Replicação do DNA

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Replicação do DNA 
 O mecanismo de replicação do DNA é um 
 processo muito rápido e preciso. 
 Em humanos a síntese ocorre na proporção de 
 aproximadamente 3000 nucleotídeos por 
 minuto, em bactérias, cerca de 30.000 por 
 minutos. Embora a velocidade de incorporação 
 seja bastante grande, a �delidade também é, 
 ocorrendo, em média, um erro por bilhão de 
 nucleotídeos incorporados. 
 A Replicação é Semiconservativa 
 Apenas cinco semanas após a publicação 
 sobre a estrutura do DNA, Watson e Crick 
 publicaram um artigo descrevendo um 
 possível mecanismo de replicação da 
 dupla-hélice. 
 Eles propuseram que os dois �lamentos 
 complementares se desenrolam, separando- 
 se e cada �lamento guia a síntese de um novo 
 �lamento complementar. A sequência de 
 bases de um �lamento parental, que no 
 esquema está em verde, é usado como molde, 
 visto que a adenina sempre se pareia com a 
 timina e a guanina citosina. Este mecanismo é 
 chamado de replicação semiconservativa, 
 metade da molécula é conservada e a outra 
 metade é recém sintetizada, mostrada na cor 
 rosa. 
 A Replicação do DNA Poderia Ocorrer de 
 Três Maneiras Diferentes 
 - Qual delas é a verdadeira? 
 Hipoteticamente a replicação poderia ocorrer 
 por qualquer um destes três mecanismos: 
 semiconservativa, conservativa ou dispersiva. 
 Na Replicação Conservativa, a dupla-hélice 
 parental seria conservada e uma nova 
 dupla-hélice seria sintetizada; já na 
 dispersiva, segmentos de ambos os �lamentos 
 da molécula de DNA poderiam ser usados 
 como molde e depois seriam unidos. 
 O Experimento de Meselson e Stahl 
 As evidências do mecanismo de replicação do 
 DNA foi dado inicialmente no experimento 
 realizado por Meselson e Stahl em 1958. Eles 
 pensaram estudar a replicação do DNA por 
 diferenças nas densidades das moléculas, 
 assim, inicialmente, precisavam criar uma 
 solução que tivesse diferentes intensidades 
 ao longo do tubo. 
 Esta variação na densidade foi produzida 
 utilizando uma solução a 6 molar de cloreto 
 de césio ( CsCl ) submetido a centrifugação de 
 alta velocidade, aproximadamente 50.000 
 RPM por um longo período de tempo. Os íons 
 de cloreto de césio tendem a ser levados pela 
 força centrífuga para o fundo do tubo, sendo 
 produzido, gradualmente, um gradiente, ou 
 seja, um gradiente de densidade. 
 Eles cultivaram bactérias Escherichia Coli 
 por várias gerações em um meio contendo o 
 isótopo pesado, o 15 N (nitrogênio 15). O DNA 
 sintetizado neste meio terá uma densidade 
 maior em relação ao DNA cultivado em 14 N 
 (nitrogênio 14). 
 Após muitas gerações crescendo nestes 
 meios, eles removeram algumas amostras da 
 bactéria, extraíram o DNA e ao centrifugar 
 essas amostras em gradiente de CsCl, 
 ocorreu o esperado: o DNA de densidades 
 diferentes se posicionavam em locais 
 diferentes nos tubos. 
 Nota: Lembre- se que as bases púricas e 
 pirimídicas contêm nitrogênio, logo, o DNA será 
 formado tanto pelo nitrogênio pesado, 15 N, 
 quanto pelo nitrogênio normal ou leve, o 14 N. 
