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Identificação de microrganismos por testes bioquímicos Universidade Federal de Santa Maria Centro de Ciências da Saúde Programa de Pós-Graduação Medicina Veterinária R= para reduzir o trabalho, o custo e abreviar o tempo requerido para diagnóstico. Porque identificar por testes bioquímicos ? A identificação dos microrganismos é efetuado através da determinação de um número mínimo de propriedades. Importante Portanto, quanto menor o número de observações efetuadas, maior o risco de erros de identificação. possuem enzimas específicas utilizadas no processo de metabolização dos substratos ou mecanismos de virulência. Identificação Bioquímica –> seg. a min. Provas rápidas Parede celular: método de Gram Bactéria gram-positiva Esquema de bactéria com parte da célula removida. Membrana plasmática Parede celular formada por camada espessa de peptidoglicano Esquema de parte da parede celular e da membrana plasmática de bactéria gram-positiva. Parede celular: método de Gram Esquema de bactéria com parte da célula removida. Esquema de parte da parede celular e da membrana plasmática de bactéria gram-negativa. Membrana plasmática Camada de peptidoglicano Bactéria gram-negativa Camada lipoprotéica externa, espessa, semelhante à m. plasmática, com lipopolissacarídeos P a r e d e c e l u l a r OBS: Exceto os estreptococos, a maioria das bactérias aeróbias e anaeróbias decompõe o peróxido de hidrogênio Catalase • Indispensável na identificação de cocos Gram positivos; catalase positivos •catalase negativos; • Proteína de composição química desconhecida, com atividade semelhante a protrombina, capaz de transformar o fibrinogênio em fibrina (coágulo) _ + _ + Coagulase Presença desta enzima indica patogenicidade • Na presença de plasma, os produtores de coagulase, como o Staphylococcus aureus, vão desencadear os mecanismos da coagulação • Diferenciar espécies de Staphylococcus (S. aureus e S. epidermidis) –> 24 h ou mais Provas lentas *Uma vez incorporado, o citrato será degradado pela enzima Citrase, produzindo compostos alcalinos. *Teste de Citrato de Simmons *Diferencia os microrganismos pela capacidade de usarem o Citrato como única fonte de carbono. Azul de bromotimol como indicador de pH *Para que a bactéria possa utilizar o citrato é necessário que ela tenha a Citrato permease, que vai permitir a entrada desse composto no interior da célula; Teste TSI (Triple sugar iron) ● H2S na presença de sais de ferro forma sulfeto ferroso, originando um precipitado negro insolúvel. A A K A Permite avaliar: 1-Fermentação da glicose, 2- Produção de gás, 3- Fermentação de lactose 4- Produção de H2S. PROVAS DO MEIO DE TSI - Preparação 1- inoculado por picada central até o fundo 2- espalhamento na superfície 3- incubação durante 18-24h a 35oC. Após o crescimento da bactéria pode-se observar os resultados: K= alcalina (vermelho) e A= ácida (amarelo) Análise dos Resultados: ● A/A (inclinação e base ácidas = amarelo). ● K/A (inclinação alcalina e base ácida); ● Presença de gases: Levantam ou fragmentam o meio. O resultado é representado como A/A com gás. Teste da Produção de Urease A urease é uma enzima que degrada a uréia em duas moléculas de amônia e uma de anidrido carbônico. Colônias são transferidas com uma alça para o meio contendo uréia, pH neutro e um indicador de pH, o vermelho fenol. _ + Na prova negativa não há alteração da cor do meio. Após o crescimento: Prova positiva quando a urease ataca a uréia alcalinizando o meio = rosa choque. A prova positiva é indicada pela viragem da cor do meio (amarelo) devido a produção de ácidos, com abaixamento do pH do meio. Além disso, o ácido fórmico é transformado em CO2 e Hidrogênio, os quais são coletados pelo tubo de Durhan. A prova negativa é revelada pela ausência de mudança de cor (laranja ou vermelho). + + - Teste da Fermentação de Carboidratos Teste da Motilidade A prova é negativa quando os microrganismos ficam restritos ao local da inoculação sem, contudo, turvar o meio. A prova é efetuada inoculando-se em linha reta, através da técnica da punctura (com agulha), 2/3 de um meio semi-sólido. A prova indica motilidade quando os microrganismos crescem deslocando-se da linha de inoculação, turvando o meio. Teste do Indol O indol pode ser detectado pela formação de um anel rosa (pink) na parte superior do tubo, após a adição de Reativo de Kovac’s O indol é produzido pela ação da triptofanase sobre o triptofano existente no meio de cultura, ocorrendo, também, a produção de ácido pirúvico e amônia. O meio contém o indicador bromocresol púrpura. Nas etapas iniciais de incubação, o tubo torna-se amarelo devido à fermentação da glicose. Se o aminoácido é descarboxilado o meio retorna à cor púrpura. _ + Teste da Lisina e Ornitina– descarboxilação Algumas bactérias possuem a lisina descarboxilase (LDC) que atua sobre a porção carboxila dos aminoácidos, com formação de aminas, de reação alcalina e CO2. A reação ocorre preferencialmente em condições anaeróbias e ligeiramente ácidas, mas inicialmente ocorre a utilização da glicose do meio para enriquecimento da cultura e acidificação do meio.
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