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Prof. Dr. Alexandre Dias UNIDADE I Bioengenharia e Biotecnologia Aplicadas à Biomedicina O que é bioengenharia? Engenharia aplicada à biologia melhoramento de processos e produtos biológicos. O que é biotecnologia? “Utilização dos seres vivos para o desenvolvimento de processos e produtos de interesse econômico e/ou social”. Contextualização Fonte: João Lúcio de Azevedo et al. (2002). Abrange diferentes áreas do conhecimento: interdisciplinaridade! Geneticistas e biologistas moleculares Bioquímicos Microbiologistas Engenheiros químicos Economistas Etc. História da biotecnologia Fonte: adaptado de: livro-texto Onde chegaremos? Difícil prever Projeto genoma humano Clonagem Transgênicos PCR Anticorpos monoclonais Estrutura do DNA Genética, vacinas e antibióticos Fermentação, domesticação de plantas e animais Antiga Clássica Moderna E v e n to s Categorias Princípios da biotecnologia molecular e engenharia genética: A engenharia genética Manipulação genômica Produção de insulina humana Incorporação de características Tecnologia do DNA recombinante Biotecnologia moderna Fonte: adaptado de: livro-texto Bactéria Cromossomo bacteriano Plasmídeo Um vetor, como um plasmídeo, é isolado O gene é inserido no plasmídeo DNA recombinado (plasmídeo) O DNA é clivado em fragmentos por uma enzima DNA contendo o gene de interesse O plasmídeo é incorporado por uma célula, como a de uma bactéria Bactéria transformada As células com o gene de interesse são clonadas O objetivo pode ser a obtenção do produto proteico do gene Plasmídeo OuO objetivo pode ser a produção de cópias do gene Produto proteico RNA As células produzem a proteína As proteínas desejadas são purificadas As cópias do gene são purificadas Um gene para resistência a uma peste é inserido em plantas Um gene altera bactérias, de modo que elas possam fazer a limpeza de resíduos tóxicos O hormônio do crescimento humano é utilizado no tratamento de casos de deficiência do crescimento Amilase, celulase e outras enzimas preparam os tecidos para a fabricação de roupas. Gene de interesse 1 3 2 4 5 6A 6B 7 Enzimas de restrição Clonagem Animais e plantas transgênicos Vacinas Alguns elementos importantes da biotecnologia... PCR Plasmídios recombinantes Células-tronco Técnicas moleculares... “Tesouras Moleculares” Enzimas que cortam a molécula de DNA em locais específicos, identificados por uma sequência de nucleotídeos que é reconhecida pela enzima Enzimas de restrição Tabela 1 – Enzimas de restrição Enzima Bactéria cuja enzima é isolada Sequência reconhecida Tipo de extremidade gerada após clivagem BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5’ ... G↓GATCC ... 3’ 3’ ... CCTAG↑G ... 5’ Extremidades coesivas (extensão 5’ fosfato) EcoRI Escherichia coli 5’ ... G↓AATTC ... 3’ 3’ ... CTTAA↑G ... 5’ Extremidades coesivas (extensão 5’ fosfato) HaeIII Haemophilus aegyptius 5’ ... GG↓CC ... 3’ 3’ ... CC↑GG ... 5’ Extremidades cegas HindIII Haemophilus influenzae 5’ ... A↓AGCTT ... 3’ 3’ ... TTCGA↑A ... 5’ Extremidades coesivas (extensão 5’ fosfato) NotI Nocardia otitidiscaviarum 5’ ... GC↓GGCCGC ... 3’ 3’ ... CGCCGG↑CG ... 5’ Extremidades coesivas (extensão 5’ fosfato) PstI Providencia stuartii 5’ ... CTGCA↓G ... 3’ 3’ ... G↑ACGTC ... 5’ Extremidades coesivas (extensão 3’ hidroxila) XhoI Xanthomonas holcicola 5’ ... C↓TCGAG ... 3’ 3’ ... GAGCT↑C ... 5’ Extremidades coesivas (extensão 5’ fosfato) Fonte: adaptado de: livro-texto P P P P P P P P OH S S S S S S S S S S S S S S S S P P P P P P P PHO TTT TT T AAA AA A C C G G P P P P P P OH S S S S S S TTTAA C AG S S P PHOP P P P P PHO S S S S S S TT AAA C T G P P OH S S Extremidade 5’ fosfato Clivagem que resulta em extremidades coesivas Extremidade 3’ hidroxila História: bacteriófagos – partículas virais que invadem e destroem bactérias: Bactérias: emprega enzimas para se defender dos bacteriófagos – endonucleases. Ferramenta para estudar e manipular o DNA e, consequentemente, para o desenvolvimento da engenharia genética e da biotecnologia. Como funcionam as enzimas de restrição? 