 Nota: Densidade = 𝑀 𝑉 𝑢𝑛𝑖𝑡 á 𝑟𝑖𝑜 
 A ideia deles era permitir que as moléculas de 
 DNA parental, contendo nucleotídeos de uma 
 densidade maior, fossem replicados em um 
 meio com nucleotídeo de densidade menor, 
 para poder entender a maneira como o DNA 
 era replicado. Assim, as bactérias cultivadas 
 em meio contendo 15 N foram transferidas 
 para um meio contendo nitrogênio leve, 14 N. 
 Logo após a transferência, uma amostra foi 
 retirada e o DNA foi extraído e centrifugado 
 novamente. 
 Como resultado desta primeira 
 centrifugação, eles viram que as amostras 
 estavam no fundo do tubo, pois tinham uma 
 densidade maior, no entanto, sabendo que a 
 Escherichia Coli demorava, aproximadamente, 
 20 minutos para se replicar em meio ideal, 
 optaram por esperar. Após o tempo, 
 retiraram e extraíram mais uma amostra do 
 DNA do mesmo tubo e centrifugaram mais 
 uma vez. 
 Desta vez, as amostras estacionaram em uma 
 localização diferente, um pouco mais acima 
 da anterior, neste ponto, já era possível 
 descartar uma das três possibilidades de 
 replicação do DNA: o modelo conservativo, 
 pois nenhuma banda pesada se formou, 
 entretanto, este DNA mais leve poderia ter se 
 replicado por uma das duas outras 
 possibilidades, ou seja, de maneira 
 semiconservativa ou dispersiva. Então, eles 
 deixaram as bactérias por mais 20 minutos, 
 totalizando 40 minutos, e repetiram todo o 
 processo anterior. Como resultado da 
 centrifugação, formou, além do DNA 
 intermediário, o DNA mais leve composto 
 apenas por nitrogênio leve. 
 A formação deste DNA totalmente livre de 15 N 
 em duas multiplicações celulares, dava 
 evidência su�ciente para mostrar que o DNA 
 se replicava de maneira semiconservativa, 
 assim, com este procedimento, os 
 pesquisadores foram capazes de distinguir 
 entre os três modelos de replicação do DNA, 
 seguindo as mudanças de densidade do mesmo. 
 Resultado Esperado Para Cada Possibilidade 
 A replicação conservativa foi descartada na 
 primeira geração, pois a banda pesada não foi 
 formada e/ ou veri�cada no tubo. Na segunda 
 geração de bactérias, ou seja, após 40 
 minutos, o padrão de bandas veri�cado 
 permitiu descartar o modelo dispersivo, pois 
 esperava-se a formação de apenas uma banda 
 de tamanho intermediário, contendo uma 
 mistura de nitrogênio leve e pesado. Neste 
 modelo, a cada geração o DNA híbrido se torna 
 cada vez mais leve. Assim, o surgimento das 
 bandas leves na segunda geração, após o 
 centrifugação, só podia acontecer se a 
 replicação fosse semiconservativa. 
 Origem Única de Replicação em 
 Bactérias e Vírus 
 O próximo passo agora seria entender o 
 mecanismo de replicação do DNA: Os primeiros 
 entendimentos foram obtidos com o DNA 
 bacteriano. 
 O genoma bacteriano é circular, os 
 cromossomos bacterianos e virais, 
 geralmente, têm uma origem única de 
 replicação. O ponto de origem de replicação 
 do DNA da Escherichia Coli é chamado oriC e 
 apresenta 245 pares de bases de 
 comprimento, contendo duas sequências 
 repetidas diferentes. 
 ● No esquema, cada parte em amarelo 
 tem os mesmos treze pares de base e, 
 neste caso, cada par está repetido 3 
 vezes uma do lado da outra; é rica em 
 bases adenina e timina que fazem duas 
 ligações de hidrogênio, tornando essa 
 região mais vulnerável ao 
 rompimento, pois duas ligações de 
 hidrogênio são mais fracas que três 
 ligações realizadas entre as bases 
 citosina e guanina. 
 ● A outra sequência em amarelo é uma 
 de nove pares de base repetidas quatro 
 vezes com uma sequência intercalada 
 entre elas. 
