Relatório Imunologia

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FAM - FACULDADE DE AMERICANA 
BIOMEDICINA 
 
 
 
 
 
RA: 20171925 NOME: Jhennyfer dos Santos Barbosa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE ESTÁGIO 
Imunologia 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Americana-SP 
2020
 
 
FAM - FACULDADE DE AMERICANA 
BIOMEDICINA 
 
 
 
 
 
RA: 20171925 NOME: Jhennyfer dos Santos Barbosa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE ESTÁGIO 
Imunologia 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Relatório de estágio, apresentado a 
disciplina de imunologia do curso de 
Biomedicina da Faculdade de Americana, 
sob orientação da supervisora Profª.Lisiery 
Negrini Paiatto. 
 
 
 
 
 
Americana-SP 
2020 
 
 
SUMÁRIO 
1. INTRODUÇÃO ................................................................................... 4 
2. DESENVOLVIMENTO ........................................................................ 7 
2.1. Métodos imunoenzimáticos usados na prática biomédica......... 7 
2.2. Testes rápidos (imunocromatográficos) usados na prática 
biomédica ........................................................................................................ 8 
2.3. Teste de aglutinação ..................................................................... 9 
2.4. Testes de Imunofluorescência e Western blot .......................... 11 
2.5. Técnicas com marcadores radioativos ...................................... 13 
2.6. PCR e PCR em tempo real........................................................... 14 
2.7. CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic 
Repeats) ......................................................................................................... 16 
2.8. Sequenciamento gênico .............................................................. 17 
3. CONCLUSÃO .................................................................................. 18 
4. REFERÊNCIAS ................................................................................ 19 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
Imunologia é o estudo do sistema imunológico, que tem como objetivo 
conhecer os princípios da resposta imunológica e os componentes pertencentes 
a ela, como esses estão envolvidos nos mecanismos de defesa do organismo, 
como pode ser realizada a análise imunológica e como as alterações do sistema 
imunológico são capazes de gerar doenças (FORTE, 2015), sendo a principal 
função prevenir infecções e erradicar infecções estabelecidas (ABBAS; 
LICHTMAN; PILLAI, 2014). 
Técnicas laboratoriais em imunologia auxiliam no diagnóstico de inúmeras 
doenças, buscando relacionar a presença e interação de diversos componentes 
celulares e moleculares, levando assim a melhor compreensão da imunologia 
como ciência (MINEO et al., 2016). 
Exames laboratoriais para confirmação da hipótese, precisam contar com 
testes de alta sensibilidade e alta especificidade (GUIMARÃES, 1985). 
 A sensibilidade é a capacidade que um teste tem de determinar, dentre 
os suspeitos de uma patologia, aqueles de fato doentes, portanto é realizado 
uma amostragem avaliando o número de suspeitos com diagnósticos evolvendo 
demonstração do agente etiológico, como em caso de doenças parasitárias, a 
porcentagem de positivos obtidos são chamados de sensibilidade, definida como 
positividade na doença (GUIMARÃES, 1985). 
 Já a especificidade, a amostragem utilizada é de indivíduos que não a 
doença, sua ausência está definida por um diagnóstico de certeza. Sendo assim, 
é a a capacidade que um mesmo teste tem de ser negativo, os suspeitos não 
apresentam a doença (GUIMARÃES, 1985). 
 A validade de um teste clínico adotado, diz respeito à extensão com que 
ele pode predizer se o indivíduo está doente ou não. Valor Preditivo (VP), que 
diz se o teste apresentou resultado positivo ou negativo e a probabilidade do 
indivíduo estar realmente doente ou sadio, e pode ser classificado em positivo 
(VPP) ou negativo (VPN) (REIS; REIS, 2009), sendo que o VPP expressa a 
probabilidade de um indivíduo avaliado e com resultado positivo ser realmente 
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doente e o VPP expressa a probabilidade de um indivíduo avaliado e com 
resultado negativo ser realmente livre da doença (KAWAMURA, 2002). 
 Determinado por três variáveis, sensibilidade, especificidade do teste, e 
prevalência da doença na população (REIS; REIS, 2009). Quanto mais sensível 
um teste, maior seu VPN, quanto mais específico um teste, maior seu VPP e 
quanto maior a prevalência maior o VPP e menor o VPN (BUCHALLA, 2017). 
 Se faz necessário o entendimento da utilização clínica de cada um na 
realização de um teste, o VPP é indicado para diagnóstico de doença, como em 
exames de rastreamento, por possuir alta especificidade, sendo assim o mais 
indicado. Já o VPN é indicado em casos de possível progressão da doença, por 
ter alta sensibilidade (SBOC, 2011). 
 Afinidade de interação é a força que a superfície de ligação de um 
antígeno se liga a um epítopo de um antígeno. As moléculas de anticorpo IgG, 
IgD e IgE apresentam dois sítios de ligação de antígeno, sendo que a IgA possui 
quatro sítios de ligação ao antígeno por ser um dímero, e a IgM 10 sítios de 
ligação por ser um pentâmero. Cada molécula anticorpo tem capacidade de 
poder ligar de 2 a 10 epítopos de um antígeno, ou epítopos em 2 ou mais 
antígenos próximos. A ligação possui uma força total maior que a afinidade de 
um antígeno ligado a um anticorpo, denominado de avidez de uma interação 
(ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2014). 
 A especificidade é necessária para que anticorpos gerados em resposta 
aos antígenos de um microrganismo não reajam com as próprias moléculas com 
estruturas similares ou com os antígenos de outros microrganismos (ABBAS; 
LICHTMAN; PILLAI, 2015). Anticorpos produzidos contra um antígeno podem 
ligar outros antígenos estruturalmente similares (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 
2014). A ligação a epítopos similares denomina-se reação cruzada, que ocorre 
quando há epítopos iguais ou muito semelhantes em antígenos diferentes. Os 
anticorpos formados contra os epítopos de um antígeno poderão reagir contra 
os epítopos iguais ou semelhantes de outro antígeno (FORTE, 2015). 
 Teste de reação cruzada de triagem é realizado para minimizar as 
chances de rejeição do enxerto, onde o teste consiste em misturar o soro do 
receptor com leucócitos de doadores potenciais, acrescentando complemento, e 
6 
 