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Fonte: adaptado de: livro-texto Mais de 3.000 enzimas identificadas. Cortam a molécula de DNA em sequências-alvo fragmentação do DNA extremidades ligantes com outro DNA fragmentado com a mesma enzima – DNA recombinante! Ex.: EcoRI reconhece apenas a sequência GAATTC e atua sempre entre o G e o primeiro A. O local do “corte” é conhecido como sítio alvo. Cada bactéria possui, geralmente, uma enzima que reconhece uma sequência de DNA com 4 a 12 pares de bases. Têm em sua maioria uma característica comum: a de terem a mesma sequência de bases quando lidas nas duas fitas complementares. Sequências de DNA fita dupla com essas características são chamadas palíndromos. Enzimas de restrição Inserção dos sítios de restrição de uma dada enzima no fragmento de cDNA capaz de sintetizar a insulina. Exemplo de aplicação das enzimas de restrição Fonte: adaptado de: livro-texto cDNA da insulina Porção do cDNA que não se anela no iniciador Produto da PCR Segmento do vetor Sítio múltiplo de clonagem cDNA da insulina DNA do vetor DNA do vetor Digestão e purificação do gel DNA do vetor DNA do vetor Ligação cDNA da insulina cDNA da insulina DNA do vetorDNA do vetor Digestão e purificação do gel Fonte: adaptado de: livro-texto Identificação de variantes no DNA de pacientes com doenças Fonte: Adaptado de: BHATTACHARYA, D., VAN MEIR, E.G. A simple genotyping method to detect small CRISPR-Cas9 induced indels by agarose gel electrophoresis. Sci Rep 9, 4437 (2019). P. ex.: Doenças recessivas Diferenças alélicas Selvagem X Mutante Etc. Adgrb3 WT Mutants M 3 17 45 32 11 10 19 2 28 29 37 39 47 34 bp: 500 400 300 1 h migration, 4% agarose gel 371 A enzima de restrição EcoRI reconhece e digere a sequência de DNA - GAATTC. Um dado fragmento de DNA ao ser tratado com a EcoRI foi clivado em três fragmentos menores de tamanhos distintos. A partir dessas informações, podemos dizer que: a) Existiam duas sequências GAATTC no fragmento original. b) A sequência GAATTC não é um palíndromo. c) Existiam três sequências GAATTC no fragmento original. d) A soma do tamanho dos fragmentos gerados é menor que o tamanho total do fragmento original. e) Existiam quatro sequências GAATTC no fragmento original. Interatividade A enzima de restrição EcoRI reconhece e digere a sequência de DNA - GAATTC. Um dado fragmento de DNA ao ser tratado com a EcoRI foi clivado em três fragmentos menores de tamanhos distintos. A partir dessas informações, podemos dizer que: a) Existiam duas sequências GAATTC no fragmento original. b) A sequência GAATTC não é um palíndromo. c) Existiam três sequências GAATTC no fragmento original. d) A soma do tamanho dos fragmentos gerados é menor que o tamanho total do fragmento original. e) Existiam quatro sequências GAATTC no fragmento original. Resposta Os transgênicos obtidos pela tecnologia de DNA recombinante em que se adiciona um gene, de espécie diferente, com o objetivo de transmitir uma característica específica. OGM – qualquer modificação no genoma do indivíduo – também se incluem aqueles em que apenas se modifica o genoma do próprio organismo (deleções ou transversões). Clonagem: produção de algo idêntico. Conceitos: clonagem, OGM e transgênicos Vetores para clonagem: plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeos e cromossomos artificiais A TRANSFERÊNCIA DOS GENES A CÉLULAS VEGETAIS Agrobacterium tumefaciens Plasmídeo Ti Vetor para inserção de gene de interesse! Fonte: adaptado de: livro-texto DNA cromossômico Célula doadora DNA cromossômico DNA cromossômico Plasmídeos Célula receptora DNA polimerase Duplicação celularPlasmídeo integrado (epissomo) Pilus Pilus Pilus Transferência do DNA Plasmídeo F Plasmídeo F Célula doadora antiga Nova célula doadora Integração do plasmídeo Duplicação celular 1. 