 É nessa região única, oriC, que a dupla hélice 
 separa-se e forma uma bolha de replicação 
 para iniciar o processo de replicação de todo o 
 genoma bacteriano. 
 Início da Replicação E.Coli 
 A primeira etapa, a pré-iniciação, acontece 
 com a ligação de quatro proteínas chamadas 
 de DNA A; dessas proteínas, quatro delas se 
 ligam às quatro repetições de 9 pares de base, 
 depois das primeiras quatro se ligarem, há 
 uma associação de 20 a 40 proteínas que se 
 ligam cooperativamente e formam a 
 curvatura no ponto de origem (oriC).Ao 
 fazer essa curvatura, as três repetições que 
 tem 13 pares de base cada se rompem, pois 
 têm adenina e timina nessa região, ou seja, 
 ligações mais fracas, assim, a curvatura 
 possibilita a formação do início da bolha de 
 replicação. 
 Em seguida, um complexo proteico se associa 
 e contribui para a formação de duas 
 forquilhas de replicação bidirecional. A 
 principal proteína, neste caso, é a DNA B 
 (helicase), onde duas delas se associam à essa 
 bolha de replicação, cada uma no lado oposto 
 da forquilha, uma vez que a replicação ocorre 
 nos dois sentidos (bidirecional). 
 ● A helicase será importante para 
 romper as ligações de hidrogênio 
 entre as duas �tas de DNA nos dois 
 sentidos. 
 Nota: Lembre- se, há participação de muitas 
 outras proteínas, mas destaca- se aqui as 
 principais. 
 Após a ligação das helicases de cada lado da 
 bolha de replicação, uma em cada forquilha, 
 as proteínas do DNA A se desligam e outras 
 proteínas se associam como, por exemplo, as 
 SSBs*. Essas proteínas se ligam para evitar 
 que as �tas simples voltem a se ligar como. 
 Ligam-se também as primases, importantes 
 para iniciar o processo de replicação, uma vez 
 que adicionam o primer de RNA, 
 importantíssimo para dar o início da síntese 
 da replicação. 
 Nota*: São proteínas ligadoras de �tas simples. 
 DNA POLIMERASE 
 Antes de prosseguir sobre o mecanismo de 
 replicação, deve-se comentar sobre as 
 exigências da DNA Polimerase III. 
 ● A síntese de DNA ocorre pela adição de 
 nucleotídeos à extremidade 3’OH da 
 cadeia de crescimento. O precursor da 
 síntese é o desoxirribonucleotídeo 5’ 
 trifosfato. 
 ● O sentido da síntese sempre é 5’ → 
 3’, sentido oposto da �ta molde 
 (antiparalelas). 
 As DNA Polimerase II só conseguem replicar 
 se tiver uma �ta molde, ou seja, não 
 conseguem sintetizar um DNA sozinha, 
 precisando da �ta molde e um iniciador, o 
 prime, que fornecerá uma hidroxila livre na 
 extremidade 3’. Assim, a polimerização 
 ocorre de 5’ em direção à 3’. 
 Com essa hidroxila na extremidade 3’, a DNA 
 Polimerase III consegue adicionar os 
 ribonucleotídeos trifosfato e segue 
 adicionando um a um para ir complementando 
 a �ta; resulta- se em dois fosfatos 
 inorgânicos depois que se incorpora o 
 nucleotídeo. 
 Ligações Fosfodiéster 
 ⤷ Ligações fosfodiéster unem os 
 nucleotídeos nas cadeias poliméricas 
 do DNA e RNA. 
 A ligação do próximo nucleotídeo com a �ta 
 molde é conhecida como ligação fosfodiéster. 
 Essa ligação envolve a hidroxila (-OH) da 
 extremidade 3’ da cadeia crescente e a 
 hidroxila do grupamento fosfato, que são 
 unidas por ligação covalente 
 (compartilhamento de elétrons). Após a 
 ligação são liberados os dois fosfatos 
 inorgânicos, anteriormente citados. 
