comFenômenos da luz.
Para começarmos a entender como funcionam as técnicas, precisamos relembrar alguns conceitos.
VOCÊ LEMBRA O QUE SÃO TRANSMITÂNCIA E ABSORBÂNCIA?
A luz, ao incidir no objeto, pode percorrer três caminhos diferentes: a absorção, a reflexão e a transmissão.
Imagem: Shutterstock.com
Resumidamente, temos a seguinte fórmula:
Vamos imaginar duas situações: na primeira, há uma luz passando por uma cubeta com uma solução incolor; e na segunda há a mesma luz, de igual intensidade, passando por uma cubeta igual, porém com uma solução azul.
Será que a intensidade de luz transmitida detectada será igual à intensidade de luz incidente? Ou será que a intensidade de luz transmitida que foi detectada no caso da solução incolor será a mesma intensidade de luz transmitida detectada com a solução azul?
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.Comparação da intensidade de luz detectada em soluções com diferentes características.
Pelo esquema anterior, podemos observar que a intensidade de luz incidente é maior do que a intensidade de luz transmitida detectada em ambos os casos. Além disso, a intensidade de luz detectada após a cubeta com a solução incolor é maior do que a intensidade de luz detectada após a cubeta com a solução azul.
Mas por que isso acontece?
Ao longo do caminho óptico, ao passar pela cubeta, há a absorção da radiação luminosa, diminuindo progressivamente a sua intensidade. Logo, a intensidade de luz detectada (I) será menor que a intensidade de luz incidente (Ii). A relação entre essas duas medidas é o que chamamos de Transmitância (T).
T=IIiT=IIi
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
A transmitância muitas vezes é apresentada em percentual, o que acaba gerando um resultado relativo. Então, para facilitar a comparação dos resultados obtidos, utilizamos a Absorbância (A), que matematicamente é o logaritmo negativo da transmitância:
A=−log T = −log IIi = log IiIA=-log T = -log IIi = log IiI
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
Além disso, podemos afirmar que a diferença encontrada entre as intensidades de luz que incide e a intensidade de luz que é detectada após a cubeta se deve a três principais fatores:
· Absortividadeconstante que depende do comprimento de onda;
· Espessura da solução atravessada pela luz (cubeta);
· Concentração da solução.
Com isso, fica estabelecido que a quantidade de intensidade de luz detectada diminui exponencialmente em algumas situações, como:
· Ao aumentar a espessura da cubeta com a solução, constituindo o que conhecemos como Lei de Lambert.
· Ao aumentar a concentração ou intensidade de cor da solução, constituindo o que conhecemos como Lei de Beer.
LEI DE LAMBERT
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.Comparação da intensidade de luz detectada em soluções com diferentes tamanhos de cubeta.
LEI DE BEER
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.Comparação da intensidade de luz detectada em soluções com diferentes concentrações/intensidade de cor.
Normalmente, o comprimento de onda é constante, a espessura da cubeta com a solução também é considerada constante se utilizarmos a mesma cubeta (o que normalmente acontece nos laboratórios de bioquímica clínica). Logo, o que muda de uma situação para a outra é a concentração da solução, que justamente é o alvo dos nossos testes laboratoriais.
Com isso, a Lei de Lambert-Beer estabelece que a concentração da substância em solução é diretamente proporcional à intensidade de luz absorvida, matematicamente representada por:
A=abcA=abc
Em que:
· a é a absortividade constante que depende do comprimento de onda;
· b é a espessura da solução atravessada pela luz;
· c é a concentração da solução.
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
Entre a transmitância e a absorbância, acabamos utilizando mais a absorbância por possuir uma relação linear com a concentração de uma substância absorvente em solução.
Relação Absorbância e % Transmitância.
Fotometria e Padronização, José Carlos Basques, 2010, pág. 9.
IMPORTÂNCIA DA LEI DE LAMBERT-BEER PARA AS DOSAGENS BIOQUÍMICAS.
Neste vídeo, a especialista Jéssica Ribeiro Lima fala sobre a importância da lei de Lambert-Beer e os conceitos de absorbância e transmitância para as dosagens em bioquímica clínica.
Vamos a um exemplo prático?
Com base nesses conceitos apresentados, como você acha que poderíamos utilizá-los na prática laboratorial?
Iniciamos com uma referência para que o teste possa ser quantitativo. Para isso, teríamos que partir de soluções com concentrações conhecidas, para que pudéssemos montar uma curva padrão. Vamos montar um experimento juntos?
