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Fundamentos de Biologia Molecular e Biotecnologia Material Teórico Responsável pelo Conteúdo: Prof. Dr. Bruno Cavelheiro Araujo Revisão Textual: Prof. Ms. Luciano Vieira Francisco A Síntese Proteica • Síntese Proteica • Transcrição do DNA • Processamento do RNA • Tradução do mRNA · Proporcionar conhecimento específico sobre os mecanismos que con- trolam a síntese proteica, principalmente relacionado aos processos de transcrição do DNA, síntese e processamento do RNA e tradução do RNA mensageiro. · Gerar conhecimento fundamental à compreensão da aplicação da Biologia Molecular na área da Biotecnologia. OBJETIVO DE APRENDIZADO A Síntese Proteica Orientações de estudo Para que o conteúdo desta Disciplina seja bem aproveitado e haja uma maior aplicabilidade na sua formação acadêmica e atuação profissional, siga algumas recomendações básicas: Mantenha o foco! Evite se distrair com as redes sociais. Determine um horário fixo para estudar. Aproveite as indicações de Material Complementar. Não se esqueça de se alimentar e se manter hidratado. Conserve seu material e local de estudos sempre organizados. Procure manter contato com seus colegas e tutores para trocar ideias! Isso amplia a aprendizagem. Seja original! Nunca plagie trabalhos. Assim: Organize seus estudos de maneira que passem a fazer parte da sua rotina. Por exemplo, você poderá determinar um dia e horário fixos como o seu “momento do estudo”. Procure se alimentar e se hidratar quando for estudar, lembre-se de que uma alimentação saudável pode proporcionar melhor aproveitamento do estudo. No material de cada Unidade, há leituras indicadas. Entre elas: artigos científicos, livros, vídeos e sites para aprofundar os conhecimentos adquiridos ao longo da Unidade. Além disso, você também encontrará sugestões de conteúdo extra no item Material Complementar, que ampliarão sua interpretação e auxiliarão no pleno entendimento dos temas abordados. Após o contato com o conteúdo proposto, participe dos debates mediados em fóruns de discussão, pois irão auxiliar a verificar o quanto você absorveu de conhecimento, além de propiciar o contato com seus colegas e tutores, o que se apresenta como rico espaço de troca de ideias e aprendizagem. UNIDADE A Síntese Proteica Contextualização Considerada uma das disciplinas mais importantes na área da Biologia, principalmente pela sua aplicabilidade em diversos segmentos sociais, tais como agricultura, pecuária e saúde, Fundamentos da Biologia Molecular e Biotecnologia tem como objetivo principal fornecer uma visão global de como podemos utilizar diversas ferramentas moleculares para solucionar problemas reais da sociedade moderna, além de buscar otimizar diversos processos relacionados a esses e muitos outros segmentos. Assim, nesta Unidade abordaremos os principais mecanismos de controle da síntese proteica. Tais mecanismos são fundamentais para maior compreensão do funcionamento molecular da célula e, consequentemente, da sua aplicação na Biotecnologia. 8 9 Síntese Proteica Como já sabemos, as proteínas são moléculas extremamente importantes para todos os seres vivos, pois desempenham incontáveis funções consideradas es- senciais para a manutenção da vida. Além disso, é a molécula mais abundante e diversa de todos os sistemas biológicos. Todas as proteínas possuem composição química similar e no geral são compostas por polipeptídios que, por sua vez, são compostos por suas unidades básicas, os aminoácidos. Apesar de desempenhar muitas funções específicas, a maioria das proteínas é formada pelos vinte amino- ácidos comumente encontrados na natureza. Desde as formas mais “simples”, como as bac- térias, até as mais “complexas”, como mamífe- ros, aves e répteis, as proteínas são sintetizadas a partir da informação genética contida nos Ácidos Desoxirribonucleicos (DNA) e em um processo altamente complexo. Tal informação é transcrita para um RNA mensageiro (mRNA) e pela ação do RNA transportador (tRNA) e do RNA ribossomal (rRNA), essa informação é traduzida em sequên- cias de aminoácidos, formando os peptídios e, consequentemente, as moléculas proteicas. Esse processo é conhecido como o dogma central da Biologia Molecular (Figura 