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Disciplina Bioquímica (PPGBAA) 15º estudo dirigido: Biossíntese de ácidos nucléicos 1) Apresente e explique detalhadamente o Dogma Central da Biologia Molecular? O Dogma central da Biologia Molecular foi imposto por Francis Crick anos depois de ter participado, junto com James Watson, do esclarecimento da estrutura do DNA (dupla hélice). Estudando a relação entre a informação contida no DNA (bases nucleotídicas A, T, C e G), as proteínas e os ácidos ribonucléicos (RNAs), surgiu então a interrogação sobre como ocorria o fluxo da informação genética. A conclusão obtida através dos estudos de Crick foi que o dogma central da biologia molecular consiste na ideia de que a informação de um organismo é perpetuada através da replicação do DNA e é traduzida através de dois processos: a transcrição, que converte a informação do DNA (fita dupla) em uma forma mais acessível, uma fita de mRNA (RNA mensageiro) complementar, (fita simples) e através da tradução que converte a informação contida no mRNA em proteínas. Sendo assim, o Dogma Central da Biologia Molecular é um conceito muito importante, pois ilustra os mecanismos de transmissão e expressão da hereditariedade após a descoberta da sua codificação na dupla hélice do DNA e ainda propõe que existe uma unidirecionalidade na expressão da informação contida nos genes de uma célula, ou seja, que o DNA é transcrito no mRNA e que este é traduzido à proteína. 2) Explique a importância da colinearidade entre as sequências de DNA, RNA e Proteínas A colinearidade entre as sequências de DNA, RNA e proteínas é muito importante, pois o código genético é a relação entre a sequência de bases do DNA/RNA e a sequência de aminoácidos nas proteínas, ou seja, a sequência dos nucleotídeos de um gene determina a sequência de aminoácidos em uma proteína (mostrado na figura a baixo). Os aminoácidos são codificados por grupos de três bases (Códons) a partir de um ponto fixo. Das quatro bases podem formar-se 43 = 64 códons diferentes, dos quais 3, por exemplo, são sinais para terminar a formação da proteína. Cada aminoácido deve ser codificado corretamente para que a ao final dos processos de síntese, transcrição e tradução ocorra a expressão gênica correta. Isso só é possível devido a colinearidade entre as sequências, que ocorre por meio de pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas, além do dobramento preciso a correta automontagem dos pares de bases e o ambiente celular correto, pois apesar de as sequencias proteicas conterem toda a informação necessária para alcançar sua correta conformação a sequencia de DNA sozinha não é suficiente para proporcionar sua formação. http://pt.wikipedia.org/wiki/Hereditariedade http://pt.wikipedia.org/wiki/Gene http://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula http://pt.wikipedia.org/wiki/Transcri%C3%A7%C3%A3o_(gen%C3%A9tica) http://pt.wikipedia.org/wiki/Tradu%C3%A7%C3%A3o_(gen%C3%A9tica) http://pt.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna 3) O que é o DNA e qual é a sua função. O ácido desoxirribonucleico, ou simplesmente DNA, é um polímero fino e longo formado por unidades simples (monômeros) de nucleotídeos, (A, T, C e G) unidos por ligações fosfodiéster cuja cadeia principal é formada por moléculas de açúcares e fosfato, sendo que a sequência de bases ao longo da molécula de DNA constitui a informação genética. Sua principal função é armazenar e repassar as gerações seguintes toda a informação genética nele contida. 4) Quais são as características da replicação do DNA? As características da replicação: 1. Semiconservativa; 2. Bidirecional; 3. Procariotos possuem uma origem de replicação e eucariotos várias origens; 4. A DNA polimerase sintetiza o DNA; 5. A síntese ocorre no sentido 5’-3’; 6. A DNA polimerase apresenta atividade de correção de erros (sentido 3’-5’); 7. A síntese é contínua em uma fita e descontínua na outra (semidescontínua); 8. A replicação do DNA é dividida em três fases: iniciação, elongação e terminação; e 9. A nova fita é complementar e antiparalela. 