Imunodiagnostico

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IMUNODIAGNÓSTICO:
Testes indiretos:
● Mais estabelecidos e clássicos são voltados para a detecção de anticorpos contra parasitas,
fungos, bactérias ou vírus.
● Indicando a presença de uma resposta imune contra o agente
Testes diretos:
● Mais modernos e sensíveis podem detectar a presença de antígenos de parasitas, fungos,
bactérias ou vírus
● Indicando diretamente a presença do agente no hospedeiro
Importância:
● Pesquisa de antígenos:
- Critério de cura
- Definição de etiologia da doença
- Seleção de doadores de sangue
- Inquéritos epidemiológicos
● Pesquisa de anticorpos:
- elucidar processos patológicos com sintomas e sinais confundíveis
- Diferenciar a fase da doença (fase aguda IgM, com evolução a IgG começa a
positivar)
- Diagnosticar doença congênita (teste do pezinho)
- Selecionar doadores de sangue e doadores/receptores de órgão
- Avaliar prognóstico de doença ou agravamento
- Avaliar eficácia do tratamento
Parâmetros para validação de teste sorológico:
● Falso positivo:
- Exame se revela positivo embora o indivíduo testado não tenha a doença
- Pode ocorrer devido a problemas do teste ou do paciente
- No caso do teste isto pode ocorrer porque o ensaio reconhece uma outra substância
além daquela de interesse (reação cruzada), embora a maioria dos testes de uso
corrente tenha sido testada para reatividade cruzada com muitos soros normais é
possível que um determinado paciente apresente uma substância incomum e que não
seja a de interesse para o diagnóstico pesquisado
- No caso do paciente, é que ele realmente tenha a substância sob teste devido a outra
causa e não tenha a doença investigada
● Falso negativo:
- teste negativo em indivíduos que realmente apresentam a doença analisada) as causas
também podem estar no paciente ou no teste
- O teste pode não ter sensibilidade analítica suficiente para detectar a substância
analisada
- O paciente pode estar numa fase da doença onde a substância analisada pelo teste não
está presente, ou está em concentrações muito baixas
● Erros técnicos podem levar a resultados falso positivos ou falso negativos. Cada teste pelas
suas características próprias, e reagentes empregados, possui uma série de etapas nas quais é
necessário cuidado para evitar resultados falsos
● A manipulação inadequada da amostra a ser analisada (exposição a temperaturas elevadas,
congelamento e descongelamento frequentes…) podem levar ao consumo ou inativação da
substância a ser avaliada resultando em resultados falso negativos
● Sensibilidade analítica:
- se refere ao limite de detecção do teste, a quantidade mínima da substância analisada
capaz de ser medida
● Sensibilidade diagnóstica
- medida da capacidade do teste em detectar todos os indivíduos com determinada
doença
- Porcentagem de resultados positivos em paciente com uma determinada doença
- Sensibilidade = positivos verdadeiros/total de doentes
● A sensibilidade de um teste pode variar em diferentes estágios da doença, isto pode ocorrer
porque a quantidade de anticorpos tende a ser pequena nos estágios inicias de doença,
resultando em testes negativos
● Um teste possuir sensibilidade muito grande, o que o torna menos específico
● Especificidade analítica:
- capacidade de um anti-soro distinguir entre dois antígenos relacionados
● Especificidade diagnostica:
- se refere a capacidade do teste em ser negativo quando o indivíduo não possui a
doença
- A especificidade pode ser calculada como a porcentagem de resultados negativos em
pacientes sem a doença testada
- Especificidade = verdadeiramente negativos/ total de sadios
Reações antígeno - anticorpo in vitro
Reações de aglutinação:
● Quando uma suspensão de partículas (Ag particulado), que apresenta determinantes
antigênicos em sua superfície, é misturado com o anti-soro específico (Ac), formam-se
grumos mais ou menos volumosos
● Ou seja, essa reação que se caracteriza pela formacao de agregados visíveis com resultados da
interação entre anticorpos específicos e partículas insolúveis que apresentam determinantes
antigenicos em sua superfície
● A visualização depende somente do tamanho dos agregados formados
● Pode ser realizado em lamina, placas ou tubos.
