Testes Sorológicos - antígeno anticorpo - imunodiagnóstico - imunologia veterinária

Prévia do material em texto

ReaReaççõesões AgAg--AcAc
Testes Testes SorolSorolóógicosgicos
TTéécnicascnicas de de 
ImunodiagnImunodiagnóósticostico
InteraInteraçção ão AgAg--AcAc: Conceito Inicial: Conceito Inicial
É uma associação bimolecular semelhante à
interação de enzimas com seus substratos ou de 
hormônios com seus receptores, com uma 
distinção bem evidente o Ac não provoca nenhuma 
alteração química irreversível na molécula de Ag, 
podendo, portanto, o produto formado (Ag-Ac) se 
dissociar nos seus 2 componentes Ag e Ac livres 
/solução/suspensão. 
Ag + Ac AgAc (Imunecomplexos)
CaracterCaracteríísticas da Interasticas da Interaçção ão AgAg--AcAc
• A interação entre Ag e Ac envolve a ocorrência de 
várias forças não covalentes entre o determinante 
antigênico (epítopo) da molécula do Ag e o sítio 
combinatório (parátopo) da molécula do Ac, 
constituído pelas regiões (domínios) variáveis de 
cadeia L e de cadeia H (VL / VH) e particularmente 
pelas regiões hipervariáveis ou regiões determinantes 
de complementaridade (CDRs) de VH e de VL. 
CaracterCaracteríísticas da Interasticas da Interaçção ão AgAg--AcAc
A elevada especificidade das interações Ag e Ac possibilitou: 
1.-) O desenvolvimento de uma grande variedade de ensaios ou reações 
sorológicas, 
2.-) As reações sorológicas podem detectar / identificar / mensurar tanto 
o Ag como os Acs, 
3.-) As reações sorológicas revestem-se de uma enorme importância 
para:
3.1.-) O diagnóstico laboratorial de enfermidades infecciosas, 
3.2.-) O monitoramento da intensidade de respostas humorais
pós-vacinação e também para identificar imunoquimicamente moléculas 
de interesse biológico ou médico.
4.-) Os ensaios sorológicos podem diferir em parâmetros como limiar de 
detecção, sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade e alguns 
podem ser quantitativos enquanto outros são qualitativos. 
ENSAIOS SOROLENSAIOS SOROLÓÓGICOSGICOS
PrimPrimááriosrios ⇒⇒ interainteraçção direta entre antão direta entre antíígeno e anticorpo: geno e anticorpo: 
RadioimnoensaioRadioimnoensaio, , ImunofluorescênciaImunofluorescência, ELISA. , ELISA. 
SecundSecundááriosrios ⇒⇒ conseqconseqüüências da interaências da interaçção entre antão entre antíígeno geno 
e anticorpo e anticorpo →→ mudanmudançças no estado fas no estado fíísico do antsico do antíígeno: geno: 
ImunodifusãoImunodifusão, Aglutina, Aglutinaçção, Fixaão, Fixaçção de Complemento.ão de Complemento.
Van Oss, 2000; Janeway, 2001
Ac + Ag Ac-Ag
K1
K2
K1 = 1010 M-1 →→ alta afinidade
NaturezaNatureza das das reareaççõesões Ag/AcAg/Ac
• Conceito de chave e fechadura
• Ligações não-covalentes
– Pontes de Hidrogênio
– Ligações Eletrostáticas
– Forças de Van derWaal
– Ligações Hidrofóbicas
• Reversível
• Ligações Múltiplas
Source: Li, Y., Li, H., Smith-Gill, S. J., 
Mariuzza, R. A., Biochemistry 39, 6296, 2000
http://www.med.sc.edu:85/chime2/lyso-abfr.htm
Os complexo Ag-Ac 
tende a se manter
unidos
Ac
Ag
Alta 
Afinidade
Ac
Ag
baixa
Afinidade
AfinidadeAfinidade
• Refere-se à força da interação entre um determinante
antigênico e o parátopo de um Ac homólogo.