2. 3. 4. Plasmídeos Plasmídeos Cromossomo bacteriano Viral: Protege o transgene da degradação por nucleases Conduz o transgene do citoplasma ao núcleo Não viral: Fácil manipulação Baixa resposta imune Baixa toxicidade Muitas aplicações Baixa taxa de transfecção Métodos de transfecção – vetores Inserindo o material genético exógeno na célula: exemplos! Microinjeção BiobalísticaEletroporação Fonte: adaptado de: livro-texto Bactéria eletrocompetente Incubação Choque elétrico Recuperação Pulso de hélio Cano da “arma” Dissipação do hélio Protoplasto da célula vegetal Microprojéteis (moléculas do DNA recombinante revestidas por ouro ou tungstênio) Partículas de ouro ou tungstênio DNA Cano da arma Protoplastos Transfecção Desenvolvimento do novo vegetal contendo o DNA de interesse Regeneração da parede celular Três formas básicas de se produzir animais transgênicos: 1. Microinjeção 2. Células-tronco embrionárias 3. Transferência nuclear Criando um produto/animal transgênico! Etapas para a construção de um transgênico: Transformação por engenharia genética Regeneração mediante técnicas de cultura de tecidos Caracterização molecular e bioquímica Avaliação do valor agronômico Melhoramento mediante cruzamentos com linhagens de elite Obtenção de uma variedade transformada geneticamente Experimentos e testes de campo, em pequena e grande escala Autorização da legislação local Liberação do cultivo para sua exploração comercial A tecnologia do DNA recombinante e o cotidiano Medicamentos obtidos pelo uso da biotecnologia Medicamento Metodologia de produção Aplicação Material biológico Antibióticos Fermentação Tratamento de infecções Penicillium notatum (penicilina), Streptomyces venezuelae (cloranfenicol), Streptomyces griseus (estreptomicina), entre outros Fatores de coagulação sanguínea Técnica do DNA recombinante Tratamento de hemofilia Células CHO (Células do Ovário do Hamster Chinês) Antitrombina (Atryn® foi o primeiro medicamento produzido utilizando animais geneticamente engenheirados aprovado pelo FDA*) Purificada do leite de animais transgênicos Utilizado em pacientes com alteração hereditária da produção de antitrombina Cabra transgênica Insulina (Humulin® foi o primeiro fármaco biotecnologicamente aprovado pelo FDA*) Técnica do DNA recombinante Tratamento do diabetes mellitus Escherichia coli Eritropoietina (Procrit®, Epogen®, Eprex® e NeoRecormon®) Técnica do DNA recombinante Tratamento de anemia decorrente de doenças renais crônicas, infecções por HIV e câncer Células CHO (Células do Ovário do Hamster Chinês) IL-2 Técnica do DNA recombinante Tratamento de câncer de células renais Escherichia coli Interferon-α (Intron-A®, Roferon-A® e Actimmume®) Técnica do DNA recombinante Tratamento de sarcoma de Kaposi, hepatites B e C, câncer de células renais Escherichia coli e Pichia pastoris Interferon-β (Avonex®, Rebif® e Betaseron®) Técnica do DNA recombinante Tratamento de esclerose múltipla secundária progressiva Escherichia coli Alfadornase (Pulmozyme®) Técnica do DNA recombinante Tratamento de fibrose cística Células CHO (Células do Ovário do Hamster Chinês) Ativador de plasminogênio (Activase®) Técnica do DNA recombinante Dissolve coágulos sanguíneos que podem causar ataque cardíaco, embolia pulmonar e derrame OKT3 (primeiro anticorpo monoclonal a se tornar disponível para terapia em humanos) Técnica do hibridoma Tratamento contra rejeição de órgãos transplantados Linfócito B e mieloma Fonte: adaptado de: livro-texto [IFSP 2014] A raposa, o lobo e o cão doméstico pertencem a espécies biológicas distintas