Técnicas de cultivo celular

Prévia do material em texto

26/01/2015
1
Técnicas de Cultivo Celular
Carlos Augusto Galvão Barboza
PPgPO / UFRN
Aplicações do cultivo celular
26/01/2015
2
CULTIVO - Definição
• Crescimento in vitro de órgãos, tecidos e células
em condições controladas: temperatura definida
(utilizando-se uma incubadora) e meio contendo
nutrientes e fatores de crescimento. 
Cultivo de órgãos
• Manutenção da organização estrutural nos 
tecidos sujeitos a variações experimentais no 
microambiente (ex: hormônios, drogas, Rx)
• Estudo da morfogênese, diferenciação e 
função de órgãos removidos cirurgicamente
• Comparação do crescimento e 
comportamento funcional de órgãos naturais 
e produzidos por engenharia tecidual
26/01/2015
3
Controle
Vit D
10 nM
Vit D
100 nM
Recellularized rat lung. OTT et al. Nature Medicine, 2010
Cultivo de órgãos
26/01/2015
4
 Diferentes tipos celulares crescem em cultivo
 Tecido conjuntivo: fibroblastos, osteoblastos, 
mioblastos, etc
 Tecido epitelial: ceratinócitos, células epiteliais
pulmonares, células epiteliais renais, etc
 Células sanguíneas: linfócitos, neutrófilos, etc
 Células tumorais
Cultivo de células
24 hCélulas-tronco do ligamento periodontal humano
26/01/2015
5
48 hCélulas-tronco do ligamento periodontal humano
72 hCélulas-tronco do ligamento periodontal humano
26/01/2015
6
Alguns dados históricos
• 1881: Ringer desenvolveu uma solução salina com cloreto de 
sódio, potássio, cálcio e magnésio para manter os batimentos
cardíacos de um coração isolado fora do corpo
• 1885: Roux manteve células de embriões de galinha vivas por
vários dias, utilizando uma solução salina aquecida.
• 1907: Harrison cultivou porções de medula espinal de rã em
um coágulo de linfa e observou a manutenção da viabilidade
das células nervosas in vitro por várias semanas. 
Harrison é considerado por alguns o “pai do cultivo celular”.
• 1913: Carrel demonstrou que células podem crescer por
longos períodos em cultura, desde que alimentadas
regularmente e cultivas sob condições assépticas.
Cultivo celular
VANTAGENS
 Uso de animais em experimentos é reduzido
 As células de uma linhagem são homogêneas
e têm necessidades de crescimento idênticas
 Modelos in vitro permitem o controle do 
ambiente extracelular
 Há a capacidade de monitorar vários
elementos e secreções sem interferência de 
outras moléculas biológicas, como acontece in 
vivo
26/01/2015
7
Recipientes para cultivo 
celular
Garrafas T
Placas de múltiplos poços
Placas de Petri
 São descartáveis
 Poliestireno tratado
 Esterilizados por radiação gama
 Podem ser adicionados proteínas 
adesivas (ex: poli-L-lisina) ou substratos 
específicos 
26/01/2015
8
DESVANTAGENS
 Com a remoção das células do ambiente in vivo
perde-se o contato com outros tipos celulares, 
hormônios, estruturas de suporte e diversas outras
moléculas.
 É praticamente impossível recriar o ambiente in vivo. 
As condições artificiais podem levar a célula a 
assumir um padrão distinto de diferenciação.
 Genótipo: a característica genética da célula
 Fenótipo: a aparência e comportamento da célula como resultado
do seu genótipo. Mais frequentemente, os cientistas avaliam
alterações fenotípicas nos estudos realizados com cultivo celular.
Principais avanços na tecnologia do 
cultivo celular
 Uso de antibióticos para inibir o crescimento
de micro-organismos.
 Uso da tripsina para remover células aderentes
no subcultivo
 Uso de meio de cultivo quimicamente definido
26/01/2015
9
Utilização do cultivo celular
Áreas com maior destaque:
 Modelos de sistemas orgânicos
Estudo da biologia celular básica, interações entre 
agentes patogênicos e células, efeitos de drogas nas
células, processo de envelhecimento es estudos
nutricionais
 Testes de toxicidade
Estudo dos efeitos de novas drogas
 Pesquisa em oncologia
Estudo da função de diversos agentes na
carcinogênese
CHEN, F-M.; JIN, Y. Periodontal Tissue Engineering and Regeneration:Current Approaches and
Expanding Opportunities. Tissue Engineering: Part B, v. 0, n. 0, p. 1-38, 2010.
26/01/2015
10
• CULTURAS PRIMÁRIAS
– Obtidas diretamente do tecido 
animal, podendo ser de origem 
tumoral ou não
– Culturas de tecidos normais
• Diplóides
• Dependentes de suporte
• Número limitados de divisões
Classificação do cultivo celular
Neurônios de rato
Fibroblastos humanos
• LINHAGEM CELULAR
– Único tipo celular expandido
– Linhagens de vida limitada
• Diplóides
• Manutenção de características
– Linhagens contínuas
• Crescimento constante
• Disponibilidade ilimitada
• Poucas características originais
Classificação do cultivo celular
HeLa
HSC-3
26/01/2015
11
Linhagem
celular
Espécie de 
origem
Tecido de 
origem
Morfologia
celular
Crescimento
aderente ou
suspensão
3T3 Camundongo Conjuntivo Fibroblasto Aderente
CHO Hamster
chinês
Ovário Epitelial Aderente ou 
Suspensão
BHK21 Hamster
sírio
Rim Fibroblasto Suspensão
HeLa Humano Adenocarcinoma
cervical
Epitelial Aderente ou 
suspensão
MDCK Cão Rim Epitelial Aderente
L6 Rato Músculo
esquelético
Fibroblasto Aderente
Linhagens celulares frequentemente utilizadas
26/01/2015
12
Extração e expansão de CT do 
tecido adiposo
26/01/2015
13
Como obter células de um 
fragmento tecidual ?