Os complexo Ag-Ac 
tende a se dissociar
CCáálculolculo de de AfinidadeAfinidade
Ag + Ac ↔ Ag-Ac
K =
[AgAc]
[Ag] x [Ac]
Aplicando a Lei de Ação de Massa
AvidezAvidez
• A força total de ligação entre um Ag com vários
determinantes e Acs multivalentes
Keq = 104
Afinidade
106
Avidez
1010
Avidez
EspecificidadeEspecificidade
• É a habilidade de um anticorpo reagir por meio do 
seu sitio combinatório com somente um 
determinante antigênico. Outros autores definem: 
• É a habilidade de uma população de moléculas de 
anticorpos reagirem fortemente com um antígeno
e fracamente com outro Ag de estrutura
semelhante.
ReatividadeReatividade CruzadaCruzada
• É a habilidade de um Ac reagir através de seu
parátopo com mais que um determinante
antigênico.
• É a habilidade de uma população de moléculas de 
Acs reagirem com mais de um Ag
Anti-A 
Ac
Ag A
Anti-A 
Ac
Ag B
Epítopo
compartilhado
Anti-A 
Ac
Ag C
Epítopo similar
Reações cruzadas
FatoresFatores queque AfetamAfetam as as ReaReaççõesões Ag/AcAg/Ac
• Afinidade
• Avidez
• Relação [Ag]:[Ac]
• Forma física do Ag 
(solúvel ou particulado)
Excesso de Ac Excesso de Ag
Equivalência – formação de rede
Fig. 2.11. Different antibodies bind to distinct epitopes on an antigen molecule.
Testes Testes BaseadosBaseados nasnas ReaReaççõesões Ag/AcAg/Ac
• Todos os testes baseados nas reações Ag/Ac 
dependerão da formação de rede ou eles
terão de utilizar outras vias para detectar
pequenos complexos imunes
• Todos testes baseados nas reações Ag/Ac 
podem ser usados para detectar o Ag ou Ac
CONCEITOS BÁSICOS SOBRE 
MÉTODOS SOROLÓGICOS EM 
DOENÇAS INFECCIOSAS E 
PARASITÁRIAS
CONCEITOS BÁSICOS SOBRE 
MÉTODOS SOROLÓGICOS EM 
DOENÇAS INFECCIOSAS E 
PARASITÁRIAS
SINAL
Resultado da integração de 
impulsos elementares 
oriundos da reação do 
anticorpo com o seu epítopo. 
É de natureza variável 
segundo a técnica utilizada
SINAL X RUÍDO
RUÍDO
Qualquer reatividade inespecífica
resultante de outras causas, que não 
a reação antígeno-anticorpo, e que 
pode interferir na capacidade 
discriminativa do teste sorológico. 
SINAL X RUÍDO
Menor número de impulsos 
elementares necessários para o 
desenvolvimento de um sinal 
discriminatório, correspondendo 
a um resultado positivo 
LIMIAR DE DETECÇÃO 
DE UM TESTE 
SOROLÓGICO
LIMIAR DE DETECLIMIAR DE DETECÇÇÃOÃO
Testes de Aglutinação
Formação de rede
3) Testes de Aglutinação: – simples, baratos, 
mas sensíveis!
Existem Vários Tipos:
a) Hemaglutinação of Eritrócitos
b) Aglutinação Bacteriana
c) Aglutinação Passiva
d) Inibição da Aglutinação (Inib. Hemaglutinação – HI)
Determinação de Grupos
Sanguíneos – Sistema ABO
Aglutinação/Hemaglutinação
• Definição - testes que têm como seu ponto final a 
aglutinação de um antígeno de natureza particulado
(células procarióticas ou eucarióticas)
– Acs: Aglutinina/hemaglutinina, principalmente do 
isótipo IgM* e IgG
+
• Teste de aglutinação qualitativa
– Podem ser pesquisados Ag ou Ac (*Via de regra é o 
Ag, Ex; tipagem de grupos sanguíneos)
Aglutinação/Hemaglutinação
• Definição
• Teste qualitativo
• Teste Quantitativo
• Aplicações
– Tipagem de sangue
– Infecções Bacterianas
• Considerações Práticas
– Fácil
– Semi-quantitativo
1/
2
1/
4
1/
8
1/
16
1/
32
1/
64
1/
12
8
1/
25
6
1/
51
2
Aglutinação/Hemaglutinação
• Teste de aglutinação quantitativa
– Título
– Efeito Prozona
1/
2
1/
4
1/
8
1/
16
1/
32
1/
64
1/
12
8
1/
25
6
1/
51
2
1/
10
24
Po
s.
