Microbiologia - Métodos de Coloração para Exames de Microbiologia

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SISTEMA DE ENSINO
MICROBIOLOGIA
Métodos de Coloração para Exames de 
Microbiologia
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Métodos de Coloração para Exames de Microbiologia
MICROBIOLOGIA
Pollyana Lyra
Sumário
Apresentação .....................................................................................................................................................................4
Métodos de Coleta e Coloração para Exames de Microbiologia ..........................................................5
Preparo de Esfregaços para Coloração ...............................................................................................................5
Colorações Simples ........................................................................................................................................................6
Colorações Diferenciais ...............................................................................................................................................6
Colorações Especiais .....................................................................................................................................................6
Paredes Celulares de Bactérias GGram-Positivas .......................................................................................6
Paredes Celulares de Bactérias GGram-Negativas .....................................................................................7
Paredes Celulares e Mecanismo da Coloração de Gram ...........................................................................9
Paredes Celulares Atípicas ......................................................................................................................................12
Paredes Celulares Álcool-Ácido Resistentes ...............................................................................................12
Coloração Álcool-Ácido Resistente ou Coloração de ZIEHL- NEELSEN .......................................12
Coloração para Cápsulas ...........................................................................................................................................13
Método da Tinta da China (Coloração Negativa) ........................................................................................14
Método da Tinta da China com Fucsina Diluída ............................................................................................14
Método de Hiss ................................................................................................................................................................15
Coloração para endosporos (esporos) ..............................................................................................................15
Coloração de Wirtz-Conklin .....................................................................................................................................16
Método para Coloração de Esporos WIRTZ-CONKLIN ............................................................................17
Coloração dos Flagelos ..............................................................................................................................................17
Coloração de Fontana Tribondeau .......................................................................................................................17
Coloração de Albert-Laybourn ..............................................................................................................................18
Destaques sobre Coleta de Amostras para Exames e Métodos de Coloração .........................20
Coloração GRAM ...........................................................................................................................................................20
Esquema Diferencial das Paredes Bacterianas Gram + e - ................................................................... 22
Componentes Exclusivos ds Bactérias ............................................................................................................ 24
Coloração de Ziehl-Neelsen (BAAR) .................................................................................................................25
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Comportamento dos Bacilos frente a cada Corante .................................................................................25
Coleta de Amostras para Exame Microbiológico .......................................................................................25
Resumo de Formas de Coleta ................................................................................................................................. 29
Exercícios ............................................................................................................................................................................31
Gabarito ..............................................................................................................................................................................43
Gabarito Comentado ...................................................................................................................................................44
Referências ........................................................................................................................................................................61
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ApresentAção
Caro(s) estudante(s), hoje iniciaremos nossa aula sobre os principais métodos de colora-
ção para exames microbiológicos e suas aplicações clínicas.
Espero que aproveitem bem o conteúdo, porque a aula foi feita com muito esmero! Prepa-
rado(s)? Então vamos começar!
A identificação de bactérias para a diagnóstico de doenças é extremamente importante 
para um tratamento mais eficaz dos pacientes. No método de bacterioscopia, existem duas 
maneiras para visualização de bactérias: com ou sem coloração. No método sem coloração 
ou exame a fresco, que é feito através da suspensão bacteriana entre lâmina e lamínula, são 
observados os microrganismos vivos; essa técnica é para visualização de mobilidade e morfo-
logia das bactérias espiraladas que na coloração podem tornar-se distorcidas após a fixação. 
Na preparação da técnica com coloração, os microrganismos são corados após serem mortos 
pelas interações químicas que na maioria dos casos podem ocorrer com o auxílio do calor. No 
material fixado e corado, há mais facilidade de identificação do microrganismo, pois as bacté-
rias e células ficam mais visíveis e podem ser transportadas em lâminas sem risco algum, uma 
vez que já estão mortas. Além disso, as técnicas de coloração possibilitam a diferenciação de 
células com afinidades distintas aos corantes e de morfologias variadas.
