Técnicas de expressão,purificação e análise de proteínas

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Técnicas de expressão, 
purificação e análise de 
proteínas 
 
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Técnicas de expressão, purificação e
 análise de proteínas 
 
↪Todo conhecimento disponivel a respeito de uma est
rutura e função de proteinas foi obtido a partir de estud
os com porteinas isoladas 
 
Purificar proteínas 
 
↪A purificação é um passo fundamental 
no estudo de proteínas 
 
↪ Uma preparação pura é essencial para que 
as propriedades e atividades de uma proteina possam s
er determinadas 
 
↪Geralmente se obtém até 98% de pureza 
 
↪ Como eu consigo a proteína ? 
1- Comprar a proteína 
2- Isolar a proteína diretamente da célula ou do 
tecido d organismo ( quando o material é 
naturalmente abundante) 
 
3 – usar biologia molecular para expressar a 
proteína de interesse ( quando o material é 
geralmente pouco abundante ) 
 
Purificação de proteínas 
↪ Para purificarmos a proteína, precisamos 
escolher a proteína de um organismo à ser 
estudado , isolamos a sequência genética que 
codifica essa proteína e essa sequencia é 
inserida em um plasmídeo 
↪ Crescimento da célula sobre agitação em uma 
temperatura específica – agitador rotatório – 
shaker – purificando e analisando 
 
Etapas para expressar proteínas 
Primeiro passo 
- seleção do organismo - 
↪ Selecionar um organismo para a expressão da 
proteína; proteínas comuns entre espécies são 
mais fáceis são mais fáceis de se trabalhar, já que 
podem ser obtidas de tecidos de animais 
domésticos ou microrganismos de fácil obtenção 
,como E Coli e Saccharomyces cerevisiae. 
↪ Outras proteínas necessitam de organismos 
mais robustos para serem expressas, já que 
necessitam sofrer alguma regulação pós 
traducional, sendo esse motivo, expressa em 
células de insetos, mamíferos e levedura 
↪Heteróloga – proteína que não é do organismo 
para que ele possa expressa-la 
Proteínas que necessitam de modificações pós-
traducionais ( glicosilação, metilação fosforilação) não 
podem ser produzidas em bactérias – não possuem a 
maquinaria pós traducional – 
As células eucarióticas possui a maquinaria de 
regulação pós traducional 
Ex : Saccharomyces cerevisiae ,pichia pastoris 
Pode ser utilizada para produção de proteínas 
com fins farmacêuticos ( não produzem 
endotoxinas ) 
Crescimento rápido 
Fácil manipulação genética 
Permite a produção de proteínas secretadas 
 
↪Modelo de células de insetos -eucarioto 
Demanda mais tempo 
Utilizado para proteínas onde há dificuldade de 
expressão em E.coli 
Utiliza baculobirus como modelo de entrega do 
gene de interesse que dará origem à proteína 
desejada _ ou seja não utiliza um plasmídeo- 
Produz grande quantidade de proteínas, incluído 
aquelas com modificações pós traducionais . 
Algumas proteínas podem ser tóxicas para alguns 
organismos. E para isso modifica-se o tipo de 
célula. 
 
↪Modelo – eucarioto – mamífero 
É sugerido para análise de proteínas que 
necessitam de modificações pós traducionais 
especificas de mamíferos 
Lento crescimento celular 
Custo elevado 
Ex: células de ovário . 
↪ nos mamíferos e insetos não é possível fazer a 
diferenciação de inserção de genes de controle 
(antibióticos) 
 
Segundo passo 
– clonagem e expressão da proteína – 
 
↪Após realizar a clonagem e a expressão , utilizando 
um plasmídeo que possua um gene de resistência a 
antibiótico, em promotor que seja regulado pela 
lactose ou seu análogo, o IPTG, para induzirmos essa 
expressão em um meio apropriado, rico em 
nutrientes para o organismo selecionado. 
↪ A proteína clonada pode constituir até 40% da 
proteína celular total do micoorganismo, tornando seu 
isolamento muito fácil 
O IPTG – análogo de lactose – ou a própria lactose 
– ligando ao promotor lac , ativando a expressão da 
proteína de interesse. 
 