entre si. Suponha que o seguinte experimento tenha sido realizado com sucesso: o núcleo de uma célula do corpo de um cão tenha sido transplantado para um óvulo anucleado de uma raposa e o embrião tenha sido implantado no útero de uma loba, ocorrendo a gestação. O animal será um clone que apresentará características genéticas: a) Da loba, apenas. b) Da raposa, apenas. c) Do cão, apenas. d) Da mistura da raposa e da loba. e) Da mistura do cão e da raposa. Interatividade [IFSP 2014] A raposa, o lobo e o cão doméstico pertencem a espécies biológicas distintas entre si. Suponha que o seguinte experimento tenha sido realizado com sucesso: o núcleo de uma célula do corpo de um cão tenha sido transplantado para um óvulo anucleado de uma raposa e o embrião tenha sido implantado no útero de uma loba, ocorrendo a gestação. O animal será um clone que apresentará características genéticas: a) Da loba, apenas. b) Da raposa, apenas. c) Do cão, apenas. d) Da mistura da raposa e da loba. e) Da mistura do cão e da raposa. Resposta O Sistema CRISPR... Fonte: 17, August 2012, Vol 337, Science. www.sciencemag.org CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Cas9: CRISPR associated Protein 9 CRISPR/Cas9 CRISPRs são classes de sequências de DNA repetitivos que agem em conjunto com os genes associados ao CRISPR para conferir imunidade bacteriana contra nucleotídeos invasores estrangeiros. 20-50 bp. Descoberto em 1987 na Escherichia coli. 2007 – evidenciada a ação da CRISPR/Cas9 em Streptococcus thermophiles. CRISPR Cas9-crRNA-tracrRNA Fonte: Adaptado de: Arq Bras Cardiol. 2017; 108(1):81-83 Exógeno Endógeno Reparo Cas9 Cas9 RNA-guia c rR N A T ra c rR N A Aplicações na cardiologia O Sistema CRISPR/Cas9 e a Possibilidade de Edição Genômica para a Cardiologia The CRISPR/Cas9 System and the Possibility of Genomic Edition for Cardiology Marcela Corso Arend, 1 2 Jessica Olivaes Pereira, 1 3 Melissa Medeiros Markoski1 Laboratório de Cardiologia Molecular e Celular – Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde (Cardiologia) – Instituto de Cardiologia/Fundação Universitária de Cardiologia – IC/FUC,1 Porto Alegre, RS; Universidade do Vale do Rio dos Sinos – UNISINOS,2 São Leopoldo, RS; Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre – UFCPA,3 Porto Alegre, RS - Brasil Método terapêutico – tratamento de doenças In vivo e ex vivo Escolha do vetor: Tamanho do gene Capacidade de transfecção Toxicidade do vetor Tempo da expressão do gene Célula-alvo Terapia gênica Métodos de recuperação do produto biotecnológico Fonte: adaptado de: livro-texto A B C A B A B Proteína alvo Precipitado Sobrenadante Cromatografia em camada delgada frente do solvente B A C origem aplicação da amostra Cromatografia em coluna solvente B A C Soro Fonte Eletrodos A α1 α2 β γ A edição genética é um assunto que causa muitas discussões no mundo atual, em que se pode ouvir que é possível modificar uma parte específica do Ácido Desoxirribonucleico (DNA) ou até mesmo uma sequência, com a edição, baseada na técnica CRISPR/CAS9, é possível remover aquilo que é indesejado ou até mesmo acrescentar e modificar aquilo que é desejado. Sobre a técnica CRISPR/CAS9, assinale a alternativa correta: a) A enzima CAS atua como uma tesoura molecular. b) O CRISPR é uma sequência repetitiva. c) O mecanismo atua na defesa da célula bacteriana. d) Essa ferramenta tem prospecção para ser utilizada para a terapia gênica no tratamento de doenças humanas. e) Todas as alternativas estão corretas. Interatividade A edição genética é um assunto que causa muitas discussões no mundo atual, em que se pode ouvir que é possível modificar uma parte específica do Ácido Desoxirribonucleico (DNA) ou até mesmo uma sequência, com a edição, baseada na técnica CRISPR/CAS9, é possível remover aquilo que é indesejado ou até mesmo