Prova Microbiologia AB1 Renan Spadini Teixeira Final

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS 
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS 
ENGENHARIA DE ENERGIAS 
MICROBIOLOGIA GERAL 2020.1 
PROFESSOR: GILDEMBERG A. LEAL JR. 
 
PROVA BIMESTRAL / AB1 
 
 
 
 
RENAN SPADINI TEIXEIRA 
 
 
 
 
 
Maceió – AL 
2021 
 
 
 
 
Universidade Federal de Alagoas 
Centro de Ciências Agrárias 
Prof. Gildemberg A. Leal Jr 
 
 
Prova AB1 – Microbiologia Geral – 2020.1 – Curso Engenharia de Energia 
 
Uma usina apresenta problemas no processo fermentativo para produção de etanol. O relatório técnico aponta 
reduzido rendimento por problemas que estão acontecendo durante a fermentação. 
A redução do rendimento pode ser explicado por duas hipóteses. A primeira seria a contaminação da 
fermentação com bactérias. A segunda seria a limitação da população de leveduras devido à redução na taxa de 
multiplicação. Considerando os conhecimentos adquiridos em microbiologia geral qual seria a sua 
abordagem para determinar qual das hipóteses é válida qual seria a sua proposta de solução para cada uma 
das hipóteses (1-a). Como você diferenciaria as bactérias da leveduras? (1-b) 
Qual seria a sua abordagem para determinar a contaminação do mosto por bactérias. O proprietário relatou que 
após consulta em outras usinas, constatou que os antibióticos penicilina ou vancomicina são recomendados para 
controle da contaminação com bactérias. Relate quais procedimentos laboratoriais você realizaria para 
confirmação da contaminação da fermentação por bactérias (2). Quais seriam as prática microbiológicas 
que ajudaria na escolha do antibiótico a ser utilizado em caso de contaminação com bactéria? Relate os 
procedimentos com detalhes (3). 
O proprietário relatou que algumas usinas que fermentam no sistema de bateladas acidificam o creme da 
levedura antes de iniciar a próxima fermentação. No entanto, o produtor não entendeu como o procedimento 
pode auxiliar na redução da contaminação de bactéria sem afetar as leveduras. Explique porque a acidificação 
controlaria o crescimento das bactérias mas não afeta o crescimento das leveduras (4). 
Apesar da possibilidade da contaminação por bactérias, o produtor não considera pertinente o controle do 
crescimento bacteriano pois ele entende que apenas as leveduras são capazes de utilizar o caldo de cana ou 
melaço como fonte de alimento para produção de etanol. Explique para o produtor por que ele está enganado 
(5). 
Quais procedimentos (práticas e insumos) o proprietário deveria adotar em relação aos equipamentos antes 
da fermentação para reduzir a contaminação no processo? (6) 
A segunda hipótese para redução da eficiência do processo fermentativo seria o aumento do tempo de 
fermentação que está relacionado ao crescimento e adaptação das leveduras ao processo. Quais procedimentos 
você utilizaria para isolar e quantificar a leveduras no processo fermentativo. 
O proprietário relatou que a taxa de crescimento das leveduras estaria associado com o rendimento da 
fermentação. O proprietário verificou que outras usinas costumam determinar a multiplicação das leveduras para 
saber sobre o crescimento da levedura que determina a vitalidade das células. Relate quais procedimentos 
laboratoriais você realizaria para obter informações necessárias sobre o tamanho da população de leveduras 
na fermentação e a taxa de multiplicação das leveduras, vitalidade das leveduras. (7) 
Outras usinas relataram adicionar nas fermentações ao menos dois nutrientes para favorecer o crescimento das 
leveduras. No entanto, não informou quais, explique para o produtor quais seriam os nutrientes e o porquê. 
(8) 
 
 
Centro de Ciências Agrárias - CECA/CAMPUS DELZA GITAI/UFAL - BR 104 Norte km 85. 57100-000 - Rio Largo - AL - Brasil, E-mail: 
jupara@hotmail.com Tel: (082)3261-3470/2967/3920/2221 Fax: 3261-1351 
 Renan Spadini Teixeira 
 
 
 