Terceiro passo 
 -remoção da proteína da célula - 
 
↪ Após a expressão, a proteína deve ser removida 
da célula onde foi expressa e , para isso, fazemos uso 
de tampões que auxiliarão no processo de lise celular 
↪ A lise da célula pode ser alcançada através de 
métodos não enzimáticos, como o uso de sonicação 
ou prensa de french, ou através da utilização de 
enzimas hidrolíticas, como a lisozima, ou ainda através 
da utilização de detergentes. 
 
A maioria dos procedimentos para romper a 
célula usa algum tipo de esmagamento ou 
moagem, seguido por filtração ou centrifugação 
para remover as partículas insolúveis maiores 
Processos para romper a parede celular 
Sonicação 
↪ Utiliza energia proveniente do ultra-som para 
agitar as partículas da solução, desfazendo 
interações intermoleculares, sendo capaz de 
destruir a membrana celular , liberando o 
conteúdo citoplasmático . 
 
 
↪ Proteínas de interesse, proteínas da bactérias e 
todas as organelas do organismo 
↪ Desvantagens 
Alta produção de calor ---- fazer o processo 
dentro de gelo, pois esquentam muito. 
Barulho 
Prensa de french ( french press) 
↪ Aplica altas pressões na atmosférica, favorecendo 
a lise celular . Atinge pressões de até 40k psi 
↪ Vantagens frente à sonificação 
Gera menos artefatos, consome menos 
tempo e não aquece a amostra 
 
 
 
↪ 
 
 
↪Desvantagens 
Difícil limpeza 
Não permite o uso de grandes volumes 
↪ Esses processos podem ser potencializados usando 
outros métodos 
 
Métodos enzimáticos ---- lisozima 
↪ A lisozima é uma proteína catiônica capaz de 
hidrolisar algumas ligações presentes nos 
peptideoglicanos , importantes constituintes da parede 
celular de bactérias 
 
Detergentes 
↪ Solubiliza as proteínas de membrana e forma poros 
nas proteína - rompendo a membrana 
↪Pode potencializar outros métodos de remoção 
↪ Após a lise, a fim de evitar a exposição da proteína 
ao meio bacteriano rico em proteases e em 
temperaturas e pH não favoráveis à proteína, 
podendo degrada-la. Para evitar tal exposição, 
devemos estocas as proteínas à baixas temperaturas, 
como -80ºC ou -196 ºC até o momento de sua 
purificação 
↪ Utilizando nitrogênio liquido, a água intra e 
extracelular congelam em taxas impedindo esses 
efeitos maléficos 
 
 
 
 
 
 
↪ Uma vez removida a proteína de interesse de seu 
ambiente natura, ele fica exposa a muitos agentes que 
podem danifica-las de forma irreversível. Deve-se 
sempre considerar fatores para que não haja a 
desnaturação da proteína 
pH 
temperatura 
 
↪ Além disso, deve-se considerar a liberação de 
enzimas degenerativas como nucleases e proteases 
↪As soluções contendo as proteínas devem ser 
armazenadas de preferência a -80 e 196 c , garantindo 
seu armazenamento por um longo tempo. 
↪ Pode ser feito antes da etapa de purificação e 
depois do método de purificação 
↪ Algumas proteínas tem um tempo de 
congelamento máximo correto 
 
Técnicas utilizadas para purificar uma 
proteína 
Quarto passo 
- separação da proteína de interesse - 
↪ As proteínas são purificadas por técnicas de 
fracionamento que consideram as diferentes 
propriedades físico-quimicas das proteínas 
↪ A ideia é eliminar seletivamente os componentes 
da mistura de proteínas provenientes da célula lisada , 
de forma que somente a substância de interesse 
permaneça 
↪ Técnicas de separação das proteínas de interesse 
 