Vamos supor que gostaríamos de dosar a substância “F” nas amostras de três pacientes.
CURVA PADRÃO
É o conjunto de valores utilizados como referência para o teste a ser realizado.
PASSO 1
Para começar, precisamos fazer uma diluição seriada da substância “F” padrão que temos em nosso laboratório. No nosso caso, diluímos em 11 amostras padrão. Após a diluição, precisamos incubar as amostras padrão diluídas com o reagente, que irá gerar uma mudança de cor ao reagir com a substância “F”.
PASSO 2
Precisamos também fazer uma cubeta com o reagente e sem nenhuma amostra, esse será o nosso branco, que serve para setar o aparelho; ou seja, indica ao aparelho quanto da intensidade de luz é refletida pela cubeta e quanto é absorvida somente pelo reagente. O valor gerado deverá ser descontado das medições das amostras padrão e das amostras de interesse. Na maioria dos aparelhos, esse desconto do valor encontrado no branco ocorre pela setagem para as medições seguintes, não sendo necessário fazer nenhum cálculo adicional nos resultados obtidos.
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.Esquema das amostras para realização da setagem do aparelho e curva padrão.
PASSO 3
Após o tempo necessário de incubação para a reação do teste, vamos realizar a leitura das amostras padrão em um aparelho que emite uma intensidade de luz, que cruza a cubeta e detecta a intensidade de luz que não foi absorvida nem dispersada.
PASSO 4
Para estabelecer uma correlação entre as concentrações conhecidas e a absorbância, montamos um quadro conforme o exemplo a seguir:
	Padrão
	Absorbância (595 nm)
	Concentração (µg/mL)
	1
	0,01
	1
	2
	0,02
	2
	3
	0,05
	5
	4
	0,1
	10
	5
	0,2
	20
	6
	0,5
	50
	7
	0,7
	70
	8
	0,8
	80
	9
	1,1
	100
	10
	1,1
	120
	11
	1,1
	130
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
Valores de absorbância comprimento de onda de 595 nm das soluções com concentrações conhecidas.
Elaborado por Fabiana Vieira de Mello
PASSO 5
Com bases nas anotações, vamos plotar em um gráfico os resultados:
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
PASSO 6
Vamos calcular a equação da reta:
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
PASSO 7
Vamos incubar as amostras dos pacientes e realizar a leitura conforme fizemos com as amostras padrão.
PASSO 8
Vamos anotar os valores de absorbância das amostras para calcularmos as concentrações da substância “F” em cada uma das amostras.
	Amostra
	Absorbância (595 nm)
	Concentração (µg/mL)
	Paciente 1
	0,6
	???
	Paciente 2
	0,35
	???
	Paciente 3
	0,72
	???
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
Valores de absorbância comprimento de onda de 595 nm das soluções com concentrações conhecidas.
Elaborado por Fabiana Vieira de Mello
PASSO 9
Com a equação da reta, calculamos as concentrações das amostras dos pacientes:
Equação:
y=0,0093x+0,0201y=0,0093x+0,0201
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
Em que: y = Absorbância; x = concentração da substância “F”.
Então:
Absorbância = 0,0093 (concentração) + 0,0201Absorbância = 0,0093 (concentração) + 0,0201
0,0093 (concentração) = Absorbância − 0,02010,0093 (concentração) = Absorbância - 0,0201
Concentração = Absorbância−0,02010,0093Concentração = Absorbância-0,02010,0093
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
Vamos calcular por paciente?
Paciente 1: Absorbância: 0,6 nm a 595 nm
Concentração = 0,6 − 0,02010,0093Concentração = 0,6 - 0,02010,0093
Concentração = 62,35 µg/mL Concentração = 62,35 µg/mL 
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
Paciente 2: Absorbância: 0,35 nm a 595 nm
Concentração = 0,35 − 0,02010,0093Concentração = 0,35 - 0,02010,0093
Concentração=35,47 µg/mLConcentração=35,47 µg/mL
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
Paciente 3: Absorbância: 0,72 nm a 595 nm
Concentração=0,72 − 0,02010,0093Concentração=0,72 - 0,02010,0093
Concentração=75,26 µg/mLConcentração=75,26 µg/mL
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
	Amostra
	Absorbância (595 nm)
	Concentração (µg/mL)
	Paciente 1
	0,6
	65,35
	Paciente 2
	0,35
	35,47
	Paciente 3
	0,72
	75,26
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PASSO 10
Plotamos no gráfico da curva padrão (pontos em vermelho):
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
PASSO 11
Conseguimos então calcular as concentrações da substância “F” nas amostras dos pacientes. E, ao observar o gráfico, verificamos que tais dosagens estão dentro da margem segura da dosagem.
