TCC ANNE E MARIELE FERMENTAÇÃO NÃO APAGAR (2)

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CURSO DE TECNOLOGIA EM ALIMENTOS
ANNE CAROLINE CARDOSO MONTEIRO
MARIELE GONÇALVES CRIPPA
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA NA PRODUÇÃO DE ETANOL: UMA REVISÃO SOBRE OS PROCESSOS E FATORES DETERMINANTES DO RENDIMENTO
Marília 
 2016
CURSO DE TECNOLOGIA EM ALIMENTOS
ANNE CAROLINE CARDOSO MONTEIRO
MARIELE GONÇALVES CRIPPA
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA NA PRODUÇÃO DE ETANOL: UMA REVISÃO SOBRE OS PROCESSOS E FATORES DETERMINANTES DO RENDIMENTO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade de Tecnologia “Estudante Rafael Almeida Camarinha” - FATEC, como requisito para conclusão do Curso de Tecnologia em Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra. Silvana Pedroso de Goes Favoni
Marília – 2016
RESUMO
O presente trabalho tem o interesse em demonstrar os vários fatores e situações que estressam e dificultam a atividade das leveduras Saccharomyces cerevisiae nas fases existentes no processo da fermentação alcoólica nas usinas sucroalcooleiras, causando uma redução na produção de etanol em relação à quantidade esperada e reduzindo consequentemente a eficiência industrial. Foram estudados os interferentes no processo de fermentação alcoólica; a qualidade da matéria prima empregada à cana de açúcar; e as diferentes formas de condução de uma fermentação. Sendo estudada a viabilidade das leveduras em diferentes meios de concentração de açucares e fermento, bem como os fatores físicos e ambientais na qual se destacam a temperatura, pH, sulfito e o próprio etanol que impactam no rendimento fermentativo e os principais micro-organismos contaminantes que podem ser encontrados e desenvolvidos no processo de fermentação alcoólica nas usinas sucroalcooleiras.
Palavras Chave: Levedura. Fermentação Alcoólica. Processo industrial. Fatores interferentes. Eficiência Industrial. 
ABSTRACT
This study is interested in showing the various factors and situations that stress out and hinder the activity of the yeast Saccharomyces cerevisiae in the existing phases in the process of fermentation in sugar and alcohol plants, causing a reduction in ethanol production compared to the expected amount and thereby reducing industrial efficiency. interferents were studied in the fermentation process; the quality of the raw material used to cane sugar; and different ways of conducting a fermentation. the viability of the yeast in different means of concentration of sugar and yeast being studied, as well as the physical and environmental factors in which stand the temperature, pH, sulfite and own ethanol impacting the fermentative yield and the main micro-organisms contaminants that they can be found and developed in the alcoholic fermentation process in sugarcane mills.
Keywords: Yeast. Alcoholic fermentation. Industrial process. confounders. Industrial efficiency.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................4
2 MATERIAL E MÉTODO..................................................................................5
3 REVISÃO DA LITERATURA..........................................................................6
3.1 Processo de produção de etanol nas usinas sucroalcooleira...............6
3.2 Processo fermentativo...............................................................................8
3.3 Levedura: o agente da fermentação alcoólica.......................................12
3.4 Fatores que influenciam a fermentação alcoólica.................................18
3.4.1 Concentração etanólica.........................................................................18
3.4.2 pH............................................................................................................18
3.4.3Temperatura............................................................................................19
3.4.4 Contaminação Bacteriana.....................................................................20
3.4.5 Sulfito......................................................................................................24
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS...........................................................................26
REFERÊNCIAS................................................................................................27
1 INTRODUÇÃO
Em meados da década de 70, acontecimentos mundiais associadas à emissão de substancias que comprometem o meio ambiente, pressões de preços e perspectivas de esgotamento das fontes não renováveis de combustíveis fósseis, levaram o Brasil a implementar o Programa Nacional do Álcool (PROALCOOL). Este fato introduziu definitivamente o etanol na matriz energética nacional, levando o país à posição de primeiro produtor mundial de etanol combustível (MAPA, 2016; VITAL, 2013; ANDRADE et al., 2009; BASTOS, 2007). Na safra 2015/2016, a produção brasileira de etanol está estimada em 29,2 bilhões de litros e conforme projeções, num futuro próximo, pode garantir ao país o perfil renovável de sua matriz energética (CONAB, 2015; MILANEZ et al., 2012). 
A produção de etanol no Brasil tem como principal matéria prima a cana de açúcar (Saccharum officinarum L.), uma gramínea rica em sacarose, que num processo fermentativo, pela ação da levedura Saccharomyces cerevisiae, é transformada em etanol (C2H6O) e gás carbônico (CO2) (LIMA, 2013). A eficiência e viabilidade econômica deste processo biotecnológico são alcançadas a partir de três parâmetros fundamentais: a eficiência na extração da matéria prima açucarada, ou seja, do caldo de cana, a eficiência do micro-organismo na transformação da matéria prima em produto e um sistema industrial apropriado, com equipamentos e condições que favoreçam a ação do micro-organismo (MILANEZ et al., 2012; ANDRADE et al., 2009). 
	Conforme Vanzella (2014) e Chieppe Junior (2012), a levedura apresenta inúmeras reações enzimáticas em seu metabolismo celular e, diversos fatores físicos, químicos e biológicos podem interferir negativamente na eficiência fermentativa, ou seja, em sua capacidade de converter os açúcares do mosto em etanol. Assim, o estudo de fatores como a temperatura, pH, presença de nutrientes e inibidores, concentração de leveduras, contaminações microbianas entre outros são fundamentais na busca pela melhoria do rendimento alcoólico na prática industrial. 
