O processo de replicação do material genético em eucariotos e sua relação com o envelhecimento e formação de células cancerígenas

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Lição 04
O processo de replicação do
material genético em eucariotos e
sua relação com o envelhecimento
e formação de células cancerígenas
Genética básica e molecular
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1. Introdução
A replicação do DNA é definida como o processo na qual todas as moléculas de DNA localizadas no
núcleo de uma célula são duplicadas de maneira idêntica às moléculas originais, antes da divisão
celular. Apesar de parecer simples, a replicação é um processo complexo que requer vários
componentes, e suas ações têm de estar intrinsecamente coordenadas a fim de garantir que o DNA
seja copiado com fidelidade.
Após a publicação da estrutura da molécula de DNA apresentada pelos pesquisadores James
Watson e Francis Crick, em 1953, diversos cientistas começaram a se perguntar como uma molécula
complexa e extremamente longa como o DNA poderia se replicar. Três modelos de replicação foram
propostos, o modelo conservativo, dispersivo e semiconservativo. Neste tópico, iremos discutir os
três modelos teóricos e como os pesquisadores comprovaram que todas as células replicam seu
material genético seguindo o modelo semiconservativo.
O processo de replicação também é ligeiramente diferente entre organismos procariotos e
eucariotos, envolvendo diversas enzimas e proteínas que diferem em número, mas com funções
semelhantes. Enquanto nos procariotos cerca de 13 componentes são utilizados, nos eucariotos o
processo de replicação pode envolver 27 componentes! Mas, isso não é motivo de preocupação;
neste tópico, serão discutidas as funções de “apenas” sete componentes.
Por fim, será discutido o processo de replicação das extremidades das moléculas de DNA, as regiões
chamadas de Telômeros. Nestas regiões, o processo de replicação é realizado por uma enzima muito
específica e capaz de utilizar uma molécula de RNA para gerar DNA. Portanto, distúrbios gerados
durante a replicação estão associados aos processos de envelhecimento e geração de células
cancerígenas.
2. Os Modelos Teóricos de Replicação
Inicialmente, foram propostos três modelos teóricos para a replicação do DNA. Na replicação
conservativa, a molécula inteira de DNA de fita dupla serve como molde para uma nova molécula
inteira de DNA, e a molécula de DNA original é totalmente conservada durante a replicação. Na
replicação dispersiva, as duas fitas de nucleotídeos se rompem (dispersam) em fragmentos, que
servem como molde para a síntese de novos fragmentos de DNA, e então, de alguma maneira,
reúnem-se de novo em duas moléculas de DNA completas. Nesse modelo, cada molécula de DNA
resultante é intercalada com fragmentos de DNA velho e novo e nenhuma molécula original é
conservada. A replicação semiconservativa é intermediária entre esses dois modelos, sendo que as
duas fitas de nucleotídeos se desenrolam, e cada uma serve como molde para uma nova molécula de
DNA (Figura 2 A).
A partir da estrutura tridimensional do DNA proposta por Watson e Crick em 1953, várias
implicações genéticas importantes estavam imediatamente aparentes. A natureza complementar
das duas fitas de nucleotídeos em uma molécula de DNA sugere que, durante a replicação, cada fita
serve como molde para a síntese de uma nova fita. A especificidade do pareamento de bases
(adenina com timina, guanina com citosina) indica que apenas uma sequência de bases pode ser
especificada para cada molde, e então, as duas moléculas de DNA construídas a partir do par de
moldes serão idênticas à molécula original. Apesar das implicações aparentes, nenhum pesquisador
foi capaz de comprovar qual modelo era utilizado pelas células para realizar o processo de
replicação. Somente em 1958, dois pesquisadores, Matthew Meselson e Franklin Stahl,
comprovaram experimentalmente o modelo de replicação do DNA. É exatamente este experimento
que será abordado no próximo slide.
Figura 2 A - Os três modelos teóricos de replicação do DNA propostos após a publicação de Watson e Crick em 1953.