ATENÇÃO
Você observou que as amostras padrão 9, 10 e 11 tiveram a mesma absorbância, mesmo tendo concentrações diferentes da substância “F”? Pois é, isso se deve ao “platô” de saturação. Independentemente da concentração, a partir da concentração da amostra padrão 9, o ponto máximo de absorbância já foi detectado. Caso a dosagem da amostra do paciente caia próxima ao “platô”, é importante repetir a dosagem diluindo a amostra do paciente, para que a dosagem caia no intervalo seguro da curva padrão.
Com esse exemplo que construímos juntos ficou mais fácil de vermos a aplicação dessas propriedades, não foi? E é assim que os exames que utilizam métodos fotométricos são realizados dentro do laboratório clínico.
Claro que todos esses cálculos já são automatizados pelos softwares dos equipamentos e toda a logística é facilitada, com utilização de kits em muitas situações. Mas se for necessário realizar um exame de emergência e o software não estiver funcionando,você conseguirá realizar o cálculo da concentração da substância com o nosso passo a passo, aplicando a Lei de Lambert-Beer.
ESPECTROFOTOMETRIA
A espectrofotometria (Espectrometria ou Espectroscopia) é uma das técnicas que utilizam a fotometria como princípio.
Foto: Shutterstock.comExemplo de espectrofotômetro.
Foto: Shutterstock.comExemplo de espectrofotômetro.
A partir dela, é possível medir a absorção de luz visível e ultravioleta, associando-a com a técnica de colorimetria, usando para isso os aparelhos espectrofotômetros.
Como mostrado no esquema a seguir, o espectrofotômetro apresenta uma fonte de luz, que será de tungstênio para luz visível ou de deutério para luz ultravioleta. Essa luz emitida passa por um monocromador, “transformando” essa luz em monocromática.
Imagem: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.Esquema simplificado dos componentes principais dos espectrofotômetros.
Atenção!
A luz visível compreende a luz com comprimento de onda de 400nm a 700nm.
Foto: Shutterstock.com
Ao passar pelo monocromador, o feixe passa por uma fenda (slit) que determina qual intervalo de comprimento de onda será permitido na avaliação. Se o monocromador for ajustado para 595nm e o aparelho tiver uma fenda de 10nm, por exemplo, o feixe de luz formado terá comprimento de onda de 590nm a 600nm.
Mas você deve estar se perguntando como esse intervalo é obtido. Vamos entender?
Quando o intervalo é de 10nm, isso indica que a avaliação será 5nm além do valor atribuído (590nm) e 5nm pra baixo (600nm). Por isso que no exemplo anterior, na fenda de 10nm, ajustado para 595nm, o feixe terá de 590nm a 600nm.
Depois do local para inserir a cubeta com a amostra, tem um detector do tipo fotomultiplicador, que transforma a luz transmitida pela amostra em impulso elétrico, que é amplificado e reconhecido eletronicamente. De acordo com o software do equipamento, esse resultado será fornecido em absorbância, transmitância e/ou concentração.
DICA
Quanto menor for o limite inferior de abertura do slit, melhor será o espectrofotômetro; e quanto menor a abertura da fenda utilizada, maior terá que ser a sensibilidade do fotomultiplicador.
Até o momento, nós discutimos que na espectrofotometria a luz será absorvida de acordo com a coloração da amostra avaliada, e que a concentração será proporcional ao valor da absorbância. Mas nem toda amostra terá uma cor diretamente relacionada com a substância de nosso interesse; assim como nem toda substância a ser investigada possui uma cor.
Então como devemos proceder para que o teste no espectrofotômetro seja substância (ou característica) específica? Como determinar a concentração da substância de interesse em uma amostra heterogênea e previamente colorida?
Essas perguntas são muito pertinentes, e vamos entender todo o passo a passo necessário para compreendermos a aplicação da espectrofotometria na prática clínica.