Aglutinação em látex:
● Partículas de látex são esferas de poliestireno que podem ser utilizadas como suportes na
adsorção de partículas
● A detecção pode ser de antígenos ou anticorpos, sendo mais comumente a detecção de Ac, ou
seja, a placa é marcada com Ag
● Quando a partícula inerte (látex) é revestida de anticorpo, a reação é chamada de aglutinação
ativa ou direta (pq pesquisa-se a presença de antígenos no soro do paciente)
● Quando a partícula inerte é revestida de antígenos, a reação é chamada de aglutinação passiva
ou indireta (porque pesquisa-se presença de anticorpos no soro do paciente)
Hemaglutinacao:
● As hemácias estão entre os melhores suportes de antígenos para os testes de aglutinação, pois
há uma serie de antígenos que pode ser ligada a sua superfície para fornecer um sistema
indicador sensível na detecção de anticorpos - tipagem sanguínea em lamina
Inibição da hemaglutinacao:
● O principio do teste de (IH) baseia-se na inibição por parte do soro-teste, da atividade viral,
diretamente relacionada a capacidade hemaglutinante
● Detecção e quantificação de anticorpos
Reação de aglutinação de cristais de colesterol - floculação
● Se da empregando cristais de colesterol sensibilizados com cardiolipina (Ag mitocondrial)
para a detecção de anticorpos para a sífilis
● A reação de floculação com antígenos padronizado de cardiolipina (VDRL) é o teste inicial na
pesquisa da sífilis
● Dependendo da quantidade de anticorpos presentes no sangue testado pôde-se diluir 1,2,3,4
ou mais vezes a amostra de sangue, até que a reação não aconteça mais
Reações de precipitação:
● As técnicas de precipitação sao baseadas na identificação de precipitados formados pela
interação de anticorpos específicos e seus antígenos
● Ou seja, quando Ag e Ac são solúveis, ocorre a formacao de precipitação quando o Ag reage
com o Ac
Precipitação em meio líquido:
● O anti-soro em meio líquido é colocado em tubo, e a seguir, cuidadosamente o acrescenta-se o
antígeno que também está em meio líquido
● Ocorrerá a formação de um disco de precipitação na interface antígeno/anti-soro
Precipitação em meio sólido - imunodifusao
● Simples:
- quando o Ag ou o Ac permanecem fixos, enquanto o outro reagente se move a forma
precipitado com ele
- Concentrações pre-estabelecidas de um componente leva a difusão do outro
componente, até que forme o complexo
● Dupla:
- Quando o Ag e o Ac se movem um em direção ao outro
- Quando o antígeno e o anticorpo se fundem, um em direção ao outro, até formar
linhas de precipitação visíveis
● Linear simples:
- o anticorpo é incorporado ao ágar, colocado em tubo ate gelificante
- Sobre o agar contendo o anticorpo é colocado agar contendo o antígeno
- O antígeno migra em direção anticorpo, formando complexo imunes estáveis
- Tais complexos podem ser analisados visualmente a olho nu
- É importante que o Ag e o Ac estejam em proporções ideais de reação (geralmente o
Ag está em maior concentração)
● Linear dupla:
- anticorpo é incorporado ao agar, colocado em tubo até gelificar
- Sobre o agar sem reagente é colocado ágar contendo o antígeno
- O antígeno migra em direção ao anticorpo e o anticorpo migra em direção ao antígeno
formando complexo imunes estáveis
- Tais complexos podem ser analisados visualmente a olho nu
● Radial simples:
- O anticorpo é incorporado ao agar, em concentração conhecida, colocado em placa
até gelificar
- Após gelificação faz-se cavidades no ágar
- Nessas cavidades, distribui-se diferentes concentrações de antígenos, ou antígenos
diferentes
- Essa reação baseia-se no principio de que existe uma relacao quantitativa entre a
quantidade de Ag colocada em cada cavidade, e a quantidade de Ac incorporado ao
agar
- O tamanho do anel de precipitação é proporcional a concentração de antígenos
● Radial dupla:
- agar em placa, após gelificacaofaz-se cavidades no agar
- Nessas cavidades, Ag e Ac são depositado em cavidades diferentes
- Durante o período de incubação em câmara úmida, Ag e Ac difundem pelo agar,
formando linhas ou arcos de precipitação no ponto de encontro
- A não formação de arco indica ausência de Ag
● Imunoeletroforese:
- Consiste na separação de proteínas individuais por meio de um campo elétrico
- Combina eletroforese, e difusão em gel de agar