1). Assim, nesta Unidade abordaremos de maneira geral as eta- pas da síntese de proteínas moduladas por RNA, ou seja, transcrição, processamento e tradução em eucariotos. Figura 1 – Representação do dogma central da Biologia Molecular Fonte: Acervo do Conteudista Transcrição do DNA A transcrição é o primeiro passo para o processo de síntese proteica. Essa etapa está relacionada à síntese de uma molécula de RNA específica a partir da informação genética contida no DNA de um gene. Apesar de o produto final da síntese proteica ser a própria proteína, o processo de transcrição codifica apenas RNA. Todos os tipos de RNA da célula são originados a partir da transcrição. A molécula que regula o processo de síntese proteica é a RNA Polimerase (RNAP). As RNAP executam cinco funções primordiais no processo de transcrição: i) reconhecem e ligam-se em sequências específicas do DNA; ii) separam a dupla hélice do DNA, expondo a sequência gênica que será copiada; iii) conferem estabilidade para a abertura da fita de DNA – mantendo-a aberta –, assim como para a ligação da fita híbrida de RNA:DNA; iv) renaturam o DNA para sua conformação estrutural inicial – dupla hélice –; v) completam a síntese de proteínas sozinhas ou 9 UNIDADE A Síntese Proteica com auxílio de proteínas específicas – essas cinco etapas serão detalhadamente descritas no decorrer deste Material teórico. A transcrição – primeira etapa da síntese proteica – seguirá sempre a regra do antiparalelismo, ou seja, seguirá direção de 3’ para 5’ na molécula de DNA molde e, inversamente, a molécula de RNA será formada a partir de sua extremidade 5’ até sua extremidade 3’. De maneira geral, a fita de RNA gerada é idêntica à que será base complementar da Adenina (A) (Figura 2): Figura 2 – Esquematização do processo de transcrição, modulado pela enzima RNAP Fonte: Adaptado de commons.wikimedia.org Transcrição em Procariotos A transcrição gênica em procariotos pode ser dividida em três etapas distintas: i) reconhecimento da molécula de RNAP pelo sítio promotor, originando o complexo de iniciação; ii) alongamento da cadeia de RNA – síntese –; e iii) terminação, quando a síntese é interrompida, liberando a molécula de RNA. Iniciação Para que o processo de transcrição seja possível, são necessárias sequências na molécula de DNA, as quais atuem como fatores de iniciação. Essas sequências são conhecidas como promotoras – regiões que possuem aproximadamente setenta pares de bases e controlam o início da transcrição. Uma série de proteínas chamadas de fatores σ, guiam as polimerases até as regiões promotoras, indicando o local exato do início da síntese. As RNAP reconhecem essas regiões e se ligam, formando o complexo RNAP holoenzima. A ligação de RNAP com o promotor promove a abertura de aproximadamente dez pares de bases da dupla hélice do DNA, dados pela quebra de suas pontes de hidrogênio, originando uma estrutura denominada bolha de transcrição – complexo aberto. Essa abertura expõe as sequências do DNA das duas fitas, no entanto, apenas uma das quais será transcrita. A molécula de RNA que será gerada a partir da transcrição é composta por ribo- nucleosídios trifosfato (ATP, UTP, CTP, GTP) presentes na célula. Esses ribonucleo- sídios possuem grande afinidade e são complementares aos desoxirribonucleotídios 10 11 (bases A, T, C, G) do DNA. Com as bases do DNA expostas pela ligação do pro- motor com as RNAP, uma primeira molécula de ribonucleosídio liga-se ao primeiro desoxirribonucleotídio do DNA. Alongamento Após essa primeira ligação, outras ligações ocorrerão sequencialmente, de modo que o segundo ribonucleosídio trifosfato se ligará ao segundo desoxirribonucleotídiodo DNA e assim consecutivamente. Da mesma forma como ocorre na conformação estrutural da dupla hélice, os ribonucleosídios se ligarão na fita simples de DNA por complementaridade, formando uma ligação não covalente, no entanto, como dito, ao invés da Timina (T), será a Uracila (U) que se ligará à base Adenina (A) da molécula de DNA. Terminação A transcrição é finalizada pela separação completa da fita de RNA sintetizada da fita de DNA molde, que recupera sua conformação estrutural original – dupla hélice. A informação referente ao término do processo de transcrição