5) O que é a replicação semiconservativa, unidirecional e bidirecional? Cada fita de DNA funciona como um molde para a síntese de uma nova fita, produzindo duas novas moléculas de DNA, cada uma com uma fita nova e uma fita velha. Isso é chamado de replicação semiconservativa. Quando a dupla hélice é análoga a um zíper que se abre, começando em uma ponta, podemos dizer que essa analogia é válida, a deselicoidização dos dois filamentos irá expor as bases em cada filamento. Cada base exposta tem potencial para parear com nucleotídeos livres na solução. Como a estrutura do DNA impõe requisitos rígidos de pareamento, cada base exposta irá parear apenascom sua base complementar, A com T e G com C. Assim, cada um dos dois filamnetemos irá agir como um molde, para dirigir a montagem de bases complementares para reestruturar uma dupla hélice idêntica à origem ginal. Os nucleotídeos recém-adicionados são supostos como vindos de um conjunto de nucleotídeos livers que devem estar presentes na célula. Então cada molécula-filha deve conter uma cadeia parental de nucletídeos e uma recém-sintetizada. A replicação unidirecional ocorre em apenas um sentido e em fitas simples e possui apenas uma forquilha de replicação. Ambas as fitas do DNA são replicadas simultaneamente, ou seja, a replicação do material genético é bidirecional onde ambas as extremidades da alça possuem forquilhas de replicação ativas. 6) Explique como a geometria do pareamento de bases contribui para a fidelidade da replicação do DNA. A geometria do pareamento de bases, contribui para a fidelidade da replicação, de forma que durante a polimerização, diferenciação entre os nucleotídeos corretos e os incorretos não está apenas nas pontes de hidrogênio que especificam o correto pareamento entre as bases complementares, mas também na geometria comum entre os pares de bases-padrão. O sítio ativo da DNA-polimerase I acomoda apenas os pares de bases que apresentem a mesma geometria. Um nucleotídeo incorreto pode ser capaz de formar pontes de hidrogênio com uma base no molde, mas esse normalmente não encaixa adequadamente no sítio ativo. As bases incorretas podem ser rejeitadas antes que a ponte fosfodiéster seja formada. Logo, a geometria do pareamento é fundamental para que a informação chegue de forma precisa no ribossomo culminando na leitura e síntese de produtos para a célula. 7) Quais são as atividades da DNA polimerase I e de que forma essas atividades contribuem para a replicação precisa do DNA? A DNA polimerase I apresenta três funções que são muito importantes para a replicação precisa do DNA. A primeira função é a atividade polimerase, onde a DNA polimerase catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5’-3’. A segunda função é a exonuclease 3’-5’, que é responsável por remover os pareamentos errados que possam ocorrer durante o processo de replicação. E a terceira função é a exonuclease 5’-3’, que degrada a dupla hélice de DNA. A replicação precisa do DNA ocorre, em parte, devido a uma atividade desenvolvida tanto pela DNA polimerase I, quanto pela DNA polimerase III, que é a atividade de exonuclease 3’-5’. Essa atividade desempenha uma função de revisão, retirando bases erradamente inseridas. As linhagens sem uma exonuclease 3’-5’ funcional apresentam uma taxa maior de mutação. Além disso como a primase não tem uma função de revisão, o primer de RNA contém provavelmente mais erros do que o DNA. Para manter a alta fidelidade de replicação, os primers de RNA nas pontas dos fragmentos de Okasaki devem ser removidos e substituídos por DNA. E essa remoção e substituição são realizadas pela DNA pol I, que se associa à ponta 3’ de um fragmentode Okasaki e catalisa a síntese de DNA para substituir o fragmento de Okasaki adjacente, sendo que, antes da síntese, o primer de RNA é degradado pela atividade de exonuclease 5’-3’ da DNA pol I. 8) Como ocorre a correção dos nucleotídeos incorporados incorretamente durante a síntese de DNA? Intrinsecamente, praticamente, todas as DNA-polimerases realizam correção, por meio do mecanismo da atividade 3’→5’ exonucleásica adicional, que verifica cada nucleotídeo após sua adição. Essa atividade nucleásica permite que a enzima remova um nucleotídeo erroneamente recém-adicionado, que então geraria um mau pareamento das bases. Se a polimerase adicionou um nucleotídeo errado, a enzima para na posição onde o próximo nucleotídeo seria adicionado, e é inibida. Essa pausa cinética gera a oportunidade para a correção. Então pela atividade 3’→5’ exonucleásica é removido o nucleotídeo erroneamente pareado, e então a polimerase reinicia sua atividade. Quando a enzima DNA polimerase I termina sua atividade de exonuclease 3’→5’, torna-se extremamente importante para que o processo de replicação ocorra livre de erro, pois sua função essencial da atividade de edição é reconhecer e clivar um pareamento incorreto na extremidade 3’-OH da fita nova. Essa atividade é também denominada correção de erro, pois elimina somente o último nucleotídeo que foi adicionado pela atividade da polimerase. A localização dessa atividade ao lado da função de polimerização facilita o processo de correção de erro. Então o processo de correção ocorre nas seguintes etapas, como observado na figura a baixo: 1- Um nucleotídeo precursor é adicionado, na cadeia nova crescente, pela atividade de polimerização, formando o pareamento das