AB1 
 
Respostas: 
1- 
Para determinar as causas da perda de eficiência no processo fermentativo de 
produção de etanol em determinada usina é necessário através de testes bioquímicos 
reconhecer as fontes potenciais de contaminação de modo que medidas apropriadas 
possam ser tomadas para minimizar as perdas. 
Necessita-se analisar os dados microbiológicos das amostras. E, através destas 
análises específicas determinar compostos metabólitos, que são produzidos pelas 
leveduras ou bactérias. Determinando a quantidade de cada. Pode-se afirmar que a 
contaminação bacteriana ocorre onde existem nutrientes e temperatura adequados. 
Após a identificação do agente causador da perda de eficiência (bactéria ou 
leveduras), tomar as devidas ações para reequilibrar a microbiota e conseguir a 
melhor eficiência possível na quantidade de etanol. Maximizando os lucros. Quanto 
mais rápida a coleta de dados, mais rápida a tomada de decisão e ação e menores 
perdas no processo. 
Além das técnicas de microscopia e plaqueamento. A determinação de ácido lático 
através de métodos enzimáticos tem sido proposta por vários pesquisadores, para 
determinar o nível de contaminação bacteriana, uma vez que o ácido lático é o 
resultado da degradação dos açucares (glicose) pelas bactérias. Outra maneira 
indireta de estimar o número de bactérias é medir a atividade metabólica de uma 
população. 
“A contaminação bacteriana é a maior causa da diminuição no rendimento de etanol 
durante a fermentação de matérias primas à base de amido ou açúcar por leveduras S. 
cerevisiae. O açúcar consumido pelas bactérias é desviado da produção de álcool e é 
convertido em produtos secundários, os quais são inibitórios para o crescimento e 
metabolismo da levedura.” (NARENDRANATH, 2003). 
“Microrganismos contaminantes podem entrar nos reatores de fermentação de várias 
maneiras, dependendo do método e padrão de cada indústria. Como a limpeza e desinfecção 
das plantas de álcool combustível não são rigorosas quanto em uma cervejaria, os 
 
 
 
contaminantes podem se desenvolver nos tanques, linhas de transferência e trocadores de 
calor” (REED; NAGODAWITHANA, 1991). 
Thomas et al. (2001), simulando uma fermentação de mosto de milho em batelada 
contaminada com diferentes bactérias láticas, observaram queda no rendimento em 
álcool, desvio dos carboidratos para produção de glicerol e ácido lático, perda de 
viabilidade e queda na taxa de multiplicação da levedura. 
Segundo Lima et al. (2001), desde que a fermentação industrial não é 
conduzida em condições de completa assepsia, a contaminação bacteriana, 
principalmente de Lactobacillus e Bacillus, está sempre presente e compromete o 
rendimento do processo fermentativo. 
Oliva-Neto e Yokoya (1994) mostraram os efeitos da contaminação bacteriana 
sobre a levedura em fermentação alcoólica. Enquanto que a acidez produzida 
aumentou em 2,7 vezes ao longo de 15 ciclos fermentativos, a viabilidade da levedura 
S. cerevisiae diminuiu mais de 64%, assim como o rendimento de etanol decresceu 
de 75% para 49%. Já em outro experimento, constataram que a autólise das células 
de leveduras, devida ao aumento da acidez, liberou aminoácidos essenciais ao 
crescimento da bactéria a partir do segundo ciclo, favorecendo o aumento da 
contaminação. 
“Entre os contaminantes encontrados na produção de álcool, as bactérias do ácido 
lático (BAL) são as mais nocivas, devido à sua habilidade de sobreviver sob condições da 
fermentação etanólica (temperatura ótima entre 30 e 40°C e pH ótimo de 5,5 – 6,0). Nestas 
condições, as BAL possuem um eficiente metabolismo de carboidratos e o tempo de 
duplicação da população é bem mais rápido que da levedura.” (NARENDRANATH, 2003). 
De acordo com Narendranath et al. (2001) o mecanismo de ação dos 
subprodutos estressantes da fermentação etanólica é bastante conhecido. Portanto, 
é necessário diminuir o número de microrganismos presentes no mosto de tal modo 
que o nível dos metabólitos seja muito baixo para afetar as taxas de produção e 
rendimento de etanol. 
Segundo Kelsalle Lyons (2003b), a maneira fundamental para controlar a 
infecção é adequar o ambiente da fermentação etanólica. Os tanques fermentadores 
devem ser esvaziados e limpos regularmente; os trocadores de 
 
 
 
calor não devem ser compartilhados; evitar ‘pontos mortos’ nas tubulações de mosto 
e vinho; maximizar o crescimento da levedura; promover fermentações rápidas com 
temperatura controlada e utilizar agentes antibacterianos. 
Lyons (2003a) afirma que uma destilaria dificilmente vai ter uma fermentação 
estéril e, como a levedura é relativamente um microrganismo de crescimento lento, 
comparada com a maioria dos microrganismos infecciosos, é crucial que se tenham 
vários agentes bactericidas, produtos de limpeza e programas efetivos prontos a 
proteger o ambiente fermentativo. 
De acordo com Narendranath (2003), os métodos mais utilizados da indústria 
do etanol para o controle de bactérias contaminantes incluem limpeza e sanitização 
severas, lavagem ácida das leveduras, ajuste do pH do mosto e o uso de antibióticos 
durante a fermentação. Mas, mesmo com os procedimentos de limpeza, as bactérias 
encontram seu caminho dentro do processo nas destilarias, devendo ser removidas o 
mais rápido possível. 
 