- Uma mistura antigênico é colocada em uma cavidade de uma placa de gel de agarose
- Após passagem m de corrente elétrica para separação do componente (de acordo com
suas características eletroforeticas)
- Adiciona-se o anti-soro (Ac) longitudinalmente
● Imunofixacao:
- Combina a separação das proteínas em gel, seguida de precipitação em situ, com
anti-soro monoespecífico
Reação de fixação do complemento:
● Deteccao de anticorpos
● Quando se forma um complexo Ag-Ac e o Ac for de classe IgM ou IgG pode ocorrer fixação
do complemento
● O sistema indicador dessa reação é hemácia de carneiro conjugada nas proporções ideais ao
seu Ac específico, a hemolítica, preparada em coelho
● Técnica laboriosa, devem ser incluídos todos os controles recomendados para avaliação da
técnica
1. Quando um antígeno é incubado com soros contendo anticorpos específicos ativa o sistema
complemento
2. Quando um antígeno é incubado com soros sem anticorpos específicos nao há ativação do
sistema complemento e quando o sistema hemolítico é adicionado há lise das hemácias que
estão absorvidas com anticorpos
Imunofluorescencia:
● Baseia-se na possibilidade de tornar visível uma reação Ag/Ac marcando um dos reagentes
com substâncias chamadas fluorocromos
● Capacidade dos fluorocromos (isotiocionato de fluoresceína) absorver energia (de uma fonte
de luz) e converter essa energia em fótons de luz
● A luz excita o elétron, que passa para um nível de energia superior e quando cessa a luz
(energia) esse elétron naturalmente volta para seu nível normais de energia e emite luz
● A leitura é feita em microscópio de fluorescência: com fonte de luz de alta intensidade, filtros
de excitação e filtros de barreira
● Direta: pesquisa de antígenos
- emprega-se nesse método um anticorpo marcado com composto fluorescente que
reage direta,entre com o antígeno que está pesquisado
- Sua utilidade consiste em identificar bacterias em cortes de tecidos, sangue, liquor,
urina, fezes…
- Resultado positivo: produção de fluorescência
● Indireta: pesquisa de anticorpos
- antígeno é fixado em um suporte
- A amostra do paciente é adicionada, se houver a presença de anticorpos específicos
ao antígeno fixado no suporte, haverá formacao do complexo Ag/Ac
- Após a lavagem adiciona-se um conjugado de antiglobalização marcada com
composto fluorescente
- Resultado positivo: formacao de fluorescência
Radioimunoensaio:
● Nas reacoes de radioimunoensaio, sao utilizados antígenos e anticorpos marcados com
isótopos radioativos
● Iodo 131 e iodo 125
● Competição entre Ag marcado (Ag*) e Ag nao marcado (amostra) pelos sítios de combinação
dos Ac específicos (limitado)
● O resultado é medido através de aparelho contador de isótopos (são átomos - unidade básica
de matéria - de um elemento químico)
● Um dos métodos in vitro mais sensíveis para detecção de Ag
Imunoensaios enzimáticos:
● Utiliza como marcador uma enzima (fosfatase alcalina)
● Mede tanto Ac (base sólida, adiciona Ag) quanto Ag (base sólida, adiciona Ac)
● Detecta Ag ou Ac virais
● A reação positiva gera um produto colorido que pode ser medido por espectrofotometria
Imunoeletrotransferencia (western blot)
● Os componentes separados por eletroforese sao transferidos para membranas de nitrocelulose
(por contato)
● As membrana de nitrocelulose sao colocadas em presença do anticorpo específico marcado
com enzima
● A adição do substrato corresponde a enzima utilizada relvela bandas especificas para o
anticorpo utilizado
Quimioluminescencia:
● Fenômeno em que se obtém energia luminosa a partir de uma reação química
● A emissão de luz é produzida em reacoes envolvendo moléculas que emitem luz, mediada por
luminometro - immulite
● Reagente: luminol e luciferase
● Testes homogêneos:
- competição entre Ag da amostra e Ag marcados com isoluminol, pelo Ac marcado
com fluoresceína
- Quanto maior a emissão de luz menor a quantidade de Ag na amostra
● Testes heterogêneos
- aumento da luminescência indica maior concentração de Ag na amostra
- Usado para marcadores tumorais, hormônios
Fluoroimunoensaio (enzima com substrato fluorescente):
● O imunoensaio fluorescente é um método que permite a deteccao e quantificação de Ag e A c,
utilizando conjugados fluorescentes cuja emissão de luz é medida em fluorímetro