está presente em locais específicos do DNA que é transcrito e geralmente é composto por uma sequência de bases T. Enquanto a RNAP percorre a região da bolha de transcrição da fita híbrida de RNA:DNA, novos ribonucleosídios são alinhados, uma extremidade da bolha continua aberta para ser transcrita e a outra extremidade é renaturada, forçando o desligamento da molécula de RNA sintetizada – terminação. Além disso, o RNA sintetizado participa diretamente do término da transcrição através da formação de estruturas secundárias, ou até mesmo ligando-se em outros fatores, resultando em uma conformação estrutural em forma de gancho, que desestabiliza a ligação entre a fita de RNA e a de DNA molde, forçando sua separação, encerrando assim o processo de transcrição. Transcrição em Eucariotos De forma geral, a transcrição em eucariotos é mais complexa que a de procariotos. Em eucariotos a molécula de RNA transcrita a partir do DNA possui regiões codificantes, os éxons, e as não codificantes, os íntrons (pré-mRNA). Por uma reação denominada splicing, os íntrons são removidos, restando apenas os códons (mRNA). Outro fato importante é que os eucariotos possuem três tipos diferentes de RNAP, enquanto que os procariotos apenas um tipo. A RNAPI que sintetiza apenas uma classe de RNA, geralmente muito longa e abundante na célula, é denominada pré-mRNA; as RNAPII são responsáveis, principalmente, pela síntese de mRNA e RNAPIII, que sintetizam rRNA, tRNA e RNA pequenos. As sequências reguladoras em eucariotos podem ser divididas em elementos promotores – upstream –, compostos por sequências consenso denominadas TATA box ou elemento TATA – região onde se inicia a transcrição – e elementos 11 UNIDADE A Síntese Proteica reforçadores – enhancer –, que são sequências pequenas de DNA e que, no geral, aumentam a expressão de um determinado gene, independentemente de sua posição na molécula de DNA. Neste contexto, abordaremos apenas os mecanismos regulatórios que envolvem as RNAPII, já que está relacionada à transcrição do mRNA. Complexo de Pré-Inicialização Diferentemente ao observado em procariotos, as RNAP de eucariotos não estão envolvidas diretamente no reconhecimento e ligação da região promotora do DNA. Esta talvez seja a diferença mais importante no processo de transcrição entre esses dois grupos. As RNAP em eucariotos requerem mais de uma proteína para reconhecerem e se ligarem nas regiões promotoras (TATA box) e, consequentemente, desdobrarem a dupla hélice. Essas proteínas são denominadas fatores de transcrição. São os fatores de transcrição que inicialmente reconhecem as regiões promotoras, ligam-se e interagem com outros fatores, formando um complexo de iniciação, ou complexo transcricional, ao qual as RNAP se ligarão diretamente. Primeiramente, o TFIID, que é o maior fator de transcrição, liga-se à região TATA box do DNA através de um componente anexo denominado TBP. Posteriormente, os fatores de transcrição TFIIA e TFIIB juntam-se ao complexo, preparando o complexo transcricional para a ligação da RNAP. Com a junção de TFIID, TFIIA, TFIIB, RNAP e outros fatores, o complexo transcricional está pronto para o processo de iniciação e para realizar a sua função, recebe a energia proveniente da molécula de ATP. Iniciação A incorporação da RNAPII propicia a abertura da dupla hélice do DNA, expondo suas bases nitrogenadas a serem transcritas, originando a bolha de transcrição. Alongamento Como observado em procariotos, nesta fase diversas ligações sequenciais serão formadas, entre ribonucleosídios e desoxirribonucleotídios do DNA, de modo a se complementar (AU e CG) de forma antiparalela (5’ → 3”), formando a fita híbrida de RNA:DNA. Terminação O processo de terminação em eucariotos é complexo e ainda pouco compreen- dido. Diferente dos mecanismos observados em procariotos, que não possuem uma compartimentalização nuclear, em eucariotos o RNA funcional necessita obrigatoria- mente atravessar a membrana nuclear até o local de ação. Com isso, a célula realiza uma espécie de “sistema de qualidade de mRNA”, do qual somente as moléculas de mRNA funcionais e que serão utilizadas, conseguem ultrapassar a membrana celular, enquanto que as moléculas defeituosas ou incompletas são prontamente eliminadas. Finalmente, o mRNA sintetizado pela RNAPII é clivado na extremidade 3’ e uma sequência denominada cauda poli (A) é aderida em sua sequência. 