Coloração de Gram e Ziehl Neelsen

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Daniella Machado
		Turma XXVI
Coloração de Gram e Ziehl Neelsen– Módulo 3 Daniella Machado 
Morfofuncional – 2º período UniEVANGÉLICA		Turma XXVI
Preparação para as colorações 
Preparo lâmina de vidro
Limpeza, livre de gordura, sendo lavadas com água e sabão, enxugadas com água e deixadas em recipientes com etanol a 95%.
Preparo do esfregaço
Os microrganismos podem ser cultivados em meio líquido ou sólido, as amostras utilizadas serão utilizadas para fazer o esfregaço devem ser manipuladas de forma diferente.
Fixação pelo calor
Necessário aquecê-la, fazendo a fixação do esfregaço pelo calor e evitando que os microrganismos sejam perdidos durante as colorações e sucessivas lavagens.
Coloração simples positiva
Utiliza apenas um único corante para a constatação de microrganismo ou alguma amostra ou substrato. Baseada na utilização de corantes carregados positivamente que se ligam às cargas negativas da superfície de células e de material nucleico.
	Pode ser utilizado a coloração de Giemsa. Visualização da forma do protozoário, determinando a forma evolutiva.
Coloração simples negativa
Corante azídico e repelido pela carga negativa da superfície celular. A lâmina de vidro em que o material está ficará corada enquanto os microrganismos ficarão mais claro, ideia de negativo fotográfico. Essa coloração é utilizada para a demonstração de cápsulas mucoides que envolvem algumas espécies de bactérias. Esse tipo de coloração pode ser usado a tinta nanquim e a nigrosina, elas não penetram no microrganismo, a coloração deve ser feita misturando os microrganismos diretamente ao corante sem aquecimento, podendo danificar o material capsular (hidratado). A aplicação dessa técnica fornece a melhor qualidade de preservação estrutural, não é seco ao ar nem fixado à lâmina pelo calor. Na detecção de cápsulas a coloração é importante, pois evita a solubilização do material capsular – solúvel em água – durante o processamento rotineiros de coloração com outros corantes. A cápsula está normalmente associada à virulência (protege contra adesão, fagocitose e destruição por células do sistema imune).
Coloração diferencial
Metodologia de coloração em microbiologia (MOC). A caracterização morfológica e tintoral dos microrganismos permite que o clínico tenha a presunção do agente etiológico presente no espécime avaliado.
Coloração de gram
É um método que permite o diagnóstico correto em 80% dos pacientes. As gram-negativas e as gram-positivas absorvem de maneira igualitária os corantes Iugol e cristal violeta.
	São utilizados 4 reagentes diferentes. Inicia com a coloração de um esfregaço de células fixado a uma lâmina histológica pelo calor, com o corante cristal violeta que cora as células com cor púrpura. Este corante se impregna em todas as células, essa coloração tem como nome – coloração primária – as células são então recobertas por uma solução de iodo que age como um mordente, que é quaisquer substâncias que forma um complexo insolúvel quando se liga ao corante primário.
	A lâmina contendo o esfregaço de células são lavadas com etanol 95% (agente descolorante) que descora seletivamente alguns tipos de células. O álcool é removido por lavagem em água, e as células são coradas por um segundo corante, a safranina ou fucsina, um contracorante, sendo sua coloração bem diferente do cristal violeta. As gram positivas adquirem cor purpura (roxo) por causa da sua parede peptidoglicano e as gram-negativas apresentam coloração cor-de-rosa, por causa da contra coloração.
	As bactérias gram-positivas possuem parede celular mais espessa, o complexo formado pelo cristal violeta e pelo iodo se liga a componentes presentes na parede das bactérias positivas, que possuem na sua composição magnésio e ácidos ribonucleicos. Formando um complexo (Mg-RNA-CV-I) de difícil remoção. A utilização do álcool terá duas funções: dissolver lipídios e desidratar as células. O corante associado à parede das bactérias gram-positivas possui alto peso molecular e não se difundem de volta para o meio externo durante a lavagem com o álcool – a célula permanece corada na cor roxa. 
	Nas gram-negativas a camada da parede é delgada já que sobre a parede encontramos outra membrana, a externa de natureza lipídica. Ao utilizar o álcool, a membrana externa é solubilizada e a célula é descolorada. Quando aplica o contracorante safranina, as células gram-negativa adquirem a cor rosada do novo corante.
Mecanismo: 
Baseado na diferença dos componentes da parede da célula, a bactéria vai reter ou perder o corante primário quando complexada com o ácido e a descoloração do álcool. A contra-corante é usada para o material que não conseguiu reter o corante principal.
Gram negativas: 
Vai descorar, ficar rosinha.