acrescentar e modificar aquilo que é desejado. Sobre a técnica CRISPR/CAS9, assinale a alternativacorreta: a) A enzima CAS atua como uma tesoura molecular. b) O CRISPR é uma sequência repetitiva. c) O mecanismo atua na defesa da célula bacteriana. d) Essa ferramenta tem prospecção para ser utilizada para a terapia gênica no tratamento de doenças humanas. e) Todas as alternativas estão corretas. Resposta Cultivo celular, células-tronco Células aderentes e células não aderentes Uma cultura primária é estabelecida a partir do crescimento de células oriundas de um fragmento de tecido obtido por desagregação mecânica ou enzimática Fonte: adaptado de: livro-texto Células primárias Biópsia a partir do rim Seleção Células renais – cultura primária A B Cultivo celular Cultura secundária (p2) Tripsinização (passagem das células de uma placa confluente para uma nova placa) Cultura primária (confluente) Crescimento até atingir confluência Tripsinização Durante a tripsinização, interações das células em cultura com a MEC, com a placa e com outras células são desestabilizadas. Assim, partes delas podem ser transferidas para outra placa Cultura secundária (confluente) Cultura terciária (p3) Ciclos de tripsinização finitos Crescimento até atingir confluência Cultura terciária (confluente) Depois de múltiplas passagens sequenciais, a cultura entra em senescênciaFonte: adaptado de: livro-texto Monocamada Invasão e metástase Fonte: adaptado de: livro-texto O crescimento das células normais é inibido pelo contato, o que leva à formação da monocamada. Várias camadas são formadas após proliferação de células tumorais em cultura. A proliferação não é inibida pelo contato. Normal Câncer Vaso linfático Tumor primário Êmbolo Vaso sanguíneo Células tumorais metastáticas Célula tumoral metastática Linfonodo Autorrenováveis: possuem a capacidade de se dividirem indefinidamente originando novas células-tronco. Clonogênicas: capacidade de gerar uma réplica exata. Potentes: capacidade de se diferenciarem em um ou mais tipos celulares. Células-tronco Trofoectoderma (forma os anexos embrionários) Blastocisto (4 dias pós-fertilização) Óvulo Espermatozoide Zigoto Totipotente Pluripotentes Massa celular interna (forma todas as células do corpo) Multipotentes Oligopotentes Unipotentes Endoderma (forma os tratos digestivo e respiratório, pâncreas e fígado) Mesoderma (forma músculos, sangue, vasos sanguíneos) Ectoderma (forma pele, sistema nervoso e partes da face e pescoço) (2ª semana pós fertilização) Fonte: adaptado de: livro-texto Clonagem 1. Isolamento de células da ovelha 1 2. Remoção do núcleo do óvulo de ovelha 2 3. Transferência do núcleo da célula somática (ovelha 1) para o óvulo anucleado (ovelha 2) 4. Os fatores citoplasmáticos do óvulo reprogramam o DNA 5. Implantação da célula originada da reprogramação em uma ovelha 3 6. Nascimento da Dolly 1. Isolamento de células somáticas do paciente 2. Remoção do núcleo do óvulo de uma doadora 3. Transferência do núcleo da célula somática para o óvulo anucleado 4. Os fatores citoplasmáticos do óvulo reprogramam o DNA 5. A estrutura começa a sofrer divisões celulares até chegar ao estágio de blastocisto 6. Isolamento das células da massa celular interna do blastocisto Fonte: adaptado de: livro-texto IPSCs Fonte: adaptado de: livro-texto 1. Isolamento de células do paciente (fibroblastos) 2. Tratamentos das células com fatores de reprogramação 3. Após algumas semanas são geradas iPSCs 4. Tratamentos das culturas com fatores que estimulam a diferenciação de uma variedade de tipos celulares Células sanguíneas Células intestinais Cardiomiócitos A construção do conceito de biossegurança teve seu início na década de 1970, quando a comunidade científica iniciou a discussão sobre os impactos da engenharia genética na sociedade. Biossegurança! Lei de Biossegurança: 11.105, 24 de março de 2005 Art. 1°: Esta Lei estabelece normas de segurança e mecanismos de fiscalização sobre a construção, o cultivo, a produção, a manipulação, o transporte, a transferência, a importação, a exportação, o armazenamento, a pesquisa, a comercialização, o consumo, a liberação no meio ambiente e o descarte de organismos geneticamente modificados – OGM e seus derivados [...]