12 13 Veja o processo de transcrição em eucariotos. O processo de Transcrição https://youtu.be/slOneovpOEk Ex pl or Processamento do RNA Em eucariotos, as moléculas de RNA – todas as formas –, sintetizadas a partir da informação genética contida no DNA, muitas vezes não estão em suas formas biologicamente funcionais. Existem alguns tipos possíveis de modificações na molécula de RNA após sua síntese, dado pela adição, deleção ou alteração de nucleotídios, ou mesmo de regiões maiores. Por possuir um sistema mais complexo, as células eucarióticas apresentam maior nível de processamento de mRNA se comparado às células procarióticas. RNA Mensageiro (mRNA) O processamento do mRNA em eucariotos ocorre em três etapas principais: a remoção dos íntrons – splicing –, a agregação de duas estruturas denominadas cap e cauda poli A. Importante! Que a descoberta da presença de íntrons em um gene viral se deu pelos norte-americanos Philip Sharp e Richard Roberts, no ano de 1977? E que ambos foram premiados com um Nobel de Medicina em 1993? Você Sabia? Incorporação do Cap O nome cap é dado para a agregação de um nucleosídio trifosfato, presente na extremidade 5’ da molécula de mRNA, a um nucleotídio metilado. Sua principal função é evitar a degradação por fosfatases e nucleases do mRNA durante o processo de remoção dos íntrons, além de ser importante na conexão do mRNA ao ribossomo durante o processo de tradução. Basicamente, o processo de adesão do cap na molécula de RNA é modulado por duas enzimas. Em um primeiro momento, uma enzima específica liga uma molécula de Guanosina Trifosfato (GTP) na extremidade 5’ do transcrito primário (mRNA) e, em seguida, uma enzima denominada metiltransferase incorpora grupos metílicos provenientes de uma molécula doadora no mRNA. Incorporação da Cauda Poli A A cauda poli A é uma estrutura formada por, aproximadamente, 250 adeninas, inserida na região 3’ do mRNA. Sua principal função é facilitar o transporte do mRNA para o citoplasma e gerar estabilidade para a molécula, já que com sua 13 UNIDADE A Síntese Proteica presença o mRNA é mais lentamente degradado. A inserção dessa sequência na molécula de mRNA recebe o nome de poliadenilação e ocorre ao término do processo de transcrição. Sabe-se que essa sequência de adeninas não é codificada pelo DNA e está presente apenas na molécula de mRNA. Diversos fatores específicos reconhecem no pré-mRNA uma sequência própria – sequência consenso – chamada de sinal de poliadenilação, formada pelos nucleotídios AAUAAA. Um desses fatores – endonucleases – cliva o pré-mRNA em, aproximadamente, vinte nucleotídios após o sinal de poliadenilação, liberando-o do DNA e uma enzima chamada poli A polimerase incorpora a sequência de 250 adeninas na extremidade 3’ do mRNA (Figura 3): Figura 3 – Processo de incorporação da cauda poli A – poliadenilação – na molécula de RNA Fonte: geneticavirtual.webnode.com.br Splicing Igualmente chamado de excisão– remoção – dos íntrons, o termo splicing refere-se ao processo de remoção das sequências presentes nos pré-mRNA que, no geral, não codificam proteínas, originando as moléculas de mRNA realmente funcionais, que são mais estáveis – por serem mais curtas – que sua precursora. De maneira geral, os íntrons são regiões conservadas – similares – no genoma de todos os grupos biológicos, apresentando regiões consenso que sinalizam a posição correta onde deve ocorrer o splicing – sítio do splicing. Algumas características são comuns nessas regiões, sendo observadas desde leveduras até mamíferos, como uma adenina localizada na mesma região (20 a 50 nt) próxima à extremidade 3’ do íntron, uma tendência a um maior número de pares de base do tipo pirimidinas (U, C) na região da extremidade 3’ e com raras exceções, os dois primeiros e dois últimos nucleotídios do íntron são, respectivamente, GU e AG 14 15 O processo de splicing pode ocorrer basicamente de duas formas: mediado por spliceossomos – estruturas que modulam os processos de splicing –, ou por autosplicing – não é intermediado pela ação dos spliceossomos, ou seja, a própria