ELISA: Teste Imunoenzimático

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ELISA
SUMÁRIO
1. O que é ELISA? ...................................................................................................3
2. Como é realizado? ..............................................................................................4
3. Tipos de ELISA ...................................................................................................4
ELISA direto .................................................................................................................. 4
ELISA indireto ............................................................................................................... 6
ELISA sanduíche .......................................................................................................... 7
ELISA por competição ................................................................................................. 8
4. Comparação entre ELISA por detecção direta e indireta ...................................10
5. Qual a importância do ELISA? ..........................................................................12
Referências ..................................................................................................................... 15
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1. O QUE É ELISA?
O ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) é um teste sorológico imunoen-
zimático cuja metodologia se baseia em reações antígeno-anticorpo detectáveis 
através de reações enzimáticas. 
Existem vários modelos de ELISA, e eles envolvem testes usando anticorpos co-
mo reagentes. Imunoensaios enzimáticos como esses utilizam enzimas ligadas a 
um dos reagentes. A presença de antígenos e/ou anticorpos no espécime clínico é 
revelada pela produção de cor com a adição do substrato da enzima e de uma subs-
tância cromógena, indicando uma reação positiva. As enzimas mais comumente uti-
lizadas como marcadores nos ELISA são peroxidase e fosfatase alcalina.
 Se liga! Os testes sorológicos utilizam o soro como amostra para 
detectar a presença de anticorpos contra parasitas, fungos, bactérias ou vírus, 
indicando que o indivíduo esteve em algum momento em contato com estes 
agentes. Mas também podem detectar a presença dos antígenos, indicando 
diretamente a sua presença no organismo. 
 Saiba mais! O teste ELISA foi desenvolvido e descrito por Peter 
Perlmann e Eva Engvall na Universidade de Estocolmo, Suécia, em 1971, quan-
do demonstraram a medida quantitativa de IgG no soro de coelho utilizando a 
enzima fosfatase alcalina como marcador. Antes do surgimento do ELISA, as 
técnicas de imunoensaio usavam marcadores radioativos, o que trazia riscos 
para a saúde dos pacientes. O ELISA então surge como um método imunoen-
zimático alternativo, cuja técnica permite a análise de amostras de proteínas 
imobilizadas em poços de microplacas usando anticorpos específicos e enzi-
mas como marcadores. 
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2. COMO É REALIZADO?
Para a realização do teste imunoenzimático a técnica, em sua forma mais sim-
ples, segue o seguinte passo a passo: 
• Um reagente é conectado a uma fase sólida, geralmente uma placa de plástico 
com um formato de vários pequenos poços.
• Adição de reagentes, ou seja, do soro como amostra clínica. É nessa etapa que 
ocorre o reconhecimento de antígeno-anticorpo, caso haja especificidade. O 
anticorpo ADICIONADO É LIGADO A UMA ENZIMA. 
• Após período de incubação, a separação dos reagentes ligados e livres, que são 
adicionados subsequentemente à fase sólida, é feita por uma simples etapa de 
lavagem.
• Uma reação enzimática é utilizada para produzir cor e quantificar a reação, atra-
vés da adição do substrato específico para a enzima utilizada.
• A leitura dos resultados se faz pela medida da ação enzimática sobre substrato 
cromogênico, levando à mudança de cor da solução quando há reação antíge-
no-anticorpo, configurando um resultado positivo. 
 Se liga! Qualquer forma ou superfície disponível em uma molécula 
que possa ser reconhecida por um anticorpo constitui um determinante anti-
gênico ou epítopo. Antígenos polivalentes contêm múltiplos epítopos idênticos 
aos quais moléculas de anticorpos idênticos podem se ligar. As funções dos 
anticorpos são dependentes de sua habilidade em se ligar especificamente a 
antígenos. Devido essa ligação específica de antígeno-anticorpo, tem-se a pre-
cisão do teste ELISA.
