Biologia Celular: tecnologia da biologia celular e molecular

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Tecnologia da biologia celular e molecular 
 
● O microscópio óptico\luz possibilitou o descobrimento de células e a elaboração da teoria                         
de que todos os seres vivos são constituídos por elas.  
 
● Os conhecimentos sobre as células progridem paralelamente aos aperfeiçoamento de                   
métodos de investigação (novas técnicas e pesquisas). 
 
Tipos de microscopia 
 
​microscopia óptica (mo) microscopia eletrônica           
(me) 
 
❖ campo claro;     
❖ campo escuro;   
❖ contraste de fase; 
❖ contraste interferencial; 
❖ polarização; 
❖ fluorescência; 
❖ microscópio invertido; 
❖ microscópio estereoscópico; 
❖ confocal a laser. 
  
 
 
❖ microscópio eletrônico de     
transmissão; 
❖ microscópio eletrônico de varredura. 
 
 
*os tópicos em negrito serão abordados à             
frente 
 
 
 
 
 
Propriedades das lentes dos microscópios 
 
Limite de resolução (LR): ​é a menor distância entre dois pontos que permite distingui-los                           
separadamente. (Ex.: distância entre dois dedos separados)  
 
Poder de resolução: ​é a capacidade de fornecer imagens nítidas. ​Quanto menor o LR melhor                             
poder de resolução. ​(mais detalhes)  
 
Fórmula para o cálculo do LR: 
 
 ​LR= K. LAMBDA\AN  
AN= n. sen alfa 
 
- LR:​ limite de resolução; 
- K:​ constante experimental estimada em ​0,61 
- LAMBDA:​ comprimento de onda da radiação ​(+- 400-700 nm ou seja mais detalhes) 
- AN:​ abertura numérica 
- n:​ índice de refração do meio 
- alfa: metade do ângulo de abertura da lente objetiva. (ângulo formado entre o eixo                           
óptico da lente objetiva e o raio mais externo utilizado na formação da imagem.)   
Observação: ​(print) 
  
 
Microscópios 
 
Microscópio Óptico\Luz 
-> ​Possui duas lentes oculares utilizadas para ampliar a imagem; 
-> Lentes objetivas aumentam a imagem e fornecem detalhes (relacionadas ao limite de                         
resolução); 
obs.: ​quanto maior a lente objetiva maior a abertura numérica e menor o limite de resolução!  
(o limite de resolução é diretamente proporcional ao comprimento de onda da luz utilizada e                             
inversamente proporcional à abertura da objetiva).  
-> ​Forma uma imagem maior, virtual, invertida & bidimensional (plana); 
 -> ​Condensador: a luz espalhada ao passar por essa lente fica com feixes paralelos; 
(quanto maior o ângulo, mais luz é necessária). 
obs2: ​o aumento final é o resultado do produto entre as lentes oculares e objetivas! 
->​ É feita a coloração da amostra para facilitar a visualização devido ao contraste. 
 desenho da lente frontal (32min do vídeo) 
 
ATENÇÃO: REVER EXERCÍCIO DA AULA 2, (EM 40MIN.) NA VÉSPERA DE ATIV. AVAL. 
 
Microscópio Eletrônico de Transmissão  
-> ​O elétron faz o mesmo papel que a luz exerce no MO; 
-> ​Comprimento de onda do elétron: 0,05 nm ; 
-> ​Mais detalhista, ou seja, menor o limite de resolução;  
obs.: quanto menor o comprimento de onda, menor o LR e melhor e mais detalhista a imagem. 
-> ​Aumentos de 5 mil a 1 milhão; 
-> ​MET > MO; 
-> ​O elétron vem de cima para baixo (a luz vem de baixo para cima);  
-> A lâmina não pode ser de vidro, deve ser cobre\material pesado (o e- não consegue                               
atravessar com facilidade); 
-> ​Não é feita coloração e sim contraste; 
-> ​Os cortes devem ser ultrafinos e de diâmetro pequeno (máx 1 mm); 
-> ​Imagens bidimensionais; 
-> ​Não é possível observar materiais vivos. 
 