Diante desse contexto, o objetivo do trabalho foi estudar os parâmetros e processos relacionados à eficiência da produção alcoólica em usinas sucroalcooleiras, sobretudo os fatores que interferem na etapa de fermentação realizada pela levedura Saccharomyces cerevisiae.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi baseado em revisão da literatura realizada na base de dados Scielo, no Google acadêmico e em livros disponíveis on line e na Biblioteca da Fatec Marília. A busca foi definida pelos uni termos relativos ao processo de fermentação alcoólica, fatores determinantes e interferentes do processo e rendimento alcoólico. 
A escolha dos artigos encontrados nas bases de dados foi realizada através da leitura de seus resumos e, após a seleção dos artigos e dos conteúdos dos livros, estes foram analisados e utilizados na elaboração do trabalho. Foram pontos de exclusão trabalhos e livros publicados antes de 2001. 
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Processo de produção de etanol nas usinas sucroalcooleira
A demanda interna de etanol carburante vem aumentando nos últimos anos em função do forte crescimento da frota de veículos flex no Brasil e, conforme Milanez et al. (2012), se as estimativas de crescimento deste setor automotivo se confirmar, a participação do biocombustível na matriz veicular brasileira passaria a ser de 63% nos próximos anos, garantindo ao país o perfil renovável de sua matriz energética. Neste cenário, vários fatores tornam-se fundamentais, entre eles a produtividade agrícola, a qualidade da matéria prima e a produtividade industrial. Quanto à produtividade industrial, destaca-se a etapa de fermentação alcoólica em si, processo pelo qual é obtido o álcool etílico através da ação de micro-organismos específicos, as leveduras.No Brasil, a cana de açúcar constitui a principal matéria prima para a obtenção do etanol carburante. De acordo com Lima (2012) a cana-de-açúcar está entre as culturas agrícolas mais antigas e mais exploradas no Brasil, sendo o país o maior produtor mundial da planta, de açúcar e de etanol (MAPA, 2016). Na safra 2015/2016, conforme estimativa da Conab – Companhia Nacional de Abastecimento, a safra está estimada em 658,7 milhões de toneladas, enquanto a produção de etanol deve situar-se em torno de 29,21 bilhões de litros (CONAB, 2015). 
A cultura da cana de açúcar espalha-se pelo Centro-Sul e pelo Norte e Nordeste do país em dois períodos de safra. No Centro-Sul, a colheita ocorre no período de abril/maio a novembro/dezembro de um mesmo ano e equivale a 85% da produção total do país, sendo o estado de São Paulo o principal produtor. Já na região Norte-Nordeste, a colheita ocorre no período de agosto/setembro de um ano até março/abril do ano seguinte representando 15% da produção total do país (VIEIRA, 2012).
Na composição da cana de açúcar destaca-se cerca de 80% de água e aproximadamente 20% de sólidos totais, principalmente açúcares sacarose (17%), glicose (0,4%), e frutose (0,2%), além das cinzas (LIMA, 2012). Segundo Vieira (2012) tão importante quanto à produção de cana por hectare, é a qualidade da matéria prima, medida pelo teor de sacarose contida na planta e que determina o potencial de produção de açúcar por tonelada de cana. A qualidade da matéria-prima em São Paulo e no Centro-Sul está entre 14 e 15,5% de POL (sacarose aparente), o que equivale ao rendimento médio de 140 a 145 kg de açúcares totais recuperados (ATR) por tonelada de cana. Para o etanol, isso significa rendimento entre 80 e 85 litros por tonelada. 
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Nas usinas sucroalcooleiras, a produção do açúcar e de etanol segue as seguintes etapas: moagem da cana de açúcar, tratamento químico do caldo e filtração. A partir daí, para a produção de açúcar o caldo filtrado passa por evaporação, cozimento, centrifugação e secagem, enquanto para a obtenção do etanol, o caldo será fermentado por leveduras, destilado e retificado para obtenção do etanol hidratado (com grau alcoólico entre 92,6 a 93,8%) ou segue para a desidratação após a destilação para obter etanol anidro (teor alcoólico mínimo de 99,3%) (Figura 1) (CHIEPPE FILHO, 2012; LIMA; MARCONDES, 2002).
Figura 1- Fluxograma resumido das etapas do processo de fabricação de açúcar e etanol nas usinas sucroalcooleiras.
FONTE: LIMA; MARCONDES, (2002).
A moagem constitui a primeira etapa na fabricação do açúcar e do álcool tendo como objetivo a separação da sacarose contida do caldo da cana. A moenda é considerada uma unidade esmagadora constituída de grupos de quatros cilindros perfeitamente ajustada formando os ternos da moenda que geralmente possui de 4 a 6 ternos. No primeiro terno é possível uma extração de 70% do caldo, e segue para os demais ternos com o intuito de se obter um bagaço com o mínimo de umidade possível, o que resulta numa maior eficiência de extração (OGANDO, 2015; LIMA e MARCONDES, 2002). O caldo então obtido contém entre 78 a 86% de água, 10 a 20 % de sacarose, 0,1 a 0,2% de açúcares redutores, 0,3 a 0,5% de cinzas e 0,5 a 1,0% de compostos nitrogenados (Lima et al., 2001). 