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3. O Experimento de Meselson e Stahl e o
Modelo Semiconservativo
O primeiro problema na compreensão da replicação do DNA foi saber se o mecanismo de replicação
era semiconservativo, conservativo ou dispersivo. Em 1958, dois jovens cientistas, Matthew
Meselson e Franklin Stahl, descobriram qual dessas possibilidades descreve corretamente a
replicação do DNA. A ideia deles era permitir que as moléculas de DNA parental, contendo
nucleotídeos de uma densidade, fossem replicadas em um meio contendo nucleotídeos de
densidades diferentes. Se o DNA fosse replicado de maneira semiconservativa, as moléculas-filhas
deveriam ser metade velhas e metade novas, e, portanto, de densidade intermediária.
Para fazer seu experimento, Meselson e Stahl cultivaram bactérias Escherichia coli em um meio
contendo o isótopo pesado de nitrogênio ( N), em vez da forma leve normal ( N). Esse isótopo foi
inserido nas bases nitrogenadas, que foram então incorporadas em filamentos de DNA recém-
sintetizados. Após muitas divisões celulares em N, o DNA das células foi bem marcado com o
isótopo pesado. As células foram, então, removidas do meio com 1 N e colocadas em um meio com
N. Após uma ou duas divisões celulares, as amostras foram colhidas e o DNA foi isolado de cada
amostra. Esse experimento relativamente simples, foi um marco para a Genética moderna, pois
evidenciou que todos os organismos replicam suas moléculas de DNA segundo o modelo de
replicação semiconservativa, porque cada fita original de nucleotídeos permanece intacta
(conservada), apesar de não se combinar mais com a mesma molécula. Assim, a molécula original
de DNA tem sua metade (semi) conservada durante a replicação (Figura 3 A).
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Figura 3 A - Previsão do modelo semiconservativo de replicação das moléculas de DNA que foi comprovado após a
realização dos experimentos de Meselson e Stahl.
4. As Forquilhas de Replicação
Após o experimento de Meselson-Stahl, outra questão pairava sobre a comunidade científica: se as
duas fitas da molécula de DNA se separam e cada uma das fitas é utilizada como molde para a
síntese de novas moléculas de DNA, em algum momento será possível observar as duas fitas das
moléculas de DNA separadas! Em 1963, John Cairns testou essa previsão, permitindo a replicação
do DNA nas células bacterianas para incorporar a timidina tritiada ([ H] timidina), o nucleotídeo
timina marcado com um isótopo radioativo de hidrogênio chamado trítio. Teoricamente, cada nova
molécula-filha sintetizada deveria conter um filamento radioativo (“quente”; com H) e outro não
radioativo (“frio”). Após intervalos variados e números variados de ciclos de replicação em um meio
“quente”, Cairns cuidadosamente lisou a bactéria e depositou o conteúdo da célula em lâminas de
microscopia eletrônica. Essa técnica permitiu que John Cairns “revelasse” uma fotografia da
molécula de DNA durante o processo de replicação.
Neste experimento, John Cairns demonstrou que a replicação do DNA se inicia pela formação das
forquilhas de replicação. As forquilhas são os locais na molécula de DNA cujo maquinário de
replicação atua e processa a replicação. As forquilhas de replicação são formadas pela quebra das
ligações do tipo pontes de hidrogênio e consequente separação dos pares de bases nitrogenadas das
duas fitas da molécula de DNA (Figura 4 A).
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Aprendendo mais uma!
Nos organismos procariotos, só ocorre a formação de duas forquilhas de replicação, porém como
as moléculas de DNA nos organismos eucariotos são maiores e ocorrem geralmente em maior
número, várias forquilhas de replicação são formadas, permitindo que o processo de replicação
ocorra mais rapidamente!
Outra importante contribuição demonstrada por John Cairns foi de que a forquilha de replicação se
move durante a replicação do DNA na medida em que a dupla hélice continuamente se
deselicoidiza. Desta forma, o processo de síntese das novasfitas difere de acordo com a fita
original. Vale relembrar que a molécula de DNA é constituída de duas fitas de polinucleotídeos
pareadas no sentido antiparalelo. Portanto, a separação das duas fitas resulta em 2 filamentos com
sentido 5’ – 3’, um que se direciona a favor e outro contra as forquilhas de replicação (Figura 4 B).
Esta característica é fundamental para a síntese das novas fitas que irão constituir as novas
moléculas de DNA, pois diferenças importantes irão ocorrer na síntese dos dois filamentos. Vamos
conferir?
Figura 4 A - Formação das forquilhas de replicação em um organismo procarioto. São apresentados os resultados do
experimento de John Cairns com uma interpretação do processo de replicação e formação das forquilhas de replicação.