As bactérias in natura são praticamente incolores não apresentando contraste suficiente, 
o que dificulta sua visualização. A diferença química entre as bactérias e o meio é o que nos 
permite distingui-las por técnicas de coloração. Na maioria das vezes o corante não interage 
com o meio externo, tornando os micróbios, quando corados, mais visíveisao microscópio. 
Além do mais, a coloração possibilita a utilização da objetiva de imersão na microscopia ópti-
ca, permitindo uma maior ampliação da imagem e o estudo de estruturas específicas da célula 
bacteriana como: parede celular, endósporos, flagelos e arranjos.
A seguir, discutiremos com maiores detalhes vários procedimentos de coloração diferen-
tes, suas técnicas e aplicações específicas.
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MÉTODOS DE COLETA E COLORAÇÃO PARA EXAMES 
DE MICROBIOLOGIA
prepAro de esfregAços pArA ColorAção
Coloração significa corar os micro-organismos com um corante que serve para evidenciar 
certas estruturas de interesse clínico. No entanto, antes do procedimento de coloração, os 
micro-organismos devem ser fixados a uma lâmina de vidro. A fixação serve tanto para matar 
os micro-organismos como para fixá-los à lâmina, a fim de que possam ser visualizados. A 
fixação também serve para preservar várias partes dos micróbios em seu estado íntegro com 
o mínimo possível de fragmentação.
Quando uma amostra precisa ser fixada e posteriormente corada, uma fina camada de ma-
terial contendo os micro-organismos é espalhada sobre a superfície da lâmina. Esta camada, 
denominada esfregaço, é exposta ao ar para secar. Na maioria dos procedimentos de colo-
ração em microbiologia, a lâmina é fixada sobre a chama de um bico de Bunsen, passando-a 
levemente por ele várias vezes até a completa secagem do material, com o lado do esfregaço 
sempre voltado para cima, ou recobrindo a lâmina com álcool metílico por um minuto.
Após este procedimento, o corante é aplicado e a lâmina é lavada com água corrente e 
seca com papel absorvente. Se não fosse feita a etapa de fixação, a coloração poderia ser per-
dida ao lavar a lâmina com água. Ao final deste procedimento, os micro-organismos corados 
estarão prontos para o exame microscópio.
Os corantes comumente utilizados são sais compostos por um íon positivo e um íon ne-
gativo, um dos quais é colorido e conhecido como cromóforo. A cor dos chamados corantes 
básicos se deve ao íon positivo; já em corantes ácidos, esta cor se deve ao íon negativo. As 
bactérias são carregadas negativamente em pH neutro. Sendo assim, o íon positivo colorido de 
um corante básico se liga à célula bacteriana carregada negativamente. Os corantes básicos, 
dos quais se destacam o cristal violeta, o azul de metileno, o verde de malaquita e a safranina, 
são mais largamente usados que os corantes ácidos. Os corantes ácidos não são atraídos pela 
maioria dos tipos de bactérias porque os íons negativos do corante são repelidos pela superfí-
cie bacteriana carregada negativamente; assim, esta coloração serve apenas como coloração 
de fundo, uma vez que não é capaz de penetrar a célula e corar suas estruturas internas.
A preparação de bactérias incolores contra um fundo corado é denominada coloração ne-
gativa. Este tipo de coloração permite a observação de formas, tamanhos e cápsulas, pois as 
células tornam-se altamente visíveis e destacadas em contraste com um fundo escuro. Nesta 
técnica, são minimizadas as distorções de tamanho e de forma da célula porque a etapa de 
fixação não é necessária e as células não captam nenhum tipo de coloração. Como exemplos 
de corantes ácidos, temos a eosina, a fucsina ácida e a nigrosina.
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Para aplicar corantes ácidos ou básicos, existem três técnicas diferentes de coloração: 
simples, diferencial e especial.