bases; 2- A enzima faz um movimento de uma base, no sentido da síntese, para poder adicionar o próximo nucleotídeo de um novo pareamento; 3- Sendo o pareamento anterior incorreto, a enzima fica impedida de continuar a polimerização e, movendo-se um nucleotídeo para trás (escorrega de volta), coloca em contato a atividade de exonuclease 3’-5’ com o nucleotídeo que deve ser removido; 4- Um novo nucleotídeo pode ser adicionado na região onde ocorre o erro. 9) Explique como ocorre a síntese do fragmento 5’-3’ e do fragmento 3’-5’ durante a replicação do DNA. A síntese da molécula de DNA ocorre através de uma série de mecanismos, enzimas e proteínas que se organizam para que esse processo ocorra de maneira eficaz e precisa. A dupla fita de DNA é desenrolada e separada através da ação da proteína DNA-helicase (DnaB-helicase), a tensão formada pelo desenrolar da dupla hélice é aliviada pela ação da proteína DNA-topoisomerase (DNA-girase). A síntese da fita continua (5’→3’) inicia após a síntese de um pequeno iniciador de RNA (primer) pela primase (DnaG) na origem de replicação para disponibilizar uma extremidade 3’- OH livre possibilitando que nucleotídeos sejam adicionados por meio por um complexo da DNA-polimerase III e a síntese ocorra continuamente. Assim, a síntese dessa fita de DNA ocorre de forma contínua, mantendo o mesmo ritmo do desenrolar do DNA na forquilha de replicação. A molécula de DNA é sempre sintetizada no sentido 5’→3’. Isso seria um problema já que essa molécula é constituída de uma dupla fita e apresenta-se em sentidos opostos e são antiparalelas, porém, existem mecanismos na replicação que proporcionam que esse processo ocorra simultaneamente, utilizando as duas fitas de DNA como molde. A interação da DnaB-primase e DnaG-primase gera um primossomo (unidade funcional dentro do complexo da replicação formado pela DnaB-helicase e DnaB-primase) necessário à produção dos primers para a síntese da fita descontinua (3’→5’). A fita descontinua utiliza vários primes a fim de proporcionar extremidades 3’-OH livres a partir da adição de cada primer para que fragmentos de DNA possam ser síntetizados. Na fita descontínua, são gerados durante a replicação, vários fragmentos, chamados de fragmentos de Okazaki. Desse modo, após a abertura da dupla fitas de DNA na origem de replicação, o movimentos da forquilha de replicação ocorre no mesmo sentido no qual, inicialmente a DNA-helicase começou a deserolar a dupla fita. Além da DNA-polimerase III presente na replicação, ainda são necessárias DNA-girase (alivia o estresse topológico ocasionado pela abertura das fitas), SSB (estabiliza as fitas a manterem-se separadas) e DNA-ligase (catalisa a formação das ligações fosfodiéster entre os fragmentos de Okazaki). Cada um dos “núcleos catalíticos” da holoenzima DNA-polimerase III sintetiza uma das fitas novas do DNA. Enquanto a holoenzima se movimenta continuamente e coordenadamente sintetizando a fita contínua, a fita-molde da síntese descontínua deverá ser “puxada”, gerando uma alça de DNA de tal forma que a síntese ocorre de modo equilibrado nas fitas-molde contínua e descontínua, ao mesmo tempo. Para a síntese dos primers na fita descontínua, a primase deve movimentar-se em sentido oposto ao movimento da forquilha. Na fita descontínua, o movimento da forquilha de replicação origina DNA de fita simples à frente do primossomo e da DNA-pol holoenzima. Portanto, o primossomo deve se movimentar ao longo da região da fita simples, até o início do primer, no mesmo sentido da forquilha. Durante a síntese do novo primer, no entanto, o sentido de deslocamento da primase se torna oposto ao da forquilha. A formação de uma alça do DNA através do primossomo é utilizada pela fita descontínua para coordenar o movimento do primossomo na orientação oposta com a replicação simultânea das duas fitas pela holoenzima. 10) Faça um resumo explicando como ocorre a replicação da molécula de DNA em procariotos e em eucariotos. O processo de replicação do DNA tanto em procariotos como em eucariotos ocorre de maneira semelhante. No entanto, em eucariotos, a replicação é mais complexa. Seguindo a mesma essência de replicação, a dupla hélice é desenrolada na forquilha de replicação, e os dois filamentos isolados assim produzidos servem como molde para a polimerização de nucleotídeos livres. Os nucleotídeos são polimerizados pela enzima DNA polimerase, que adiciona nucleotídeos novos à ponta 3’ de uma cadeia crescente de DNA. Como a adição é apenas nas pontas 3’, a polimerização em um molde é contínua, produzindo o filamento contínuo, e no outro é descontínua em trechos curtos (fragmentos de Okasaki), produzindo o filamento chamado de lagging. A síntese do filamento contínuo (leading) e