Gram positivas: 
Vai permanecer corada
 Arranjadas em cachos de uvas – staphylococcus aureus
 Streptococcus, cadeias longas
BAAR (bactérias álcool ácido resistente) ou e Ziehl Neelsen
Identificação de bactérias do gênero Mycobacterium (tuberculose e lepra) e identificar cepas patogênicas de bactérias do gênero Nocardia. Muito utilizado para tuberculose. A parede das micobactérias possui uma espessa camada de lipídeos (ácido micólico) que evita a penetração de diversos corantes. Quando o corante penetra, ele não pode ser removido facilmente, nem mesmo com a mistura álcool-ácido. A célula permanece corada após a mistura álcool-ácido ter sido aplicada é denominada álcool-acidorresistente, em que se descoram por não possuírem a mesma composição de parede célula são denominadas álcool-acidossensíveis.
No esfregaço, é difícil espalhar as micobactérias na gota de água sobre a lâmina, por causa da característica hidrofóbica de sua parede, sendo fixado pelo calor da chama, passando a lâmina 3-5 vezes, por 3-4 segundo por vez.
O esfregaço deve ser recoberto com o corante (carbolfucsina) e colocado sobre uma placa aquecedora morna ou sobre um recipiente com água quente (não deixe o corante evaporar). A alta temperatura facilita a penetração deste pela parede da bactéria.
Após lavar a lâmina com água, deve resfriar rapidamente na geladeira ou passá-la sob jatos de água gelada. O resfriamento deixa a camada de lipídios das bactérias álcool-acidorresistentes mais consistente, evitando que o corante sai do citoplasma.
A lâmina é tratada com álcool-ácido que age como um agente descolorante, descorando um grupo de células. As células descoradas são coradas em azul pelo metileno. Duas populações de cores diferentes surgem após esse tipo de coloração: células vermelhas (álcool-ácidorresistentes e células azuis (álcool-acidossensíveis).
O corante após a lavagem com o agente descolorante continua impregnado em células cuja composição da parede pose ser encontrada em tipos especiais de lipídios.
Coloração de Albert Laybourn
O corante de Albert Laybourn cora o corpo das bactérias do gênero Corynebacterium em tom esverdeado. O Lugol forte cora a granulação metacromática (Babes Ernst) na extremidade bacterina de cor marrom. Ao final a bactéria fica com o corpo verde e a extremidade fica de cor marrom.
Usada para diagnóstico de Corinebacterium Dipheteriae em pacientes com suspeita de Difteria.
Procedimento
Fixar no calor, material presente na lâmina – solução de ALBERT Laybourn (3-5 minutos) – escorrer a lâmina sem lavar – Lugol forte (2 minutos) e lavá-la – secar e observar no MOC em imersão.
Coloração de Fontana Tribondeau
Bactérias muito delgadas, como as espiroquetas vão se impregnar pela prata quando tratadas com solução de nitrato de prata, tornando-se marrons e visíveis em MOC.
Usadas para detectar a presença de Treponema pallidum em amostras de lesões em órgão genital, mucosas oral e anal. Pacientes com suspeita de Cancro duro (lesões sifílicas).
Procedimento
Fixação de material – cobrir com solução fixadora por 30 segundos – cobrir com solução mordente, aquecer até emitir vapores, aguardar 3º segundo e lavar – cobrir com solução impregnadora de prata, aquecer até emitir vaporese deixar agir por 30 segundos – deixar secar e observar em imersão.
Banco de imagens
A. Bacilos gram-positivos relativamente delgados dispostos em um padrão de “letras chinesas” sugerem uma das bactérias corineformes (difteroides).
B. Bacilos gram-positivos formadores de esporos. Os aeróbios formadores de esporos fazem parte do gênero Bacillus; os formadores de esporos anaeróbios pertencem ao gênero Clostridium. Esta imagem ilustra células de Bacillus sphaericus, formador de esporos.
C. Cocos gram-positivos dispostos em grupos pequenos, que são típicos de uma espécie de Staphylococcus.
D. Os cocos gram-positivos minúsculos presentes nesta fotomicrografia são estreptococos.
E. Essa coloração direta de um esfregaço de escarro purulento corado por Gram revelou diplococos gram-positivos típicos de Streptococcus pneumoniae.
F. Os bacilos gram-positivos claviformes ramificados sugeriam uma espécie de Bifidobacterium, que foi isolada na cultura para anaeróbios. Algumas espécies de Actinomyces podem ter morfologia semelhante.
G. Preparação corada por Gram de um esfregaço direto do sedimento urinário de uma paciente com cistite aguda. Observe os diversos bacilos gram-negativos dispersos entre os neutrófilos segmentados ao fundo. Escherichia coli foi isolada em cultura pura.
H.Diplococos gram-negativos intracelulares típicos de Neisseria gonorrhoeae. As células bacterianas desta fotografia tinham coloração mais clara que se observa normalmente ao exame microscópico direto.
I. Esta fotomicrografia de um esfregaço de escarro ilustra alguns neutrófilos segmentos ao fundo e um infiltrado difuso com alguns bacilos gram-negativos curtos, dos quais alguns parecem estar circundados por um halo. A cultura isolou Klebsiella pneumoniae.
J. Esta fotomicrografia com filamentos gram-positivos delicados ramificados sugeria Propionibacterium acnes, que foi isolado em cultura. Algumas espécies de Actinomyces podem ter morfologia semelhante na coloração por Gram.
Levedura
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