3. TIPOS DE ELISA
ELISA direto
O ELISA direto pode ser considerado como a forma mais simples do ELISA. É 
utilizado na dosagem de anticorpo, logo, identifica se o indivíduo foi exposto à 
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determinada doença. Nessa reação, o antígeno é fixado a um suporte sólido con-
tendo vários pequenos poços onde a amostra contendo anticorpo é adicionada 
para reagir. Esse anticorpo, ligado a uma enzima é chamado de anticorpo primário. 
Nessa etapa ocorre o reconhecimento de antígeno-anticorpo e, após procedimentos 
intermediários (incubação e lavagem) há retirada dos componentes não fixados. 
Em seguida, a reação positiva é visualizada com a adição do substrato específico 
da enzima utilizada, em que ocorre mudança de cor na solução através de catálise 
enzimática. A intensidade da cor é estimada colorimetricamente e é proporcional à 
concentração do anticorpo pesquisado.
Figura 1: ELISA ou um ensaio de imunoabsorção enzimática é um teste de laboratório que usa anti-
corpos e enzimas para identificar uma substância.
Fonte: Soleil Nordic/Shutterstock.com
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ELISA indireto
O ELISA indireto é o mais amplamente empregado e também é utilizado na dosa-
gem de anticorpo. 
Neste método, a placa de microtitulação contendo vários pequenos poços é sen-
sibilizada com preparações antigênicas. A seguir, coloca-se sobre essas amostras 
de soro em teste (ex. soro humano), em diluições recomendadas pelo fabricante, 
para incubação por período preestabelecido, para permitir a reação dos anticorpos 
presentes na amostra com o antígeno fixado na microplaca. Se houver anticorpos 
no soro em teste ocorrerá a formação da ligação antígeno-anticorpo. Após lavagem 
dos poços, essa ligação é posteriormente detectada pela adição de um segundo 
anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie onde se busca detectar os an-
ticorpos. Esse anticorpo anti-imunoglobulina o qual é ligado à enzima (peroxidase, 
por exemplo) e denomina-se conjugado, ou anticorpo secundário. Esse conjugado 
antiimunoglobulina humana reage com o anticorpo capturado pelo antígeno da fase 
sólida. Após incubação e posterior lavagem para retirada dos anticorpos não ligados, 
a reação é revelada com adição do substrato específico para a enzima utilizada. Em 
casos de reações positivas, ocorre mudança de cor na solução e a intensidade da 
cor é estimada colorimetricamente, sendo proporcional à concentração do anticorpo 
pesquisado.
Figura 2: ELISA por detecção indireta.
Fonte: Soleil Nordic/Shutterstock.com
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ELISA sanduíche
A característica desse ensaio é utilizar antígenos recombinantes ou peptídeos 
sintéticos tanto na fase sólida quanto sob a forma de conjugado. Esse formato per-
mite a detecção simultânea de imunoglobulinas de diferentes classes. Para a rea-
lização da técnica do ELISA sanduíche, o antígeno específico e conhecido é fixado 
aos poços contidos em uma placa sólida à qual serão adicionados dois anticorpos 
contidos na amostra sorológica. Após procedimentos intermediários (incubação e 
lavagem) será adicionado um conjugado (anticorpo ligado à enzima). Esse complexo 
do anticorpo ligado à enzima reage com os dois primeiros anticorpos adicionados. 
Após incubação e posterior lavagem para retirada dos anticorpos não ligados, é adi-
cionada uma substância que irá reagir com a enzima, ocorrendo mudança de cor na 
solução através de catálise enzimática. 
A possibilidade de detectar anticorpos da classe IgM torna esse ensaio mais sen-
sível do que os demais para identificação da fase aguda de doenças. Além disso, há 
aumento da especificidade do exame, pois o conjugado liga-se apenas à fração livre 
do anticorpo que está no complexo imune (antígenosna fase sólida do ensaio e anti-
corpos da amostra).
Figura 3: ELISA sanduíche.
Fonte: Soleil Nordic/Shutterstock.com
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ELISA por competição
A técnica ELISA por competição é um teste em que a presença de antígenos em 
determinado soro é revelada pela competição com um antígeno marcado por um 
anticorpo específico. É utilizado principalmente quando o antígeno testado possui 
poucos epítopos de ligação ou é muito pequeno.