molécula de RNA remove os íntrons. Para as duas formas a reação ocorre em duas etapas de transferência. Incialmente, ocorre uma transferência de um fosfato de um açúcar para outro e, posteriormente, a transferência de uma ligação fosfodiéster. Essas reações liberam os íntrons no formato característico de um “laço”, unindo os éxons (Figura 4): Figura 4 – Processo de splicing mediado por spliceossomo Fonte: geneticavirtual.webnode.com.br Assista à animação apresentando o processo de splicing mediado pelo spliceossomo. Splicing do mRNA https://youtu.be/bQvukfT3MJc Ex pl or Importante! Que em alguns casos, o processo de splicing pode gerar proteínas diferentes, ou múltiplas proteínas codificadas por um mesmo gene, dado pela inclusão ou remoção de éxons do mRNA? E que neste caso denominamos splicing alternativo? Você Sabia? 15 UNIDADE A Síntese Proteica RNA Transportador O tRNA é uma molécula de baixo peso molecular – 74 a 95 nucleotídios em cadeia linear –, correspondendo a, aproximadamente, 10% do RNA total da célula, possui conformação estrutural em forma de trevo – essa conformação é dada devido aos quatro pares de base de sequências complementares que se emparelham – e suas principais funções são: alinhar os aminoácidos seguindo a ordem marcada pelos códons do mRNA e transportá-los para o processo de síntese proteica a ser realizado nos ribossomos. O processamento do tRNA é dado pela retirada de um único íntron, tornando-a uma molécula efetivamente madura. Diferentemente ao observado no mRNA, no tRNA não existem regiões consenso, sendo a própria molécula de pré-tRNA o elemento de reconhecimento para o processo de splicing. A maturação do tRNA é realizada em duas etapas distintas: inicialmente ocorre uma quebra nas extremidades 5’ e 3’ do íntron a ser liberado e como resultado dessa clivagem, o tRNA é dividido em dois éxons. Posteriormente, devido a interações bioquímicas – pareamento de bases –, essas duas metades são unidas pela ação de uma enzima específica, denominada RNA-ligase, formando o tRNA maduro – funcional. Cada tipo específico de tRNA sofre alterações pela substituição de nucleotídios comuns por nucleotídios considerados raros como, por exemplo, a substituição da base U pela base pseudouridina (ψ). Outro fato importante é a substituição dos trinucleotídios AAA – presentes na extremidade 3’ – de todos os tRNA pelo trinucleotídio CCA. RNA Ribossômico (rRNA) O rRNA é o componente primário dos ribossomos e, assim como o mRNA e o tRNA, é transcrito a partir da informação genética contida no RNA. Entre todos é o RNA mais abundante nas células – aproximadamente 90% –, responsável pela estruturação dos ribossomos. O processamento, ou seja, a montagem do rRNA em ribossomo, é realizado no nucléolo e essa estrutura é formada por várias subformas do rRNA, como o pré-rRNA, os rRNA biologicamente funcionais – maduros –, além de outras enzimas e subunidades. Em eucariotos existem quatro tipos diferentes de rRNA, de acordo com tamanho e função: 5S, 5.8S, 18S e 28S. O processo de maturação – processamento – é realizado por sucessivas clivagens, obedecendo uma ordem preferencial, no entanto, não obrigatória. Inicialmente ocorre a clivagem das estruturas denominadas espaçadores transcritos externos, seguida por duas clivagens que resultam na liberação do RNA 18S em sua forma biologicamente funcional. Posteriormente ocorrem três clivagens para a liberação da forma 5S e normalmente da forma 28S. A única exceção é com relação à forma 5S, que é transcrita separadamente. Após essas sucessivas clivagens, o rRNA deixa o núcleo celular para compor a estrutura dos ribossomos. 