ColorAções simples
Esta coloração consiste em uma solução aquosa ou alcoólica de um único corante básico. 
Embora diferentes corantes se liguem especificamente a diferentes partes das células, uma 
coloração simples destaca todo o micro-organismo, para que as formas celulares e as estru-
turas básicas fiquem visíveis. A coloração é aplicada ao esfregaço fixo por certo período de 
tempo e, depois de lavada, a lâmina é seca e examinada. Em alguns casos, pode-se adicionar 
uma substância química à solução para intensificar a coloração; esta substância é denomi-
nada mordente. O mordente aumenta a afinidade de um corante por uma amostra biológica 
e também recobre uma estrutura específica da célula (como por exemplo, um flagelo) para 
torná-la mais espessa e mais fácil de ser visualizada após a coloração. Alguns dos corantes 
simples mais usados em laboratório são o azul de metileno, a carbolfucsina, o cristal violeta e 
a safranina.
ColorAções diferenCiAis
Ao contrário das colorações simples, as colorações diferenciais reagem de modo distinto 
dependendo do tipo de bactéria, podendo assim ser utilizadas para diferenciá-las. As colora-
ções diferenciais mais frequentemente utilizadas para bactérias são a coloração de Gram e 
a coloração álcool-ácido resistente. Calma, que vou esquematizar direitinho esses tipos de 
colorações que mais são cobrados em provas para você!
ColorAções espeCiAis
As colorações especiais são usadas para corar e isolar partes específicas dos micro-orga-
nismos, como os endosporos e os flagelos, e para revelar a presença de cápsulas. Como exem-
plos deste tipo de coloração, destacam-se a Coloração de Fontana Tribondeau, a Coloração de 
Albert-Laybourn e a Coloração de Wirtz-Conklin.
Para compreender melhor os métodos de coloração diferencial, façamos uma breve revisão 
sobre a estrutura da parede celular das bactérias GramGram-positivas e GramGram-negativas.
pAredes CelulAres de BACtériAs ggrAm-positivAs
Na maioria das bactérias GramGram-positivas, a parede celular consiste em muitas cama-
das de peptideoglicana, formando uma estrutura espessa e rígida. Em contraste, as paredes 
celulares de bactérias GramGram-negativas contêm somente uma fina camada de peptideo-
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glicana. Além disso, as paredes celulares das bactérias GramGram- positivas contêm ácidos 
teicoicos, constituídas principalmente por um álcool (como o glicerol ou ribitol) e fosfato.
Existem duas classes de ácidos teicoicos: ácido lipoteicoico, que atravessa a camada de 
peptideoglicana e se liga à membrana plasmática, e ácido teicoico da parede, que se liga ape-
nas à camada de peptideoglicana. Devido à carga negativa dos grupos fosfato, os ácidos tei-
coicos podem se ligar e regular o movimento de cátions (íons positivos) tanto para dentro 
quanto para fora da célula. Eles também podem assumir um papel estrutural, impedindo a 
ruptura extensa da parede e a possível lise celular.
Figura 1: Estrutura de uma parede celular GramGram-positiva. Fonte:
Fonte: modificada de Tortora, Funke& Case, Microbiologia.
pAredes CelulAres de BACtériAs ggrAm-negAtivAs
As paredes celulares das bactérias GramGram-negativas consistem em uma ou poucas 
camadas de peptideoglicana e uma membrana externa. A peptideoglicana está ligada a lipo-proteínas, que são lipídeos covalentemente ligados a proteínas, na membrana externa, e se 
localiza no periplasma, entre a membrana externa e a membrana plasmática. O periplasma 
contém uma alta concentração de enzimas de degradação e proteínas de transporte.