No método, a amostra contendo o antígeno teste e anticorpo específico é adi-
cionada à placa contendo antígeno ligado à uma enzima. Esse antígeno ligado irá 
competir com o antígeno da amostra, pois o anticorpo possui afinidade para ambos. 
Quanto maior a concentração de antígenos teste que se ligam, maior o grau de ini-
bição dos antígenos marcados. Dessa forma, o grau de competição é proporcional 
à quantidade de antígenos contidos na amostra. Como nos demais tipos de ELISA, 
após procedimentos intermediários de incubação e lavagem, com a adição do subs-
trato enzimático que irá reagir com o conjugado (neste caso, será um antígeno ligado 
a uma enzima), ocorrerá mudança de cor na solução através de catálise enzimática. 
Entretanto, a coloração aparecerá nos orifícios onde não havia ligação entre anticor-
pos e antígenos teste. Ou seja, a positividade do exame se dá pela ausência de mu-
dança de coloração.
 Saiba mais! Existem ensaios usados para quantificar as células T 
efetoras e secretoras de citocinas dentro dos tecidos linfoides. O ELISpot, outra 
forma de ELISA, é um exemplo. Nele, as células T são cultivadas em placas e à 
medida que as citocinas são secretadas das células T individuais, elas se ligam 
aos anticorpos específicos em pontos correspondentes à localização de cada 
célula. Os pontos são visualizados pela adição de uma enzima secundária liga-
da ao anticorpo, como em um ELISA padrão, e o número de pontos é contado 
para se determinar a medida do número de células secretoras de citocina. 
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MAPA MENTAL: TIPOS DE ELISA
Tipos de 
ELISA
Pesquisa de anticorpos
Pesquisa de antígenosÉ o mais usadoTécnica com maior especificidade
Utilizado quando o alvo 
possui poucos epítoposPesquisa de anticorpos
Anticorpo fica entre 
dois antígenos
Utiliza antígeno marcado 
para competir com o alvo
Utiliza anticorpos 
primário e secundário
Positividade do exame 
se dá pela mudança 
de coloração
Positividade do exame 
se dá pela mudança de 
coloração
Enzima ligada a 
antígenos recombinantes 
ou peptídeos sintéticos
Positividade do exame 
se dá pela ausência de 
mudança de coloração
Enzima ligada ao 
anticorpo secundário
Detecta diferentes 
classes de 
imunoglobulinas 
simultaneamente
Direto
Indireto
ELISpot
CompetiçãoSanduiche
Positividade do exame 
se dá pela mudança 
de coloração
É a técnica básica 
do ELISA
Utiliza apenas um 
anticorpo primário
Ensaio usado para 
quantificar as células 
T efetoras e secretoras 
de citocinas dentro dos 
tecidos linfoides
Enzima ligada ao 
anticorpo primário
Enzima secundária 
ligada ao anticorpo 
como no ELISA padrão
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4. COMPARAÇÃO ENTRE ELISA POR 
DETECÇÃO DIRETA E INDIRETA
O método de detecção direta tem como vantagens:
• Mais simples por usar apenas um anticorpo primário;
• Mais rápido porque menos etapas são usados;
• A reatividade cruzada do anticorpo secundário é eliminada.
Por outro lado, possui como desvantagens:
• A especificidade do anticorpo primário pode ser afetada adversamente pela 
ligação ao marcador (enzima);
• Não há flexibilidade na escolha do marcador de anticorpo primário de um ex-
perimento para outro.
• Amplificação mínima do sinal para a detecção. 
Já o método de detecção indireta possui como vantagens: 
Uma grande variedade de anticorpos secundários com diferentes marcadores es-
tá disponível comercialmente; 
Versátil porque muitos anticorpos primários podem ser usados no mesmo teste 
enquanto apenas um anticorpo secundário pode ser usado para detecção;
A especificidade do anticorpo primário não é afetada;
Maior sensibilidade e possibilidade de amplificação do sinal, pois o anticorpo se-
cundário pode se ligar a diferentes epítopos do anticorpo primário; 
Apresenta maior especificidade no teste por usar anticorpo secundário, tendo 
que garantir duas reações específicas para resultar em uma reação positiva com a 
mudança de coloração. 