Técnica ultracentrifugação 
↪ A ultracentrifugação utiliza altas velocidades, 
permitindo a separação de frações celulares e ainda 
permite a separação de proteínas de acordo com a 
característica de sedimentação, que é dependente da 
forma e da massa molar da proteína 
↪Utiliza altas velocidades, permitindo a separação de 
frações celulares 
↪ Permite ainda a separação de proteínas de acordo 
com a característica de sedimentação, que é 
dependente de forma e de massa molar da proteína. 
↪ Formação do pellet ( material precipitado ) 
 
 
 
↪ Existe utltracentrifugação de ângulos móveis 
 
 
↪ Divisão por densidade das moléculas - geralmente 
é utilizado esse método para purificar vírus .Salting out 
↪ O Salting-out é a adição exagerada de sal, o que 
torna a solubilidade da proteína menor, isso ocorre 
devido à competição de moléculas de água pelo sal 
adicionado, restando na solução muitos íons solvatados 
e pouco solvente para dissolver as proteínas . 
↪ Isso ocorre devido à competição de moleculas de 
água pelo sal adicionado, restando na solução muitos 
íos solvatados e pouco solvente para dissolver as 
proteínas 
↪ As interações proteína proteína são favorecidas, 
uma vez que as interações proteína água estão 
desfavorecidas 
 
 
↪ Geralmente se utiliza o sulfato de amônio- devido à 
elevada solubilidade em água 
 
 
Cromatografias 
↪ Cromatografia é o melhor e mais poderoso método 
de fracionamento, baseia-se no tamanho, carga e 
afinidade da proteína.. Utiliza uma fase móvel ( 
solvente) e uma fase estacionária ( matriz). 
↪ A mistura de substância a ser fracionada é 
dissolvida em um líquido que é chamado de fase 
móvel e ele é passado através de uma coluna 
contendo uma matriz sólida e porosa chamada de fase 
estacionaria. A interação do soluto com a fase 
estacionária permite a separação dos diferentes 
solutos 
 
Cromatografia em papel 
 
↪ Na cromatografia em papel utiliza-se como fase 
estacionária papel-filtro e a fase móvel desloca-se 
através da fase estacionária por ação da capilaridade ( 
arrasta a substância pela qual tem mais afinidade, 
separando-a das substâncias com maior afinidade pela 
fase estacionária) 
↪Como as substancias são incolores, a revelação é 
feita através da utilização de luz UV, vapores de iodo, 
soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de 
potássio 
↪ É utilizada para separação de substâncias polares 
 
 
↪ Pode separar as substâncias como se fosse um gel 
bidimensional invertendo o filtro e colocar um 
segundo solvente para separar cada vez mais as 
amostras 
- utilizados para separar aminoácidos – 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cromatografia líquida 
↪ A cromatografia líquida pode ser clássica ou de alta 
eficiência : Na cromatografia líquida (CLC) , a fase 
móvel é arrastada através da coluna apenas por força 
da gravidade, enquanto que na cromatografia de alta 
eficiência (CLAE/HPLC) se utilizam fases estacionárias 
de partículas menores , sendo necessário o uso de 
uma bomba de alta pressão para eluição da fase 
móvel. 
 
 
↪Emprega sistemas automatizados com aplicação 
precisa de amostra, fluxo controlado em altas 
pressões e detectores de fluorescência 
↪ Vantagens: 
Melhora significativamente a velocidade das 
corridas, a resolução e a reprodutibilidade das 
separações 
 
Permite explorar diferentes propriedades das 
proteínas 
Ligação e/ ou 
interação com 
outras 
moléculas ---- 
cauda de 
afinidade na 
proteína e a 
superfície da 
fase 
estacionaria cotem uma molécula ao qual a cada de 
uma proteína tenha afinidade 
 