As paredes celulares GramGram-negativas não contêm ácidos teicoicos. Como as paredes 
celulares das bactérias GramGram-negativas contêm somente uma pequena quantidade de 
peptideoglicana, são mais frágeis e, portanto, mais suscetíveis ao rompimento mecânico. A 
membrana externa da célula GramGram-negativa é constituída por lipopolissacarídeos (LPS), 
lipoproteínas e fosfolipídeos. A membrana externa tem várias funções especializadas; sua 
forte carga negativa é um fator importante na evasão da fagocitose e nas ações do com-
plemento, causando lise de células e promovendo a fagocitose, dois componentes das defe-
sas do hospedeiro. A membrana externa também fornece uma barreira contra certos tipos de 
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antibióticos, como por exemplo a penicilina, e também enzimas digestivas como a lisozima, 
detergentes, metais pesados, sais biliares e certos corantes. Apesar de sua alta resistência, a 
membrana externa não fornece uma barreira para todas as substâncias do ambiente, pois os 
nutrientes devem atravessá-la para possibilitar o metabolismo celular. Grande parte da perme-
abilidade da membrana externa se deve a proteínas denominadas porinas, que formam canais. 
As porinas permitem a passagem de moléculas como nucleotídeos, dissacarídeos, peptídeos, 
aminoácidos, vitamina B12 e ferro.
O lipopolissacarídeo (LPS) da membrana externa é uma molécula grande e complexa que 
contém lipídeos e carboidratos formado por três componentes: lipídeo A, um cerne polissaca-
rídico e um polissacarídeo O. O lipídeo A é a porção lipídica do LPS e está inserido na parede 
superior da membrana externa. Quando bactérias GramGram-negativas morrem, elas liberam 
lipídeo A, que funciona como uma endotoxina. O lipídeo A é responsável pelos sintomas as-
sociados a bactérias GramGram-negativas, como febre, dilatação de vasos venosos, choque 
e formação de coágulos sanguíneos. O cerne polissacarídico é ligado ao lipídeo A e contém 
açúcares incomuns. Seu papel é estrutural e serve para fornecer estabilidade à célula bacteria-
na. O polissacarídeo O se estende para fora do cerne polissacarídico e é composto por molé-
culas de açúcar. O polissacarídeo O possui função antigênica, sendo, por isso, bastante útil na 
diferenciação de espécies de bactérias GramGram-negativas. Esse papel é semelhante ao dos 
ácidos teicoicos nas células GramGram-positivas.
Figura 2: Estrutura da parede celular de bactérias Gram-negativas.
Fonte: modificadaTortora, Funke& Case, Microbiologia.
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pAredes CelulAres e meCAnismo dA ColorAção de grAm
Agora que você estudou a química da parede celular bacteriana, fica mais fácil compre-
ender o mecanismo da coloração de Gram. Esse mecanismo tem como base as diferenças 
nas estruturas da parede celular das bactérias GramGram-positivas e GramGram-negativas e 
como cada uma dessas estruturas reage às várias substâncias utilizadas para produzir rea-
ção química.
A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans 
Christian Joachim Gram. Esta técnica é um dos procedimentos de coloração mais úteis, pois 
classifica as bactérias em dois grandes grupos: GramGram-positivas e GramGram-negativas.
A coloração de Gram começou a ser estudada quando esse médico descobriu que, co-
locando as bactérias em contato com corantes distintos, passavam a apresentar uma nova 
cor. Foi a partir desse momento que o diagnóstico de doenças sexualmente transmissíveis 
começou a ser realizado em laboratório. A bacterioscopia também é realizada para exames 
de infecção do trato urinário, que é uma das infecções bacterianas mais comuns nos adultos. 
A microscopia tem a finalidade de detectar os elementos insolúveis presentes na urina, que 
podem ou não ter significado clínico e, por isso, devem ser tanto identificados quanto quanti-
ficados. O aumento da presença de alguns elementos, como leucócitos, hemácias, células e 
principalmente microrganismos, estão relacionados com casos de infecção do trato urinário. 