Porém, esse método possui como desvantagens:
• Maior complexidade devido a mais uma etapa para adição do anticorpo 
secundário;
• Uma etapa de incubação extra é necessária no procedimento;
• A reatividade cruzada pode ocorrer com o anticorpo secundário, resultando em 
sinal não específico e um resultado falso-positivo. 
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MAPA MENTAL: COMPARAÇÃO ENTRE ELISA POR DETECÇÃO DIRETA E INDIRETA
ELISA
DesvantagensVantagens Vantagens Desvantagens
Menos etapas Mais etapasAmplificação mínima do sinal para a detecção Maior especificidade
Mais simples por 
usar apenas um 
anticorpo primário
Maior complexidade
Especificidade do 
anticorpo primário 
pode ser afetada
Amplificação do sinal
Ausência de reatividade 
cruzada do anticorpo 
secundário
Possibilidade de 
reatividade cruzada
Sem flexibilidade na 
escolha do marcador 
de um experimento 
para outro
Especificidade do 
anticorpo primário 
não afetada
Diferentes anticorpos 
primários podem ser 
usados no mesmo teste
Variedade de anticorpos 
secundários com 
diferentes marcadores
DIRETO INDIRETO
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5. QUAL A IMPORTÂNCIA DO ELISA?
ELISA é uma técnica imunoenzimática atualmente mais usada tanto na prática 
médica como também em pesquisa, que tem a vantagem de ser um método muito 
sensível, de fácil execução e aplicável diretamente sobre as amostras sorológicas 
coletadas e permitir rápido diagnóstico. Tem como características unir a especifi-
cidade de uma ligação antígeno-anticorpo com a sensibilidade de uma reação enzi-
mática, sendo amplamente usado para diagnóstico de várias doenças que induzem a 
produção de imunoglobulinas, como também para dosagem de antígenos. 
Dentre as patologias para as quais o ELISA é utilizado na busca do agente etioló-
gico ou pesquisa de anticorpos específicos no soro de pacientes infectados temos: 
HIV; HTLV-1 e 2; Hepatite C; Doença de Chagas; Rotavírus, entre outras. 
Além disso, os métodos imunoenzimáticos, por apresentar como vantagens a 
possibilidade de automação e alta sensibilidade, são os de escolha na triagem de 
doadores de sangue.
 Se liga! O teste ELISA pode ser padronizado para privilegiar a sen-
sibilidade ou especificidade. Essa padronização é importante quando se trata 
de investigação de doenças na triagem de doadores em banco de sangue. 
Nesse caso deve ser privilegiada a sensibilidade do teste para detectar peque-
nas quantidades de antígenos ou anticorpos no sangue dos doadores, mesmo 
que os resultados indiquem falsos–positivos, pois, esses resultados podem ser 
posteriormente confirmados por outros métodos. Dessa forma, essa conduta 
aumenta a segurança nos procedimentos de transfusão sanguínea.
No Brasil, nos hemocentros, conforme a Resolução da Diretoria Colegiada - RDC 
n° 153, de 14 de julho de 2004 da ANVISA, emprega-se como teste de triagem so-
rológica para HTLV-1 e 2 o teste de ELISA. O resultado pode ser POSITIVO (reativo); 
NEGATIVO (não reativo) ou INDETERMINADO (valor de absorbância próximo do valor 
de ponto de corre). Se for positivo, uma nova coleta deverá ser feita e a nova amostra 
é testada em duplicata. Diante da reatividade em uma ou ambas dessas duplicatas, 
deve-se realizar um teste confirmatório, o Western Blot (WB).
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MAPA MENTAL: RESUMO DO TEMA
ELISA
(Ensaio de Imunoabsorção 
Enzimática)
Indireto: Chagas e HIV.