observando se ocorrerá a lise celular, indicando se há anticorpos pré-formados 
contra antígenos da superfície celular do doador (normalmente antígenos do 
MHC) (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2014). 
 Diante de um antígeno são produzidos anticorpos com diferenças entre 
si, resultantes de diferentes clones de células B. Designado anticorpos 
monoclonais aqueles iguais entre si proveniente de um único clone de linfócito B 
(FORTE, 2015). 
 A produção de anticorpos monoclonais é realizada a partir de células B de 
um animal, geralmente camundongos, que são sensibilizados com o antígeno 
para o qual se deseja uma resposta imunológica (FORTE, 2015), e são fundidas 
com células de mielomas (tumores de plasmócitos), que podem ser propagadas 
indefinidamente em cultura de tecido (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2014). 
 A fusão de duas populações celulares é selecionada por meio da cultura 
com fármacos, onde a linha celular de mieloma é incapaz de crescer na presença 
de determinado fármaco por necessitar de uma enzima específica, já as células 
fundidas, compostas tanto pelo mieloma quanto pelos núcleos de células B, 
fornecem a enzima que falta, sendo capaz de crescer na presença do fármaco. 
Sendo possível o crescimento de apenas células fundidas derivadas de células 
B e de mielomas, que são chamadas de célula híbrida (ABBAS; LICHTMAN; 
PILLAI, 2014), que é tratada em meios de cultura, dando início, após alguns dias, 
à síntese de anticorpos monoclonais resultante desse único clone celular 
produzido (FORTE, 2015), sendo possível selecionar e expandir células que 
crescemcontinuamente e que secretam o anticorpo com a especificidade 
desejada, possibilitando fazer anticorpos monoclonais contra praticamente 
qualquer antígeno (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2014). Por isso anticorpos 
monoclonais têm inúmeras aplicações práticas na pesquisa e diagnóstico 
médicos e na terapia (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015). 
 
 
 
 
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2. DESENVOLVIMENTO 
2.1. Métodos imunoenzimáticos usados na prática biomédica 
 O Ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) é um método de 
análise quantitativa de um antígeno imobilizado em uma superfície sólida pelo 
uso de um anticorpo específico com uma enzima covalentemente acoplada, ou 
seja, uma interação antígeno-anticorpo que é detectável por meio de uma reação 
enzimática, que é determinada pela medição espectrofotométrica da conversão 
de um substrato claro para um produto colorido pela enzima associada (ABBAS; 
LICHTMAN; PILLAI, 2014). 
 É utilizado em diversos tipos de amostra biológicas para pesquisa de 
antígenos ou anticorpos específicos de determinado antígeno. Existem vários 
modelos de testes de ELISA, os mais comuns são o direto, indireto e o sanduiche 
(MINEO et al., 2016). 
 O ELISA Direto é uma técnica para detecção de antígenos, baseada na 
competição entre o antígeno da amostra e o antígeno marcado com enzima pelo 
anticorpo (BENDER; VON MÜHLEN, 2008), pode ser utilizado para o diagnóstico 
da hepatite B (MINEO et al., 2016). 
 No ELISA indireto as placas de microtitulação são sensibilizadas com 
antígeno equivalente ao anticorpo alvo. Para a retirada do excesso de antígeno 
não ligado as placas são lavadas, e, em seguida, é feito o bloqueio de sítios 
inespecíficos através da incubação de uma solução proteica que preencherá os 
espaços vazios dos poços não tomados pelo reagente da sensibilização. A 
solução de bloqueio a ser utilizada pode ser em concentrações padronizadas do 
tipo leite desnatado, caseína, albumina sérica bovina (BSA), soro fetal bovino 
(SFB) e gelatina (MINEO et al., 2016). 
 Na comparência de anticorpos no soro em teste ocorrerá a formação do 
complexo antígeno-anticorpo, que subsequentemente é constatada pela adição 
de um segundo anticorpo administrado contra imunoglobulinas da espécie onde 
se busca identificar os anticorpos (no caso anticorpos humanos), a qual é ligada 
à peroxidase. Denomina-se conjugado o anticorpo anti-IgG, ligado à enzima. Ao 
incorporar o substrato adequado à enzima (H2O2) e cromógeno, ocorre a 
acatlização da enzima resultando na coloração da reação. A reação enzimática 
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é proporcional à concentração de antígeno ou de anticorpo ligado e mensurado 
por espectrofotômetro. A coloração do produto da reação de uma curva-padrão 
conhecida pode ser utilizada para determinar a concentração do anticorpo 
presente na amostra (MINEO et al., 2016). 
 Aids, toxoplasmose, doença de Chagas e dengue são uns dos exemplos 
de doenças que podem ser diagnosticadas através da detecção de anticorpos 
em uma amostra por ELISA indireto (MINEO et al., 2016). 
 No ELISA sanduíche placas de microtitulação são sensibilizadas com 
anticorpo específico, lavada e bloqueadas. Em seguida, adiciona-se a amostra 
teste com o antígeno de interesse, posteriormente o conjugado, a enzima e 
cromógeno, e pôr fim a solução stop, que é uma solução ácida. Assim como no 
teste ELISA indireto a coloração do produto da reação de uma curva-padrão 
conhecida pode ser utilizada para determinar a concentração do anticorpo 
presente na amostra (MINEO et al., 2016). 
 Esse teste detecta o antígeno em amostra teste, usado para dosagem de 
hormônios, proteínas séricas, citocinas, antígenos tumorais, etc (MINEO et al., 
2016). 
2.2. Testes rápidos (imunocromatográficos) usados na prática biomédica 
 