1
Para termos uma amostra viável para ser utilizada na espectrofotometria, precisamos realizar reações bioquímicas colorimétricas, nas quais utilizamos reagentes que em contato com as substâncias de interesse geram alterações na cor da solução, seja por consumo de substrato ou por formação de novos produtos.
Essa cor gerada será proporcional à concentração da substância corada na solução e, por conseguinte, obtemos a concentração da substância de interesse, de acordo com a reação bioquímica.
2
3
A cor da solução resultante das reações bioquímicas será avaliada de acordo com o comprimento de onda de luz que absorve; ou seja, se uma solução apresenta cor azul, significa que ela transmite luz azul e absorve a cor complementar, que é a luz amarela.
Logo, sua leitura deverá ser realizada com feixe no comprimento de onda de 580nm a 595nm, referente à luz amarela. Clique e veja o esquema.
4
Correlação dos comprimentos de onda e as cores absorvidas e complementares.
Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
No laboratório de bioquímica clínica, grande parte dos exames realizados se baseia nos métodos que acabamos de estudar – fotometria e colorimetria –, tendo como valores finais as concentrações das substâncias de interesse que são expressas em mg/dL, U/L, mmol/L, entre outras escalas.
As reações podem ter características qualitativas ou quantitativas, sendo os testes mais comuns para dosagem/identificação de:
· Proteínas, glicose, colesterol e lipídeos;
· Íons: ferro, cálcio, magnésio;
· Produtos nitrogenados: amônia, ureia e ácido úrico;
· Enzimas: fosfatase alcalina, amilase;
· Pigmentos endógenos: bilirrubina.
A seguir vamos conhecer algumas reações bioquímicas utilizadas na prática laboratorial. Lembrando que hoje já são vendidos kits com todos os reagentes e parâmetros padronizados, facilitando a parte operacional.
	Analito
	Método
	Leitura
	Glicose
	o-toluidina
	600 nm a 650 nm
	Creatinina sérica
	Cinético colorimétrico de tempo fixo
	490 nm a 520 nm
	Amilase
	Monitorização do tempo de hidrólise com iodo
	660 nm
	Fósforo
	Molibdato de amônio
	650 nm
	Ferro sérico
	Dissociação e redução do ferro
	540 nm a 580 nm
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
Vamos conhecer melhor os métodos de detecção desses analitos:
Glicose: A molécula de glicose reage com a o-toluidina em um meio ácido e aquecido. Dessa reação resultam a glicosamina e a base de Schiff, que produz coloração azul e será proporcional à concentração de glicose presente na amostra avaliada.
Creatinina sérica: A molécula de creatinina reage com o picrato alcalino (pH 12,4) em meio tamponado, gerando a molécula de picrato de creatinina de coloração vermelha, que será proporcional à concentração de creatinina na amostra avaliada.
Amilase: essa técnica é realizada de forma pareada à amostra com um padrão. Preparam-se dois tubos com amido e iodo, que será de cor azul. Será adicionado em um dos tubos a amostra para quantificar a amilase. A amilase presente na amostra irá degradar o amido a 37 °C, e a avaliação será pela perda da coloração azul; comparativamente com o tubo controle, onde o amido não foi degradado e continua com a coloração azul. A absorbância detectada será inversamente proporcional à atividade da amilase na amostra.
Fósforo: os íons de fósforo reagem com o molibdato de amônio quando em presença de ácido sulfúrico, formando o fosfomolibdato de amônio. A esse produto será adicionado hidroxilamina em meio alcalino, que resultará em azul de molibdênio, indicando a concentração de fósforo na amostra avaliada.
Ferro: a molécula de ferro sérico será dissociada da transferrina em meio ácido, reduzindo seu estado férrico pela hidroxilamina. As proteínas são precipitadas com o ácido clorídrico, ácido tricloroacético e ácido tioglicólico. Ao final, o ferro irá reagir com a ferrozina, formando um complexo de cor violeta que indicará a concentração do ferro na amostra avaliada.
TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA
A turbidimetria e a nefelometria são métodos que também se baseiam na fotometria, uma vez que utilizam a intensidade de luz como fonte para avaliar a concentração da substância de interesse na amostra; porém diferem da espectrofotometria, por não associar a colorimetria, e sim a turbidez da amostra e a consequente dispersão e/ou transmissão da luz incidente.