Sanduiche: teste de gravidez 
(detecção de gonadotropina 
coriônica humana (HCG) no 
soro); 
HIV Como regra geral, o 
M1n1sténo da Saúde, através 
do Programa Nacional de 
DST/AIDS, sugere um ensaio 
imunoenzimático para teste 
de triiagem, sendo indicação 
absoluta a realização de 
testes confirmatórios,diante 
de resultado positivo.
Fazer casos clínicos com 
resultados do ELISA, 
mostrando qual é mais 
utilizado em casa doença e 
qual o padrão em cada uma 
delas (as mais relevantes).
Definição
Importância
O que pesquisa
Tipo de amostra
Tipos
Teste sorológico imunoenzimático cuja metodologia se 
baseia em reações antígeno-anticorpo detectáveis 
através de reações enzimáticas.
Por detecção direta
Antígenos e anticorpos
Sanduíche
Soro ou plasma
Por competição
Por detecção indireta
ELISpot
Diagnóstico de doenças que induzem a produção de 
imunoglobulinas, como também para dosagem de antígenos 
(HIV; HTLV-1 e 2; Hepatite C; Doença de Chagas)
1. Um reagente é conectado a uma fase sólida
2. Adição de reagentes acoplados
3. Etapas de incubação e lavagem
4. Adição do substrato da enzima
Triagem de doação de sangue/órgãos
5. Os resultados são obtidos através do desenvolvimento da cor
Peroxidase e Fosfatase alcalina
Como é realizado
Marcadores mais usados
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Agora vamos ver alguns casos clínicos para sedimentar o conteúdo e testar nos-
sos conhecimentos:
• Paciente masculino, 25 anos, compareceu ao consultório de Clínica Médica 
com queixa de febre, cansaço, aumento de linfonodos e perda ponderal. Revela 
nunca ter realizado exames sorológicos para doenças virais. Qual o tipo de 
ELISA você considera o ideal para a detecção de anticorpos contra o vírus de 
imunodeficiência humana (HIV) em sua fase aguda?
• Uma paciente feminina, com suspeita de HTLV, realizou triagem sorológica cuja 
metodologia adotada foi o ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA). 
A ordem das amostras da técnica de ELISA empregada pode ser resumida da 
seguinte forma: 1) Partículas fragmentadas do HTLV (antígeno); 2) Soro do pa-
ciente; 3) Anticorpos anti-IgG conjugados à enzima; 4) Substrato enzimático. 
Qual o tipo de ELISA usado?
RESPOSTAS: 
• O ELISA sanduíche. O Ministério da Saúde, através do Programa Nacional de 
DST/AIDS, sugere um ensaio imunoenzimático para teste de triagem, sendo 
indicação absoluta a realização de testes confirmatórios, diante de resultado 
positivo. Se tratando de um paciente em fase aguda da doença, essa técnica é 
a mais adequada para a triagem do paciente, uma vez que é possível detectar 
anticorpos anti-HIV IgM e IgG nos testes de HIV. 
• O ELISA indireto. Nessa técnica a presença de anticorpos específicos é detecta-
da por um conjugado constituído por Anticorpos anti-IgG conjugados à enzima. 
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REFERÊNCIAS 
Abbas AK, Lichtman AH, Pillai SHIV. Imunologia celular e molecular. 8. ed. Rio de 
Janeiro: Elsevier, 2015. 
Ministério da Saúde (BR). Manual Técnico para o Diagnóstico da Infecção pelo HIV 
em Adultos e Crianças. Brasília: Ministério da Saúde, 2016. 
Erichsen ES, Viana LG, Faria RMD, Santos SME. Medicina laboratorial para o clínico. 
Belo Horizonte: COOPMED, 2009. 
Crowther JR. Methods in Molecular Biology, The ELISA Guidebook. 2. ed. [S.l.]: 
Humana Press, 2009. 
Teste de ELISA, Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Medicina, Departamen-
to de Anatomia Patológica e Medicina Legal, 2000. 
Teste de ELISA, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2010.
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