 
Cromatografia de troca iônica 
↪ A cromatografia de troca iônica usa uma matriz de 
polímero sintético (resina) contendo grupos 
carregados ligados . Resina aniônica é uma resina 
trocadora de cátions, sequestrando cargas positivas, já 
a resina catiônica é uma resina trocadora de ânions, 
sequestrando cargas negativas 
↪ Dois tipos 
Aniônicas – resinas trocadoras de cátions : 
sequestram cargas positivas 
Catiônica – resina trocadora de Ânions : sequestram 
cargas negativas 
↪ OBS: A afinidade de ligação depende da presença 
de outros ions e do ph da solução. Sendo assim, a 
proteína que se liga com alta afinidade apenas sairá 
em pH ou concentração de sal especifica 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cromatografia de gel filtração (exclusão por tamanho) 
↪A cromatografia de gel filtração ( exclusão por 
tamanho) usa uma matriz que contêm grânulos de 
polímeros que apresentam ligações cruzadas, com 
poros ou cavidades planejados em um tamanho 
particular. A separação se dá por tamanho : proteínas 
de maior peso molecular são eluidas antes das de 
menor peso , que ficam retidas nos poros dos grãos 
de polímero, são eluídas depois 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
↪ Separação por tamanho : proteínas de maior peso 
molecular são eluidos antes das de menor peso que 
ficam retidas nos poros dos grãos de polímero 
↪ As moléculas grandes atravessam a coluna mas 
rapidamente que as moléculas pequenas, que passam 
através dos poros 
 
 
 
 
↪ Particularidade: fração de exclusão, tudo aquilo que 
conseguimos excluir da coluna – que são as proteínas 
de tamanhos menores – as proteínas de inclusão são 
as proteínas pequenas 
 
 
 
 
 
 
Cromatografia de afinidade 
↪ Cromatografia de afinidade usa matriz impregnada 
de um ligante de alta afinidade pela proteína de 
interesse para separá-las das demais. A eluição é feita 
com um ligante e sal, que interfere nas alterações 
iônicas enfraquecendo a ligação da proteína com a 
coluna. 
↪ Utiliza-se uma matriz impregnada de um ligante de 
alta afinidade pela proteína de interesse para separa-
los dos demais 
 
 
↪ A eluição é feita com um ligante e sal, interferindo 
nas interações iônicas enfraquecendo a ligação da 
proteína 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ex : insulina – proteína receptor de insulina 
 
 
 
Técnicas para saber se uma proteína foi 
efetivamente purificada 
Quinto passo : 
-avaliar a separação da proteína- 
 
Eletroforese em gel 
↪ A eletroforese em gel de poliacrilamida , que avalia 
a migração diferencial de proteínas através do campo 
elétrico, permitindo a separação por tamanho e por 
mobilidade eletroforética. Utiliza-se o detergente SDS 
para desnaturar as proteínas, fazendo com que a 
proteína apresentem formas similares e razões 
carga/massa parecidas, permitindo a separação apenas 
pelas diferenças de tamanho. A utilização do redutor 
B-mercaptoetanol permite avaliar proteínas de 
múltiplas subunidades. A revelação dos géis é feita por 
corantes específicos, como o azul de coomassie e 
nitrato de prata 
 
 
↪ Como funciona 
 
 
↪ Gel cassete --- gel de policrilamida e disacrilamida – 
pra juntas formarem uma malha que separa as 
proteínas por tamanho 
↪ Eletrodo – polo negativo e polo positivo – 
migração do negativo para o positivo – 
↪ Utiliza géis de agarose ou poliacrilamida com 
tamanho de poros característicos 
↪ A mobilidade das moléculas pequenas é maior do 
que a mobilidade das moléculas 
 