 Desoxirribonucleico 
 ● A hidroxila mencionada anteriormente 
 é a que está no carbono 3’ da pentose. 
 ● O carbono 5’ sai para fora do anel e, 
 este carbono, com o carbono 3’, dá a 
 polaridade da molécula de DNA. 
 Nota: Lembre- se, toda vez que se fala de 
 carbonos 5’ e 3’, neste resumo, trata- se dos 
 carbonos da pentose. 
 Antiparalelas 
 ⤷ As �tas de DNA são antiparalelas. 
 Como as �tas de DNA são antiparalelas, ou 
 seja, as polaridades estão invertidas uma em 
 relação a outra, na hora da replicação do DNA, 
 isto cria uma di�culdade para a DNA 
 Polimerase III, a enzima que só consegue 
 adicionar nucleotídeos na extremidade 3’. 
 Assim, em uma �ta ela adiciona da 5’ - 3’ e na 
 outra da 3’ - 5 ‘: em sentido contrário. 
 Visão Macromolecular da Replicação 
 Visão Geral 
 Entretanto, quando se faz análise de 
 auto-radiogra�a, usando isótopos marcados, 
 assim como os estudos de microscopia 
 eletrônica, ambos os tipos de estudos 
 evidenciam que as duas �tas crescem na 
 mesma direção da abertura da forquilha de 
 replicação. Acredita- se, então, que à medida 
 que a dupla-hélice se abre, ambos os lados 
 vão sendo sintetizados. 
 Vamos então tentar fechar este 
 quebra-cabeça. 
 Fita Descontínua 
 ⤷ Uma das �tas é sintetizada 
 descontinuamente. 
 Assim que a bolha de replicação é formada, a 
 primase sintetiza o primer de RNA, contendo 
 entre 8 a 12 nucleotídeos. Este, é o iniciador 
 para que a DNA Polimerase III continue a 
 síntese da �ta. 
 Após o primer, a DNA Polimerase III continua 
 dele em direção a forquilha de replicação. 
 Então ela adiciona nucleotídeos e a �ta vai 
 crescendo de 5’ a 3’ com base na �ta molde. 
 Nessa �ta, não há problema, pois a síntese 
 está no sentido certo, permitindo que a DNA 
 Polimerase III continue sem problema à 
 medida que a forquilha vai se abrindo. 
 Entretanto, a outra �ta não permite o 
 crescimento no mesmo sentido de abertura da 
 �ta: o sentido de crescimento está ao 
 contrário. Para replicar esta �ta se faz 
 necessário outra estratégia, os primers são 
 adicionados à medida que a forquilha vai se 
 abrindo. 
 DESCRIÇÃO 
 Normalmente, abre- se a dupla hélice, que 
 servirá de molde, e a DNA Polimerase III vem 
 sintetizando no sentido da abertura da �ta. 
 Na �ta contrária, à medida que vai abrindo e, 
 já há espaço su�ciente, a primase sintetiza o 
 primer (em preto no esquema) e a DNA 
 Polimerase III continua a sintetizar do primer 
 em diante, formando o primeiro fragmento de 
 Okasaki. Assim, quando a forquilha abre mais 
 um pouco, um novo primer é adicionado e 
 segue o processo anterior, formando um novo 
 fragmento. 
 No passo seguinte, observa- se que o primer 
 anterior foi removido. 
 Essa remoção é realizada pela enzima DNA 
 Polimerase I, que remove o prime de RNA e 
 preenche as lacunas com DNA. 
 Posteriormente, uma nova observação é feita 
 e já não há mais fragmento, pois outra 
 enzima, a DNA ligase, sela (une) os 
 fragmentos por ligação covalente. 
 Esse processo ocorre repetidas vezes até que 
 todo o DNA seja replicado. 