de cada fragmento de Okasaki é iniciada por um curto primer de RNA (sintetizado pela primase) que fornece uma ponta 3’ para a adição de desoxirribonucleotídeos. Os vários eventos que devem ocorrer com precisão e rapidez na forquilha de replicação são efetuados pelo replissomo, uma máquina biológica. Esse complexo de proteína inclui duas unidades de DNA polimerase: uma para agir no filamento descontínuo. Desse modo, a síntese demora mais tempo e une os fragmentos de Okasaki em um filamento contínuo, e é temporariamente coordenada com a síntese menos complicada do filamento contínuo. Onde e quando ocorre a replicação são cuidadosamente controlados pela montagem ordenada de replissomos em alguns locais, ou origens, no cromossomo. Os genomas eucaritóticos podem ter dezenas de milhares de origens. A montagem dos replissomos nessas orgigens pode ocorrer apenas em uma época específica do ciclo celular. A replicação de DNA de células eucarióticas são consideravelmente mais complexas do que aquelas das bactérias e estão organizadas em estruturas complexas de nucleoproteínas. A replicação do DNA em procariotos é regulada e coordenada com o ciclo celular, introduzindo algumas complexidades adicionais. 11) Quais são os tipos e as funções dos RNAs? mRNA (mensageiros) – atuam como mensageirosservindo como intermediários e passam informações do DNA para a proteína, ou seja, tem por função carregar a informação genético presente nos genes para os ribossomos onde ocorrerá a síntese da proteína correspondente. tRNA (transportador) – são moléculas responsáveis por levar o aminoácido correto para o mRNA no processo de tradução, ou seja, leem a informação codificadas no mRNA e transferem o aminoácido apropriado para uma cadeia polipeptídica nascente durante a síntese proteica. rRNA (ribossômico) – são moléculas dos principais componentes dos ribossomos, que são grandes máquinas macromoleculares que guiam a montagem da cadeia de aminoácidos pelo mRNA e tRNA, catalisando a síntese protéica. snRNA (pequenos RNA nucleases – são partes de um sistema que processa os RNA transcritos nas células eucarióticas, Alguns snRNA unem-se a várias subunidades proteicas para formar o complexo ribonucleoproteico de processamenro (o spliceossomo) que remove íntros dos mRNA eucariótios. miRNA (microRNA) – possui um amplo papel na regulação da qualidade de proteínas produzidas por muitos genes eucarióticos. Regulam a expressão gênica tipicamente pelo bloqueio da tradução do mRNA selecionado. siRNA (pequenos RNA de interferência) – ajudam a proteger a integridade dos genomas de plantas e animais. Inibem a produção de vírus e impedem a dispersão de elementos da transposição para outros loci cromossômicos. Desligam a expressão dos genes pela degradação direta do mRNAs selecionados e pelo estabelecimento de estruturas de cromatinas compactas. soRNA (pequenos RNA nocleolares) – utilizados para processar e modificar quimicamente os rRNAs. scaRNA (pequenos RNA de Cajal) – usados para modificar snoRNAs e snRNAs. Outros RNA não codificantes – atuam em diversos processos moleculares incluindo, incluindo a síntese de telômeros, a inativação do cromossomo X e o transporte de proteínas para o retículo endoplasmático. 12) Conceitue: Promotor, Elemento em cis, Fator em trans, Intron, Exon, Sequência consenso, Códon de iniciação, Códon de terminação, 5’-UTR, 3’-UTR, Região transcrita, Região traduzida, Sítio de terminação da transcrição, Sítio de clivagem, Sítio de início da transcrição, Sítio de início da tradução e Gene. Promotor: é uma sequência de DNA à qual a RNA-polimerase pode ligar-se, levando ao início da transcrição. O promotor determina o ponto inicial, isto é, o primeiro nucleotídeo que será transcrito em RNA. Na região promotora (também chamada de região reguladora 5’) encontram-se os elementos regulatórios - elementos cis e as sequências consenso – que serão reconhecidos pela sequência consenso. Elemento em cis: são sequências específicas da região promotora reconhecidas por fatores de transcrição – sítio de ligação do complexo basal de início da transcrição (Ex.: TATA Box que são sequências de nucleotídeos conservadas). Fator em trans: é o conjunto de proteínas cuja natureza bioquímica é ter habilidade de se ligar a sequências especificas que são utilizados para ativar o complexo de transcrição por reconhecer um elemento cis. Intron: é uma sequência de nucleotídeos em um gene que é transcrita, mas é removida antes da tradução do gene; também chamada de sequência interveniente. Éxon: é o seguimento de um gene eucariótico que codifica para uma parte do produto final do gene; um segmento de RNA que permanece após o processamento pós-transcricional e é traduzido em uma proteína ou incorporado na estrutura do um RNA. Seqüência consenso: é uma sequência de DNA ou de aminoácidos que consiste em resíduos que ocorrem mais comumente em cada posição em um grupo de sequências similares. Códon de iniciação: é uma seqüencia de três nucleotídeos que vai produzir um aminoácido (Ex.: AUG, às vezes GUG ou, mais raramente, UUG em bactérias e arquibactérias), ou seja, codifica para o primeiro aminoácido de uma sequência polipeptídica. Códon de terminação: UAA, UAG e UGA na síntese proteica, esses códons sinalizam o término da síntese de uma cadeia polipeptídica. Também conhecidos como códon de parada. 