 De acordo com Holz (2010) uma vez realizada a moagem, o bagaço é encaminhado para a caldeira para a queima e geração de energia, enquanto o caldo pode ser destinado à fabricação de açúcar ou de etanol. Segundo Schiavone (2009) para a obtenção de álcool  após a moagem, o caldo é submetido a aquecimento entre 102-105ºC, decantação, filtração e correção de pH. Em seguida o caldo clarificado é aquecido a 115ºC para evaporação da água e concentração dos sólidos solúveis em 20 ºBrix, promovendo também sua esterilização. Este caldo aquecido é resfriado a 300C em trocadores de calor e corrigido para compor o mosto (líquido açucarado fermentável), constituído pelo caldo clarificado adicionado de melaço (também chamado de Mel final) e água para diluição do oBrix , geralmente sendo utilizado 18 oBrix (LIMA et al., 2011). São características desejadas do mosto: ausência de sólidos (bagacilho, areia e terra), temperatura máxima de 320C e nível de contaminação microbiana abaixo de 102 células/mL (CHIEPPE JUNIOR, 2012). O mosto é então conduzido às dornas fermentativas e entra em contato com o fermento, dando inicio à fermentação alcoólica.
3.2 Processo fermentativo
De acordo com Santos (2008), a fermentação alcoólica é um processo anaeróbico que ocorre pela transformação de açúcares em álcool etílico (C2H6O), e dióxido de carbono (CO2), catalizado por enzimas. Este processo é executado principalmente por leveduras, em nível citoplasmático, tendo como objetivo a produção de energia, na forma de ATP, que será empregada nas funções fisiológicas e ainda para o crescimento e reprodução do micro-organismo. O álcool etílico produzido constitui somente um subproduto de excreção desse processo. 
Segundo Lima et. al (2001), a fermentação alcoólica se divide em três fases: preliminar, tumultuosa e complementar. A fase preliminar inicia-se, quando o substrato é acrescentado junto às células. Nesta fase, a multiplicação celular é intensa, e o açúcar consumido é usado na reprodução. Caracteriza-se por uma pequena elevação da temperatura e baixo desprendimento de CO2, cuja duração depende das características do sistema de fermentação, e pode ser reduzida quando se emprega elevada concentração de células ou pela adição de células em um meio nutricionalmente mais rico que o original, tendo em média duração de 4 a 6 horas. 
Conforme Venturini Filho (2010), a fase tumultuosa se inicia com o desprendimento intenso de dióxido de carbono, que faz com que o mosto se agite como em ebulição, formando espuma. Durante esta fase há aumento da temperatura que é corrigida através de trocadores de calor. A duração desta fase se dá em torno de 12 a 16 horas, evidenciada o seu término pela diminuição do desprendimento de CO2.
Na fase complementar, que leva de 4 a 6 horas, o desprendimento de gás carbônico diminui sensivelmente e o líquido ascenta na dorna fermentativa, a temperatura abaixa e há redução abrupta no teor de açúcares do meio, completando o processo em torno de 24 horas (PASCHOALINI; ALCARDE, 2009).
De acordo com Ferrari (2013), os processos fermentativos são classificados conforme a maneira que o substrato é adicionado às dornas de fermentação e o produto obtido é retirado. Para a obtenção de etanol, existem três tipos básicos: processo em batelada ou descontínuo, batelada alimentada, e o processo contínuo. 
No processo em batelada, considerado um sistema fechado, substrato e micro-organismos são adicionados apenas no inicio da operação e o produto formado retirado ao final do processo. No transcorrer da fermentação apenas oxigênio pode ser adicionado na fase inicial para a formação da biomassa, antiespumante quando houver aumento acentuado de espuma durante a fase tumultuosa e ácidos ou bases para a correção do pH (no preparo do mosto). Ao final da batelada, o fermentador é lavado e esterilizado ficando apto para a próxima batelada (CARDOSO, 2006). 
Cardoso (2006) destaca que uma das principais características da fermentação descontínua é a manutenção do volume na dorna durante todo o processo, tendo em vista que não há adição de soluções para o controle do processo e nem perdas de material por evaporação, sendo esta uma das vantagens deste método. Entretanto, a adição total do substrato pode ocasionar baixo rendimento fermentativo, pois pode gerar efeitos de inibição e produtos metabólicos não desejáveis no processo fermentativo. Steinle (2013) associa o estresse induzido pelo aumento da osmolaridade externa com a redução em crescimento e perda da viabilidade das células das leveduras, devido às perturbações no gradiente osmótico através da membrana plasmática. Isto leva, por sua vez, a perdas em volume das células que se contraem por causa de diferenças em pressão osmótica entre o exterior e o meio intracelular.Nas destilarias brasileiras o processo mais utilizado é a batelada alimentada, em que se mistura o mosto ao fermento conforme a dorna vai sendo abastecida. Este método é produtivo e expõe as leveduras a menores riscos de se tornarem inativas por repressão catabólica (PACHECO, 2010).
A fermentação contínua é considera um sistema aberto, em que se adiciona continuamente o mosto esteril ao fermentador, no qual o volume da reação é mantido constante através da retirada sistemática do vinho (líquido fermentado), fazendo com que o sistema atinja a condição de “estágio estacionário” com as variáveis do processo (concentração de células, de substrato limitante e produto) constantes (CARDOSO, 2006).
O reaproveitamento de células de leveduras provenientes de uma fermentação anterior é prática comum nas destilarias brasileiras, num processo conhecido como Melle-Boinot (OLIVEIRA, 2010). Neste processo as células são separadas do vinho por centrifugação, saindo de um lado o leite de levedura composto pelas células e de outro o vinho delevedurado (Figura 2). Após a separação das células, estas são tratadas com ácido sulfúrico comercial concentração a 98% até obtenção de pH entre 2,5 a 3,0, o que leva em torno de 3 horas para ocorrer, cuja finalidade é o controle da contaminação bacteriana. Além deste tratamento ácido, água é adicionada às células com o propósito de reduzir o teor alcoólico do meio, uma vez que o álcool constitui um importante fator estressante para a levedura. Nutrientes também são adicionados para suprir as necessidades metabólicas dos micro-organismos e a homogeneização é feita com agitação. Toda esta etapa ocorre em dornas menores denominadas dornas de tratamento e uma vez tratado o inóculo este é re-enviado à dorna de fermentação para a próxima batelada (VENTURINI FILHO, 2010). Conforme Missawa (2009), cerca de 90% das leveduras são reaproveitadas de uma batelada para outra e o reciclo de células ocorre durante toda a safra.