Aprendendo mais uma!
As origens de replicação nos eucariotos, geralmente, são formadas nas regiões da molécula de DNA
com sequências longas de pares A – T (adenina e timina). Isso ocorre porque essas bases se
pareiam pela formação de duas pontes de hidrogênio, sendo mais fácil quebrá-las do que nas
regiões contendo bases C – G (citocina e guanina) que se pareiam por três pontes de hidrogênio.
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Figura 4 B - A forquilha de replicação move-se na síntese de DNA na medida em que a dupla hélice continuamente se
deselicoidiza. A síntese do !lamento contínuo (em inglês: Leading) pode continuar sem interrupção no sentido do
movimento da forquilha de replicação, mas a síntese do !lamento descontínuo (em inglês: Lagging) deve ocorrer no
sentido oposto, afastando-se da forquilha de replicação.
Aprendendo mais uma!
As !tas Leading e Lagging recebem estes nomes devido a velocidade na qual ocorre a síntese da
nova !ta. Enquanto o processo de formação na !ta contínua (Leading) segue até o !nal da molécula
de DNA, a !ta descontínua (Lagging) é pausadamente sintetizada devido a formação dos
fragmentos de Okazaki.
5. Visão Geral da Replicação
Como foi visto anteriormente, para que o processo de replicação ocorra, é necessário quebrar as
pontes de hidrogênio que unem as duas fitas antiparalelas das moléculas de DNA, formando as
forquilhas de replicação. O local em que ocorrem forquilhas de replicação são chamados de origem
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da replicação, que nos organismos eucariotos ocorrem em mais de um local da molécula de DNA
(Figura 5 A).
Os primeiros componentes do maquinário responsável pelo processo de replicação devem,
portanto, realizar a quebra das pontes de hidrogênio e manter toda a estrutura separada. As
primeiras proteínas envolvidas no processo são das classes das Helicases e as Topoisomerases. As
Helicases são enzimas que rompem as pontes de hidrogênio que mantêm os dois filamentos da
dupla hélice juntos e rapidamente desenrolam a dupla hélice à frente da síntese de DNA. As
Topoisomerases têm função diferente, elas impedem que a molécula de DNA seja super-
helicoidizadas pela formação das forquilhas. As Topoisomerases relaxam o DNA super-
helicoidizado, quebrando um único filamento de DNA ou ambos os filamentos, o que permite que o
DNA gire, tornando-se uma molécula relaxada. Neste contexto, inibidores de topoisomerases são
usados em protocolos de quimioterapia, pois desta forma, o DNA tenciona e impede a replicação do
mesmo e inibe a divisão celular, fazendo com que os compostos combatam o avanço do tumor. As
Figura 5 A - (a) Representação da origem de replicação no processo de replicação de organismos eucariotos. (b)
Representação do processo de replicação, ocorrendo em diferentes origens de replicação, mecanismo que acelera o
tempo necessário para a replicação da molécula de DNA.
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Topoisomerases terminam reunindo os filamentos da molécula de DNA agora relaxada. Por fim, as
Proteínas de Ligação atuam na Fita Simples (SSB) que se ligam às fitas que foram separadas e
impedem que as pontes de hidrogênio sejam formadas novamente.
Após a separação das duas fitas, onde começa o processo de replicação? Essa é uma pergunta
importante, pois como foi visto nos tópicos anteriores, a síntese das estruturas primárias das
moléculas de DNA (cadeias de polinucleotídeos pelas ligações fosfodiéster) só são possíveis
adicionando novos nucleotídeos às extremidades do carbono 3’ das pentoses. Desta forma, a síntese
das novas fitas sempre deve seguir o sentido dos carbonos 5’ – 3’. A proteína responsável por
adicionar novos nucleotídeos à fita de DNA é a DNA polimerase III (DNA Pol III). Porém, a DNA
pol III necessita de carbonos 3’ disponíveis para que ela adicione novos nucleotídeos. Vale a pena
recordar que a molécula de DNA sempre é utilizada como molde para síntese de outras moléculas;
porém, desta vez, não existe nenhuma pentose livre para que a DNA pol III realize seu trabalho.