N
eg
.
Título
64
8
512
<2
32
128
32
4
Paciente
1
2
3
4
5
6
7
8
FIGURE 6-7
Demonstration of humaglutination using Ab against sheep 
red blood cells (SRBCs): a constant # of SRBCs plus serial two-fold 
dilutions of anti-SRBC serum 
4. Agglutination Reactions4. Agglutination Reactions
+ + + (control)
-visible clumping by interaction between Ab & a particulate antigen suchas RBC,
latex beads.
-depend on the crosslinking of polyvalent antigens, similar to precipitation rxns
(lgM is a good agglutinin) 
-provide a way to type bacteria with a panel of typing antisera.
-routinely performed to type RBCs for blood transfusion.
Aglutinação Passiva /Hemaglutinação
• Definição – teste de aglutinação feito com um 
antígeno solúvel adsorvido a uma partícula (por
ex. Cels./hemácias ou partículas de látex)
+
Aplicações
– Medida de anticorpos para antígenos solúveis
(por ex. Ags sols. do Toxoplasma gondii)
Aglutinação Passiva
• As particulas são revestidas com Ags, 
• Partículas mais usadas Eritrócitos, látex, bentonita
ou carvão.
Teste de Coombs (Antiglobulina)
• Ac Incompleto
• Teste de Coombs Direto
– Detecta anticorpos sobre eritrócitos
+
RBCs de Paciente Reagente de Coombs
(Antiglobulina)
Teste de Coombs (Antiglobulina)
• Teste de Coombs Indireto
– Detecta anticorpos anti-eritrócito em soro
Soro de Paciente RBCs
Alvo
+
1a. etapa
+
Reagente de Coombs
(Antiglobulina)2a. etapa
TesteTeste de Coombs (de Coombs (AntiglobulinaAntiglobulina))
• Aplicações
– Detecção de Ac anti-Rh
– Anemia hemolítica auto imune
--AglutinaAglutinaçção Bacterianaão Bacteriana
-As infecções bacterianas frequentemente induzem a 
produção de Acs séricos específicos para Ags de superfície 
das Bactérias.
-A presença de tais Acs pode ser detectada pelas reações de 
aglutinação bacteriana.
-Os títulos dos Acs séricos de um indivíduo suspeito é
definido como a recíproca da maior diluição do soro que 
produz uma reação positiva de aglutinação.
-O título aglutinante de um soro pode ser usado para o 
diagnóstico de infecções bacterianas. 
Um exemplo de teste de soro-
aglutinação com partículas é o teste
de Látex de aglutinação ou de 
aglutinação bacteriana.
Ag BacterianoAcs Anti-bacterianos
Testes de Testes de PrecipitaPrecipitaççãoão
- Formação de rede
- Tipo de Ags: Macromoléculas Solúveis
- Principais Acs envolvidos: IgG e IgM
- Formação de Precipitado dos 
Imunocomplexos
- Maior formação de precipitado de 
imunecomplexos na zona de equivalência
entre as concentrações de Ag e de Ac 
1. Reações de Precipitação:
-Acs e Ags em soluções aquosas formam uma rede/malha => 
Precipitação
A formação da rede requer:
1) Acs polivalentes
2) Ags devem ser bivalentes / polivalentes
Testes de Precipitação: – simples, baratos, mas específicos! 
e pouco sensíveis!!!