Figura 2- Fermentação pelo processo Melle-Boinot.
 FONTE: VENTURINI FILHO (2010). 
Normalmente a multiplicação do fermento é realizada no inicio da safra até que se atinja a concentração ideal de células para a condução do processo. Nesta etapa aeróbia a oxigenação normalmente é realizada com ar comprimido e sob agitação, em caldo de cana com sólidos solúveis entre 6 a 100 Brix. Para favorecer a multiplicação rápida do fermento, sulfato de amônio, sulfato de magnésio, potássio, zinco, fósforo, entre outros são adicionados. Durante a safra o monitoramento desta concentração e viabilidade celular é realizado, e quando necessário às células são multiplicadas para garantir o percentual de células viáveis, pois mortes por envelhecimento e perdas de células durante o processo são comuns (CHIEPPE JUNIOR, 2012). Conforme Pacheco (2010), a concentração inicial do inóculo é de 106 a 107 células/mL de mosto, e ao final da fermentação esta concentração passa para 108 células/mL ou mais, sendo a concentração inicial de fermento um dos parâmetros fundamentais para a produtividade da fermentação.
De acordo com Venturini Filho (2010) alguns fatores levam o método Melle-Boinot em batelada alimentada a ser o mais empregado nas usinas sucroalcooleiras, pois acarreta maior rendimento em etanol com fermentações mais rápidas, necessita menor volume de dornas, isto é, um menor custo em instalação, garante grande pureza das fermentações diminuindo os riscos de contaminações.
3.3 Levedura: o agente da fermentação alcoólica
Segundo Silva (2009), os micro-organismos do gênero Saccharomyces constituem os mais empregados pelas usinas sucroalcooleiras no Brasil, destinados à fermentação alcoólica. São fungos unicelulares, diploides (2n), cuja principal forma de reprodução é assexuada por brotamento, que ocorre com a formação de uma dilatação denominada gema, formada através de mitoses na superfície externa da célula progenitora, podendo separar-se e dar origem a um novo indivíduo. Além da reprodução assexuada, as leveduras também se reproduzem sexuadamente por esporulação através de meiose seguida de segregação e formação de haploides e posteriores cruzamentos entre eles formando as células diploides. As leveduras apresentam formas com dimensões variáveis, cerca de 4 a 8 µm no menor diâmetro por 5 a 16 µm no maior diâmetro. As formas apresentadas por uma dada espécie variam grandemente em função da composição do meio de cultivo e em circunstâncias nutricionais favoráveis, são capazes de dividirem-se a cada 90 minutos. 
As leveduras são micro-organismos facultativos, isto é, realizam respiração pelo metabolismo aeróbico resultando na transformação do açúcar em H2O e CO2 e também o metabolismo anaeróbico quando na ausência do oxigênio, produzindo etanol (C2H6O) e dióxido de carbono (CO2), além de subprodutos como ácidos orgânicos e glicerol (VENTURINI FILHO, 2010).
 Segundo Del Rio (2004), as leveduras devem apresentar certas características fundamentais para a eficiência do processo, como a velocidade de fermentação que é determinada pela quantidade de açúcar fermentado por uma quantidade de leveduras durante certo tempo. Quanto maior a velocidade de fermentação, maior a produtividade em fermentações mais rápidas, o que leva ao aumento da produção diária e reduz, consequentemente, o custo de produção e o risco de contaminação por micro-organismos prejudiciais. Outra característica desejada para as leveduras alcooleiras é a tolerância ao álcool em valores acima de 10% p:v, uma vez que a baixa tolerância ao etanol limita o seu rendimento e produtividade durante a fermentação industrial. Além destes fatores, a resistência e dominância perante contaminantes e a estabilidade fisiológica para suportar oscilações no processo industrial também são fundamentais para estes micro-organismos.
Conforme Cardoso (2006), a levedura é capaz de utilizar a sacarose presente na cana-de-açúcar quase que imediatamente, hidrolisando o dissacarídeo em glicose e frutose pela produção e ação da enzima sacarase ou invertase (β- fructofuranosífrutohidrolase, EC. 3.2.1.26). A Saccharomyces cerevisiae dispõe de dois tipos de invertase, uma na forma extracelular ou periplasmática e outra intracelular, sendo que a extracelular apresenta- se como uma glicoproteína com cerca de 50% de carboidratos. A utilização dos açúcares pelas leveduras envolve inicialmente o seu transporte para o interior da célula, sendo executada pela invertase extracelular, numa reação que acontece fora da célula, chamada de hidrólise extracelular (SALVATO, 2010). 