5’-UTR (untranslated region): são regiões não codantes de uma molécula de mRNA, ou seja, são regiões não traduzidas. O 5' UTR inicia-se no CAP 5' e se estende até o códon de iniciação (que indica o início da síntese proteica). 3’-UTR: é uma região não traduzida que afeta a estabilidade do mRNA e a tradução da sequência codificadora da proteína. Esta região 3' UTR se estende do códon de terminação (sinal para o fim da síntese protéica) até a cauda poli-A. Região transcrita: e a região transcrita da fita molde da qual mRNA é sintetizada. Região traduzida: é a região do mRNA que forma a proteína, ou seja, aquela região que é reconhecida para formar as proteínas. Sítio de terminação da transcrição: são sequências específicas de nucleotídeos que sinalizam o termino da transcrição. Sítio de clivagem: são sequências de nucleotídeos que sinalizam o produto da RNA polimerase a partir do gene. Sítio de início da transcrição: corresponde ao primeiro nucleotídeo que será transcrito (+1). Sítio de início da tradução: corresponde ao primeiro códon que origina o primeiro aminoácido. Gene: é uma unidade básica, física e funcional, localizada no cromossomo, que contêm a informação para construir moléculas funcionais de polipeptídeos ou de RNA na qual pode-se interpretar os vários aspectos da hereditariedade. Do ponto de vista molecular, um gene, seja ele de um procarioto ou de um eucarioto, pode ser definido como toda sequência de ácido desoxirribonucleico que contém uma região promotora responsável pela transcrição e uma região transcrita, suficiente para a síntese de um polipeptídio ou de uma molécula de RNA estável (como rRNA ou um tRNA, por exemplo) com funções catalíticas ou estruturais. 13) Apresente a estrutura e a organização de um gene procarioto e de um gene eucarioto. Quais são as diferenças entre eles? Gene Procarioto Gene Eucarioto As características que os distinguem são: O Gene procarioto encontra-se disperso no citosol da célula e não apresentando íntrons, enquanto a célula eucariótica apresenta maior organização estrutural e apresenta éxons e íntrons. Essa diferença entre os genes reflete diretamente no processo de transcrição e tradução, no qual na célula procariótica a transcrição e tradução ocorrem acopladas, diferentemente de eucariotos que ocorre separado e ainda sofrem o processamento. 14) Quais são as características da transcrição do DNA? As características da transcrição do DNA são: (a) Algumas regiões do DNA são transcritas em RNA. Transcrição é o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir de um molde de DNA, porém também é um processo extremamente seletivo no qual somente algumas partes do DNA são transcritas para a síntese do RNA, por exemplo, nas células somente 1% de toda a sequência do DNA é copiada para formar sequências de RNA funcional e algumas partes do DNA podem nunca ser transcritas. (b) Fatores de transcrição reconhecem o promotor do gene que será transcrito. Os promotores para transcrição no DNA são inicialmente reconhecidos por fatores de transcrição que, ligados ao DNA, interagem com outros fatores, formando um complexo no qual as RNA-polimerases se associam. (c) A enzima RNA polimerase é recrutada pelos fatores de transcrição que se ligam ao promotor. Isto ocorre porque a RNA-polimerase (RNAP) têm múltiplas atividades necessárias para a transcrição, como por exemplo, a de reconhecer e se ligar a sequências específicas de DNA; ela desnatura o DNA, expondo a sequência de nucleotídeos a ser copiada; mantêm as fitas de DNA separadas na região de síntese; mantêm estável o híbrido DNA: RNA na região de síntese; restauram o DNA na região imediatamente posterior à da síntese; eelas sozinhas ou com auxílio de proteínas específicas, terminam a síntese do RNA. (d) A transcrição ocorre no sentido 5’-3’. Para síntese de RNA somente uma das fitas de DNA é utilizada como molde, e segue as regras de complementariedade e antiparalelismo do DNA, exceto pelo pareamento de uracila (U) ao invés de timina (T) com adenina (A). O RNA recém-sintetizado e complementar a fita 3’→5’, que serviu de molde e idêntico a outra fita de DNA(5’→3’).