. Na entrada dos laboratórios deve ser anexada uma planta mostrando a localização e a natureza de produtos químicos e inflamáveis e produtos biológicos, a qual poderá ser consultada pelo pessoal de emergência. Essa planta deve ser confeccionada de comum acordo com o pessoal do laboratório e um profissional do serviço de emergência, quando for aplicável (CIENFUEGOS, 2001). Biossegurança Na unidade I você aprendeu as técnicas do DNA recombinante e como manipular o DNA de qualquer organismo por meio das enzimas de restrição. Além disso, discutimos sobre os vetores de clonagem, as variadas formas de introduzi-los no hospedeiro, bem como os diferentes mecanismos envolvidos na seleção da célula de interesse. Também falamos sobre o CRISPR, um sistema que ocorre naturalmente em bactérias e que se tornou uma ferramenta revolucionária de edição gênica. Vimos ainda que tão importante quanto a produção de proteínas recombinantes é a sua purificação, a qual pode ser realizada por diferentes métodos. Em resumo... A biologia das células-tronco foi outro assunto importante abordado nesta unidade. Vimos que as células-tronco podem ser classificadas de acordo com o seu potencial de diferenciação. Além das células-tronco naturalmente encontradas em adultos e tecidos embrionários, já existem tecnologias que permitem gerar células-tronco de pluripotência induzida, e as vantagens de seu uso também foram abordadas. As ferramentas e as tecnologias citadas acima possibilitaram a clonagem nuclear e a geração de organismos geneticamente modificados, que abrem diversas discussões e pontos relevantes que precisam ser considerados em termos éticos e de biossegurança. Em resumo... A pesquisa para o tratamento de doenças com a utilização de células-tronco apresenta resultados promissores e encorajadores para a medicina moderna. Com grande capacidade proliferativa e de regeneração, as células-tronco são classificadas como totipotentes, pluripotenes, multipotentes, unipotentes e reprogramadas. Marque a alternativa incorreta sobre as células-tronco. a) As células da massa celular interna do embrião (blastocisto) possuem característica de pluripotência b) Para a manutenção celular, os housekeeping genes são expressos em todas as células do organismo. c) As células-tronco possuem capacidade de responder a estímulos externos. d) O transplante autólogo de células-tronco é indicado para o tratamento de doenças genéticas. e) A medula óssea é uma das principais fontes de células-tronco adultas. Interatividade A pesquisa para o tratamento de doenças com a utilização de células-tronco apresenta resultados promissores e encorajadores para a medicina moderna. Com grande capacidade proliferativa e de regeneração, as células-tronco são classificadas como totipotentes, pluripotenes, multipotentes, unipotentes e reprogramadas. Marque a alternativa incorreta sobre as células-tronco. a) As células da massa celular interna do embrião (blastocisto) possuem característica de pluripotência. b) Para a manutenção celular, os housekeeping genes são expressos em todas as células do organismo. c) As células-tronco possuem capacidade de responder a estímulos externos. d) O transplante autólogo de células-tronco é indicado para o tratamento de doenças genéticas. e) A medula óssea é uma das principais fontes de células-tronco adultas. Resposta ATÉ A PRÓXIMA!
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