Conforme Pacheco (2010), a fermentação da glicose (C6H12O6) ocorre em uma via comum denominada glicólise, também conhecida como via de Ebden-Meyerhof, e é o primeiro estágio do metabolismo, caracterizada por dez etapas sucessivas, com participação de dez enzimas em sequencia. O processo glicolítico não necessita do oxigênio molecular (O2) para a sua ocorrência, visto que a transformação do açúcar não é caracterizada por uma oxidação. De forma geral, o processo envolve a quebra da glicose com 6 átomos de carbono em duas moléculas de piruvato (C3H4O3), cada uma com 3 átomos de carbono. Os primeiros cinco passos enzimáticos formam a fase conhecida como fase preparatória, onde a glicose será fosforilada enzimaticamente pelo ATP (Adenosina Trifosfato), primeiro no carbono 6 e depois no carbono 1, obtendo-se assim a frutose 1,6-difosfato, a qual é quebrada ao meio, produzindo duas moléculas de gliceraldeído 3-fosfato (molécula com 3 átomos de carbono) produto da primeira fase da glicólise. Os cinco passos restantes, na segunda fase da glicólise, representam o “pagamento” do rendimento da glicólise, sendo a energia liberada pela transformação de duas moléculas de gliceraldeído 3-fosfato em duas moléculas de piruvato, conservada através do acoplamento da fosforilação de quatro moléculas de ADP a ATP (Figura 3). Embora quatro moléculas de ATP sejam formadas na segunda fase da glicólise, o rendimento líquido final é de apenas duas moléculas de ATP por molécula de glicose degradada, uma vez queduas moléculas de ATP foram gastas na primeira fase da glicólise. 
A fermentação ocorre quando, após a glicólise, não é realizado o ciclo de Krebs, porque esta via está bloqueada pela hipóxia (ausência de oxigênio). Então, as duas moléculas de piruvato sofrem descarboxilação pela ação da enzima piruvato descarboxilase, gerando duas moléculas de CO2 e duas de acetaldeído, que será convertido em duas moléculas de etanol pela ação da enzima álcool desidrogenase (Figura 4) (MADIGAN et al., 2010).. 
Figura 3- Sequencia das reações enzimáticas pela fermentação alcoólica de carboidratos, conduzida por Saccharomyces.
FONTE: LIMA et al. (2001).
De acordo com Monteiro (2016) deve ser levado em conta o relevante papel da glicose na regulação das opções metabólicas da levedura. A presença de glicose acima de 0,3% no mosto ocasiona um efeito repressor sobre os genes que codificam as enzimas da cadeia respiratória e estruturas mitocondriais, isto é, exerce uma repressão catabólica. Com isso, ocorre acumulo de biomoléculas em sua forma reduzida na qual o NADH gerado durante a glicólise é prevalentemente oxidado através da reação de conversão do piruvato em etanol, isto é, mesmo sob condições de aerobiose a fermentação predomina sobre a respiração. Com a repressão catabolica, ocorre aumento da taxa de fermentação e isto influencia negativamente os transportadores de açúcar para o interior da célula, resultando numa baixa produtividade de etanol. Este efeito regulatório do metabolismo da levedura é conhecido como efeito Crabtree.
Figura 4- Esquema da fermentação alcoólica.
FONTE: MADIGAN et al. (2010).
Segundo Lima et al. (2001), a função primordial da levedura em metabolizar o açúcar é a geração de ATP, ou seja, uma forma de energia química instável que determinará a realização de diversas funções fisiológicas e biossínteses necessárias para manutenção do metabolismo da célula. O etanol e o CO2 resultantes constituem tão somente produtos de excreção, sem utilidade metabólica para a célula em anaerobiose. Entretanto, o etanol, bem como outros produtos de excreção (como o glicerol e ácidos orgânicos), com redução da disponibilidade de glicose no meio, pode ser oxidado metabolicamente, gerando mais ATP e biomassa, mas apenas em condição de aerobiose, constituindo um comportamento metabólico conhecido com diáuxico. 
De acordo com Steinle (2013) as relações da estequiometria servem como base de calculo do rendimento da fermentação alcoólica, isto é corresponde ao grau alcoólico ou massa específica, que pode ser convertido a partir da sacarose ou de açúcar de determinada polarização. Após a inversão da sacarose, as duas moléculas de açúcares invertidos podem ser diretamente fermentadas para a conversão em quatro moléculas de etanol e quatro moléculas de gás carbônico, mas a levedura utiliza preferencialmente a glicose. Conforme representado na Equação 1, estequiometricamente 342,29g de sacarose produzem 360,31g (2*180,1572) de açúcares redutores totais (ART) que por sua vez produzem 184,25g de etanol, ou seja, cada quilograma de sacarose corresponde a 4*46,07/342,30= 0,53 kg de etanol, essa massa de etanol pode ser transformada em volume dividindo seu valor pelo grau mássico do etanol, que é de 789,23 kg/m3. 
Equação 1:
342,29 Kg → 4 ∗ 46,06 kg → 1000 ∗ 4 ∗ 46,06 Kg → 0,68 L
 789,23 Kg∕L
 Sacarose Kg etanol Kg fórmula conversão etanol L
O cálculo estequiométrico mais utilizado, porém, considera apenas a glicose, onde 100 Kg do açúcar produzirão 51,1 Kg de etanol e 48,9 Kg de CO2 (MARTINS, 2009). Entretanto, relaciona que parte dos açúcares presentes no meio será consumida em reações paralelas necessárias para a síntese de etanol, formando outros produtos como glicerol e ácidos orgânicos, principalmente acéticos e succínico, além de outros alcoóis. Por estes motivos costuma-se observar rendimentos na fermentação alcoólica industrial em torno de 90% (CANHA, 2009; BIOCONTAL, 2011). Assim, a partir de 100 Kg de glicose haverá uma produção real de aproximadamente 46,12 Kg de etanol. 
A produção de glicerol na fermentação alcoólica está ligada ao crescimento e à formação de ácidos e a situações de estafa para a levedura, tais como o estresse osmótico causado por elevadas concentrações de açúcares ou sais no mosto, contaminação bacteriana, presença de sulfito no mosto e temperatura elevada.