2- 
 Para confirmar se a fermentação está contaminada por bactérias, 
necessitamos realizar exames microbiológicos específicos nas amostras. 
 Como por exemplo a determinação da quantidade de ácido lático através de 
métodos enzimáticos, que tem sido proposta por vários pesquisadores, para conseguir 
determinar o nível da contaminação bacteriana. Uma vez que o ácido lático é o 
resultado da degradação dos açucares (glicose) pelas bactérias. 
3- 
Através de exames laboratoriais microbiológicos e testes bioquímicos das 
amostras afim de determinar quais são os compostos metabólitos indesejados 
encontrados após a fermentação. Especificando exatamente qual é a bactéria que 
está contaminando a fermentação. Podendo-se assim usar o antibiótico específico em 
seu tratamento. Na tabela abaixo alguns dos métodos utilizados para identificar 
metabólitos. 
 
 
 
 
 
“Análises empregando tecnologia enzimática vêm sendo introduzidas na indústria 
sucroalcooleira para determinação de compostos indesejáveis. Por exemplo, a dextrana, 
produzida por L. mesenteroides e o glicerol, um metabólito secundário de S. cerevisiae, são 
detectados por essas técnicas.” (COPERSUCAR, 2001). 
“As vantagens das enzimas em análises são sua sensibilidade e especificidade. Ou 
seja, elas são hábeis para detectar quantidades muito pequenas de materiais e reagem com 
uma molécula específica, sem afetar outras próximas. Além do mais, as técnicas enzimáticas 
são precisas, rápidas e não dependem de condições extremas. Os métodos mais modernos 
empregam instrumentos eletrônicos que simplificam os procedimentos e diminuem a 
possibilidade de erro humano.” (HASSELBERGER, 1978). 
 
4- 
 Como já dito, o controle da contaminação bacteriana na fermentação impacta 
na eficiência industrial de uma usina produtora de etanol. 
Ceballos-Schiavone (2009) relata que a contaminação bacteriana na 
fermentação impacta, diretamente, na produtividade e no rendimento final, devido à 
degradação da sacarose para geração de ácidos, ao invés de etanol, e à intoxicação 
das leveduras, causadas por esses ácidos. 
Sabe-se que o crescimento de bactérias láticas é reduzido significantemente 
em meios de pH inferiores a 5,0. Desse modo, a maioria das destilarias de etanol tenta 
 
 
 
controlar a contaminação bacteriana diminuindo o pH da fermentação como uso de 
ácido sulfúrico (NARENDRANATH;BREY, 2009). 
“No processo fermentativo Melle-Boinotas leveduras em suspensão são 
sistematicamente submetidas ao tratamento com ácido sulfúrico após cada fermentação até 
pH 2,5 (+/-0,5) por 1 a 3 horas,antes de retornar aos reatores para iniciar um novo ciclo 
fermentativo.” (GOLDEMBERG; MACEDO, 1994). 
“Embora o tratamento com ácido sulfúrico seja amplamente empregado nas destilarias 
brasileiras, as leveduras são prejudicadas pelo ácido, que provoca extração de nutrientes 
como nitrogênio, fósforo e potássio, e ocasiona desgaste em sua parede celular prejudicando 
a produção de etanol.” (VIÉGAS, 2011; DORTA, 2006) 
5- 
O produtor está enganado pois a contaminação bacteriana na fermentação 
impacta, diretamente, na produtividade e no rendimento final, por causa da 
degradação da sacarose para geração de ácidos, ao invés de etanol, e levando 
consequentemente à intoxicação das leveduras, causadas por esses ácidos. 
6- 
A maneira de controlar a infecção bacteriana é adequar o ambiente da 
fermentação etanólica. Os tanques fermentadores devem ser esvaziados e limpos 
regularmente; os trocadores de calor não devem ser compartilhados; evitar ‘pontos 
mortos’ nas tubulações de mosto e vinho; maximizar o crescimento da levedura; 
promover fermentações rápidas com temperatura controlada e utilizar agentes 
antibacterianos. 
 
7- 
A levedura como entidade viva independente, realiza a fermentação do açúcar 
com o objetivo de conseguir a energia química necessária à sua sobrevivência, 
sendo o etano! apenas e tão somente um subproduto desse processo. 
Para descobrir a taxa de crescimento e a taxa fermentativa (eficiência) das leveduras. 
Cria-se um ambiente favorável ao seu crescimento para que se analise a sua curva 
de crescimento da massa celular e consequente taxa de consumo de substrato, de 
maneira que a concentrações de açúcares totais permaneçam constantes. 
 
 
 
8- 
Nutrientes específicos favorecem o crescimento das leveduras. Como compostos 
nitrogenados. Por exemplo, uma ótima receita para melhorar o crescimento 1L de 
melaço aditivado com 6% de um substrato suplementado de KH2PO4 (0.87 g/L), 
(Nltt)2SO4 (0.66 g/L), uréia (0.66 g/L), MgSO4.H2O (0.49 g/L), ZnSO4.7H2O (0.03 g/L), MnSO4.H2O 
(0.02 g/L) e ácido linolêico (0.03 g/L), prosseguindo o crescimento a temperatura ambiente (23 ± 3°C) 
por 70 horas. 
 
 
 
 
 
 
Referências Bibliográficas 
 
 
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