É nesta hora que entra em cena outra proteína fundamental, as Primases. Esta classe de proteínas é
responsável por adicionar um pequeno segmento de RNA na fita molde de DNA. Com isso, a DNA
pol III é capaz de identificar a pentose com carbono 3’ livre e adicionando novos nucleotídeos e,
assim, sintetizar a nova fita. Na medida em que a DNA pol III avança, a dupla hélice é
continuamente desenrolada na frente da enzima, para expor mais os filamentos de DNA separados
que atuarão como moldes. A DNA pol III atua na forquilha de replicação, a zona em que a dupla
hélice está se desenrolando. Entretanto, como a DNA polimerase sempre adiciona nucleotídeos na
ponta 3“ em crescimento, apenas um dos dois filamentos de polaridade inversa pode servir como
molde para a replicação no sentido da forquilha de replicação. Para esse filamento, a síntese pode
ocorrer de modo contínuo e ininterrupto no sentido da forquilha. O novo filamento sintetizado
nesse molde é chamado de filamento contínuo (em inglês: Leading). A síntese do outro filamento
também ocorre na extremidade em crescimento 3”, mas essa síntese está no sentido “errado”, pois,
para esse filamento, o sentido 5“ – 3’ da síntese está se distanciando da forquilha de replicação
(Figura 5 B).
Como foi visto, a natureza da maquinaria de replicação demanda que a síntese de ambos os
filamentos ocorra na região da forquilha de replicação. Portanto, a síntese da fita descontínua (em
inglês: Lagging), ou seja, a que se move afastando-se da forquilha de replicação, não pode
continuar por muito tempo. Ela tem de ocorrer em segmentos curtos! Para que isso aconteça, a
Primase deve adicionar novos primers de RNA à fita, permitindo que a DNA pol III sintetize um
segmento e, então, move-se para a ponta 3“ do próximo segmento, onde a Primase expôs um novo
Figura 5 B - Sentido da síntese das duas !tas de DNA durante a replicação da molécula de DNA.
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primer na forquilha em movimento, e o processo começa novamente. Esses trechos curtos (1.000 a
2.000 nucleotídeos) de DNA recém-sintetizado são chamados de fragmentos de Okazaki (Figura 5
C).
Após todo o processo de síntese das novas fitas, as moléculas recém-sintetizadas ainda precisam de
algumas alterações, pois como vocês se lembram as primases adicionaram pequenos segmentos de
RNA na molécula tanto na fita contínua quanto na descontínua. Como existem diferenças entre os
nucleotídeos de RNA e DNA, todos os nucleotídeos de RNA precisam agora ser substituídos da
molécula por nucleotídeos de DNA. A proteína responsável pela substituição é a DNA polimerase I
(DNA pol I). Além disso, a DNA pol I confere se todas os nucleotídeos adicionados correspondem
com os pareamentos das bases da fita original. A DNA pol I é, portanto, fundamental para evitar
erros de replicação e garantir que a molécula foi replicada fielmente.
Por último, ocorre a ação da proteína DNA ligase que é responsável por conectar os nucleotídeos
recém substituídos, formando umafita contínua de nucleotídeos de DNA. Esta proteína é
responsável por realizar as ligações do tipo fosfodiéster, a ligação básica que forma a estrutura
primária das moléculas de DNA (Figura 5 D).
Figura 5 C - (a) Representação da origem de replicação no processo de replicação de organismos eucariotos. (b)
Representação do processo de replicação ocorrendo em diferentes origens de replicação, mecanismo que acelera o tempo
necessário para a replicação da molécula de DNA.
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Figura 5 D - Funcionamento das proteínas associadas ao processo de replicação executando suas funções na forquilha de
replicação.
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6. O Replissomo
Outra característica da replicação do DNA é a velocidade. O tempo necessário para que a bactéria E.
coli replique seu cromossomo pode ser tão rápido que em 40 minutos o processo se encerra.
Portanto, seu genoma de cerca de 5 milhões de pares de bases tem de ser copiado a uma velocidade
de cerca de 2.000 nucleotídeos por segundo. O replissomo é o maquinário molecular responsável
pela síntese de DNA. Ele inclui duas DNA polimerases III para fazer a síntese em cada filamento e
coordena a atividade de proteínas acessórias necessárias para a adição dos primers de RNA, a
deselicoidização da dupla hélice e a estabilização dos filamentos separados. Além disso, faz a
verificação completa das novas fitas e une os filamentos recém-sintetizados. Para auxiliar na
discussão, a tabela abaixo lista as funções e processos desempenhados pelos diferentes
componentes do replissomo.