Não PrecipitaçãoPrecipitação +
Reação de Imunodifusão
em Gel de Ágar
Reação de Imunodifusão
em Gel de Ágar
TESTE DE LIGAÇÃO SECUNDÁRIA
•Nem todo anticorpo que reagiu participa da geração de sinal
•Sensibilidade analítica = 30 µg / mL
TESTE DE ELEVADA
ESPECIFICIDADE ANALÍTICA
BAIXÍSSIMA OCORRÊNCIA DE RUÍDO
TESTE DE
EXECUÇÃO SIMPLES
BAIXO CUSTO
CURVA DE PRECIPITAÇÃO
QUANTITATIVA EM MEIO LÍQUIDO
ANTÍGENOS SOLÚVEIS
Curva de Precipitação
ZONA DE EQUIVALÊNCIA ENTRE AS CONCS. Ag:Ac
SOLUBILIZAÇÃO POR EXCESSO DE ANTICORPO
SOLUBILIZAÇÃO POR EXCESSO DE ANTÍGENO
FATORES QUE AFETAM A DIFUSÃO
•CONCENTRAÇÃO D=K x C
•TEMPERATURA D=K x T
•PESO MOLECULAR D=K x 1/PM
•FORMATO MOLÉCULA D=Maior moléculas esféricas
•VISCOSIDADE DO MEIO D= K x 1/V
•TAMANHO DO PORO (gel) D=K x DIAM. PORO
4,5 mL GEL 1%
LÂMINA 24 X 76 mm
ORIFÍCIO NO GEL
5 mm Diâmetro
40 µL 
soro ou antígeno
ONDA DE DIFUSÃO
40 µL 
soro
40 µL 
antígeno
40 µL 
soro
40 µL 
antígeno
40 µL 
soro
40 µL 
antígeno
Antígeno e Anticorpo encontrando-se 
em proporções ótimas
3. Precipitation Reactions3. Precipitation Reactions
FIGURE 6-5
Diagrammatic representation of radial & double immunodiffusion.
: precipitation reactions in gels yield visible precipitin lines; no visible 
precipitate forms in regions of Ab or Ag excess. 
in the Ab-containing semisolid medium
The region of equivalence
-> The area is proportional to 
the conc. of Ag.
Técnica de Imunodifusão Dupla
em Gel deÁgar - IDGA
ANTÍGENO 
A
ANTI- A
IDENTIDADE TOTAL SOROS
anti- A
ANTÍGENO- A
IDENTIDADE TOTAL ANTÍGENOS
ANTIGENO AB
IDENTIDADE PARCIAL SOROS
anti - A anti - AB
anti- AB
IDENTIDADE PARCIAL ANTÍGENOS
ANTÍGENO A ANTÍGENO AB
ANTÍGENOS
A + B
NÃO IDENTIDADE DE SOROS
anti- A anti- B
anti- A + anti B
NÃO IDENTIDADE DE ANTÍGENOS
ANTÍGENO A ANTÍGENO B
Testes de Testes de PrecipitaPrecipitaççãoão -- ResumoResumo
-Formação de rede
-Tipo de Ags: Macromoléculas Solúveis
-Principais Acs envolvidos: IgG e IgM
-Formação de Precipitado dos Imunocomplexos
-Maior formação de precipitado de 
imunecomplexos na zona de equivalência entre
as concentrações de Ag e de Ac 
Fig. 2.10. Antibody can precipitate soluble antigen to generate a precipitin curve.
Different amounts of antigen are added to a fixed amount of antibody, and precipitates form by antibody
crosslinking of antigen molecules. The precipitate is recovered and the amount of precipitated antibody measured, 
while the supernatant is tested for residual antigen or antibody. This defines zones of antibody excess, equivalence, 
and antigen excess. At equivalence, the largest antigen:antibody complexes form. In the zone of antigen excess, 
some of the immune complexes are too small to precipitate. These soluble immune complexes can cause 
pathological damage to small blood vessels when they form in vivo (see Chapter 12).