 O Problema da Replicação no Sentido 
 Contrário 
 Pelo fato da enzima precisar replicar na 
 direção oposta da abertura da dupla-hélice, 
 isto cria um problema, pois todo complexo 
 enzimático caminha junto na direção 
 contrária da síntese da �ta descontínua. 
 Assim, a �ta que serve de molde para replicar 
 a �ta descontínua, forma uma alça atrás da 
 DNA Polimerase III que a puxa para poder 
 replicar na direção contrária. Quando a 
 Polimerase III encontra o fragmento mais 
 antigo, essa �ta é solta e a curvatura se 
 desfaz, no entanto, se forma novamente na 
 síntese de um novo fragmento. 
 Topoisomerases 
 DNA girasse em bactérias. 
 ● Enzimas que promovem a quebra 
 transitória nas pontes fosfodiéster 
 adicionando ou removendo 
 superenrolamentos. 
 ○ A enzima permanece ligada 
 covalentemente ao DNA e 
 permite que as �tas passem 
 uma sobre as outras. 
 Essa enzima bastante importante é, na 
 verdade, uma categoria de enzimas, pois elas 
 operam de maneiras diferentes. Em bactérias 
 muitas vezes são achadas com o nome de 
 girasses. 
 Essas proteínas se posicionam na frente da 
 forquilha de replicação, pois ali está a 
 helicase que abre as �tas, quebrando as 
 ligações (pontes) de H. Esse desenrolar da �ta 
 de DNA causa uma torção na frente da �ta o 
 que provoca uma tensão na frente da 
 molécula,Assim, as Topoisomerases, clivam 
 temporariamente o DNA que está a frente, 
 diminuindo a torção e, consequentemente, 
 alivia a tensão a frente da forquilha de 
 replicação. 
 Replicação nas Duas Forquilhas da 
 Mesma Bolha 
 Quando avaliamos a direcionalidade que 
 ocorre nas duas forquilhas de replicação, 
 veri�camos que a �ta que é sintetizada 
 continuamente em uma das forquilhas, não é 
 a mesma sintetizada na forquilha oposta, ou 
 seja, em ambas as forquilhas de replicação a 
 �ta que se replica continuamente estão 
 posicionadas em lados opostos, sendo �tas 
 opostas. 
 Replicação em E. Coli 
 Resumo geral da replicação do DNA circular da E. Coli . 
 DNA - Polimerase III 
 A DNA Polimerase I foi a primeira a ser 
 encontrada, mas a DNA Polimerase III é a 
 principal enzima de replicação do DNA. 
 O complexo protéico é chamado de 
 Replissomo e tem pelo menos 20 
 polipeptídeos. 
 No esquema, vemos uma simpli�cação do 
 complexo. 
 O cerne catalítico de replicação do DNA existe 
 de dois lados, sendo necessário dois cernes, 
 pois tem duas �tas de DNA. A parte mais 
 complexa, ou seja, que envolve mais 
 proteínas, é usada pela �ta de replicação 
 descontínua. 
 A subunidade , presente dos dois lados, tem α 
 atividade de polimerase de 5’ - 3’. No entanto, 
 esse cerne catalítico sintetiza �lamentos bem 
 curtos de DNA devido a sua tendência de sair 
 do molde. Para evitar que essa subunidade 
 saia (desprenda) da �ta de DNA, existe a 
 subunidade , presente também dos dois lados β
 - ela prende uma das �tas, evitando que o 
 complexo proteico saia da replicação. 
 Existe também a subunidade que tem função ε 
 de revisão e a com função de exonuclease - θ 
 remoção do nucleotídeo se necessário, no 
 caso, se foi incorporado incorretamente; há 
 também o complexo Gama, um conjunto de 
 cinco proteínas necessárias para ajudar a 
 prender e abrir/ fechar o complexo das 
 proteínas do lado da �ta descontínua, pois β
 de vez em quando o DNA precisa ser solto 
 para aliviar a alça formada toda vez que é 
 feito um fragmento de Okasaki. 