Microscópio Eletrônico de Varredura 
->​ Sistema análogo ao MET; 
->​ Usa-se feixe de elétrons; 
->​ São formadas imagens tridimensionais de tamanhos variados; 
->​ Mais rica em detalhes, mostra microestruturas celulares; 
->​ Possível utilizar materiais inteiros (ex.: formiga); 
->​ Devem-se ser contrastados; 
->​ O elétron “varre” a amostra para formar a imagem; 
->​ Utilizado para ver a superfície das amostras. 
Técnicas de preparo de materiais para microscopia 
 
->​ Toda imagem levada ao microscópio deve ser ​preparada anteriormente; 
->​ ​Providenciar o animal ou planta a ser utilizado; 
obs.: ​ao trabalhar com animais vertebrados deve-se pedir ​autorização do comitê de ética da                           
instituição para fazer a eutanásia (anestésicos, câmara de CO2); 
->​O material recolhido deve ser lavado para remoção dos fluidos corporais (uso de NaCl a 0,9%                               
m\v para evitar a perda ou ganho de água ou íons no material); 
-> ​Processo de fixação: preservar as estruturas celulares e extracelulares e evitar autólise                         
(quebra das estruturas da célula por suas próximas enzimas);  
->​ ​Lavagem:​ para remover o excesso de fixador (ex.: formol) 
-> ​Desidratação: ​para facilitar os cortes que devem ser finos (utilizado: álcool ou acetona,                           
através de concentrações crescentes, ex: 70%- 80%- 90%, etc, para evitar a retração da peça) 
->​ ​Processo de Inclusão: ​colocar o material para endurecer e formar um “bloquinho”; 
(​X ​parafina: é um hidrocarboneto, hidrofóbica> deve-se garantir que toda a água foi retirada                           
-usando o processo de desidratação- e também o álcool- utilizando xilol (cancerígeno, deve-se                         
usar 3 frascos para retirar bastante álcool e substituir pelo xilol que também é hidrofóbico e dá                                 
certo com a parafina) ​+barata​) 
(​X ​resina: é anfipática (afinidade com compostos formados com água e hidrofóbicos) ou seja,                           
não precisa passar pelo banho do xilol, apenas retirar a água. ​+visível  
-> Processo de Infiltração: ​Parafina: no último vidro de xilol, mergulhar o cassete em 3 banhos                               
de parafina líquida (em uma estufa coloca 3 beckers com a parafina sólida, temp.65º); 
Resina: mistura resina líquida e álcool (50% de cada), a temperatura ambiente, aprox. 2 horas                             
e depois mergulhar na resina pura para que ela entre no lugar do álcool.  
-> ​Processo de Inclusão: Pegar uma forma (papel: parafina & silicone: resina), coloca o                           
fragmento e preenche com o material (a resina deve ser misturada com o catalisador). 
obs.: ​microtomia é o processo de corte, usando navalhas de aço (apenas parafina), vidro  
(MO=resina; MET=papel celofane e água p\ melhor visualização) e ou diamante.  
-> Coloração HE: ​hematoxilina e eosina, corantes a base de água; coram as células com base                               
nas suas propriedades químicas. ​Hematoxilina é um corante básico então cora estruturas                       
ácidas em azul (ex.: ác. nucleicos- são estruturas basófilas, ou seja, coram em meio básico). Já a                                 
eosina ​é um corante ácido, por isso cora estruturas básicas em rosa (ex.: proteínas- acidófilas). 
obs.: ​a parafina por ser hidrofóbica não deixa o corante (a base de água) pegar na amostra..                                 
Deve-se então fazer um processo de desparani,fização (mergulhar a lâmina no xilol 1,2,3 e no                             
álcool absoluto)  
Microscopia de fluorescência 
-> ​Geralmente aplicada com​ técnicas citoquímicas 
-> ​O feixe de luz é lateral e atravessa um filtro que incide em um espelho difusor do feixe que                                       
desce e entra em contato com o material, virando um objeto fluorescente. 
-> ​Principal aplicação da microscopia de fluorescência: ocorre em combinação com métodos                       
imunológicos, nas técnicas imunocitoquímicas que utilizam anticorpos conjugados a compostos                   
fluorescentes ou que formam precipitados; 
-> ​A imunocitoquímica se baseia na ​reação antígeno-anticorpo​, esta técnica pode ser realizada                         
aplicando-se a imunocitoquímica direta (pouco sensível, e por isso, pouco usada atualmente) ou a 
imunocitoquímica indireta (maior sensibilidade, permitindo a demonstração de quantidadesmínimas de antígeno, sendo a mais usada na prática). 
-> ​Algumas substâncias podem ser utilizadas para ​marcar os anticorpos​, dentre elas:                       
peroxidase, ferritina, anticorpo fluorescente, complexo de ouro coloidal + proteína A (extraída                       
das bactérias Staphylococcus aureus). 
 