Contudo, este exame a fresco permite apenas a detecção da presença do microrganismo. 
Para a observação da forma e outras características, como composição química, estrutura, 
permeabilidade da parede celular, fisiologia, metabolismo e patogenicidade, é necessária a re-
alização da bacterioscopia pelo método da coloração de Gram. Como vimos anteriormente, as 
bactérias gGram-positivas não se descoram facilmente pelo tratamento com o álcool, por elas 
possuírem uma espessa parede celular (várias camadas de peptidioglicano) e outros compo-
nentes como: ácidos teicóicos e proteínas polissacarídicas. Sendo assim, essas substâncias 
não são solúveis em álcool, que parece atuar reduzindo a permeabilidade da parede dificultan-
do a saída pelo citoplasma. Desta forma, as bactérias GramGram-positivas permanecem com 
a cor roxa até o final da técnica de coloração.
As bactérias GramGram-negativas são descoradas pelo tratamento com o álcool. Elas pos-
suem uma delgada camada de peptideoglicano e também uma membrana rica em lipídios. 
Sendo assim o álcool dissolve esses lipídeos o que contribui para um aumento da permeabi-
lidade da parede permitindo a remoção do citoplasma. As bactérias assim descoradas pelo 
álcool não apresentam contraste que permita sua visualização e são coradas por um corante 
secundário, a fucsina que cora a cor rosa.
Neste procedimento, um esfregaço fixado pelo calor é recoberto com um corante básico 
púrpura, geralmente o cristal violeta. Uma vez que a coloração púrpura impregna todas as cé-
lulas sem distinção, ela é denominada coloração primária. Após um curto período de tempo, 
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o corante púrpura é lavado, e o esfregaço é recoberto com o mordente (iodo). Quando o iodo 
é lavado, tanto as bactérias GramGram-positivas como as GramGram-negativas aparecem em 
cor violeta escuro ou púrpura.
A seguir, a lâmina é lavada com álcool ou uma solução de álcool-acetona. Essa solução é 
um agente descolorante, que remove a cor púrpura das células de algumas espécies, mas não 
de outras. O álcool é lavado, e a lâmina é corada com safranina, um corante básico vermelho. 
O esfregaço é lavado novamente, seco com papel e examinado microscopicamente. O corante 
púrpura e o iodo se combinam no citoplasma de cada bactéria, corando-a de violeta escuro ou 
púrpura. As bactérias que retêm essa cor após a tentativa de descolori-las com álcool são clas-
sificadas como GramGram-positivas; as bactérias queperdem a cor violeta escuro ou púrpura 
após a descoloração são classificadas como GramGram-negativas.
Como as bactérias GramGram-negativas são incolores após a lavagem com álcool, elas não ficam mais visíveis. 
É por isso que o corante básico safranina é aplicado, para corar a bactérias GramGram-negativas de rosa. Coran-
tes como a safranina, que possuem uma cor contrastante com a coloração primária, são denominados contra-
corantes. Como as bactérias Gram-positivas retêm a cor púrpura original, não são afetadas pelo contracorante 
safranina.
Figura 3: Etapas do método de coloração de Gram. Fonte: Tortora, Funke& Case, Microbiologia.
Diferentes tipos de bactérias reagem de modo distinto à coloração de Gram, pois diferen-
ças estruturais em suas paredes celulares afetam a retenção ou a liberação de uma combi-
nação de cristal violeta e iodo, denominada complexo cristal violeta-iodo (CV-I). Entre outras 
diferenças, as bactérias Gram-positivas possuem uma parede celular de peptideoglicano mais 
espessa (dissacarídeos e aminoácidos) que as bactérias Gram-negativas. Além disso, as bac-
térias Gram-negativas contêm uma camada de lipopolissacarídeo (lipídeos e polissacarídeos) 
como parte de sua parede celular. Quando aplicados a células Gram-positivas e Gram-nega-
tivas, o cristal violeta e o iodo penetram facilmente nas células. Dentro das células, o cristal 
violeta e o iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo é maior que a molécula de 
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cristal violeta que penetrou na célula e, devido a seu tamanho, não pode ser removido da cama-
da intacta de peptideoglicano das células Gram-positivas pelo álcool. Deste modo, as células 
Gram-positivas retêm a cor do corante cristal violeta.
