Produção in vitro de embriões

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Produção in vitro de embriões 
 
• É uma biotecnologia onde os processos 
fisiológicos como maturação folicular, 
fertilização e desenvolvimento embrionário 
ocorrem em laboratório, ou seja, fora do 
útero do animal 
• Maturação in vitro de oócitos (MIV) 
• Fertilização in vitro de oócitos (FIV) 
• Cultivo in vitro de zigotos e estruturas 
embrionárias (CIV) 
 
Introdução 
• Biotécnica alternativa 
• Acelerar a produção de animais superiores 
• Impedir descarte precoce de fêmeas 
o Portadores de alterações que 
impedem a reprodução natural e TE 
o Estudos – evolução da TE 
§ Dinâmica folicular, ciclo estral, 
sincronização da ovulação sem 
extrapolar para animais de 
laboratórios 
 
Vantagens da PIV 
• Acelerar o melhoramento genético 
• Impedir o descarte precoce de fêmeas 
• Servir de base para o estudo da fisiologia da 
reprodução 
o Dinâmica folicular 
o Ciclo estral 
o Sincronização da ovulação 
• Viabilizar outras técnicas 
o Injeções intracitoplasmática de 
embriões 
o Clonagem 
o Transgenia 
 
Etapas da PIV 
• Aspiração folicular 
• Maturação folicular 
• Fecundação 
• Cultivo embrionário 
• Transferência dos embriões 
 
 
Obtenção de oócitos 
 
 
Vantagens da aspiração folicular 
• Aspiração folicular 
o Fêmeas: 
§ 6 meses de idade 
§ Vacas prenhes até 3º mês 
§ Pós-parto – 2 a 3 semanas 
o Peridiocidade 
o Esporádica ou regular 
o Intervalo – 2 semanas – processo 
inflamatório ovários 
o Várias semanas ou meses 
 
 
@paulacharbel 
Fatores que influenciam a 
aspiração folicular e recuperação 
de oócitos 
• Condição corporal da doadora 
o Nutrição 
§ Desenvolvimento de oócitos 
§ Número de blastocistos 
• Período – aspiração e transporte ao 
laboratório 
• Raça 
o Zebuínas X Europeias – maior número 
de folículos 
• Seleção de folículos 
• Frequência e momento da coleta 
• Fisiologia reprodutiva da doadora 
o Bezerras 
§ Pequena dimensão da pélvis e 
menor cap de 
desenvolvimento de oócitos 
o Novilhas 
o Vacas prenhez e em lactação 
o Senis 
§ Menor quantidade de folículos 
visíveis 
• Estimulação hormonal ou não? 
o Drogas para superovulação 
§ Não – doadora ciclando 
normalmente 
o FSH – retarda – seleção do folículo 
dominante/atresia dos subordinados; 
morfologia dos oócitos e taxa de 
clivagem 
o Somatotropina bovina (BST) – 
morfologia oócitos 
o Melhora eficiência 
§ Modificação endocrinológicas 
§ Atividade ovariana 
§ Quantidade e qualidade do 
complexo cumulus – oócito 
• Fatores técnicos 
o Taxa de sucesso – parcialmente taxa 
de recuperação (7% a 70%) 
§ Visualização dos oócitos 
§ Equipamentos e utensílios 
utilizados – diâmetro da 
agulha, nível de vácuo da 
aspiração e meios soluções do 
lavado 
§ Experiencia do técnico 
 
Etapas da produção e 
transferência in vitro de 
embriões 
• Recuperação de oócitos 
o Fase 1: aspiração folicular 
§ Tipos: pós-morten, 
laparoscópica (flanco) e 
transvaginal 
§ Folículos 2 a 3mm – taxa 
recuperação e 
desenvolvimento 
§ Menores – competentes para 
reiniciar o processo de meiose 
§ Folículos maiores que 8mm – 
atresia 
§ 2-8mm tem sido usado – maior 
número disponível 
• Relação inversa 
o Maior diâmetro folicular 
o Taxa de recuperação oócitos 
§ Alteração morfológica no 
complexo cumulus-oócito 
§ Viscosidade do fluido folicular 
§ Quantidade de material a ser 
aspirado 
§ Pressão intrafolicular 
• Recuperação de oócitos 
o Fase 2 – seleção de oócitos 
§ Número de camadas de células 
cumulus – saudáveis 
§ Aspecto do citoplasma do 
oócito 
§ coleta-se tudo – diferentes 
fases hormonais 
 
Classificação morfológica dos 
oócitos 
• Várias classificações morfológicas 
• Qualidade 1 a 4 
• Viabilidade 
o Plasma homogêneo 
o Granulações finas, de coloração 
marrom 
o Completamente envolvidos por várias 
camadas de células do cumulus 
dispostas de forma compacta 
 