Tabela 1. Descrição dos principais componentes do replissomo e suas funções no processo de
replicação das moléculas de DNA.
Número Proteína Função desempenhada
1 Helicases Quebra das pontes de hidrogênio e separação das !tas
antiparalelas
2 Topoisomerases Estabilização da molécula de DNA, evitando giros e hiper-
helicoidização
3 Proteínas de ligação à !ta
simples (SSB)
Manter as !tas separadas, evitando a formação das ligações de
ponte de hidrogênio
4 Primases Adiciona primers de RNA, liberando pentoses com carbono 3’
disponíveis
5 DNA polimerase III Adiciona nucleotídeos de DNA, sintetizando a nova !ta
6 DNA polimerase I Faz a troca dos primers de RNA por nucleotídeos de DNA e revisa o
processo de replicação
7 DNA ligase Faz a ligação entre os segmentos alterados pela DNA pol I
7. Replicação, Envelhecimento e Formação
de Células Cancerígenas
Como foi visto até agora, a replicação da molécula de DNA em um cromossomo eucariótico ocorre
em ambas as direções a partir de várias origens de replicação. Esse processo replica a maior parte
do DNA cromossômico, mas há um problema inerente em replicar as duas pontas das moléculas de
DNA lineares, as regiões chamadas de telômeros. Enquanto a síntese do filamento contínuo pode
ocorrer normalmente até a ponta do molde, a síntese do filamento descontínuo demanda primers
de RNA à frente do processo. Logo, quando o último primer é removido, são perdidas sequências
na ponta do filamento. Em consequência, resta uma ponta unifilamentar em uma das moléculas-
filhas de DNA. Se o cromossomo-filho com essa molécula de DNA fosse replicado novamente, o
filamento com sequências faltando na ponta se tornaria uma molécula bifilamentar encurtada após
cada replicação. A cada ciclo subsequente de replicação, o telômero continuaria a se encurtar, até
que informações codificantes essenciais fossem perdidas (Figura 7 A).
Aprendendo mais uma!
Os telômeros são estruturas especializadas, nas pontas dos cromossomos, que contêm repetições
em uma curta sequência de DNA que é adicionada à ponta 3“ pela enzima telomerase. Os
telômeros estabilizam os cromossomos, evitando a perda de informação genômica após cada
rodada de replicação do DNA e associando-se a proteínas para formar um revestimento que
”esconde“ as pontas dos cromossomos da maquinaria de reparo de DNA da célula.
As células desenvolveram um sistema especializado para evitar essa perda. A solução envolve a
adição de múltiplas cópias de uma sequência simples não codificadora ao DNA das pontas dos
cromossomos. Assim, sempre que um cromossomo é duplicado, ele fica mais curto e apenas essas
sequências repetidas, que não contêm informação, são perdidas. As repetições perdidas são, então,
acrescentadas de volta às pontas dos cromossomos.
A enzima responsável por esse processo é a Telomerase. Esta é encontrada em organismos
unicelulares, células germinativas, células embrionárias iniciais e algumas células somáticas
proliferativas (como as da medula óssea e as que revestem o intestino); todas têm obrigatoriamente
divisão celular contínua. A maioria das células somáticas tem pouca ou nenhuma atividade de
telomerase, e seus cromossomos são progressivamente encurtados em cada divisão celular. Essas
células podem sofrer um número limitado de divisões; quando os telômeros são encurtados além de
um ponto crítico, o cromossomo torna-se instável, com tendência a sofrer rearranjos, sendo então
degradado.
Figura 7 A - A replicação na região dos telômeros pode resultar no encurtamento progressivo da molécula de DNA.
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Aprendendo mais uma!
Todas as proteínas envolvidas na replicação do DNA sempre utilizam a molécula de DNA como
molde para construção de moléculas de RNA. A Telomerase é a única enzima capaz de construir
sequências de nucleotídeos de DNA, utilizando uma molécula de RNA como molde.