3.4 Fatores que influenciam a fermentação alcoólica 
3.4.1 Concentração etanólica
Segundo Dorta et al. (2006) a levedura Saccharomyces cerevisiae tem sua tolerância limitada perante o etanol, cuja concentração máxima que permite o crescimento é de 10% (p:v) proporcionando uma produção de etanol no máximo de 20% (p:v). O efeito inibidor do etanol está intimamente relacionado à temperatura da fermentação e a faixa de melhor resistência ao etanol para levedura é de 13 a 27°C. Fora desta faixa de temperatura ocorre inibição do crescimento da levedura em função do álcool presente no meio.
Monteiro (2016) descreve que esta limitação quanto a presença de etanol no meio é verificada pela queda da viabilidade celular e pela redução do seu crescimento. O etanol tem a capacidade de se instalar no meio da bicamada fosfolipídica mais precisamente na parte hidrofóbica, se alojando nos espaços que resultam das interações entre ácidos graxos insaturados e proteínas. Isto leva a um decréscimo na fluidez da membrana, pois restringi o movimento dos ácidos graxos na cadeia e promove um aumento da polaridade perturbando a troca livre das moléculas polares. O resultado é a alteração do posicionamento das proteínas na bicamada fosfolipídica, que afeta diretamente a capacidade da levedura em preservar o gradiente de concentração de compostos variados através da membrana citoplasmática, refletindo na inibição da taxa máxima de captação de glicose.
3.4.2 pH 
A sigla pH é utilizada para representar o potencial hidrogeniônico presente em uma determinada solução ou mistura. Esse potencial se refere à quantidade (concentração molar) de cátions hidrônio (H+ ou H3O+) presentes no meio e indica se esse meio ou mistura é ácido, básico ou neutro. Assim, a avaliação do pH de um meio sempre leva em consideração a concentração de hidrônios (cátions) e a de hidróxidos (ânions) ( SOUSA; MONTEIRO, 2011).
A faixa de pH ótimo para sobrevivência e crescimento de um micro-organismo defini-se através do valor mínimo (no final ácido da escala) e pelo valor máximo (no final básico da escala), sendo que cada espécie apresenta um valor ótimo de pH (FORSYTHE, 2002).
Sousa, Monteiro (2011) cita que as fermentações alcoólicas, cujos agentes são as leveduras, podem desenvolver-se em ampla faixa de pH, porém a faixa considerada ideal para o crescimento microbiano situa-se entre 4,0 e 5,0. Entretanto, a fermentação alcoólica industrial inicia-se com valores de pH mais baixos entre 2,0 e 3,0 e finaliza com valores entre 3,5 a 4,0. Isto se dá porque fermentações alcoólicas quando são conduzidas em meios mais ácidos apresentam melhores resultados quanto ao rendimento em etanol, pelo fato de restringir o crescimento do fermento, e consequentemente a redução da produção de glicerol. Ao mesmo tempo, pH mais baixo reduz a contaminação bacteriana, e considerando que não há correção do pH durante o processo de fermentativo e tão somente durante o tratamento inicial do fermento, a condução da fermentação em pH em faixa abaixo do ótimo é benéfica ao processo (LIMA et al., 2001; SOUSA; MONTEIRO, 2001).
Além da condução do processo industrial em faixa de pH mais baixo, durante a fermentação o pH pode variar em função do consumo de fontes de nitrogênio e também pela formação de ácidos orgânicos como acético, láctico, pirúvico, succínico, contribuindo para a prevenção de contaminações bacterianas.
3.4.3 Temperatura
De acordo com Forsythe, (2002) as faixas de temperatura para o crescimento microbiano, assim como ocorre com o pH, dispõe um valor mínimo e um valor máximo, obtendo um valor ótimo de temperatura para o crescimento máximo. Ocontrole da temperatura consiste num fator importante durante o processo de fermentação alcoólica, pois para a produção de biomassa a temperatura ótima situa-se entre 25º C e 30º C, caracterizando-as como mesófilas, enquanto para a produção alcoólica as temperaturas ótimas situam-se na faixa mais ampla de 26º a 35º. Sousa, Monteiro (2001) e Chieppe Junior (2012) relacionam que valores de temperatura na faixa 26º a 35º causam enfraquecimento da levedura, ou seja, o crescimento é reduzido, além de ser propicio ao surgimento de contaminantes e ocasionar perdas do produto formado por evaporação. Já em temperaturas abaixo de 25º C, a levedura apresenta menor atividade de crescimento e também de formação do produto. 
No Brasil, o inicio da safra se dá no mês abril que condiz com o inverno, cuja temperatura é baixa, chegando perto de 14ºC a 15°C, nas regiões Sul e Sudeste requerendo o aquecimento prévio do mosto para atingir a temperatura entre 28ºC a 30°C, benéfico à atividade da levedura alcoólica. No decorrer da safra, com o aumento da temperatura ambiente, esta medida se faz desnecessária. Como a fermentação alcoólica é um processo exotérmico, a temperatura do mosto pode exceder os limites admitidos para uma fermentação normal, isso acarreta em fatores que afetam a atividade microbiana e por isso a temperatura durante a fermentação é controlada havendo resfriamento por trocadores de calor nas dornas fermentativas (SOUSA, MONTEIRO, 2011). 
Embora as leveduras S. cerevisiae sejam mesófilas, não esporadicamente as temperaturas nas destilarias alcançam 38º C, dependendo das condições climáticas da região, pois o mosto é dispensado na dorna em temperatura ambiente. À medida que a temperatura se amplia, eleva-se a velocidade da fermentação, porém, conforme descrito acima, esta condição torna-se mais propicia à contaminação bacteriana, ao mesmo tempo em que a levedura fica mais sensível a toxidez do álcool, levando a formação de metabolitos secundários como o glicerol (LIMA et al., 2001). 