O teste rápido conhecido também como imunocromatográfico, é 
composto pelo filtro de amostra, suporte do conjugado, membrana de 
nitrocelulose e filtro de adsorção. As partes se sobrepõem uma sobre a outra e 
são montadas sobre uma placa de suporte (JAPOLLA et al., 2015). Contém em 
cada trecho antígenos específicos, que reagem ao sangue coletado para o 
exame, indicando ou não a existência de doenças (VIEIRA, 2007). 
É uma ferramenta muito utilizada para diagnosticar diversas doenças, 
devido suas vantagens de detectar anticorpos ou antígenos, rapidez no 
resultado, custo de fabricação relativamente baixo, facilidade de produção em 
grande escala, grande prazo de validade, sem necessidade de recursos 
tecnológicos para leitura e utilização de pequenos volumes de amostras 
(JAPOLLA et al., 2015). 
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O mercado apresenta diversos tipos de testes e a escolha do melhor 
formato está relacionada aos objetivos pretendidos, como o tipo de material a 
ser identificado, tais como antígenos, anticorpos ou qualquer outro material 
biológico ou químico (JAPOLLA et al., 2015). 
É utilizado para detecção qualitativa rápida de anticorpos-Hiv-1/2/0 em 
amostra de soro, plasma ou sangue total, utilizando antígenos recombinantes do 
vírus, com elevada sensibilidade e especificidade. Consiste em uma membrana 
com antígenos recombinantes de HIV-1/0 e HIV-2 (gp41 e gp36) imobilizados na 
linha teste e um anticorpo anti-IgG imobilizado na linha controle. A amostra é 
colocada para reagir com um conjugado de compostos de partículas de ouro 
coloidal marcadas com antígenos recombinantes de HIV-1/2/0 e partículas de 
ouro coloidal marcados com IgG. Com a adição da solução diluente, a mistura 
amostra-conjugado se move cromatograficamente na membrana por ação 
capilar. Quando ocorre a formação de duas linhas horizontais coloridas significa 
que o teste é positivo, caso haja apenas a formação de uma linha na posição 
controle indica que o teste é negativo, a ausência da mesma indica que o teste 
não processou adequadamente e deve ser repetido (LABTEST DIAGNÓSTICA 
S.A., 2012). 
Pode detectar também anticorpos anti-HBsAg que presentes na amostra 
ligam-se ao conjugado HBsAgouro coloidal, formando um complexo antígeno-
anticorpo. Este flui pela área de reação da placa/tira-teste indo se ligar aos 
antígenos HBsAg presentes na região da área teste, determinando o 
aparecimento de uma banda colorida. A mistura da reação continua a fluir pela 
membrana atingindo a área controle. Seu resultado se mostra da mesma forma 
do teste rápido de HIV onde a formação de duas linhas horizontais coloridas 
significa que o teste é positivo, a formação de uma linha na posição controle 
indica que o teste é negativo e a ausência da mesma indica que o teste não 
processou adequadamente e deve ser repetido (WAMA DIAGNÓSTICA, 2011). 
2.3. Teste de aglutinação 
 