Essas técnicas visam avaliar a presença de complexos insolúveis, como complexos de antígeno-anticorpo. A quantificação desse imunocomplexo será proporcional à dispersão da luz: quanto mais turva for a amostra, mais concentrada está a substância de interesse e, consequentemente, mais a luz incidente será dispersada.
Esses dois métodos são inversos e complementares, mas quais são as diferenças entre eles?
A turbidimetria avalia e quantifica a luz que não foi dispersada, ou seja, a luz que foi transmitida até os detectores / fotomultiplicadores. Já a nefelometria quantifica a luz dispersada pelos detectores alocados em ângulos entre 45° a 90°, sendo um método bem mais sensível do que a turbidimetria.
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.Esquema que compara os métodos de nefelometria e turbidimetria.
Vamosentender melhor?
A intensidade de luz que é captada nos detectores, tanto na nefelometria quanto na turbidimetria, irá variar de acordo com as características do complexo proteico formado, principalmente em relação ao quantitativo, ao tamanho e à forma. Para intensificar a turbidez da técnica, muitos kits comerciais utilizam partículas de látex revestidas pelos anticorpos contra a substância de interesse.
Imagem: U.S. Geological Survey / Wikimedia Commons / Domínio Público.Esquema ilustrando o aumento da turbidez da reação antígeno-anticorpo com o látex.
Assim como na espectrofotometria, a curva padrão (de calibração) é fundamental para que se possa ter valores de referência e para que o aparelho seja calibrado de maneira correta antes de ser utilizado com as amostras de interesse. Para zerar o aparelho, também se utiliza um tubo somente com o reagente, chamado de branco.
A vantagem da turbidimetria é que pode ser realizada em aparelhos de espectrofotometria, enquanto a nefelometria precisa de um aparelho específico e que nem sempre está disponível nos laboratórios de análises clínicas.
De maneira geral, o método turbidimétrico é vantajoso pela sua rapidez de execução, exatidão e facilidade operacional. Por outro lado, é preciso se certificar de que não haja coloração na amostra, pois a coloração pode atrapalhar e acabar interferindo no resultado final.
A turbidimetria pode ser usada nos seguintes setores:
MICROBIOLOGIA
Para acompanhar o crescimento bacteriano por meio de turvação, mensuração da sensibilidade aos antibióticos nas culturas.
IMUNOLOGIA
Para avaliação de Proteína C-reativa (PCR).
BIOQUÍMICA
Para quantificação da concentração de proteínas em diversos líquidos biológicos, como em LCR (líquido cerebrospinal) e urina.
Já a nefelometria é frequentemente utilizada para exames de detecção de anticorpos, uma vez que são mais sensíveis do que a turbidimetria, como detecção de fator reumatoide (FR).
	
	Finalidade
	Método
	Leitura
	Microalbuminúria
	Quantificação da albumina na urina.
	Reação de aglutinação de antígeno-anticorpo.
	540 nm
	Ferritina
	Quantificação da ferritina no soro.
	Reação de aglutinação de antígeno-anticorpo.
	540 nm
	Proteína C-reativa (PCR)
	Quantificação da Proteína C-reativa no soro.
	Reação de aglutinação de antígeno-anticorpo.
	540 nm
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
Vamos conhecer melhor os métodos de detecção desses analitos:
Microalbuminúria: quantificação da concentração da albumina de maneira diretamente proporcional à aglutinação da albumina presente na amostra de urina avaliada com partículas de látex recobertas com anticorpos antialbumina humana. Realizar a leitura do tubo padrão e da amostra imediatamente após a incubação com o reagente e após 2 minutos, para comparar a amostra antes e depois da possível formação da aglutinação.
Ferritina: quantificação da concentração da ferritina de maneira diretamente proporcional à aglutinação da ferritina presente na amostra de soro avaliada com partículas de látex recobertas com anticorpos antiferritina humana. Realizar a leitura do tubo padrão e da amostra imediatamente após a incubação com o reagente e após 5 minutos, para comparar a amostra antes e depois da possível formação da aglutinação.
Proteína C-reativa (PCR): quantificação da concentração da PCR de maneira diretamente proporcional à aglutinação da PCR presente na amostra de soro avaliada com partículas de látex recobertas com anticorpos anti-PCR humana. Realizar a leitura do tubo padrão e da amostra imediatamente após a incubação com o reagente e após 2 minutos, para comparar a amostra antes e depois da possível formação da aglutinação.