 
↪ Acrilamida e desacrilamida forma uma rede de 
poros com diferentes tamanhos e esse polímero 
formado é catalisada por dois reagentes – TEMED e 
persulfato de amónio . 
↪ De acordo com a quantidade de acrilamida 
conseguimos separar as proteínas por tamanho – 
quanto maior a porcentagem do gel separa melhor 
as proteínas menores – 
↪ SDS – PAGE 
Utiliza-se detergente SDS para desnaturar as proteínas 
fazendo com que as proteínas apresentem formas 
similares e razões carga/massa parecidas , permitindo 
a separação apenas pelas diferenças de tamanho. 
↪ A utilização do redutor B-mercaptoetanol permite 
avaliar proteínas de múltiplas subunidades. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
↪ A revelação dos géis de poliacrilamida é feita 
através de colorações especificas 
↪ Coramos os géis com dois tipos de marcação, uma 
com marcação de 
Comassi blu – azul de comassi – quando se 
cora com comassi é possível descorar ele 
Nitrato de prata -- não é possível retirar a 
cor 
↪ A técnica de corar por prata é mais sensível e é 
possível avaliar algumas contaminação que antes não 
conseguimos detectar 
 
A focalização isoelétrica 
 
A focalização isoelétrica permite a separação das 
proteínas pelas cargas, de acordo com o seu ponto 
isoelétrico. As proteínas migram em busca do ponto 
onde PH = pI ao alcança-lo, sua carga torna-se nula e 
migração cessa . 
↪ Permite a separação das proteínas pelas cargas, de 
acordo com o seu ponto isoelétrico 
↪ As proteínas migram em busca do pH = pI 
 
 
 
Eletroforesebidimensional 
↪ A eletroforese bidimensional combina a eletroforese 
desnaturante e a focalização isoelétrica: primeiro 
ocorre a migração eletroforetica e depois a 
separação no gel de poliacrilamida 
↪ Combina a eletroforese desnaturante e a 
focalização isoelétrica 
↪ Primeiro separa a amostra por focalização 
isoelétrica e depois pega a fita de gel e põe ela sobre 
um gel de poliacrilamida ( gel desnaturante) e aplica 
novamente um campo elétrico 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Sexto passo : 
- avaliar se a proteína separada é a proteína de -
interesse 
 
Western blot 
↪ A técnica de western – blot baseia-se na 
separação das proteínas através da eletroforese em 
gel. As proteínas após a separação são transferidas do 
gel para uma membrana de nitrocelulose, onde são 
utilizados anticorpos específicos capazes de 
reconhecer e se ligar à proteína de interesse . 
↪ Baseia-se na separação das proteínas através da 
eletroforese em gel 
↪ As proteínas após a separação são transferidas do 
gel para uma membrana de nitrocelulose, onde são 
utilizadas anticorpos específicos capazes de 
reconhecer e se ligar à proteína de interesse 
 
 
 
 
↪ Os anticorpos específicos para proteínas de 
interesse com anticorpo secundário com uma fonte 
de fluorescência -- géis para bloting não são corados 
com comassi 
 
 
 
 
Espectrometria de massa 
↪ Espectrometria de massa permite identificar a 
massa e a sequência de peptídeos. O espectrômetro 
bombardeia a proteína com elétrons para produzir 
moléculas carregadas ( ionizadas ). Estas moléculas são 
capazes de atravessar um campo magnético que 
curva sua trajetórias de modos diferentes 
dependendo de suas massas . 
↪ Permite identificar a massa e a sequencia de 
peptídeos 
 
 
↪ No primeiro momento há a remoção de um e da 
camada de valência produzindo um íon molecular 
carregado positivamente 
↪ Faz com que haja uma aceleração através dessas 
placas que são carregadas de forma negativamente e 
pela presença de um campo elerico separamos a s 
amostras pela relação carga e massa – quanto maior 
as cargas e as massa das eletroproteínas a separação 
ocorre de forma mais rápida 
 
 
 
 
 
Sequenciamento de Sanger 
↪Sequenciamento de Sanger hidrolisa a proteína 
toda, permitindo apenas a identificação do aminoácido 
terminal. As repetições do ciclo permitem o 
conhecimento da sequência interna 
1- Identificar e separar as subunidades – através 
da utilização, por ex de compsotos 
fluorescentes capazes de se ligar 
especificamente as aminas primárias ( n 
terminal ) 
 
 
2 – clivar as pontes de enxofre inter e intra 
cadeia – originam cadeias menores e mais 
fáceis de serem sequenciadas 
 