 A ligação cruzada com produção de agregados ocorre quando um 
anticorpo reage com um antígeno multivalente presente em uma partícula 
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insolúvel (BENDER; VON MÜHLEN, 2008). A aglutinação pode ocorrer tanto 
com partículas de um insolúvel nativo, antígenos expressos em células 
(antígenos eritrocitários) ou partículas cobertas com antígenos (partículas de 
látex) (BENDER; VON MÜHLEN, 2008), ou mesmo com células antigenicamente 
não relacionadas (hemácias, bactérias) às quais se adsorvem ou fixam 
antígenos solúveis (MINEO et al., 2016). As reações de aglutinação têm boa 
sensibilidade e podem ser analisadas a olho nu, no entanto são mais sujeitas a 
resultados falso-positivos devido à aglutinação inespecífica (BENDER; VON 
MÜHLEN, 2008). 
 A aglutinação se dá pelos anticorpos serem pelo menos bivalentes, ou 
seja, têm pelo menos dois sítios Fab de interação com o antígeno. Os dois sítios 
na imunoglobulina e os múltiplos sítios no antígeno resultam na malha antígeno-
anticorpo (MINEO et al., 2016). 
 Reações de aglutinação são muito utilizadas no diagnóstico laboratorial 
de patologias causadas por bactérias, protozoários, vírus e fungos, doenças 
autoimunes, na tipagem de grupos sanguíneos, na detecção de hormônios, etc. 
E as reações de aglutinação podem ser do tipo diretasou indiretas (MINEO et 
al., 2016). 
 Na reação de aglutinação direta ou ativa utilizam partículas antigênicas 
insolúveis como, hemácias, bactérias, fungos e protozoários, em sua forma 
íntegra ou fragmentada podem ser aglutinados diretamente por anticorpo 
(MINEO et al., 2016). São realizadas diluições em série do anticorpo diante a 
uma quantidade constante do antígeno. A aglutinação se completa após um 
período de incubação e o resultado é geralmente expresso como a máxima 
diluição em que ocorre a aglutinação (BENDER; VON MÜHLEN, 2008). 
 A tipagem sanguínea (antígenos específicos) é um bom exemplo de 
reação de aglutinação direta (BENDER; VON MÜHLEN, 2008), hemácias 
têm antígenos em sua superfície, os dois principais são chamados A e B, e o 
sangue é classificado de acordo com a presença ou ausência desses antígenos. 
Nosso sistema imunológico produz naturalmente anticorpos contra antígenos A 
e B que não temos em nossas hemácias. Através da técnica de aglutinação 
https://labtestsonline.org.br/glossary/antigen
https://labtestsonline.org.br/glossary/antibody
11 
 
verifica-se a presença/ausência de antígenos e anticorpos do sistema ABO (LAB 
TESTS, 2012). 
 Já nas reações de aglutinação passiva ou indireta, as hemácias e as 
partículas inertes como a bentonita, látex, sepharose, leveduras e gelatina 
podem ser sensibilizadas por adsorção passiva. Que pode ser realizado através 
de contato direto com antígenos solúveis, por adsorção via agentes químicos 
solúveis, por adsorção com agentes químicos, como o ácido tânico ou cloreto de 
cromo e por conjugação através de ligações químicas covalentes. Os processos 
de adsorção fornecem reagentes estáveis. Devido à grande diversidade de 
antígenos que podem se ligar às células ou partículas, a aplicação dos testes de 
aglutinação passiva é muito variada (BENDER; VON MÜHLEN, 2008). 
 A aglutinação indireta é utilizada para diagnóstico de Artrite Reumatoide, 
o teste baseia-se na aglutinação das partículas de látex sensibilizadas com 
gama-globulina humana (antígeno), quando misturadas com soro de pacientes 
contendo fatores reumatoides (FR), envolvendo assim uma reação antígeno-
anticorpo com leitura por visualização direta da aglutinação formada (MACEDO 
et al., 2016). 
2.4. Testes de Imunofluorescência e Western blot 
Imunofluorescência Técnica na qual uma molécula é detectada pelo uso 
de um anticorpo marcado com um indicador fluorescente (ABBAS; LICHTMAN; 
PILLAI, 2015). É útil para quantidades pequenas do elemento a ser identificado. 
São acrescentados corantes fluorescentes como a fluoresceína para que a 
reação antígeno-anticorpo se torne visível, observando-se a luz emitida. A 
reação de imunofluorescência pode ser direta ou indireta, conforme se pesquise 
antígeno ou anticorpo (FORTE, 2015). 
 A reação de imunofluorescência direta é a detecção como o próprio 
nome diz direta de antígenos usando anticorpo antígeno-específico delimitado 
com substância fluorescente (BENDER; VON MÜHLEN, 2008). Identifica-se o 
antígeno com base em quantidades conhecidas de anticorpos. A fluoresceína é 
associada à anti-imunoglobulina, e os resultados dependem quantidade da 
reação antígeno-anticorpo associados a ela, medindo-se a luz emitida pela 
fluoresceína na presença de luz ultravioleta (FORTE, 2015). É uma técnica 
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ocasionalmente quantitativa por ser utilizada para detectar antígenos em tecidos 
biológicos. É muito utilizada diagnóstico de vírus respiratórios com influenza, 
parainfluenza, vírus sincicial respiratório e adenovírus (BENDER; VON 
MÜHLEN, 2008). 
 No teste de imunofluorescência indireta o anticorpo presente na amostra 
reage com um antígeno específico fixado em uma lâmina de microscopia. 
realizado uma lavagem e um conjugado marcado com substância fluorescente é 
adicionado. Após uma segunda lavagem, para remover o conjugado não ligado, 
a observação de fluorescência ao microscópio é indicativa da presença do 
anticorpo em estudo na amostra. O conjugado é isotipo-específico, sendo assim 
possível distinguir reações condicionadas pela presença de IgG, IgA e IgM 
(BENDER; VON MÜHLEN, 2008). 
 A imunofluorescência indireta é o teste de referência na sorologia de 
muitas doenças, como as infecciosas e auto-imunes e no diagnóstico de 
infecções pelo Treponema pallidum, Tripanosoma cruzi, para as diversas 
Chlamydiae, entre outros (BENDER; VON MÜHLEN, 2008). 
 Western blot, também conhecido como Immunoblot, é uma técnica 
analítica na qual anticorpos são usados para detectar a presença de um antígeno 
ligado a uma matriz sólida, como papel de filtro (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 
2015). É um procedimento em que as proteínas são separadas pelo tamanho 
por eletroforese e, após separação, transferidas para uma membrana de 
nitrocelulose onde ficam imobilizadas (BENDER; VON MÜHLEN, 2008). 
 É uma técnica imunológica usada para determinar a presença de uma 
proteína em amostra biológica. A mistura é submetida à separação analítica, 
tipicamente por SDS-PAGE, de forma em que o posicionamento final de 
diferentes proteínas no gel ocorra em função de seus tamanhos moleculares. A 
matriz de proteínas separadas é transferida do gel de separação para um suporte 
de membrana por eletroforese, de maneira que a membrana adquire uma réplica 
do padrão das macromoléculas presentes no gel. O SDS é deslocado da 
proteína durante o processo de transferência, e os determinantes antigênicos 
nativos são frequentemente recuperados como dobras das proteínas. A posição 
do antígeno proteico na membrana pode, então, ser detectada com a ligação de 
um anticorpo não marcado específico para aquela proteína (o anticorpo primário) 
13 
 