(e) A transcrição pode ser constitutiva. A qualquer momento pode acontecer à transcrição, lembrando que esta espelha o estado fisiológico da célula e, portanto, é extremamente variável para atender às suas necessidades. (f) A transcrição pode ser temporária: Um determinado gene pode ser expresso no momento em que for necessário, ou seja, são ativados em um dado momento da vida. Isto faz com que a célula tenha uma economia de energia. (g) A transcrição pode ser regulada: Genes podem ser ativados para realizar uma determinada função, ou eles podem ser reprimidos após a realização de sua função. (h) A transcrição envolve quatro etapas. (1) Ligação da RNA polimerase ao promotor, quando ocorre o reconhecimento de sequências específicas no DNA (promotor), (2) A formação do complexo de iniciação, quando a hélice dupla do DNA é aberta pelo rompimento das pontes de hidrogênio, (3) O alongamento da cadeia de RNA ou síntese propriamente dita, quando os ribonucleotídeos são sucessivamente incorporados, originando a cadeia nascente de RNA, e (4) a terminação, quando, com ou sem a participação de proteínas específicas, sequências de DNA são reconhecidas (terminador) e a síntese de RNA é finalizada, liberando o complexo RNAP, a molécula de RNA sintetizada e o DNA de hélice dupla. 15) Faça um resumo explicando como ocorre a transcrição da molécula de DNA em procariotos e em eucariotos, indicando as quatro etapas necessárias durante a transcrição do DNA. Em eucariotos, existem três RNA polimerase (RNAP) diferentes que estão envolvidas na síntese de RNAs específicos, enquanto que na transcrição de procariotos há apenas uma RNAP envolvida no processo. Em procariotos a transcrição ocorre da seguinte forma: Reconhecimento do promotor: Esta fase é crítica para o controle da expressão gênica, pois define se a transcrição de um determinado gene será ou não iniciado. O núcleo da enzima RNAP (α2ββ´ω) tem afinidade por DNA, sem especificidade de sequência. Em condições fisiológicas, provavelmente, já está ligada frouxamente à hélice dupla do DNA e pode localizar sequências específicas no DNA. Essas sequências no DNA (promotores) sinalizam exatamente onde a síntese do RNA deve ser iniciada. Entretanto, o núcleo da RNAP somente irá reconhecer e ligar-se mais firmemente ao promotor, na presença do fator σ o qual liga-se às regiões -10 e -35, posicionando assim a holoenzima para iniciar corretamente a transcrição no ponto de início. Após a ligação desse fator é formado um complexo RNAP holoenzima (α2ββ´ωσ), que é totalmente funcional. Os promotores são definidos como sequências de DNA em que o complexo RNAP se liga para o início da transcrição. Essas sequências demarcam exatamente onde, no genoma, estão as regiões que são transcritas. Início da transcrição: Após o reconhecimento e a ligação da holoenzima RNAP ao promotor, nos complexos de iniciação, aminoácidos específicos do fator σ estão ligados ao DNA e que esse fator confere ao complexo RNAP a capacidade de reconhecer e ligar-se ao promotor. Em E. coli fatores σ diferentes são responsáveis pela ligação da RNAP a diferentes grupos de promotores, com sequências características. Duas são as etapas de reconhecimento do promotor pela holoenzima: a formação do complexo de iniciação e a iniciação abortiva. O complexo é inicialmente fechado (RNAP ligado ao promotor, com as duas fitas de DNA ainda pareadas) e, forma-se o complexo aberto, com a abertura das fitas do DNA, por rompimento das pontes de hidrogênio (formação de bolhas de transcrição). A abertura das fitas ocorre exatamente na região -10 (TATAAT) a qual é rica em AT, que são os pareamentos mais facilmente rompidos (duas pontes de hidrogênio), sendo, portanto, a região mais suscetível à abertura. O complexo se posiciona e inicia a síntese em +1. Em seguida há a incorporação dos dois primeiros nucleotídeos e a formação da ligação fosfodiéster. Sem que a enzima se desloque na superfície do DNA, até nove ribonucleotídeos podem ser incorporados na cadeia de RNA. Enquanto o fator σ permanece ligado à RNAP, a enzima não se desloca e, portanto, permanece na fase de iniciação abortiva. O desligamento do fator σ do complexo permite à RNAP deslocar-se e iniciar a próxima fase na síntese de RNA. Alongamento da Cadeia: Após o desligamento da subunidade σ, ocorre uma alteração conformacional na RNAP a qual adota uma forma mais esférica durante toda a etapa de alongamento. A RNAP que, durante a fase de início, ocupava entre 70 a 80 pb da sequência de DNA, passa a ter contato com 30 pb, uma região da dupla hélice do DNA estão desnaturados permitindo à RNAP reconhecer a sequência no molde de DNA, parear os ribonucleotídeos e incorporá-los, sucessivamente no sentido 5’-3’. Nesta região apenas uma das fitas