3.4.4 Contaminações bacterianas
Segundo Viégas (2011) a cana de açúcar constitui um excelente meio de crescimento não apenas para as leveduras alcoólicas, mas também para bactérias contaminantes do processo, pois apresenta teor relevante de nutrientes, alta atividade de água e pH favorável, e sujidades vindas do campo ou mesmo provenientes do processo de obtenção do caldo da cana. Além disso, a má assepsia dos equipamentos intensifica ainda mais a contaminação bacteriana no processo de fermentação alcoólica. 
De acordo com Nobre (2005) o processo de infecção na fermentação alcoólica pode ocasionar inúmeros danos ao processo industrial tais como: consumo de açúcar e redução da produção alcoólica, formação de goma refletindo no aumento da viscosidade do caldo e consequentemente ligado ao entupimento nas tubulações, danos aos equipamentos como centrifugas, peneiras e trocadores de calor elevando os custos em manutenção.
No decurso da infecção pode ocorrer a floculação do fermento, com diminuição da velocidade de fermentação, gerando perda de células de leveduras no fundo das dornas, o que dificulta o exercício das centrifugas, além do baixo rendimento alcoólico. Várias podem ser as causas para a floculação do fermento, todas relacionadas a contaminações: presença de gomas sintetizadas por bactérias, o próprio contato com bactérias indutoras da floculação e ainda pela presença de leveduras selvagens floculantes. Outro ponto de destaque para as contaminações é a presença de toxinas e ácidos orgânicos que ocasionam a inibição e a queda da viabilidade celular. Estes compostos excretados no meio pelos contaminantes, juntamente com todo o processo ocorrido leva a redução no rendimento da fermentação e interfere na eficiência da fermentação industrial (NOBRE, 2005; LUDWING et al., 2001).
Conforme Naves et al. (2010), no âmbito da fermentação e destilação industrial as bactérias lácticas são as predominantes iniciadoras de fermentações indesejáveis, particularmente as bactérias Gram-positivas do gênero Lactobacillus, Bacillus e Leuconostoc, sendo as do tipo Lactobacillus e Bacillus as mais presente na fermentação industrial uma vez que apresentam tolerância ao álcool. Nos Lactobacillus e Bacillus, a floculação ocorre devido a presença de uma capa proteica gelatinosa presente nestes micro-organismos, o que os torna capazes de se fixar mecanicamente nas células de leveduras. Desta forma as leveduras se agregam umas as outras dando origem a flocos que sedimentam drasticamente no meio (COSTA, 2006; ALCARDE, 2001). 
Os inconvenientes gerados pela floculação da levedura por contaminação bacteriana são intensificados pelo reciclo de células, que promove a condensação dos agentes de floculação juntamente com as leveduras e consequentemente decréscimo da produção de etanol. (ALCARDE, 2001). Assim, o controle microbiano é extremamente relevante do ponto de vista da produção alcoólica com altos rendimentos. Procedimentos como o tratamento com acido sulfúrico realizado no creme de levedura, cujos custos são relativamente baixos, o uso de antibióticos tais como tetraciclina, cloranfenicol, penicilina e virginiamicina e a busca por novos métodos de controle devem ser amplamente estudados e otimizados, uma vez que podem prevenir a contaminação bacteriana (GOMES, 2009). Embora o tratamento com ácido sulfúrico seja amplamente empregado nas destilarias brasileiras, às leveduras são prejudicadas pelo ácido, que provoca extração de nutrientes como nitrogênio, fósforo e potássio, e ocasiona desgaste em sua parede celular prejudicando a produção de etanol (VIÉGAS, 2011; DORTA, 2006). 
De acordo com Bertoletti (2008), a floculação gerada por espécies do gênero Lactobacillus estaria relativamente ligada com um mecanismo intracelular, na qual abrange os resíduos de aminoácidos indicados pela presença proteica do grupo indol do triptofano e o grupo hidroxil fenólico da tirosina da superfície celular da bactéria e carboidratos da parede celular da levedura. Alem disto a relação intracelular necessita também da presença de íons Ca++, que atuam de modo direto na floculação. O cálcio exerce uma ponte de ligação entre os grupos negativos das fosfomananas que é um complexo de fosfato e mananas situada na parede celular da levedura e os receptores proteicos das células bacterianas. Níveis de pH acima de 3,0 contribui para que estas ligações ocorram, enquanto em pH inferiores a 3,0 e com quantidades elevadas de íons H+ no meio, estes disputam as ligações com os íons Ca++. Por esse motivo as indústrias fazem uso da metodologia de reciclo de células (processo Melle-Boinoit) com a adição de acido sulfúrico no tratamento do fermento para manter o pH baixo ocasionando o rompimento dessas pontes de ligação dos íons Ca++, apesar das injúrias que este tratamento pode provocar nas leveduras. 
Outro procedimento que pode ser adotado no controle da contaminação bacteriana é o uso de antibióticos, cuja função é inibir ou anular o crescimento de bactérias através das vias metabólicas, e pela mudança do equilíbrio osmótico afetando a estrutura de suas paredes celulares. Porém, o uso contínuo de antibióticos traz limitações como, por exemplo, a indução da resistência bacteriana a ação do antibiótico, além do custo elevado que este tratamento apresenta, considerando que seu uso deve ser contínuo na indústria (VIÉGAS, 2011; NAVES et al., 2010). Assim, conforme Viégas (2011) é constante a busca por novos compostos naturais bactericidas, que sejam mais eficientes que os atuais a um custo menor e que possam substituir antibióticos sintéticos, reduzindo então a resistência microbiana aos antibióticos empregados atualmente. Um exemplo disto é a própolis, substância resinosa produzida por abelhas e que tem se destacado no controle de bactérias contaminantes, sendo tão eficiente quanto à ampicilina em testes laboratoriais. Sua ação antimicrobiana está relacionada à presença de flavonoides, ácidos fenólicos, ésteres, aldeídos fenólicos e cetonas, cujo mecanismo da atividade antimicrobianaé complexo e atribuído ao sinergismo entre flavonoides, hidroxiácidos e sesquiterpenos (CAETANO, MADALENO, 2011).