 Assim, os dois cernes catalíticos apresentam 
 habilidades diferentes de ligação ao DNA, 
 além disso um lado tem uma associação 
 contínua e do outro a associação é desfeita 
 quando necessário (descontínua) 
 ● Em E. Coli são Encontradas 3 DNAs 
 Polimerases Bem Descritas 
 Nota: Mais duas já foram encontradas, a IV e V. 
 OBSERVAÇÕES 
 ● A DNA polimerase I, assim como a DNA 
 polimerase II, estão envolvidas no 
 reparo do DNA. 
 ● Todas têm a função de polimerase 
 (polimerização), ou seja, conseguem 
 adicionar nucleotídeos de 5’ - 3’, 
 assim, só adicionam novos 
 nucleotídeos se tiver uma hidroxila na 
 extremidade 3’. 
 ● Todas também têm função 
 exonuclease de 3’ - 5’, ou seja, 
 conseguem remover nucleotídeos 
 atrás. 
 ○ No entanto, apenas a DNA 
 Polimerase I tem função 
 exonuclease de 5’ - 3’, podendo 
 remover também nucleotídeos 
 à frente. 
 O Genoma Eucariótico 
 ● Várias origens. 
 O processo de replicação do DNA é muito 
 semelhante entre células eucarióticas e 
 procarióticas, mas tem alguns detalhes que 
 são diferentes, por exemplo, como o genoma 
 eucariótico é muito grande, ele tem várias 
 origens o que facilita e agiliza a replicação. 
 Na imagem, tem o DNA eucariótico e os 
 pontos vermelhos representam vários pontos 
 de origem na �ta de DNA que se abrem em 
 momentos diferentes. No entanto, cada bolha 
 de replicação, de igual maneira, cada bolha 
 tem duas forquilhas e vão progredindo 
 bidimensionalmente até que se encontrem. 
 ● Replicação do DNA Resultará em 
 Replicação Cromossômica em Células 
 Eucarióticas 
 A replicação do DNA como está na imagem, 
 uma �ta simples que se abre, formando duas 
 �tas de DNA. Essas �tas de DNA serão 
 empacotadas, unindo- se, logicamente, a 
 proteínas básicas e depois a outras proteínas 
 que não são básicas, ou seja, proteínas ácidas; 
 e o DNA vai empacotando (condensando) cada 
 vez mais até atingir a estrutura de 
 cromossomo. Assim, quando vemos um 
 cromossomo duplicado, nada mais é do que o 
 resultado da replicação do DNA. 
 - Por que a célula sintetiza, por que ela 
 replica? 
 Ela replica porque a célula vai se dividir, 
 então existe o ciclo celular nas células 
 eucarióticas. Por exemplo, uma célula humana 
 antes da divisão precisa replicar o material 
 genético e, para facilitar o processo de 
 divisão celular, empacota o DNA na forma de 
 cromossomo. 
 DNAs Polimerases em Células 
 Eucarióticas 
 Outra diferença é que nas células 
 eucarióticas existem muitas DNAs 
 Polimerases, pelo menos 15 já foram 
 encontrados. 
 ● Tem uma DNA Polimerase que tem a 
 função de primase que inicia a síntese. 
 ● A DNA Polimerase que sintetiza a ε
 �ta contínua e a DNA Polimerase que δ
 serve para �ta descontínua. 
 ● A DNA Polimerase vai replicar o DNA γ
 mitocondrial, uma vez que dentro da 
 mitocôndria há DNA, feito por uma 
 DNA Polimerase especí�ca. 
 Existem outras DNAs Polimerases também: 
 uma só de reparo, outra só para meiose, 
 substituição de bases, etc. Então a 
 complexidade é um pouco maior, embora o 
 processo seja muito parecido.