Citoquímica 
 
Conceito:  compreende técnicas diversas para a identificação e             
localização das moléculas que constituem as células. 
 
Organelas 
 
Ácido desoxirribonucleico (DNA):​ é demonstrado quimicamente pela ​reação de Feulgen. 
Etapas:  
1. mergulha-se as lâminas em solução aquecida de ác. clorídrico, promovendo hidrólise das                       
bases púricas, deixando livre as extremidades desoxirribose, que possuem radicais                   
aldeídicos; 
2. trata-se o preparado pelo reativo de Schiff (solução fucsina básica decorada pelo                       
anidrido sulfuroso), que ao se combinar com grupamentos aldeídicos da desoxirribose,                     
forma um complexo na cor vermelha. 
 
 
Polissacarídeos: ​um exemplo é a técnica utilizada para evidenciar o glicogênio, chamada de                         
técnica do PAS;  
-> ​A reação baseia-se na oxidação pelo ácido periódico, de grupamentos OH vizinhos, formando                           
grupamentos aldeídicos que dão uma coloração vermelha ao reativo de Schiff; 
-> A reação não é específica para o glicogênio, então usa-se do seguinte artifício: tomam-se                               
duas lâminas com cortes do mesmo tecido, uma das quais é previamente tratada pela enzima                             
alfa-amilase (ela hidrolisa e remove o glicogênio). Portanto, a estrutura que aparecer corada                         
pelo PAS na lâmina não tratada é o glicogênio. 
 
Técnica imunocitoquímica direta: ​O composto (precipitado) formado pela ação da 
peroxidase sobre a 3-3’-diaminobenzidina é de cor marrom-clara e elétron-denso. 
Por isso, a técnica pode ser aplicada tanto à microscopia óptica como à eletrônica. 
 
Técnica imunocitoquímica direta: ​O composto (precipitado) formado pela ação da 
peroxidase sobre a 3-3’-diaminobenzidina é de cor marrom-clara e elétron-denso. 
Por isso, a técnica pode ser aplicada tanto à microscopia óptica como à eletrônica. 
 
Etapas da imunocitoquímica indireta:  
1. o antígeno cuja localização se deseja determinar combina-se com o anticorpo específico,                       
formando um complexo que não é visível nem no microscópio óptico, nem no eletrônico. A                             
finalidade das etapas seguintes é tornar esse complexo visível.  
2. agrega-se antigamaglobulina marcada com peroxidase ao complexo já formado.  
3. por meio da técnica citoquímica para peroxidase, forma-se precipitado visível nos                     
microscópios óptico e eletrônico, revelando-se assim o local onde está presente o antígeno                         
cuja localização era desejada. 
 
obs.: ​A imunocitoquímica indireta possui maior sensibilidade. Pela técnica direta o antígeno                       
fixaria quatro moléculas do anticorpo, pela técnica indireta, fixaria 20 moléculas de                       
antigamaglobulina.