MÉTODOS ELETROFORÉTICOS
A eletroforese é um método de separação baseado principalmente na diferença de migração dos componentes/substâncias carregados sob influência de campo elétrico.
De maneira geral, as substâncias que possuem carga negativa migram em direção ao polo positivo (ânodo), e as que possuem carga positiva migram em direção ao polo negativo (cátodo). Essa migração é feita em uma “malha” onde as amostras são injetadas, podendo ser em capilar ou placa de gel. Essa malha é embebida em tampão específico para a corrida das amostras. E é necessário um sistema composto por:
Imagem: Shutterstock.comApresentação esquemática da eletroforese em gel e a obtenção dos resultados.
Além da carga dos componentes da amostra, o tamanho e o volume também podem influenciar essa separação. Quanto mais concentrada for essa malha, menores serão os poros, e mais lento será o processo de separação.
Conforme acontece o processo de separação, formam-se bandas na malha, que diferem umas das outras pela carga elétrica e/ou pelo tamanho das substâncias.
A corrente elétrica aplicada no método é contínua, e quanto maior ela for, menor tende a ser o tempo para separação dos componentes, pois a velocidade será maior. Além disso, terá uma menor dispersão da banda, sendo mais eficiente, porém gerará maior calor, que poderá gerar processos de convecção e, assim, misturar as bandas já separadas.
Imagem: Shutterstock.comEsquema da amostra no gel antes e depois da eletroforese.
Com isso, os parâmetros aplicados, como corrente, tempo e concentração da malha, devem ser avaliados caso a caso, conforme a necessidade operacional/experimental.
Vamos conhecer o que é necessário para realizar uma eletroforese:
SUPORTE E MALHA
Pode ser de gel de agarose, gel de poliacrilamida, acetato de celulose.
SOLUÇÃO-TAMPÃO
Formada por água, sal ácido ou sal básico (pode ser ácido ou alcalino, dependendo da necessidade).
CUBA DE ELETROFORESE
Permite que a malha fique embebida no tampão e possui os eletrodos positivo e negativo.
FONTE DE VOLTAGEM
Aparelho que transforma a corrente alternada em corrente contínua, permitindo a regulagem da intensidade e determinando a polaridade dos compartimentos da cuba.
A escolha da malha precisa ser avaliada de acordo com a necessidade de cada caso. O acetato de celulose permite uma separação proteica rápida e possibilita um armazenamento mais prolongado dos filmes corados, além de ter um custo mais baixo, porém é um pouco limitado quanto à separação de amostras muito heterogêneas.
Foto: Shutterstock.comAparato para a eletroforese em cuba vertical.
Foto: Shutterstock.comAparato para a eletroforese em cuba horizontal .
O gel de agarose possui ampla capacidade de separação proteica e permite avaliar substâncias com peso molecular alto. Também possui custo relativamente baixo, porém não pode ser armazenado e preservado por muito tempo.
O gel de poliacrilamida pode conter um reagente desnaturante, que facilita a separação das substâncias. Comparada a outras técnicas, é a que apresenta melhor resultado em termos de visualização de proteínas com baixas concentrações, porém é a de mais difícil execução para a rotina laboratorial, sendo destinada para casos mais específicos.
Uma das aplicações da eletroforese no laboratório de análises clínicas é a avaliação das diferentes proteínas nas amostras.
Para entendermos esse processo na prática, vamos ver um passo a passo de uma eletroforese em gel de agarose de hemoglobinas na prática clínica.
1
Diluímos o pó da agarose em tampão, de acordo com a concentração desejada.
Colocamos a solução de agarose para solidificar no suporte específico, e com o “pente” que irá demarcar os locais para aplicação das amostras no gel.
Foto: Shutterstock.comEncaixe do “pente” no gel ainda líquido para formação dos poços, onde será feita a aplicação das amostras.
2
3
Após a solidificação total, colocamos o gel dentro da cuba de eletroforese horizontal e acrescentamos a solução-tampão.
Colocamos no primeiro poço para as amostras (slot) um padrão de peso molecular ou um padrão dos parâmetros a serem avaliados. No nosso caso, podemos colocar uma amostra padrão contendo hemoglobina AS (traço falcêmico), uma contendo hemoglobina A (normal), no slot ao lado um padrão de hemoglobina SS (falcêmico), e em outro a amostra de um paciente. Em todas as amostras, antes de aplicá-lasno gel, misturamos com um tampão de amostra para corrida.
