Técnicas de Diagnóstico Genético

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Técnicas de 
Diagnóstico Genético
Genética Humana
Prof. Gustavo Moraes Holanda
Extração de DNA/RNA
• Lise celular: quebra da célula para acessar o DNA; 
• Remoção de lipídios. Remoção ou separação da membrana lipídica e restos 
celulares;
• Desproteinação do extrato celular;
• Remoção do DNA/RNA;
• Precipitação/agregação/eluição de DNA/RNA.
Extração de DNA/RNA
• Detergente: solubilização de membranas;
• Sal: dissociação de proteínas;
• Solução tampão: estabilização de pH;
• Inativador de RNAses/DNAses: proteção do DNA genômico e RNA;
• Álcool: precipitação de DNA/RNA.
Enzimas de restrição tipo I
Construção de moléculas de DNA 
recombinante
Construção de moléculas de DNA 
recombinante
Construção de moléculas de DNA 
recombinante
Clonagem gênica em vetores 
bacterianos
• Óperon lac: ativado na ausência 
de glicose e presença de lactose;
• Bactérias azuis: não houve 
inserção = degradam lactose;
• Colônias brancas: houve inserção 
= não degradam lactose;
• Permite seleção das colônias de 
interesse.
O que é a PCR?
• Reação de cadeira da Polimerase (PCR)
• Amplificação de um segmento específico de DNA dentro de um
genoma (gene ou parte dele, regiões não codificantes, genes de
rRNA, etc);
• “Xerox” molecular;
• Imita o processo in vivo de replicação
PCR
Objetivo da PCR
Amplificar uma sequência
específica de DNA, como
objetivo de torná-la abundante e 
disponível para diversas técnicas
de biologia molecular.
Alvos da PCR
Os alvos a serem considerados no PCR são as regiões que flanqueiam a 
sequência específica de DNA a ser amplificada, a qual pode ser um 
gene inteiro ou somente uma região pequena.
TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA
O . . . . Representa o meio da sequência de DNA, e não há problemas
em não conhecê-la para poder amplificá-la.
PCR: variação de temperatura
Ciclos de temperatura
1. Separação das fitas de DNA;
▪ Inicial: 4 min/94 °C
2. Ligação dos primers;
▪ 60 – 90 s
3. Extensão da cadeia de DNA
▪ 1 a 2 min / 72 °C
▪ Varia conforme o tamanho
Introdução à eletroforese
• ELETROFORESE: migração de 
moléculas ionizadas acordo com
suas cargas elétricas e pesos
moleculares em campo elétrico
constante.
• A migração das partículas 
depende do seu tamanho e carga,
além da DDP a que foram
submetidas
Introdução à eletroforese
Técnica de separação de partículas de DNA, RNA ou proteínas, através da 
aplicação de uma diferença de potencial (corrente elétrica)
as partículas são separadas de acordo com o tamanho (massa)
Eletroforese
• DNA: carga negativa
▪ Tem tendência a se dirigir ao polo 
positivo quando sujeito a um campo 
elétrico
• Serve para separar moléculas por 
tamanho/carga elétrica
▪ Proteína deve ser desnaturada com 
detergente (SDS)
• Técnica utilizada à exaustão em 
trabalhos de biologia molecular
PCR e eletroforese
• Eletroforese em gel de 
agarose;
• Diagnóstico molecular;
▪ Patógenos e alterações 
genéticas;
• Testes de identificação 
humana;
• Genotipagem e 
sequenciamento
Sequenciamentopelométodode Sanger
Frederick Sanger
13 Aug 1918 – 19 Nov2013
• Prêmio Nobel de Química em 1958 e 1980
• Publicou o método de sequenciamento em 1977
Sequenciamento 
por Sanger
Sequenciamento de Sanger
Plataformas de 
sequenciamento
• Roche: 454
• Life technology: SOLiD / Ion 
Torrent
• Illumina: Genome Analyzer / 
Hiseq/ Miseq/ Miniseq
• Pacific Biosciences: PacBio
• Oxford: Nanopore
Análise de NGS
Galaxy Project – Análise de NGS
Resultados
• Leitura do Artigo “Aconselhamento genético” (PINA-NETO, 2008), 
disponível em:
• https://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0021-
75572008000500004&script=sci_arttext
• Assistir o vídeo “What Is Genetic Counseling?” disponível em:
• https://www.youtube.com/watch?v=7yIW0L9dLCQ
Conteúdo do AVA