de DNA não está pareada, pois a fita molde forma pontes de hidrogênio com a cadeia de RNA que está sendo sintetizada. O movimento da RNAP sobre o molde de DNA induz à formação de superenrolamento positivo no DNA à frente da bolha de transcrição e superenrolamento negativo, na região oposta. As topoisomerases têm participação ativa na transcrição em procariontes e eucarionte, minimizando, nesses processos, os efeitos dos superenrolamento. Dentro da bolha, os últimos oito ou nove nucleotídeos adicionados à cadeia de RNA formam um hibrido RNA: DNA por pareamento complementar de bases com filamento-molde. À medida que a cadeia de RNA aumenta em sua ponta 3’, a ponta 5’ unifilamentar é liberada da polimerase. A velocidade da transcrição não é constante ao longo de toda fase de alongamento e depende da sequência de nucleotídeos da região do DNA que está sendo transcrita, pois sequências ricas em GC reduzem a velocidade porque estes pares são mais resistentes à desnaturação e o passo de abertura das fitas é mais demorado do que em outras regiões. A processividade da RNAP é elevada e mesmo em pausas prolongadas o complexo de transcrição não é dissociado antes do sinal de término da transcrição. Término da transcrição: O alongamento continua até que a RNAP reconheça sequências especiais de nucleotídeos que atuam como um sinal para o termino da cadeia. O encontro com os nucleotídeos de sinal inicia a liberação do RNA nascente e a enzima do molde. Em E.coli, existem dois mecanismos de terminação: rho (ρ) independente e terminação ρ dependente. Na terminação ρ independente o termino é direto e a sequência sinal contém cerca de 40 pb, terminando em um trecho rico em GC que é seguido por uma fileira de seis ou mais A. Como G e C no molde darão C e G, respectivamente, no transcrito, o RNA nessa região é rico em GC. Estas bases são capazes de formar pontes de hidrogênio (três sítios) uma à outra, resultando em uma alça em grampo. Estas alças em grampo G-C são mais estáveis são mais estáveis que alças A-U. Com a formação da laça em grampo há estabilidade do hibrido DNA: RNA ocasionando o desligamento do RNA do sistema provocando a ruptura do complexo de transcrição. A terminação ρ dependente requer a ajuda de uma proteína ρ a qual reconhece o sinal de término para a RNAP geralmente não tem alças em grampo e sim uma sequência de cerca de 40 a 60 nucleotídeos que é rica em C e pobre em G. De modo geral, a proteína ρ liga-se ao RNA nascente e move-se no sentido da bolha de transcrição, colide e libera os componentes: hélice dupla de DNA, RNA sintetizado e o núcleoda RNAP. Já em Eucariotos existem três RNA polimerase (RNAP I, RNAP II e RNAP III), porém apenas a RNAP II transcreve mRNA. No geral as fases de iniciação, alongamento e término da síntese de RNA em eucariontes lembram aquelas em procariontes. Entretanto existem diferenças importantes. Ativação da RNAP II: Nesta fase, antes da iniciação, a RNAP II não se liga diretamente ao DNA promotor, mas sim a fatores gerais de transcrição (TFs), um dos quais reconhece a sequência TATA na maioria dos promotores eucarióticos. Os TFs aumentam a formação de complexos estáveis multissubunidades, no promotor localizado a montante do sítio de iniciação da transcrição. Primeiro, TFIID liga-se a TATA box -35, seguido pelos TFIIA eTFIIB. A formação desse complexo sinaliza à RNAP II para que esta se ligue, sendo o complexo resultante ainda mais estabilizado sob a influência TFIID. Chega ao complexo o TFIIE que completa este complexo de pré-iniciação possibilitando à RNAP II iniciar a transcrição do gene. Iniciação: Essa ligação sinaliza para que outros fatores se liguem entre si e a outros elementos do promotor. Quando todos os fatores já estiverem em seus devidos locais, o complexo estará pronto para receber a RNAP II e formar o chamado complexo de iniciação da transcrição. A RNAP II é responsável por abrir as fitas de DNA, e colocar a primeira base. Essa abertura das cadeias forma a “bolha de transcrição”, estrutura que é característica do processo. Para ativar a transcrição, outros fatores ligam-se ao enhancer e interagem com o complexo de iniciação da transcrição. Alongamento da cadeia: É o aumento da cadeia de RNA, para o qual, outros fatores acessórios são necessários. Os fatores utilizados no complexo de iniciação da transcrição são liberados e a RNAP II sofre alterações na sua conformação. A “bolha de transcrição” move -se sobre o molde de DNA, abrindo o DNA à frente e fechando atrás de si. Um duplex híbrido DNA-RNA forma-se dentro da bolha à medida que o RNA é sintetizado. Os erros na sequência da cadeia produzidos nesta etapa são cuidadosamente corrigidos pela RNA polimerase. Uma peculiaridade irônica e não frequente descrita sobre a meticulosidade dessa correção, é que a RNA polimerase ao demorar tanto tempo corrigindo seus erros pode até esquecer de continuar a transcrição. Terminação da transcrição: Muito pouco se conhece sobre o término da transcrição. Sabe-se que todas as três RNAPs terminam a síntese em regiões consenso do DNA ricas em T. Essas regiões são “sinais” codificados pelo DNA, que indicam onde deve ser a extremidade 3'. Esses sinais são reconhecidos por enzimas que se ligam ao RNA, clivando-o para formar a extremidade 3', ou seja, o sítio de clivagem precede esta região consenso. Após a clivagem, esses nucleotídeos que compunham a região consenso sinalizadora para a clivagem, são degradados no núcleo. 