4
5
Foto: Shutterstock.comAplicação das amostras nos poços do gel.
Após aplicar todas as amostras, cada uma em um poço, fechamos a cuba eletroforética e ligamos os eletrodos à fonte. Atenção! Precisamos de muita atenção para colocar o gel de maneira que as amostras (que estão carregadas negativamente) corram no gel em direção ao polo positivo; pois se colocar o gel virado ao contrário, todas as amostras sairão do gel, invalidando a corrida.
Esperamos o tempo necessário para as substâncias migrarem pelo gel de agarose e se separarem conforme carga elétrica.
Imagem: Shutterstock.comGel com a migração das diferentes moléculas por amostra.
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7
Imagem: Paulo Cesar Naoum, Hemoglobinas, 2013, p. 49 adaptado por Fabiana Vieira de Mello.Eletroforese em gel de agarose de hemoglobinas.
Analisaremos a distribuição de bandas das amostras comparando com a distribuição de bandas do padrão.
A partir do gel, podemos observar que na amostra padrão da hemoglobina A e no paciente verificamos uma banda mais forte (que seria a hemoglobina A) e uma banda mais fraquinha na parte inferior do gel (que seria a hemoglobina A2), ambas as amostras com características de migração no gel similares. É importante ressaltar que em indivíduos normais a hemoglobina é formada por quatro globinas (duas cadeias alfa e duas cadeias beta) e um grupo heme. Na amostra padrão da hemoglobina AS temos três bandas, sendo a mais fraquinha compatível com a hemoglobina A2, uma mais forte compatível com a hemoglobina A e uma outra banda, compatível com a migração da hemoglobina S. A hemoglobina S difere da hemoglobina A, pois a cadeia beta da globina apresenta uma substituição de um ácido glutâmico por uma valina na sexta posição da cadeia de DNA que origina uma hemoglobina anormal. Indivíduos que apresentam Hb AS apresentam traço falciforme e possuem aproximadamente 50% de hemoglobina A e 50% de hemoglobina S. Já os indivíduos Hb SS apresentam anemia falciforme e têm aproximadamente 100% da hemoglobina S. O nosso paciente em estudo não apresenta alteração na hemoglobina.
ATENÇÃO
Na bioquímica clínica, a eletroforese é muito utilizada para investigar a composição de proteínas na urina e no soro, principalmente quando o paciente apresentou níveis anormais na dosagem de proteínas totais, ou albumina, no exame anterior. O médico solicita esse exame de maneira complementar para entender o que está afetando as concentrações dessas proteínas no sangue e/ou na urina.
A eletroforese de proteínas do sangue forma um padrão clássico de bandeamento de aproximadamente 5 grupos: albumina, alfa-1, alfa-2, beta e gama.
Imagem: Shutterstock.comResultado típico do bandeamento das proteínas do soro humano.
Algumas doenças, porém, podem afetar essa produção equilibrada, aumentando o quantitativo de uma banda específica, como no caso de mieloma múltiplo. Quando se detecta uma banda em quantidade anormal, realiza-se um exame complementar de imunofixação.
Imagem: Paula Virginia Bottini, Testes laboratoriais para avaliação do componente monoclonal, 2007, p. 24.Eletroforese em gel de agarose. Em (A), paciente normal; e em (B), paciente com mieloma múltiplo.
Além do mieloma múltiplo, a eletroforese de proteínas também pode ser solicitada quando os sintomas indicam algumas doenças autoimunes, inflamatórias, hepáticas ou renais.
Outra aplicação clínica é a avaliação do perfil de lipoproteínas por eletroforese, sendo utilizada como auxílio no diagnóstico das dislipidemias primárias e secundárias. Onde tem-se como referência o padrão de distribuição de:
· alfa lipoproteínas (22,3 a 53,3%)
· pré-beta lipoproteínas (4,4 a 23,1%)
· beta lipoproteínas (38,6 a 69,4%)
· lipoproteína-Lp(a) (Ausente)
A eletroforese também pode auxiliar no diagnóstico dos processos inflamatórios no sistema nervoso central, como esclerose múltipla, a partir da análise eletroforética da composição proteica do líquor. Por fim, conforme já falamos ao longo do módulo, a eletroforese é muito utilizada para o diagnóstico de talassemias e hemoglobinopatias, sendo fonte de diagnóstico diferencial de microcitoses e anemias hemolíticas.