16 17 Tradução do mRNA A tradução é o processo final da síntese proteica. Todo o processo é mediado pelo tRNA, que conduzirá os aminoácidos presentes no citosol da célula para os ribossomos e os alinhará considerando a informação contida nos códons do mRNA. A informação genética contida no DNA é transcrita no mRNA, que mediará todo o processo. Como sabemos, a informação genética é formada por códons, compostos por três nucleotídios (A, U, C, G) cada, de modo que cada códon possui afinidade específica pelos vinte tipos de aminoácidos. O tRNA também é uma molécula específica e possui uma região que se liga diretamente aos aminoácidos – de acordo com sua especificidade – e outra que se liga aos códons do mRNA. O processo de tradução pode ser basicamente dividido em três etapas: iniciação, alongamento e terminação – processo esse representado resumidamente na Figura 5. Importante! Fique atento(a)! Não confunda essas etapas com as fases de iniciação, alongamento e terminação do processo de transcrição. Importante! Iniciação Uma série de proteínas denominadas Fatores de Iniciação (IF) mediam essa etapa. Entre outras funções, os IF alinham a molécula de mRNA com uma subunidade menor que posteriormente formará o ribossomo. Essa subunidade percorrerá o mRNA até detectar um códon específico, denominado códon de iniciação, sempre represen- tado pela sequência AUG. Uma região denominada anticódon no tRNA, contendo as bases UAC, ligar-se-á por complementaridade com a sequência AUG do códon de iniciação do mRNA. O tRNA com o anticódon contendo a sequência UAC carrega consigo, por uma série de interações bioquímicas, seu aminoácido correspondente que, neste caso, é a metionina. Após a ligação entre códon de iniciação do mRNA e anticódon do tRNA, a subunidade maior ligar-se-á a esse complexo para formar o ribossomo funcional, finalizando a etapa de iniciação. Alongamento Assim como no processo de iniciação, o alongamento é modulado pela ação de fatores, neste caso os Fatores de Elongação (EF). A formação do ribossomo dado pela junção da subunidade menor com a maior constitui dois sítios no interior do complexo denominado local Peptidilo (local P) e Aminoácilo (local A). O primeiro tRNA – ligado ao códon de iniciação – ocupará o local P, enquanto o segundo tRNA, com seu aminoácido correspondente e suas bases complementares ao segundo códon, ocupará a região A. A metionina presente no primeiro tRNA – localizado 17 UNIDADE A Síntese Proteica na região P –, instantaneamente é transferida e unida ao aminoácido do segundo tRNA – localizado na região A. Após essa transferência, o primeiro tRNA deixa o ribossomo, este então move-se pelo mRNA e o tRNA seguinte – complementar ao terceiro códon – entra no ribossomo. Com isso, o aminoácido do segundo tRNA é transferido e unido ao aminoácido do terceiro tRNA e assim sucessivamente, formando um peptídio extenso. À medida que o ribossomo se move pelo mRNA, o tRNA contendo o peptídio é deslocado para a região A, sendo esse movimento denominado translocação. Terminação Esta etapa da tradução é modulada por Fatores de Terminação (RF). Da mesma forma que o códon de iniciação,existe um códon que sinaliza o término da tradução, denominado códon de terminação, que é representado pelas trincas UAA, UGA ou UAG, sendo observado apenas um dos três códons no mRNA. Quando a região A do ribossomo passa e reconhece o códon de terminação no mRNA, o fator de terminação ocupa a região A, o peptídio – proteína – pronto é liberado juntamente com o último tRNA, de modo que as subunidades menor e maior se separam e o processo de tradução é finalizado. Cadeia Polipeptídica (proteína) Aminoácido Anticódon CódonSubunidade pequena Subunidade grande RNAm RNAt Figura 5 – Esquema geral do processo de tradução de proteínas Fonte: Adaptado de iStock/Getty Images Assista ao processo de tradução de proteínas: Tradução do mRNA https://youtu.be/NZ9m4aydAn0 Ex pl or 18 19 Material Complementar Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade: Livros Biologia Molecular da Célula ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. 5. ed. Porto Alegre, RS: Artmed, 2010. Fundamentos de Biologia Molecular MALACINSKI, G. M. Fundamentos de Biologia Molecular. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. Vídeos Biologia https://youtu.be/BTpVc8aNqgk Processamento RNA https://youtu.be/eWPOzNVyocs 19 UNIDADE A Síntese Proteica Referências DE ROBERTS, E. M. F.; HIB, J. Base da Biologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. MALAJOVICH, M. A. Biotecnologia 2011. Rio de Janeiro: ORT, 2012. ZAHA, A. Biologia Molecular básica. 3. ed. Porto Alegre, RS: Mercado Aberto, [20--]. ZÁRATE, C. B.; SAHAGÚN, D. O.; BORUNDA, J. S. A. Biología Molecular: fundamentos y aplicaciones. Desarrollo Santa Fe: McGraw-Hill, 2009. 20
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