Tipagem celular

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Prática☺ 
Tipagem celular 
Determinar tipos de células diferentes – qual o tipo de DNA, de RNA, seus constituintes, qual o estado de maturação, se é um 
linfócito T auxiliar ou citotóxico, qual sua função, o que há em seu citoplasma, etc. 
Na hematopoiese, a célula-tronco hematopoiética se diferenciará e dará origem a todas as outras. 
• Técnicas mais utilizadas 
Citometria de fluxo 
Técnica de análise celular multiparamétrica baseada em laser. Permite a medição das propriedades individuais das células, ou 
partículas em geral, em fluxo contínuo, passando uma de cada vez, sequencialmente, em frente a um feixe de laser com sensores 
para medir dispersão de luz e fluorescência. É utilizada em células em suspensão (separadas). * Contar, examinar e classificar 
partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Consegue identificar marcadores celulares, tamanho, componentes 
intracelulares. 
Tem capacidade de analisar individualmente cada célula. Determina características físicas e química de partículas ou célula em 
suspensão (dissociadas), de 0.2 a 150 micrômetros. 
Realizada em uma suspensão de células separadas, com um mínimo de resíduos. Algumas substâncias fluorescentes (fluorocromos) 
podem ser usadas conjugadas ou não com anticorpos, sendo que às vezes o anticorpo que está conjugado é o que dá a fluorescência 
e não ela em si – esses anticorpos podem ser comprados e cada um apresenta uma especificidade. Ao passar pelo laser, os 
fluorocromos emitem sinais luminosos. Os padrões de emissões de luz podem ser utilizados para analisar aspectos moleculares das 
células. 
Exemplo: paciente HIV precisam fazer dosagem de CD4 e CD8, pois o vírus infecta CD4, divide-se e lisa-as. No sangue periférico, 
haverá 1 CD8 para 2 a 3 CD4, aproximadamente, porém em paciente com HIV, o número de CD4 cai e os CD8 se sobressaem. Para 
fazer a contagem de células são vendidos anticorpos fluorescentes – anti CD4 e anti CD8 – que farão ligações com seus respectivos 
linfócitos e ao passarem pelo laser refletirão uma luz, ressaltando que graças a captação dessa luz e a sua transformação em sinal 
elétrico, teremos a conversão em um parâmetro de computador. 
“Usando vários anticorpos fluorescentes, pesquisadores podem obter dados robustos, multiparamétricos e estatísticas de base 
populacional na diferenciação de células-tronco e culturas. Pode isolar células-tronco e seus derivados do tecido primário e 
diversificada em populações in vitro.” 
 