PRINCIPAIS ERROS DE EXECUÇÃO DAS TÉCNICAS DE ESPECTROFOTOMETRIA E ELETROFORESE
A especialista Fabiana Vieira de Mello discute sobre os principais erros metodológicos na execução das técnicas em laboratórios de bioquímica clínica.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
Parte superior do formulário
1. O TÉCNICO DO LABORATÓRIO PROCUROU O RESPONSÁVEL TÉCNICO PARA APRESENTAR AS ABSORBÂNCIAS DA DOSAGEM DE DUAS AMOSTRAS DENTRO DO GRÁFICO DA CURVA PADRÃO DIÁRIA, SOLICITANDO QUE VOCÊ ASSINE O LAUDO PARA LIBERAÇÃO DOS RESULTADOS.
ELABORADO POR FABIANA VIEIRA DE MELLO.
NO GRÁFICO, AMOSTRAS EM TESTES ESTÃO SINALIZADAS PELO TRIÂNGULO VERDE E PELO QUADRADO ROXO E AS AMOSTRAS PADRÃO, REPRESENTADAS PELAS BOLAS BRANCAS. A PARTIR DOS RESULTADOS APRESENTADOS, VOCÊ:
Assina o laudo e autoriza a liberação dos resultados com os valores apresentados.
Não assina o laudo e solicita que refaçam as dosagens das duas amostras.
Não assina o laudo, e solicita que refaça a dosagem da amostra quadrado roxa diluindo-a.
Não assina o laudo e solicita que refaça a dosagem da amostra triângulo verde diluindo-a.
Não assina o laudo e solicita que refaça a dosagem das duas amostras diluindo-as.
Parte inferior do formulário
Parte superior do formulário
2. (ADAPTADA) SERVIÇO AUTÔNOMO DE ÁGUA E ESGOTO DE SÃO PAULO (SAAE-SP) - DIVERSOS CARGOS (VUNESP - 2014). O ENSAIO QUE AVALIA A TURBIDEZ DA AMOSTRA E COM A CONSEQUENTE DISPERSÃO DA LUZ INCIDENTE É:
Eletroforese
Nefelometria
Turbidimetria
Espectrometria
Reação de aglutinação do látex
Parte inferior do formulário
GABARITO
1. O técnico do laboratório procurou o responsável técnico para apresentar as absorbâncias da dosagem de duas amostras dentro do gráfico da curva padrão diária, solicitando que você assine o laudo para liberação dos resultados.
Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
No gráfico, amostras em testes estão sinalizadas pelo triângulo verde e pelo quadrado roxo e as amostras padrão, representadas pelas bolas brancas. A partir dos resultados apresentados, você:
A alternativa "C " está correta.
A partir do gráfico, vemos que a amostra representada pelo quadrado roxo está na região “platô” da curva padrão. Caso a dosagem da amostra do paciente caia próxima ao “platô”, é importante repetir a dosagem diluindo a amostra do paciente, para que a dosagem caia no intervalo seguro da curva padrão. Em relação à amostra representada pelo triângulo verde, podemos liberar o laudo, pois está dentro da faixa de margem segura da dosagem.
2. (Adaptada) Serviço Autônomo de Água e Esgoto de São Paulo (SAAE-SP) - Diversos Cargos (VUNESP - 2014). O ensaio que avalia a turbidez da amostra e com a consequente dispersão da luz incidente é:
A alternativa "B " está correta.
A turbidimetria e a nefelometria são métodos que também se baseiam na fotometria, em que se utiliza a intensidade de luz como fonte para avaliar a concentração da substância de interesse na amostra. A turbidimetria avalia e quantifica a luz que não foi dispersada, e a nefelometria quantifica a luz dispersada.
CONCLUSÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Como vimos, a realização de um exame requer muitos cuidados e ajustes laboratoriais, desde a fase pré-analítica até a fase pós-analítica, para termos uma segurança na execução e na liberação dos laudos para os pacientes. Compreender os controles de qualidade aplicados são de suma importância, pois quando algum resultado gerado for discrepante, podemos rastrear e identificar se é devido a alguma alteração fisiológica do paciente ou por erros no processamento da amostra, conseguindo assim resolver a não conformidade.
Além disso, também visitamos o funcionamento das principais metodologias utilizadas na realização dos exames bioquímicos, facilitando o entendimento por trás de cada resultado liberado.
AVALIAÇÃO DO TEMA: