Testes Sorológicos Primários - Anticorpos Marcados - Imunologia Veterinária

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TESTES SOROLÓGICOS 
PRIMÁRIOS:
REAÇÕES COM 
ANTICORPOS MARCADOS
•• UtilizaUtilizaçção de anticorpos em Ensaios Sorolão de anticorpos em Ensaios Sorolóógicos gicos ���� 1954: Teste 1954: Teste 
de de ImunofluorescênciaImunofluorescência ((WellerWeller & & CoonsCoons); 1959: ); 1959: 
RadioimunoensaioRadioimunoensaio ((YalowYalow & & BersonBerson))
•• Anos 60: enzimas conjugadas a antAnos 60: enzimas conjugadas a antíígenos e anticorpos (genos e anticorpos (NakaneNakane
& Pierce, 1967; & Pierce, 1967; AvrameasAvrameas, 1969), 1969)
•• Anos 70: ELISA (Anos 70: ELISA (EngvallEngvall & & PerlmannPerlmann, 1971); produ, 1971); produçção de ão de 
anticopos anticopos monoclonaismonoclonais ((KohlerKohler & & MilsteinMilstein, 1975) , 1975) ����
desenvolvimento desenvolvimento de novos testes (kits comerciais)de novos testes (kits comerciais)
•• MMéétodos todos colorimcoloriméétricostricos, radioativos, fluorescentes, , radioativos, fluorescentes, 
quimioluminescentesquimioluminescentes, etc., etc.
•• Agentes infecciosos, anticorpos, hormônios, Agentes infecciosos, anticorpos, hormônios, alaléérgenosrgenos, , 
poluentes, etc.poluentes, etc.
Ronald & Stimson, 1998
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��PrimPrimááriosrios ���� interainteraçção direta entre antão direta entre antíígeno e anticorpo: geno e anticorpo: 
RadioimnoensaioRadioimnoensaio, , ImunofluorescênciaImunofluorescência, ELISA , ELISA 
��SecundSecundááriosrios ���� conseqconseqüüências da interaências da interaçção entre antão entre antíígeno geno 
e anticorpo e anticorpo →→→→→→→→ relarelaçção com o estado fão com o estado fíísico do antsico do antíígeno: geno: 
ImunodifusãoImunodifusão, Aglutina, Aglutinaçção, Fixaão, Fixaçção de Complementoão de Complemento
Van Oss, 2000; Janeway, 2001
Ac + Ag Ac-Ag
Ka
Kd
Ka = 1010 M-1 →→→→→→→→ alta afinidade
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�� SinalSinal ���� integraintegraçção de impulsos elementares (ligaão de impulsos elementares (ligaçção ão 
parparáátopotopo--epepíítopotopo): Espec): Especíífico ou fico ou InespecInespecííficofico (rea(reaçções ões 
cruzadas)cruzadas)
�� RuRuíídodo ���� qualquer reatividade qualquer reatividade inespecinespecííficafica resultante de resultante de 
outras causas que não a reaoutras causas que não a reaçção ão AgAg--AcAc e que pode interferir e que pode interferir 
na capacidade discriminatna capacidade discriminatóória do testeria do teste
�� Limiar de detecLimiar de detecççãoão ���� menor quantidade de impulsos menor quantidade de impulsos 
elementares capazes de desenvolver um sinal elementares capazes de desenvolver um sinal 
discriminatdiscriminatóório, correspondendo a um resultado positivorio, correspondendo a um resultado positivo
�� Anticorpos marcadosAnticorpos marcados ���� sondas (enzimas, sondas (enzimas, fluorocromosfluorocromos, , 
radioisradioisóótopos)topos)
Deshpande, 1996
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�� Limiar de detecLimiar de detecçção: nano ou ão: nano ou picogramaspicogramas
�� QuantificaQuantificaçção de hormônios, drogas, marcadores ão de hormônios, drogas, marcadores 
tumoraistumorais, , alaléérgenosrgenos, anticorpos e ant, anticorpos e antíígenos microbianosgenos microbianos
�� Quantidade de reagente marcado (Quantidade de reagente marcado (AgAg ou Ac) quantifica o ou Ac) quantifica o 
AgAg ou Ac nãoou Ac não--marcado na amostra marcado na amostra ���� competicompetiççãoão
�� MarcaMarcaçção com ão com radioisradioisóótipostipos ((125125I e I e 131131I)I)
�� DeterminaDeterminaçção de curvasão de curvas--padrãopadrão
�� DesvantagensDesvantagens: custo, vida m: custo, vida méédia dos reagentes e risco dia dos reagentes e risco 
operacionaloperacional
Ferreira & Ávila, 1996
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Ac + Ag* AcAg*
���� Lembrando o equilíbrio!
AcAg* + Ag AcAg* + AcAg + Ag*
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���� Curva-padrão
���� Fase Sólida
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�� Anticorpos conjugados com Anticorpos conjugados com fluorocromosfluorocromos
�� FluorocromosFluorocromos: substâncias que absorvem luz de menor : substâncias que absorvem luz de menor λλλλλλλλ
e, quando excitados com luz ultravioleta, emitem luz de e, quando excitados com luz ultravioleta, emitem luz de 
maior maior λλλλλλλλ (fluorescência)(fluorescência)
�� Mais utilizados: Mais utilizados: isiotiocianatoisiotiocianato de de fluorescefluoresceíínana e e rodaminarodamina
(absorvem em (absorvem em λλλλλλλλ diferentes, mas emitem luz na faixa do diferentes, mas emitem luz na faixa do 
visvisíível)vel)
�� Teste direto Teste direto ���� pesquisa de antpesquisa de antíígenos (cgenos (céélulas ou tecidos)lulas ou tecidos)
�� Teste indireto Teste indireto ���� pesquisa de anticorpospesquisa de anticorpos
�� Referência para sorodiagnReferência para sorodiagnóóstico de vstico de váárias doenrias doenççasas
Ferreira & Ávila, 1996
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� Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível; 
simples execução; determinação de classes e subclasses de 
anticorpos
� Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição 
da fluorescência sob irradiação; subjetividade na leitura; 
ausência de automação
Laranja578480, 545, 565Ficoeritrina
Vermelho620596Vermelho Texas
Vermelho570552Rodamina
Verde525495Fluoresceína
CorEmissão (nm)Excitação (nm)Fluorocromo
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�� DetecDetecçção e localizaão e localizaçção de antão de antíígenos celulares/teciduaisgenos celulares/teciduais
�� Anticorpos conjugados com enzimas Anticorpos conjugados com enzimas ���� conversão de conversão de 
substrato incolor em produto colorido (deposisubstrato incolor em produto colorido (deposiçção pode ser ão pode ser 
observada diretamente ao microscobservada diretamente ao microscóópio pio óóptico)ptico)
�� Enzimas mais utilizadas: Enzimas mais utilizadas: PeroxidasePeroxidase; ; FosfataseFosfatase Alcalina, Alcalina, 
ββββββββ--GalactosidaseGalactosidase e Glicose Oxidasee Glicose Oxidase
�� MMéétodo direto todo direto ���� AcsAcs primprimáários conjugados (detecrios conjugados (detecçção de ão de 
antantíígenos)genos)
�� MMéétodo indireto todo indireto ���� AcsAcs secundsecundáários conjugados (detecrios conjugados (detecçção ão 
de antde antíígenos ou anticorpos)genos ou anticorpos)
�� Desvantagens: atividade enzimDesvantagens: atividade enzimáática endtica endóógena, gena, 
armazenamento inadequado dos conjugadosarmazenamento inadequado dos conjugados
Ferreira & Ávila, 1996; Kumar, 2000
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Detecção de bacilos nas 
vilosidades intestinais
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Marrom
Glicose Oxidase
Glicose/trinitroblue tetrazolium (TNBT)
Azul5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- β-D-galactosidase (IbGa)
ββββ-Galactosidase
Azul-preto5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate (BCIP), nitroblue tetrazolium (NBT)
Fosfatase alcalina
Azul-pretoP-Phenylenediamine dihydrochloride
Azul4-Chloro-1-naphthol (CN)
Marrom3,3´-Diaminodenzidine tetrahydrochloride (DAB)
Peroxidase
ProdutoSubstrato
Kumar, 2000
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�� PAP (PAP (peroxidaseperoxidase--
antiperoxidaseantiperoxidase) e APAAP ) e APAAP 
((fosfatasefosfatase alcalinaalcalina--antianti--
fosfatasefosfatase alcalina): complexos alcalina): complexos 
enzimaenzima--antianti--enzima enzima →→→→→→→→
amplificaamplificaçção do sinal (maior ão do sinal (maior 
limiar de deteclimiar de detecçção)ão)
�� AvidinaAvidina--biotinabiotina: alta constante : alta constante 
de associade associaçção (Kão (Kdd=10=10--1919M; M; 
para Ac, Kpara Ac, Kdd = 10= 10--55); ); avidinaavidina
tem valência de 4 para biotina tem valência de 4 para biotina 
((AcsAcs podem ter vpodem ter váárias rias 
molmolééculas de biotina culas de biotina 
acopladas) acopladas) →→→→→→→→ amplificaamplificaçção do ão do 
sinal (maior limiar de sinal (maior limiar de 
detecdetecçção)ão)
Kumar, 2000
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�� EnzymeEnzyme--LinkedLinked ImmunosorbentImmunosorbent AssayAssay ���� Anticorpos Anticorpos 
conjugados com enzimas conjugados com enzimas ���� conversão de substrato conversão de substrato 
incolor em produto coloridoincolorem produto colorido
�� Enzimas mais utilizadas (+ de 25): Enzimas mais utilizadas (+ de 25): PeroxidasePeroxidase; ; FosfataseFosfatase
Alcalina, Alcalina, ββββββββ--GalactosidaseGalactosidase e Glicose Oxidasee Glicose Oxidase
�� Suportes sSuportes sóólidos: lidos: microplacasmicroplacas de poliestireno e de poliestireno e 
polivinilcloretopolivinilcloreto (intera(interaçção hidrofão hidrofóóbica)bica)
�� MMéétodo direto todo direto ���� antantíígenosgenos
�� MMéétodo indireto todo indireto ���� anticorposanticorpos
�� SandwichSandwich e Competitivo e Competitivo ���� antantíígenos e anticorposgenos e anticorpos
Ferreira e Ávila, 1996; Butler, 2000
����
����
Lequin, 2005
����
����
���� Indireto
����
����
Butler, 2000
����
����
�Desnaturação das proteínas 
adsorvidas (>90%)
�Anticopos de captura: 10 a 25% 
funcionais →→→→ Ag capturados são 
10x mais funcionais do que os 
adsorvidos na placa
�Entretanto, 6% necessários para 
o desenvolvimento do teste
Butler, 2000
����
SINAL SINAL ×××××××× RURUÍÍDODO
����
���� Papel dos detergentes: 
Tween 20, Triton, SDS
���� Bloqueadores: BSA, 
gelatina, LPD, soro 
caprino
�� Limiar de detecLimiar de detecçção: 0,1ão: 0,1--1,0 1,0 fmolfmol (10(10--1515) ) ���� substratos substratos 
fluorogênicosfluorogênicos ou ou quimioluminogênicosquimioluminogênicos ((luminolluminol). ). 