O citômetro de fluxo tem 3 sistemas principais de detecção: 
Sistema fluídico: introduz, transporta e alinha as partículas em um fluxo contínuo. Coloca o tubo com a amostra, o equipamento a 
aspira e dentro do mesmo há um fluído que fica circulando, ajudando o transporte e alinhamento para análise individual das células. 
Sistema óptico: laser, lente e filtros. Geram e coletam os sinais de luz emitidos. Determina tamanho da célula e quantidade de 
grânulos intracitoplasmáticos. É capaz de marcar a membrana da célula com auxílio dos anticorpos para identificar o tipo celular. 
Sistema eletrônico: converte sinais óptico/luminosos em sinais eletrônicos, disponibilizando-os para análise no computador na 
forma de gráficos. Os sinais luminosos gerados pela interação laser-célula devem ser coletados para análise. Sensores específicos 
para cada tipo de sinal luminoso captam os sinais, transformando-os em sinais elétricos. Os sinais elétricos são amplificados e 
registrados em computadores. Através de softwares específicos as informações obtidas são devidamente analisadas. Eixo X: 
tamanho. Eixo Y: granulosidade. 
Pode analisar nas células o tamanho, complexidade/granulosidade, antígenos celulares/proteínas de membrana, enzimas 
intracelulares, DNA, citocinas, receptores celulares e metabolismo. 
Um feixe de luz (laser) de um único comprimento de onda (cor) é direcionado a um meio líquido em fluxo. Cada partícula suspensa 
passando através do feixe de luz do laser, dispersa a luz de uma forma, e os corantes químicos fluorescentes (fluorocromos) 
encontrados na partícula ou acoplados a anticorpos específicos juntos as partículas podem ser excitados emitindo luz de 
comprimento de onda característico. Um número de dectores são apontados ao local onde o fluxo passa através do feixe de luz; um 
na posição do feixe de luz (Forward Scatter ou FSC) e vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC), além de um ou mais 
detectores fluorescentes. Esta combinação de luz dispersa e fluorescente é captada pelos detectores, de acordo com filtros situados 
a frente dos mesmos. Analisando as flutuações de brilho de cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente) é possível 
explorar vários tipos de informação sobre a estrutura física e química de cada partícula individual. FSC correlaciona-se com o 
volume celular e SSC depende da complexidade interna da partícula, por exemplo: forma do núcleo, quantidade e tipo dos grânulos 
citoplasmáticos e rugosidade da membrana. 
Aplicações 
Identificar os diferentes tipos celulares, avaliar constituintes celulares (RNA e DNA), determinar fases do ciclo celular, identificar 
células neoplásicas ou tumorais, realizar contagem de células, como os linfócitos (B e T), estudar a interação entra parasitas e a 
células hospedeira, detectar partículas virais intracelulares e realizar a separação específica de células (Sorting). 
Sorting 
Alguns citômetros possuem o sorting que é capaz de separar um tipo celular específico. Ex: é preciso separar o linfócito T auxiliar, 
então o sistema é configurado para que após a passagem do linfócito pelo laser, ele receba uma descarga elétrica, dado que isso 
deixa as células positivas e colabora com a ida das mesmas para o polo negativo da placa, ocasionando a separação. 
Conclusão 
A citometria de fluxo nos permite uma avaliação individual, quantitativa e qualitativa de partículas ou células, seja para a 
investigação científica em pesquisas ou para auxiliar o diagnóstico clínico. 
Para o pesquisador, o conhecimento dos princípios básicos da citometria de fluxo facilita a elaboração de experimentos, preparação 
da amostra a ser utilizada e melhor compreensão dos resultados obtidos. 
Imunohistoquímica 
Técnica em que se aplica antígenos específicos presentes nos cortes histológicos, em associação com métodos de detecção altamente 
sensíveis para a revelação da ligação antígeno/anticorpo. Dessa maneira, identifica-se a expressão de marcadores teciduais, 
simultaneamente à avaliação morfológica. 
*Método de localização de antígenos (e.g. proteínas) em tecidos, explorando o princípio da ligação específica de anticorpos a 
antígenos no tecido biológico. A coloração imunohistoquímica é amplamente utilizada no diagnóstico de células anormais, tais 
como aquelas encontradas em neoplasias. Marcadores moleculares específicos são característicos de eventos celulares particulares, 
tais como proliferação ou morte celular (apoptose). IHQ é também amplamente utilizada na pesquisa básica para compreender a 
distribuição e localização de biomarcadores e proteínas diferentemente expressas em diferentes partes de um tecido biológico. A 
visualização de uma interação antígeno-anticorpo pode ser obtida de diversas formas. Na situação mais comum, um anticorpo é 
conjugado a uma enzima, como uma peroxidase, que pode catalisar uma reação que produzirá coloração. Alternativamente, o 
anticorpo pode também ser marcado com um fluoróforo, como fluoresceína, rodamina, Flúor DyLight ou Flúor Alexa. 
 
Na preparação da amostra em IHQ, deve-se colocar parafina nos cassetes com o corte histológico, deixar solidificar e fazer os cortes 
no micrótomo. 
Método direto (One-step): método de coloração de um passo e envolve um anticorpo marcado (com enzima) reagindo diretamente 
com o antígeno na amostra de tecido. Essa técnica utiliza apenas um anticorpo e o procedimento é, portanto, simples e rápido. 
Entretanto, pode sofrer problemas com sensibilidade devidoà pequena amplificação de sinal e é menos comumente utilizado do que 
os métodos indiretos. 
Indireto: envolve um anticorpo primário não-marcada (primeira camada) que reage com o antígeno do tecido, e um anticorpo 
secundário marcado (segunda camada) que reagem com o anticorpo primário. Esse método é mais sensível devido à amplificação 
de sinal através de diversas reações de anticorpos secundários com diferentes sítios antigênios do anticorpo primário. A segunda 
camada de anticorpos pode ser marcada com uma enzima. 
 
Os cortes inicialmente congelados deram lugar aos materiais processados na rotina (fixação em formalina e embebição em parafina). 
A busca por um fixador ideal (preservação antigênica) foi abandonada, preservando-se praticidade, custo, eficácia para todos 
marcadores e preservação da morfologia. 
Precisa fazer uma lâmina para cada marcador, diferente da citometria. É mais barata de ser realizada. 
Aplicações 
Elucidação do tecido de origem de uma neoplasia morfologicamente indiferenciada, determinação do órgão de origem de uma 
neoplasia diferenciada, subtipagem de neoplasias (linfomas), pesquisa de fatores prognósticos, terapêuticos e índices proliferativos 
de algumas neoplasias (por exemplo, hormônios), identificação de estruturas, organismos e materiais secretados pelas células, 
detecção de células neoplásicas metastáticas e diferenciação entre uma proliferação celular maligna e benigna.