Técnicas citoquímicas

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São técnicas amplamente utilizadas para o conhecimento da 
natureza química das células e dos tecidos. Detectam a 
presença de compostos específicos e indicam sua localização 
e distribuição exata. 
Conceitos básicos 
As técnicas permitem a localização, ao microscópio de luz ou 
MET, de componentes químicos específicos que compõe as 
células e os tecidos, respeitando a integridade celular/tecidual. 
Têm como base reações químicas entre o composto pesquisado 
e o reagente utilizado. 
A técnica citoquímica deve ser específica para o componente 
pesquisado e sensível. Sua execução requer o conhecimento do 
mecanismo da reação química envolvida. 
 
O complexo formado indicará a presença da substância 
pesquisada (reação positiva) e somente os locais de 
positividade aparecem marcados na preparação. Dependendo 
da técnica utilizada e do objetivo do estudo, pode-se submeter 
os cortes de tecidos a uma contracoloração (coloração não 
específica, baseada em acidofilia-basofilia), após realização da 
técnica histoquímica. 
Aplicações 
1) Técnica citoquímica para demonstração de carboidratos 
(reação do PAS) 
A técnica de PAS (ácido periódico – reativo de Schiff) foi 
descrita em 1945 por McManus e se tornou uma das mais 
usada para demonstração de carboidratos simples ou 
associados a proteínas. 
Mecanismo de reação 
Tem como base o uso sequencial de dois reagentes seletivos: 
o ácido periódico e o reagente de Schiff. 
i) Oxidação dos grupos hidroxilas livres em dois átomos de 
carbonos pelo ácido periódico, produzindo radicais aldeídicos; 
ii) reação dos radicais aldeídicos com o reativo de Schiff, 
produzindo composto de cor magenta (cromóforo). 
PAS é positiva para: 
Células animais: 
Glicoproteínas neutras 
Glicoproteínas ácidas ricas 
em ácido siálico 
Glicogênio 
Células vegetais: 
Amido 
Celulose 
Hemicelulose 
Pectinas 
 
Distinção entre carboidratos 
A distinção entre glicogênio e glicoproteínas é feita 
submetendo-se o material a tratamento enzimático com 
amilase (enzima que digere glicogênio e amido). Logo, as 
estruturas que não se coram com o PAS são células que 
contêm glicogênio, enquanto as que coram com PAS contêm 
glicoproteínas. 
A distinção entre glicoproteínas neutras de glicoproteínas 
ácidas e de outros glicoconjugados é feita associando-se a 
técnica do PAS com a técnica do alcien blue. A positividade é 
indicada pelo aparecimento de cromóforo de cor azul celeste. 
Alcien blue é positiva para: 
pH 0,5 pH 2,5 
Glicoconjugados ácidos 
sulfatados 
Glicoconjugados ácidos 
sulfatados 
Glicoconjugados ácidos 
carboxilados 
Glicoproteínas ácidas 
 
 
 
Localização
Cromóforo
Visível ao microscópio 
de luz de campo claro
Fluoróforo
Visível ao microscópio 
de fluorescência
Produto elétron-denso
Visível ao MET
2) Técnica para demonstração de DNA (Feulgen) 
Mecanismo de reação 
É baseada na ação hidrolítica do ácido clorídrico sobre o DNA 
e nas propriedades químicas do reativo de Schiff. 
i) o ácido clorídrico quebra a molécula de DNA, a base 
nitrogenada é liberada e os grupos aldeídicos ficam expostos; 
ii) reação dos radicais aldeídicos com o reativo de Schiff, 
produzindo cromóforo de cor púrpura-lilás. 
A reação não forma grupos aldeídicos com o açúcar do RNA e, 
portanto, é específica para DNA. 
 
3) Técnica citoquímica para demonstração de lipídios (Oil Red 
O-ORO) 
Mecanismo de reação 
A marcação de lipídios pelo ORO tem como base as 
propriedades físicas deste corante, que tem grande afinidade 
por compartimentos ricos em lipídios neutros. Aparece na cor 
vermelha formando cromóforo e fluoróforo. 
 
Imunocitoquímica 
Tem como objetivo a identificação de uma molécula com 
potencial antigênico, por meio de seu anticorpo específico. Para 
cada antígeno pode-se obter um anticorpo, chamado de 
anticorpo primário que, por sua vez, pode ser marcado direta 
ou indiretamente com um composto denominado marcador, o 
qual irá permitir a visualização do complexo antígeno-anticorpo. 
Quando o antígeno encontrasse presente na célula, o anticorpo 
primário liga-se diretamente a ele e o complexo resultante é 
detectado ao microscópio de luz ou MET. O produto da reação 
deve ser corado, emitir fluorescência ou ser elétron-denso. 
A aplicação dessas técnicas deve ser sempre acompanhada de 
controles positivos e negativos para fins de validação dos 
resultados. 
Detectam moléculas isoladas, geralmente tipos específicos de 
proteínas, como, por exemplo, proteínas em células tumorais ou 
em células em processo de morte ou ativação. 
O método mais comumente utilizado é o indireto e este 
envolve duas etapas: 
i) o anticorpo primário liga-se ao antígeno correspondente; 
ii) o segundo anticorpo é conjugado com um marcador que 
indicará a positividade da reação. 
Imunocitoquímica ultraestrutural 
Aplicação da técnica de imunocitoquímica em microscopia 
eletrônica: 
i) células seccionadas e incubadas com solução contendo 
anticorpo primário; 
ii) incubação com o anticorpo secundário conjugado com 
marcador elétron-denso. 
O resultado é a identificação da proteína em sítios 
intracelulares. A técnica de imunocitoquímica ultraestrutural é 
conhecida como immunogold pelo fato de utilizar anticorpos 
marcados com partículas de ouro.