seguido por um anticorpo secundário marcado e que se liga ao anticorpo 
primário. Este procedimento fornece informações sobre o tamanho do antígeno 
e sua quantidade (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015). 
 Este teste, pode determinar se há antígeno ou anticorpo na amostra bem 
com a sua especificidade, se o preparado é puro ou não, quais proteínas estão 
sendo reconhecidas pelo anticorpo, diferenciar perfis de anticorpos conforme a 
fase da doença ou infecção ou, em relação a presença ou não de infecção, 
distinguir entre cepas patogênicas e não patogênicas. Pode ser empregada para 
a pesquisa de antígenos ou de anticorpos, sendo um importante auxiliar no 
diagnóstico de doenças infecciosas e auto-imunes (BENDER; VON MÜHLEN, 
2008), como na confirmação de HIV (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2014). 
2.5. Técnicas com marcadores radioativos 
As técnicas com marcadores radioativos utilizam um reagente marcado, 
antígeno ou anticorpo, para quantificar o antígeno ou o anticorpo da amostra. 
Assim o composto desconhecido pode ser determinado pela medida da 
radioatividade emitida. Quando o componente marcado é o antígeno o ensaio 
denominasse radioimunoensaio e quando o componente marcado é o anticorpo 
ensaio imunorradiométrico (BENDER; VON MÜHLEN, 2008). 
O radioimunoensaio é uma metodologia de quantificação, que se soma às 
técnicas biológicas, químicas e físicas empregadas na dosagem de substâncias 
de importância biológica (MANTOVANI et al., 2011). Método imunológico 
altamente sensível e específico de quantificação da concentração de um 
antígeno em uma solução que depende de um anticorpo marcado 
radioativamente e específico para um antígeno (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 
2015). 
Há quatro componentes básicos que são fundamentais na 
radioimunoensaio, a substância a ser medida, a substância purificada e 
sinalizada com radioisótopo, da mesma categoria química que a substância a 
ser quantificada, tida como traçador, o anticorpo específico com grande afinidade 
pela substância a ser medida e processos de separação do complexo antígeno-
anticorpo do traçador livre (MANTOVANI et al., 2011). 
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Tem como princípio a competição entre a substância não-marcada e o 
traçador, pelo sítio de interação com o anticorpo (MANTOVANI etal., 2011). São 
utilizados dois anticorpos específicos para o antígeno. O primeiro anticorpo não 
está marcado, mas ligado a um suporte sólido, onde ele se liga e imobiliza o 
antígeno cuja concentração é determinada (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015). 
As concentrações do traçador e do primeiro anticorpo permanecem constantes 
em todos os tubos de uma mesma análise e só a quantidade da substância a ser 
medida é variável (padrão ou amostra) (MANTOVANI et al., 2011). A quantidade 
do segundo anticorpo, marcado, que se liga ao antígeno imobilizado, como 
determinado pelos detectores radioativos, é proporcional à concentração de 
antígeno na solução em teste (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015). No estado de 
equilíbrio, haverá complexos formados pelo anticorpo com a substância não-
marcada, complexos entre o anticorpo e o traçador, sendo possível separá-los 
da substância não marcada e traçador livres, e determinar a radioatividade dos 
complexos (MANTOVANI et al., 2011). 
Técnica utilizada na medição de hormônios e súbstâncias presentes nos 
fluídos corpóreos como drogas, enximas e hormônios (MALLMANN, 2003). 
Já o ensaio imunoradiométrico é uma técnica alternativa ao 
radioimunoensaio onde os anticorpos monoespecíficos radiomarcados são 
empregados a quantificação do antígeno. O sistema sanduiche de dois sítios é 
manipulado, onde o antígeno é capturado pelo anticorpo da fase sólida que 
reage com o anticorpo marcado. A quantidade de a radioatividade e a quantidade 
de antígeno na amostra são proporcionais. Paralelamente, são ensaiadas 
diluições seriadas da amostra padrão. Comparado ao radioimunoensaio de 
competição, o IRMA tem menos tempo de incubação, maior precisão e 
sensibilidade (MALLMANN, 2003). 
2.6. PCR e PCR em tempo real 
A reação em cadeia de polimerase (PCR, do inglês polimerase chain 
reaction) é um método rápido de se copiar e amplificar sequências específicas 
de DNA. Revolucionando as técnicas de genética molecular, por isso é 
amplamente usado como técnica preparativa e analítica em todas as áreas da 
biologia molecular (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015). 
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A PCR se compreende em 3 etapas, na primeira etapa ocorre a 
desnaturação do DNA gnômico contendo a sequência a ser amplificada, ou seja, 
ocorre a separação da dupla fita de DNA. A segunda fase compreende a 
hibridização, onde os primers se ligam a fita de DNA que será amplificada, sendo 
um deles complementar à sequência em uma fita dupla-hélice de DNA e o outro 
complementar à sequência na outra fita. São eles que irão identificar qual trecho 
de interesse do DNA deverá ser copiado. A terceira e ultima fase é a 
polimerização, onde a TAq polimerase se liga a fita sinalizada pelo primer, assim 
complementando-a, iniciando-se a extensão do novo fragmento de DNA, 
originando novamente uma fita dupla de DNA (KASVI, 2017). 
Esse processo é realizado inúmeras vezes até milhões de cópias serem 
produzidas. Na PCR convencional, a detecção do produto de amplificação é feita 
em eletroforese em gel de agarose. Após a coloração, ocorre a visualização do 
DNA pesquisado (KASVI, 2017). 
O teste da PCR é comumente aplicado no monitoramento de doenças 
como a artrite reumatóide e febre reumática aguda (LABORCLIN, 2004), 
identificação genética, medicina forense, análises clínicas, diagnóstico de 
doenças, controle de qualidade industrial, entre outros (KASVI, 2017). 
A tecnologia de PCR em Tempo Real (qPCR) é uma evolução do método 
de PCR (KASVI, 2017), que permite a quantificação dos produtos de 
amplificação gênica em todas as fases de uma reação de PCR (ALMEIDA; 
SADDI, 2007). Se baseia na duplicação de cadeias de DNA “in vitro” que pode 
ser repetida diversas vezes, gerando quantidade de DNA suficiente para realizar 
diversas análises. Com um único fragmento de DNA é possível reproduzir 
milhões de cópias (KASVI, 2017). 
 Durante a qPCR, a amplificação é detectada em "tempo real", para cada 
ciclo da reação, por meio da excitação de fluorocromos que marcam sondas 
sequência-específicas ou primers usados na reação (ALMEIDA; SADDI, 2007), 
dispensando a eletroforese. Isto é possível pela adição de sondas fluorescentes 
às reações de PCR. À medida em que o DNA é amplificado, o nível de 
fluorescência cresce proporcionalmente. O equipamento é capaz de detectar a 
fluorescência eventualmente produzida pela amostra e assim a técnica permite 
acompanhar a reação e a apresentação dos resultados em tempo real. Além 
16 
 