Segundo Caetano e Madaleno (2011), outros biocidas naturais como o jambolão e o lúpulo estão sendo estudados pelo seu fator bactericida. Quanto ao jambolão, as folhas são ricas em taninos e saponinas e são citadas três hipótese para a ação antimicrobiana atribuída aos taninos. Uma delas é a de que os taninos inibem enzimas bacterianas e fúngicas e ou se complexam com os substratos dessas enzimas. A segunda hipótese inclui a ação dos taninos sobre as membranas celulares dos micro-organismos, modificando seu metabolismo, e a terceira fundamenta-se na complexação dos taninos com íons metálicos, diminuindo a disponibilidade de íons essenciais para o metabolismo microbiano. No que diz respeito ao lúpulo, os β-ácidos conhecidos como lupulonas possuem ação bactericida, agindo no transporte de metabólitos na membrana celular e alterando o pH intracelular. Sua pronunciada ação bacteriostática sobre bactérias Gram-positivas parece estar relacionada à interferência do grupo prenil, presente nas cadeias laterais dos β-ácidos, sobre a membrana plasmática das células, inibindo fortemente o seu crescimento. Porém, apesar de promissores, estes métodos alternativos ainda não são aplicados em nível industrial, sendo o procedimento quase que padrão nas destilarias brasileiras o uso de ácido sulfúrico no controle de contaminantes. 
3.5.5 Sulfito
Conforme Dorta et. al (2006), o sulfito presente na fermentação alcoólica é proveniente da queima do enxofre elementar em fornos rotativos, no tratamento químico do caldo primário para retirada de impurezas solúveis, coloidais ou insolúveis com a finalidade de se fabricar o açúcar branco. Durante o processo de fabricação do açúcar gera-se um subproduto denominado melaço, também conhecido como Mel final. Um produto esgotado, que não serve para extrair mais açúcar por razões de ordens técnico-econômicas. 
De acordo com Steinle (2013) desde 1990, há um crescimento elevado da utilização do melaço na formulação do mosto juntamente com água e caldo de cana-de-açúcar para fermentação alcoólica. A utilização do melaço tem como finalidades principais a correção de sólidos solúveis do caldo e também por motivos econômicos, evitando assim perdas na eficiência da fabricação do açúcar. Amaral (2009), relata que o sulfito de sódio adicionado ao processo industrial é na faixa de 200 a 700 mg/L, gerando na maioria das vezes mostos com até 300 mg/L de dióxido de enxofre (SO2).
Esta presença de sulfito no mosto ocasiona redução do rendimento alcoólico e diminuição da viabilidade das células das leveduras, sendo que os níveis de toxicidade pode ser maior ou menor perante as condições em que se encontram os níveis de pH, a contaminação, assim como o teor alcoólico no decorrer do processo fermentativo (DORTA et. al, 2006). Conforme Favero et. al (2011), o sulfito age como um antimicrobiano tanto para bactérias como para as leveduras através de sua ligação a receptores celulares situados na parede celular do micro-organismo, ocasionando rompimento na membrana citoplasmática, inativação da replicação do DNA e da síntese de proteínas, inibição das reações catalisadas enzimaticamente vinculadas com a membrana citoplasmática, bem como, em reações individuais com os componentes de vias metabólicas. Um exemplo da ação antimicrobiana do sulfito está na inibição da cadeia enzimática encarregada pela produção de ATP, o que leva a diminuição da viabilidade celular. 
Apesar de sua ação indesejada sobre as leveduras, Meneses (2008) cita que estudos relacionados com a toxidez do sulfito, mostraram que sua presença no meio fermentativo em até cerca de 100 ppm (partes por milhão) acarretaria benefícios ao processo de fermentação alcoólica, uma vez que diminui os custos de produção, pois exerce efeito inibitório no crescimento bacteriano, visto que a contaminação acarreta maiores danos ao rendimento alcoólico do que a presença de sulfito prejudicial às leveduras. Amaral (2009) relaciona que a concentração mínima inibitória (CMI), para o sulfito de sódio em pH 4,5 se encontra na faixa de 10-40 mg/mL para bactérias contaminantes do processo fermentativo, enquanto para a levedura os valores são de 5000mg/mL em pH 4,5, o que justifica o uso do Mel na composição do mosto.
4. Considerações Finais
A partir de revisões da literatura foi possível constatar que vários fatores tem influência direta na eficiência de conversão de açúcar em etanol pela levedura Saccharomyces cerevisiae, ligados diretamente com o rendimento alcoólico. Dentre os fatores analisados o controle de pH, temperatura, presença de sulfito e teor alcoólico do meio é fundamental, pois relacionam-se diretamente ao desempenho da levedura e à sua viabilidade. Uma vez afetada a viabilidade celular, a tendência é o aumento do tempo de fermentação, o que acarreta custos mais elevados e propicia o aumento das contaminações bacterianas. As contaminações bacterianas por sua vez, em níveis acima de 102 células /mL, provocam redução da produção alcoólica e aumento da acidez, o que leva à diminuição da qualidade do produto final. Assim, considerando a importância do etanol no mercado nacional, conhecer os fatores interferentes da fermentação alcoólica bem como de medidas que melhorem a eficiência de sua obtenção devem ser cada vez mais estudados a fim de contribuir para melhorias do processo industrial.
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