16) Descreva como ocorre o processamento do mRNA. Qual é a importância do processamento do mRNA? O mRNA após ser sintetizada no núcleo precisa passar por algumas alterações bioquímicas para transformar o pré-mRNA em mRNA maduro (mRNA processado), antes de ser transportado do núcleo para o citoplasma onde será traduzido. Primeiramente o pré-mRNA passa por modificações que ocorre em sua extremidade 5’, e isso ocorre em seguida ao início do processo de transcrição. Um resíduo de guanina é ligado covalentemente ao primeiro nucleotídeo do mRNA através de uma ligação fosfato 5’-5’, com o resíduo de guanina estando na posição inversa a dos demais nucleotídeos. Essa estrutura é chamada de CAP o qual sofre uma metilação na posição 7 da guanina, resultando no nucleotídeo 7-metilguanilato. O CAP atua na proteção da extremidade 5’ do transcrito contra a ação de exonucleases que são enzimas com propriedade de cortar ou clivar ácidos nucléicos, ou seja, moléculas de mRNA sem a região CAP são rapidamente degradadas. Outra modificação está relacionada à adição da cauda de poli A (Poliadenilação), uma sequência de aproximadamente 200 resíduos de adenina em sua extremidade 3’. Essa cauda poli A não está codificada no DNA e não existe nos rRNAs e tRNAs. Ela é adicionada aos pré-mRNAs pela enzima poli A-polimerase. Um aspecto comum a todos pré-RNAs mensageiros é a presença da sequência consenso AAUAAA, 11-30 nucleotídeos antes do sítio de poliadenilação (local onde deve ser adicionado a cauda poli A). Esta sequência é reconhecida por um fator específico, que “marca” o local e permite que ocorra a clivagem por uma endonuclease. A adição da cauda poli A é feita na extremidade 3’ OH gerada pela clivagem. Após a chegada do mRNA poliadenilado no citoplasma, a cauda poli A vai diminuindo ao longo do tempo por ação de nucleases. A cauda poli A é uma parte importante do processamento, pois facilita o transporte do mRNA para o citoplasma e ao ser lentamente degradada, estabiliza a molécula no citoplasma. Os mRNA primários apresenta as sequências éxons (porção codificadora do transcrito primário que estão presentes no RNA maduro) e íntrons (sequências não presentes no RNA maduro, pois não codificam nenhum aminoácido da proteína a ser sintetizada). Os íntrons são então retirados para dar origem ao mRNA funcional (maduro ou traduzível) e isso ocorre após a adição do CAP e da cauda poli . Assim, o pré-mRNA deve passar pelo processo de excisão dos íntrons (splicing) e junção dos éxons. Após a adição da estrutura 5’-CAP, a adição da cauda poli A e o splicing o RNA encontra-se pronto para deixar o consiste no fato de que esta molécula possui em seu açúcar ribose a presença de OH no carbono 2’ocasionando instabilidade a molécula, o que a deixa vulnerável para reagir com outras moléculas, ou ser degradada por nucleases. O processamento desses pré-mRNAs resultam no aumento da estabilidade deste pré-mRNA por converte-o em mRNA maduro. Esta estabilidade garante a molécula de mRNA seu deslocamento seguro do núcleo para o citosol da célula onde será traduzido em uma cadeia polipeptídica. 17) O mRNA de procariotos é processado? Explique. Nos procariotos o processamento do mRNA é nulo pelo fato de não apresentam em seus genes regiões éxons e íntrons e os processos de transcrição e tradução ocorrem de forma acoplada no espaço celular, não sendo necessário que seja feita a proteção do mRNA contra endonucleases. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. 4a ed. Porto Alegre, Editora Artes Médicas, 2004. GRIFFITHS, A.J.F.; MILLER, J.H.; SUZUKI, D.T.; LEWONTIN, R.C.; GELBART, W.M.; WESSLER, S.R. Introdução à Genética. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 9ª ed., 2010. LEHNINGER, A. L.. Princípios de Bioquímica. 5. ed. Porto Alegre: Savier, 1273 p. 2011. GEOFFREY M. COOPER, ROBERT E. HAUSMAN. A Célula: uma abordagem molecular. 2ª ed. Artmed, 2005. JUNQUEIRA, L.C.U.; CARNEIRO, J. Biologia Celular e Molecular. Guanabara Koogan, 2005.
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