 
Maturação in vitro (MIV) 
• Oócitos aspirados 
o Não aptos a fecundação 
o Transformações no núcleo e 
citoplasma 
§ Reorganização das organelas 
citoplasmáticas 
§ Migração dos grânulos corticais 
§ Alteração do padrão da síntese 
proteica 
§ Modificações das células da 
granulosa e do cumulus – 
passagem de nutrientes e ptn 
• In vivo – início pico pré-ovulatório LH 
• In vitro 
o Remoção do folículo 
o 20 a 22h – maturação 
 
MATURAÇÃO IN VITRO DOS 
OÓSCITOS 
• Expansão das células do cumulus 
• Maturação nuclear 
o Retomada da meiose da fase de 
prófase da 1ª divisão meiótica 
(conhecida como estágio de vesícula 
germinativa – GV) para metáfase 2 
(M2) 
• Maturação citoplasmática: engloba os 
processos que ocorrem no oócito 
preparando-o para fecundação, ativação e 
desenvolvimento embrionário de pré-
implantação 
• Coordenação entre maturação nuclear e 
citoplasmática 
o Síntese e secreção da zona pelúcida 
o Sensibilidade do sistema de liberação 
de cálcio intracelular ao IP3 
o Aquisição de habilidade do oócito 
sofrer liberação dos grânulos corticais 
frente à penetração do 
espermatozoide 
o Síntese de proteínas durante a 
maturação nuclear que se misturam 
ao conteúdo citoplasmático 
 
 
 
Obtenção e MIV dos oócitos 
• Causas de variação 
o Transporte dos ovários (tempo de 
temperatura) 
o Método de obtenção dos oócitos 
o Seleção morfológica dos complexos 
cumulus-oócitos (COCs) 
o Diâmetro dos folículos 
o Tempo de maturação in vitro 
o Condições de cultivo in vitro 
§ Meios e aditivos 
§ Temperatura 
§ Hormônios 
 
Preparação do sêmen e FIV 
• Causas de variação: 
o Método de preparação do sêmen 
o Reprodutor 
o Concentração espermática 
o Capacitação in vitro 
o Tempo de incubação sêmen-oócito 
o Condições de cultivo in vitro: 
§ Meios e aditivos 
§ Temperatura 
§ Estimulantes da motilidade 
espermática 
 
Interações oócito-espermatozoide 
• Penetração do cumulus oophorus 
o Hialuronidase 
o Enzima que penetra a Corona Radiata 
• Adesão e penetração da zona pelúcida 
o Proteínas da zona 
o Enzimas do acrossoma 
 
Capacitação 
• Capacitação é uma alteração da membrana 
plasmática do espermatozoide permitindo a 
reação acrossomal 
• Reação acrossomal é uma progressiva quebra 
e fusão das membranas plasmáticas e 
acrossomal externa 
 
Fecundação – reação 
acrossômica 
• Milhões de espermatozoides circundam o 
ovócito e forcam a passagem em direção a 
zona pelúcida 
• Ocorre fusão da membrana plasmática do 
acrossomo do sptz liberando enzimas que 
reagem com a corona radiata 
• Um espermatozoide entra em contato com a 
zona pelúcida 
• Milhões de espermatozoides circundam o 
ovócito e forcam a passagem em direção a 
zona pelúcida 
 
 
Fusão do espematozóide (sptz) e 
oócito 
• A membrana do sptz na região do segmento 
equatorial se funde com a membrana do 
oócito 
• Fusão causa a liberação dos grânulos corticais 
• Membrana do oócito invade a cabeça do sptz 
• Resulta na formação de vesículas com 
componentes de ambos os gametas 
 
 
Fecundação in vitro (FIV) 
 
 
Cultivo in vitro para o 
desenvolvimento embrionário 
• Corresponde a etapa do desenvolvimento do 
oócito fertilizado até o estádio de blastocisto 
• Ativação do genoma embrionário 
• Divisão celular 
• Compactação dos blastômeros 
• Diferenciação celular 
• Causas de variação: 
o Bloqueio do desenvolvimento 
embrionário em cultura 
o Meios de cultura (TCM199, MÉNEZO, 
SOF, CR1) 
o Soro fetal bovino (SFB) 
o Glicose 
o Cultura de células primarias (BOEC, 
granulosa, cumulus) 
o Cultura de linhagens de células (VERO, 
BRL) 
o Fatores de crescimento (IGF-I, IGF-II, 
TGF) 
o Substâncias que previnam a formação 
de radicais livres 
 
 
Desenvolvimento embrionário in 
vitro