• Digestão 
enzimática do 
tecido
• Explante tecidual
Digestão enzimática
- Colagenase
- Dispase
26/01/2015
14
1h, 37ºC, estufa CO2
Extrato de Ligamento Periodontal
Colagenase + Dispase
Explante tecidual
Não faz digestão 
enzimática
Cultiva pequenas 
partes do tecido e 
espera o crescimento 
celular nas margens
26/01/2015
15
Adesão e expansão celular
26/01/2015
16
Equipamento básico
 Capela de fluxo laminar
 Incubadora: 37 °C, 5% de CO2, 99% umidade
 Refrigerator /Freezer
 Meios líquidos mantidos a 4 °C, enzimas (ex: tripsina) 
e componentes do meio (ex: soro) a -20 °C
 Banho-maria (37 °C)
 Microscópio invertido
 Frascos plásticos para cultivo celular -
polystyrene
26/01/2015
17
Capela de Fluxo Laminar
Capela de Fluxo Laminar
26/01/2015
18
Estufa (incubadora) de CO2
37 °C 5% CO2
26/01/2015
19
A teoria
A prática
Microscópio invertido
26/01/2015
20
CÉLULAS EM CONFLUÊNCIA:
Meios de cultivo
• A escolha depende do tipo de célula
• Comumente usa-se DMEM, α-MEM, 199, RPMI, 
HAM-F12, etc. (MEM: Minimum Essential Medium)
• O meio deve ser suplementado com antibióticos
(ex: penicilina, estreptomicina, etc) 
• Armazenado a 4 °C
• Data de validade
• Estoque: líquido x pó
26/01/2015
21
SORO (FBS, HS, etc)
0-20% de Soro
– Fatores de crescimento
– Transferrina (Fe)
– Lipídios
– Insulina
– Detoxificação
Problemas
– Agentes
infecciosos
(vírus, príons)
– Composição
variável
– Caros
26/01/2015
22
Plásticos para cultivo
Inimigos do Cultivo Celular
Microorganismos crescem ~10-50 vezes mais rápido do que 
células de mamíferos, as quais levam ~8-16 horas para se 
dividirem. Os MO são mais tolerantes a variações na temperatura, 
pH and estado nutricional do que as células.
Células são mais vulneráveis à contaminação quando há falhas 
nas técnicas assépticas. Isto pode levar ao desenvolvimento de 
MO resistentes aos antibióticos.
26/01/2015
23
Extração e expansão de CT da medula óssea
26/01/2015
24
CT medula óssea (P3)
Meio osteogênico (14 d)
Meio osteogênico (21 d)
Coloração von Kossa modif.
Conservação das células
CRIOPRESERVAÇÃO26/01/2015
25
SANTIS, G. C.; PRATA, K. L. Cryopreservation of hematopoietic progenitor cells. Revista de Medicina, 
Ribeirão Preto, v. 42, n. 1, p. 36-47, 2009. http://www.fmrp.usp.br/revista
PROCEDIMENTOS DE CRIOPRESERVAÇÃO
26/01/2015
26
DELINEAMENTO DO ESTUDO:
P1
P3
Células 
criopreservadas
P1
P2
Expansão
P3
P2
Análise da adesão e
proliferação celular: 24; 48;
72 horas.
OBTENÇÃO E PROCESSAMENTO DOS DENTES:
Lavagens de 10
minutos: meio α-
MEM, Penicilina,
Estreptomicina,
Gentamicina e
Anfotericina B.
26/01/2015
27
Cultivo celular
5% 
CO2
37ºC / 
1h
Remoção do Ligamento 
periodontal
Digestão enzimática 
(colagenase/dispase)
Centrifugada a 1200 rpm durante
5 minutos.
A solução foi aspirada e processada em filtro de 
70 µm.
26/01/2015
28
Células cultivadas.Sobrenadante é removido. 
Células precipitadas. 
Cultivo celular
Passagem pelo filtro 
(70µm)
Armazenadas em P60 
(Alfa-MEM + 15% SFB)
Cultivo celular
(mantidas na incubadora, 
37 ºC e 5% de CO2)
26/01/2015
29
CRIOPRESERVAÇÃO DAS CÉLULAS MESENQUIMAIS 
INDIFERENCIADAS DO LIGAMENTO PERIODONTAL:
1 x 106 de células
SFB
10 % DMS0
1 mL
Solução homogênea contendo
células em SFB.
PROTOCOLO DE CRIOPRESERVAÇÃO
► 2 horas à 4º C, 18 horas à -20º C, e então mantidas à -85º C.
26/01/2015
30
CURVA DE CRESCIMENTO
CONCLUSÃO:
O processo de criopreservação, após um período
de 30 dias, não exerceu influência na capacidade de
adesão e proliferação de células mesenquimais
indiferenciadas do ligamento periodontal de
terceiros molares humanos.
26/01/2015
31
einstein. 2014;12(1):75-81
26/01/2015
32
Ensaios de cicatrização de ferida
Ensaios de invasão celular
26/01/2015
33
In conclusion, the present results show that LLLT at
660 nm using low doses facilitates the proliferation and
invasion of SCC25 cells by influencing the expression of
cyclin D1, β-catenin, E-cadherin, and MMP-9. These
findings suggest that the use of laser therapy, particularly
a dose of 1.0 J/cm2, should be avoided in situations in
which increased cell proliferation and invasion can disturb
the balance between cells and tissues.
26/01/2015
34
Muito obrigado!
email: cbarboza@cb.ufrn.br