 
3- Clivagem de polipeptídeos – utilizam 
endopeptidases ( enzimas que catalisam a 
hidrólise de ligações peptídicas internas ) 
 
 
Como avaliar a estrutura de uma proteína 
Sétimo passo : 
- colocar a proteína em tampão próprio para as -
análises 
 
↪Diálise : importante para remover ela de algum 
tampão que não seja o tampão experimental que 
quer utilizar 
 
 
↪ Podemos utilizar um composto químico ( ativador ) 
que reagir com o grupo carboxila de um aminoácido 
tornando-o mais reativo ao grupo amina de outro 
aminoácido , resultando na liberação de água e 
formação da ligação peptídica entre eles 
↪ Para analisar as proteínas 
Absorbância 
A maioria das proteínas contém aminoácidos 
aromáticos ; que são capazes de absorver 
luz em 280 nm . 
 
Espectrometria 
↪ O espectrofotômetro é um aparelho capaz de 
medir intensidade de luz em função da cor, ou mais 
especificamente pelo comprimento de onda da luz 
 
 
 
 
 
↪ Aparelho capaz de quantificar a transmitância da luz 
↪ É um aparelho que faz passar um feixe de luz 
monocromático através de uma solução, e mede a 
quantidade de luz que foi absorvida por essa solução. 
 
Espectrometria de Fluorescência 
 
↪ Avalia o grau de exposição de seus resíduos de 
triptofano ao solvente na presença e ausência de 
agentes desnaturantes, como ureia, guanidina e até 
mesmo detergentes, como o SDS a C124 possui 
estrutura ela terá seu espectro de fluorescência do 
triptofano desviado para o comprimento de onda 
maiores, indicando que esse triptofano está inserido na 
estrutura proteica, ao passo que, se a C124, na 
presença dos agentes desnaturantes, estiver 
desenovelada seu espectro de fluorescência do 
triptofano estará desviado para comprimentos de 
ondas menores, indicando que esse triptofano está 
exposta da estrutura proteica . 
↪Os aminoácidos aromáticos quando e possui 
estrutura ,excitados emitem fluorescência 
↪ Fluorescência é a capacidade de uma substância de 
emitir luz quando exposto a radiações de tipo 
ultravioleta 
↪ Durante a emissão, uma grande quantidade de 
energia é produzida. Sendo assim, a fluorescência é 
comumente observada com a intensidade de 
emissão em uma gama de comprimentos de onda . 
 
Fluorescência : equipamento fluorímetro 
↪ Nesse equipamento avaliamos o quanto que esse 
triptofano está inserido em determinadas membranas. 
Em um ambiente não polar, onde está mais exposto 
ao solvente ele libera mais energia – em 
comprimento de ondas maiores e menos energéticos 
se ele estiver em um ambiente mais internalizado – 
menos exposto ao solvente- significa que a proteína 
está mais enovelada – comprimento de onda menor 
e mais energético 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dicroísmo circular 
 
↪ Dicroísmo circular, a partir da análise de um 
espectro obtido a partir de uma luz circularmente o 
polarizada incidida sobre a amostra contendo C124, 
podendo dizer se a mesma possui estrutura em alfa- 
hélice , folha beta ou randômica, dependendo do perfil 
de picos do espectros obtido 
↪Avaliamos um feixe de luz absorvido por uma 
amostra opticamente ativas 
↪Incidência de uma luz circularmente polarizada para 
direita e para esquerda 
↪ Absorção – diminuição da amplitude da onda 
↪Moléculas biológicas como proteínas e DNA são 
compostos de elementos com atividade ótica e eles 
podem adotar diferentes conformações tridimensionais 
apresentando diferentes espectros de Dicroismo 
circular 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
↪A técnica de dicroísmo avalia a estrutura secundária 
de proteína 
 
Espectroscopia de infravermelho 
↪ Por transformada de Fourier 
↪ Espectrometria de infravermelho – alternativa de 
avaliar a estrutura secundária 
↪ Cada um dos picos é característicos de folhas betas 
, alfa hélice e estruturas rondômicas .