Normalmente: pg/Normalmente: pg/mLmL
�� Rapidez, baixo custo, objetividade de leitura, automaRapidez, baixo custo, objetividade de leitura, automaçção, ão, 
sensibilidade e especificidade elevadassensibilidade e especificidade elevadas
�� InterpretaInterpretaçção matemão matemáática dos resultados (ponto de corte)tica dos resultados (ponto de corte)
Ferreira & Ávila, 1996; Butler, 2000
����
�� ELISA para a detecELISA para a detecçção ão 
e mensurae mensuraçção de ão de 
anticorpos ou antanticorpos ou antíígenos genos 
secretados por csecretados por céélulas lulas 
linflinfóóides (OPD em ides (OPD em áágargar))
Anthony & Lehmann, 2003
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Linfócito
Peptídeo
Anti-IFNγγγγ
Anti-IFNγγγγ
Marcador
IFNγγγγ
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�� IdentificaIdentificaçção e separaão e separaçção de cão de céélulas baseadas na lulas baseadas na 
dispersão de luzdispersão de luz e fluorescência sob feixe de lasere fluorescência sob feixe de laser
�� Estudo de populaEstudo de populaçções de linfões de linfóócitos citos →→→→→→→→ luz dispersa luz dispersa →→→→→→→→
tamanho e forma da ctamanho e forma da céélulalula
�� FACS (FACS (fluorescencefluorescence--activatedactivated cellcell sortersorter) ) →→→→→→→→ separaseparaçção de ão de 
uma uma úúnica cnica céélulalula
�� Para cada cPara cada céélula (gota) lula (gota) éé dada uma carga eldada uma carga eléétrica trica 
proporcional proporcional àà quantidade de fluorescência quantidade de fluorescência →→→→→→→→ separaseparaççãoão
�� 10106 6 ccéélulas/hora. FITC, lulas/hora. FITC, RodaminaRodamina, etc., etc.
�� Alta reprodutibilidade, alto limiar de detecAlta reprodutibilidade, alto limiar de detecçção (100fg/ão (100fg/mlml), ), 
quantificaquantificaçção de amostras, diluião de amostras, diluiçção ão úúnica, vnica, váárias rias 
amostras, sistemas amostras, sistemas multiplexmultiplex
Barrientos et al., 2000
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Barrientos et al., 2000
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Vignali., 2000
Sistemas 
Multiplex
Vignali., 2000
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Sistemas 
Multiplex
Jani et al., 2002
Sistemas 
Multiplex
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�� Transferência de proteTransferência de proteíínas separadas por eletroforese do nas separadas por eletroforese do 
gel de gel de poliacrilamidapoliacrilamida para membranas para membranas →→→→→→→→ ELISAELISA
�� ResoluResoluçção obtida pela separaão obtida pela separaçção ão eletroforeletroforééticatica de mistura de mistura 
de protede proteíínas + especificidade de anticorpos usados como nas + especificidade de anticorpos usados como 
sondas para a detecsondas para a detecçção de Antão de Antíígenosgenos
�� Suportes: membranas de Suportes: membranas de nitrocelulosenitrocelulose (intera(interaçções ões 
hidrofhidrofóóbicas); nylon, bicas); nylon, polyvinyldifluoridepolyvinyldifluoride (PVDF) (PVDF) →→→→→→→→ alta alta 
capacidade de ligacapacidade de ligaçção a proteão a proteíínasnas
�� QuantificaQuantificaçção de bandas por ão de bandas por densitometriadensitometria
Stott, 2000
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�� DOTDOT--ELISA ELISA ���� reareaçção ão imunoenzimimunoenzimááticatica sobre membranassobre membranas
�� Qualitativa ou semiQualitativa ou semi--quantitativa: rquantitativa: ráápida e simplespida e simples
�� ProteProteíínas solnas solúúveis, fungos, protozoveis, fungos, protozoáários, bactrios, bactéérias e vrias e víírusrus
Stott, 2000
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NASA
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Rose et al, 1997