disso, é possível determinar com precisão a quantidade de DNA-alvo presente 
na amostra original (KASVI, 2017). 
A qPCR pode ser utilizada para se avaliar a presença de um patógeno em 
uma amostra, podendo ser um teste qualitativo ou quantitativo, sendo mais 
sensíveis, específicos e rápidos, principalmente quando comparados aos testes 
convencionais, levando de 2 a 3 horas para emitir o resultado (KASVI, 2017). 
É utilizado para detecção de patógenos, identificando infecções virais e 
bacterianas, independente de isolamento ou crescimento do patógeno ou da 
detecção de uma resposta imune contra o agente. Diagnóstico de dengue, 
infecções respiratórias, ISTs, meningites, doenças genéticas, e na oncologia 
para identificação do cromossomo Philadeplhia (KASVI, 2017). 
2.7. CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 
O Sistema CRISPR é uma nova abordagem para gerar mutações nas 
linhagens celulares (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015), possibilita a edição do 
genoma através de clivagem do DNA por uma endonuclease (Cas9), guiada a 
partir de uma sequência de RNA, que é capaz de se parear com as bases de 
uma sequência-alvo (AREND; PEREIRA; MARKOSKI, 2017), corrigindo assim 
“falhas” genéticas ou inserindo caracteres benéficos em um determinado 
organismo (VASCONCELOS; FIGUEIREDO, 2015). 
A constituição genética do CRISPR, no sistema bacteriano, é constituída 
de repetições palindrômicas curtas, agrupadas e interespaçadas. As repetições 
e os espaçadores, quando transcritos, formam o RNA transativador, que vai 
direcionar enzima Cas9 ao alvo. Aproveitando-se desta estratégia, tanto a 
proteína Cas9 quanto o RNA guia, podem ser introduzidos in vitro em outras 
células e direcionados a locais específicos do genoma, gerando quebras na fita 
dupla (AREND; PEREIRA; MARKOSKI, 2017). A cotransfecção do plasmídeo 
com a versão mutada da sequência-alvo permite uma recombinação homóloga 
eficiente (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015), através da alteração sequência de 
DNA, adotando a modificação levando a correção de erros no genoma. Assim, o 
sistema pode ser utilizado para reparar mutações (restaurando a função gênica) 
e também para introduzir mutações novas (causando o "nocaute" gênico) 
(AREND; PEREIRA; MARKOSKI, 2017). 
17 
 