Fig. 2.12. IDGA – IMUNODIFUSÃO DUPLA EM GEL DE ÁGAR - Ouchterlony gel-diffusion
assay for antigen:antibody binding.
Antigen and antibody are placed in different wells of an agar gel. They diffuse toward each other
and precipitate where they meet at equivalence, forming a visible band. When serum samples in two
wells are tested against the same well of antigen, the relatedness of the samples can be determined by
the shape of the precipitin line formed (not shown).
Imunodifusão Radial (Mancini)
• Interpretação
– Diâmetro do anel é
proporcional à
concentração
• Quantitativo
– Níveis de Ig
• Método
– Ac em gel
– Ag no poço
Concentração do Ag
D
iâ
m
et
ro
2
AgAgAgAg
Ac em gel
Imunoeletroforese
• Método
• Interpretação
• Qualitativa
– Concentração relativa
Imunoeletroforese
• Método
– Ags sâo separados por eletroforese
• Interpretação
– Precipitina representam os antígenos individuais
Ag
-+
Ag
Ac
Ag
Ac
– Ac é colocado dentro do agar cortado
Fig. 2.14. Immunoelectrophoresis reveals the presence of several distinct
immunoglobulin isotypes in normal human serum.
3. Precipitation Reactions3. Precipitation Reactions
FIGURE 6-6 (a)
Immunoelectrophoresis.
- an antigen mixture is first electrophoresed to separate its components by charge
- diffusion & producing lines of precipitation.
Eletroforese contra corrente ou
contra-imuno-eletroforese
• Método
– Ag e Ac migram em direção ao outro pela eletroforese
– Usado somente quando o Ag e o Ac têm cargas opostas
• Qualitativa
–Rápida
Ag Ac
- +
Ensaios Baseados no 
Complemento
Fixação de Complemento
– Ag misturado com soro teste para ser ensaiado pelo Ac
– Quantidade padrão de complemento é adicionado
– Eritrócitos cobertos com Acs é adicionado
– Determinação da quantidade de eritrócitos lisados
Ag
Soro de 
paciente
Ag Sem Ag
Ag
• Metodologia
LIMIAR DE DETECÇÃO OU
SENSIBILIDADE ANALÍTICA
DE ALGUMAS REAÇÕES 
SOROLÓGICAS
LIMIAR DE DETECÇÃO OU
SENSIBILIDADE ANALÍTICA
DE ALGUMAS REAÇÕES 
SOROLÓGICAS
TESTES DE LIGAÇÃO 
PRIMÁRIA
• RIE 0,00005 g/ml
• ELISA 0,0005 g/ml
TESTES DE LIGAÇÃO 
SECUNDÁRIA
• HEMAGLUT. PASSIVA 0,01 g /ml
• RFC 0,05 g/ml
• AGLUT. BACTÉRIAS 10,05 g /ml
• PRECIPITAÇÃO GEL 30,00 g/ml
 μ μ
 μ
 μ
 μ
 μ
	 Reações Ag-Ac�Testes Sorológicos�Técnicas de Imunodiagnóstico
	Interação Ag-Ac: Conceito Inicial
	Características da Interação Ag-Ac
	Características da Interação Ag-Ac
	Natureza das reações Ag/Ac
	Cálculo de Afinidade
	Especificidade
	Testes Baseados nas Reações Ag/Ac
	Testes de Aglutinação
	Aglutinação/Hemaglutinação
	Aglutinação/Hemaglutinação
	Aglutinação Passiva /Hemaglutinação
	Teste de Coombs (Antiglobulina) 
	Teste de Coombs (Antiglobulina) 
	Teste de Coombs (Antiglobulina) 
	Testes de Precipitação - Resumo
	Imunodifusão Radial (Mancini)
	Imunoeletroforese
	Imunoeletroforese
	Eletroforese contra corrente ou contra-imuno-eletroforese