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O encurtamento dos telômeros contribui para o processo de envelhecimento. Os telômeros de
camundongos modificados pela engenharia genética sem um gene da telomerase funcional (e,
portanto, que não expressam a telomerase nas células somáticas e germinativas) sofrem
encurtamento progressivo nas gerações sucessivas. Após várias gerações, esses camundongos
apresentam alguns sinais de envelhecimento prematuro, como mudança da cor do pelo para
grisalho, perda de pelo e cicatrização mais lenta de feridas. Por meio da engenharia genética,
também é possível criar células somáticas que expressam a telomerase. Nessas células, os telômeros
não encurtam, o envelhecimento celular é inibido e as células se dividem indefinidamente.
Entretanto, nestas células podem ser observadas uma forte relação entre a telomerase e o
desenvolvimento de células cancerígenas.
As células tumorais têm a capacidade de se dividir indefinidamente, e a telomerase é expressa em
90% de todos os cânceres. Algumas evidências recentes indicam que a telomerase estimula a
proliferação celular independentemente do seu efeito no comprimento do telômero, mas o
mecanismo usado pela telomerase para contribuir com o câncer não está claro. O câncer é um
processo complexo de várias etapas, que requer mutação em, pelo menos, vários genes. A ativação
da telomerase sozinha não leva ao crescimento do câncer na maioria das células, mas parece que é
necessário junto a outras mutações para surgir o câncer.
Uma das dificuldades no estudo do efeito do encurtamento do telômero no processo de
envelhecimento é que a expressão da telomerase nas células somáticas também promove câncer, o
que pode encurtar o tempo de vida da pessoa. Para contornar esse problema, estudos têm sido
desenvolvidos, utilizando camundongos modificados pela engenharia genética que expressam a
telomerase e carreiam genes que os tornam resistentes ao câncer. Esses camundongos têm
telômeros mais longos, vivem mais e exibem poucas mudanças relacionadas à idade, como
alterações na pele, redução da coordenação neuromuscular e doenças degenerativas. Esses
resultados apoiam a ideia de que o encurtamento do telômero contribui para o envelhecimento.
Figura 7 B - Procedimento de ação daenzima Telomerase, responsável pela replicação na região dos telômeros.
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8. Conclusão
Este tópico procurou mostrar todo o processo de replicação das moléculas de DNA. O assunto
discutido irá permitir que você possa explorar, de forma mais embasada, todos os elementos e
variações da reprodução da codificação genética. Diante de mundo altamente tecnológico, entender
e procurar tirar vantagens dos processos evolutivos será de grande utilidade para o exercício
profissional e para a educação continuada.
O trabalho experimental sobre a natureza molecular do material hereditário demonstrou de
maneira conclusiva que o DNA (e não as proteínas, os lipídios ou os carboidratos) é, de fato, o
material genético. A replicação é feita de maneira semiconservativa tanto em procariotos quanto
em eucariotos. Uma dupla hélice é replicada para formar duas hélices idênticas, cada uma com seus
nucleotídeos na ordem linear idêntica. Cada uma das duas novas duplas hélices é composta por um
filamento de DNA antigo e um novo (recém-polimerizado).
Os vários eventos que têm de ocorrer com acurácia e rapidez na forquilha de replicação são
efetuados pelo maquinário biológico denominado replissomo, um complexo proteico que inclui
duas unidades de DNA polimerase III: uma para agir no filamento contínuo e outra para agir no
filamento descontínuo. Desse modo, a síntese demora mais tempo e a união dos fragmentos de
Okazaki, em um filamento descontínuo, pode ser temporariamente coordenada com a síntese
menos complicada do filamento contínuo. O controle minucioso do local e do momento em que
ocorre a replicação é feito pela montagem ordenada do replissomo em determinados locais no
cromossomo denominados origens de replicação.
As pontas de cromossomos lineares (telômeros) representam um problema para o sistema de
replicação, porque há sempre um curto trecho em um filamento que não pode ser iniciado. A
enzima telomerase adiciona várias sequências curtas e repetitivas, para manter o tamanho do
cromossomo, sendo importantes no processo de envelhecimento e produção de células
cancerígenas.
9. Referências
GRIFFITHS, Anthony J. F. Introdução à genética. 10. ed. Guanabara Koogan, 2013.
PIERCE, Benjamin A. Genética: um enfoque conceitual. 3. ed. Guanabara Koogan, 2011.
YouTube. (2017, Julho, 02). McGraw-Hill Animations. Meselson and Stahl Experiment.
2min06seg. Disponível em: <https://www.youtube.com/watch?v=8mu6Kr3sGFY>. Acesso em: 25
out. 2018.
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