2.8. Sequenciamento gênico 
 O sequenciamento gênico é o processo realizado para determinar a 
sequência exata de nucleotídeos em uma molécula de DNA. Essa sequência é 
a base para o conhecimento de um gene ou genoma. Ela contém as informações 
sobre as propriedades hereditárias e bioquímicas da vida (BIOMETRIX 
DIAGNÓSTICA, 2018). 
 É possível determinar rapidamente uma sequência completa de um 
genoma humano, e os pesquisadores são capazes de comparar grandes 
extensões de DNA de indivíduos diferentes, com mais agilidade (BIOMETRIX 
DIAGNÓSTICA, 2018). 
 Essas comparações são capazes de gerar vastas informações sobre o 
papel da herança na suscetibilidade a doenças e em resposta a influências 
ambientais, tendo grande potencial para diagnósticos e terapias (BIOMETRIX 
DIAGNÓSTICA, 2018). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
18 
 
3. CONCLUSÃO 
A aplicação de cada teste na biomedicina apresenta benefícios, os testes 
rápidos apresentam rapidez na obtenção dos resultados, permitindo uma rápida 
triagem, facilitando o acesso a cuidados, aconselhamento, tratamentos e 
resultados para os pacientes. Os testes sorológicos desempenham papel 
fundamental na patologia clínicacomo auxiliares no diagnóstico de uma suspeita 
clínica principal e é principalmente utilizado na seleção de doadores de sangue. 
O teste de Western blot apresenta alta especificidade, desse modo, é usado 
para confirmar um resultado positivo obtido por um teste de triagem. O teste 
ELISA é uma técnica imunoenzimática altamente sensível utilizada na triagem, 
possui alta precisão quando os reagentes e os parâmetros estão devidamente 
padronizados, sendo capaz de detectar quantidades extremamente pequenas 
de antígenos ou anticorpos. O CRISPR e o sequenciamento gênico são testes 
promissores para detecção de doenças, sendo considerados como técnicas 
revolucionárias devendo ser aprimoradas com base nos conhecimentos já 
adquiridos para sua total eficácia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
19 
 
4. REFERÊNCIAS 
ABBAS, Abul K.; LICHTMAN, Andrew H.; PILLAI, Shiv. Imunologia Básica: 
Funções e Distúrbios do Sistema Imunológico. 4. ed. [S. l.]: Elsevier Editora Ltda, 
2014. 539 p. 
ABBAS, Abul K.; LICHTMAN, Andrew; PILLAI, Shiv. Imunologia Celular e 
Molecular. 8. ed. [S. l.]: Elsevier Editora Ltda, 2015. 549 p. 
ALMEIDA, Priscilla S. R.; SADDI, Vera Aparecida. Monitoramento de doença 
residual mínima em leucemia mielóide crônica por PCR em tempo real. São 
José do Rio Preto, v. 29, n. 4, p. 382-386, out/dez 2007. Disponível em: 
https://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1516-
84842007000400012&script=sci_arttext&tlng=pt. Acesso em: 13 out. 2020. 
AREND, Marcela Corso; PEREIRA, Jessica Olivaes; MARKOSKI, Melissa 
Medeiros. O Sistema CRISPR/Cas9 e a Possibilidade de Edição Genômica para 
a Cardiologia. São Paulo, v. 108, n. 1, p. 81-83, jan. 2017. Disponível em: 
https://www.scielo.br/pdf/abc/v108n1/pt_0066-782X-abc-108-01-0081.pdf. 
Acesso em: 18 out. 2020. 
BENDER, Ana Lígia; von Muhlen, CA. Testes laboratoriais aplicados à 
imunologia clínica. Imunologia Clínica na Prática Médica.: , 2008, v. , p. -. 
BIOMETRIX DIAGNÓSTICA (PR). Sequenciamento de DNA: Desvendando o 
código da vida. In: BIOMETRIX DIAGNÓSTICA (PR). Sequenciamento de DNA: 
Desvendando o código da vida. Curitiba, 18 maio 2018. Disponível em: 
https://www.biometrix.com.br/sequenciamento-dna-desvendando-codigo-da-
vida/. Acesso em: 18 out. 2020. 
BUCHALLA, Cassia Maria. Testes Diagnósticos. [S. l.], 2017. Disponível em: 
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/3036063/mod_resource/content/1/Aula
%203%20Testes%20Diagnosticos.pdf. Acesso em: 24 set. 2020. 
FORTE, Wilma Carvalho Neves. Imunologia do básico ao aplicado. 3. ed. [S. l.]: 
Atheneu, 2015. 361 p. 
GUIMARÃES, M. Carolina S. EXAMES DE LABORATÓRIO: SENSIBILIDADE, 
ESPECIFICIDADE, VALOR PREDITIVO POSITIVO. [S. l.], p. 117-120, abr/jun. 
1985. Disponível em: 
20 
 
http://www.soupro.com.br/nnce/Arquivos/Aulas/bioestatistica/6-
sensibilidade_especificidade-suplementar.pdf. Acesso em: 24 set. 2020. 
JAPOLLA, Greice et al. TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO DE FLUXO 
LATERA: UMA FERRAMENTA RÁPIDA DE DIAGNÓSTICO. Goiânia, v. 11, n. 
22, p. 26-49, 1 dez. 2015. Disponível em: 
https://www.researchgate.net/publication/285746907_TESTE_IMUNOCROMAT
OGRAFICO_DE_FLUXO_LATERAL_UMA_FERRAMENTA_RAPIDA_DE_DIA
GNOSTICO. Acesso em: 13 out. 2020. 
KASVI (PR). PCR em Tempo Real (qPCR): Aplicação no diagnóstico de 
Doenças. In: KASVI (PR). PCR em Tempo Real (qPCR): Aplicação no 
diagnóstico de Doenças. São José dos Pinhais, 1 set. 2017. Disponível em: 
https://kasvi.com.br/pcr-em-tempo-real-qpcr-diagnostico-doencas/. Acesso em: 
13 out. 2020. 
KAWAMURA, Takao. Interpretação de um Teste sob a Visão Epidemiológica: 
Eficiência de um Teste. Interpretação de um Teste sob a Visão Epidemiológica., 
Araçatuba, v. 79, n. 4, p. 437-441, 2002. Disponível em: 
https://www.scielo.br/pdf/abc/v79n4/12718.pdf. Acesso em: 24 set. 2020. 
LAB TESTS. Tipagem sanguínea. In: LAB TESTS. Tipagem sanguínea. [S. l.], 
11 out. 2012. Disponível em: https://labtestsonline.org.br/tests/tipagem-
sanguinea. Acesso em: 13 out. 2020. 
LABORCLIN (PR). PCR - PROTEÍNA C-REATIVA L/B. Pinhais: [s. n.], 2004. 2 
p. Disponível em: 
https://www.interlabdist.com.br/dados/produtos/bula/doc/456048cfb81fea5b4.pd
f. Acesso em: 13 out. 2020. 
LABTEST DIAGNÓSTICA S.A. (Minas Gerais). HIV: Instruções de uso. Lagoa 
Santa: [s. n.], 2012. 4 p. Disponível em: https://labtest.com.br/wp-
content/uploads/2016/09/Ref_110_RevJulho2012_Ref240717_Port.pdf. Acesso 
em: 13 out. 2020. 
MACEDO, Isabella Barony et al. ANALISANDO. Artrite Reumatoide e Fator 
Reumatoide, Belo Horizonte, n. 19, p. 1-4, 27 jan. 2016. Disponível em: 
http://www.goldanalisa.com.br/exibe_noticia.asp?id=113. Acesso em: 13 out. 
2020. 
21 
 
MALLMANN, Giovanni Mateus. Métodos de dosagem de hormônios. [S. l.], p. 1-
15, 2003. Disponível em: https://www.ufrgs.br/lacvet/restrito/pdf/hormonios.pdf. 
Acesso em: 24 out. 2020. 
MANTOVANI, Milene et al. PADRONIZAÇÃO DO RADIOIMUNOENSAIO (RIE) 
PARA DOSAGEM DE ANGIOTENSINA II (ANG-II) E SUA VALIDAÇÃO 
METODOLÓGICA. Ribeirão Preto, p. 1-13, 2011. Disponível em: 
https://inis.iaea.org/collection/NCLCollectionStore/_Public/42/081/42081691.pdf
?r=1&r=1. Acesso em: 13 out. 2020. 
MINEO, José Roberto et al. Manual Ilustrado de Práticas Laboratoriais em 
Imunologia. Uberlândia: Edufu, 2016. 116 p. 
 
REIS, Edna Afonso; REIS, Ilka Afonso. Avaliação de Testes 
Diagnósticos. Relatório Técnico do Departamento de Estatística da Universidade 
Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, n. 2, p. 1-22, 2009. Disponível em: 
http://www.est.ufmg.br/portal/arquivos/rts/rte0203.pdf. Acesso em: 24 set. 2020. 
SBOC (RS). Leitura Crítica de Artigos Científicos. Artigos sobre Testes 
Diagnósticos, [s. l.], p. 83-90, 26 out. 2011. Disponível em: 
https://www.sboc.org.br/app/webroot/leitura-critica/LEITURA-CRITICA_C5.pdf. 
Acesso em: 24 set. 2020. 
VASCONCELOS, Maria José Vilaça de; FIGUEIREDO, José Edson Fontes. 
Tecnologia CRISPR-Cas para Edição Genômica. Sete Lagoas, MG, n. 1, p. 1-
38, 2015. Disponível em: 
https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/1039785/1/doc19
7.pdf. Acesso em: 18 out. 2020. 
VIEIRA, Ana Maria. Consórcio desenvolve tecnologia nacional para diagnóstico 
rápido de doenças infecciosas. Bom, barato e brasileiro, [S. l.], v. 33, n. 1581, p. 
1, 10 set. 2007. Disponível em: 
https://www.ufmg.br/boletim/bol1581/4.shtml#:~:text=O%20m%C3%A9todo%2
C%20conhecido%20como%20imunocromatografia,n%C3%A3o%20a%20exist
%C3%AAncia%20de%20doen%C3%A7as. Acesso em: 13 out. 2020. 
22 
 
WAMA DIAGNÓSTICA (São Paulo). Imuno-Rápido: anti-HBsAg. São Carlos: [s. 
n.], 2011. 2 p. Disponível em: https://www.wamadiagnostica.com.br/bulas/imuno-
rapido/Anti-HBsAg-1.pdf. Acesso em: 13 out. 2020.