Nas células Gram-negativas, a lavagem com álcool rompe a camada externa de lipopolis-
sacarídeo, e o complexo CV-I é removido através da camada delgada de peptideoglicano. Com 
isso, as células Gram-negativas permanecem incolores até serem contracoradas com a safra-
nina, adquirindo a cor rosa.
As células Gram-positivas retêm o corante e permanecem com a cor púrpura. As células 
Gram-negativas não retêm o corante; e ficam incolores até serem contracoradas com um co-
rante vermelho. O método de Gram é uma das mais importantes e discutidas técnicas de co-
loração na microbiologia médica. Porém, os resultados da coloração de Gram não são univer-
salmente aplicáveis, pois algumas células bacterianas coram-se fracamente ou não adquirem 
cor. A reação de Gram é mais consistente quando utilizada em bactérias jovens, que estejam 
ainda em fase de crescimento.
Figura 4:Micrografia de bactérias coradas pelo método de Gram. Os bastonetes e os cocos (roxo) são Gram-posi-
tivos, e os vibriões (rosa) são Gram-negativos.Fonte: Tortora, Funke& Case, Microbiologia.
A reação de Gram de uma bactéria pode fornecer informações valiosas para o tratamento 
de doenças. As bactérias Gram-positivas tendem a ser mais facilmente mortas por penicilinas 
e cefalosporinas. As bactérias Gram-negativas geralmente são mais resistentes porque os an-
tibióticos não podem penetrar a camada de lipopolissacarídeo. Parte da resistência a estes 
antibióticos entre ambas as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas deve-se à inativação 
bacteriana dos antibióticos.
Algumas células Gram-positivas poderão apresentar uma resposta Gram-negativa, sendo 
caracterizadas como bactérias Gram-variáveis. Essas células normalmente estão mortas. En-
tretanto, há alguns poucos gêneros Gram-positivos que apresentam um número crescente de 
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células Gram-negativas à medida que a cultura envelhece. Alguns exemplos de células Gram-
-variáveis são bactérias pertencentes aos gêneros Bacillus e Clostridium.
pAredes CelulAres AtípiCAs
Entre os procariotos, certos tipos de células não possuem paredes ou têm pouco material 
de parede. Eles incluem os membros do gênero Mycoplasma e organismos relacionados. Os 
micoplasmas são as menores bactérias conhecidas que podem crescer e se reproduzir fora 
de células vivas de hospedeiros. Devido ao seu tamanho e por não terem paredes celulares, 
passam através da maioria dos filtros bacterianos, tendo sido inicialmente confundidos com 
vírus. Suas membranas plasmáticas são únicas entre as bactérias por possuírem lipídeos de-
nominados esteróis, os quais podem protegê-las da lise celular. As arquibactérias podem não 
ter paredes ou ter paredes incomuns compostas de polissacarídeos e proteínas, mas não de 
peptideoglicana. Essas paredes contêm uma substância similar à peptideoglicana, denomi-
nada pseudomureína. A pseudomureína contém ácido N-acetiltalosaminurônico em vez de 
N-acetilmurâmico (NAM) e não possui os D-aminoácidos encontrados nas paredes celulares 
bacterianas. As arquibactérias geralmente não podem ser coradas pelo método de Gram, mas 
aparentam ser Gram-negativas por não conterem peptideoglicana.
pAredes CelulAres ÁlCool-ÁCido resistentes
A coloração álcool-ácido resistente é usada para identificar todas as bactérias do gênero 
Mycobacterium e espécies patogênicas de Nocardia. Essas bactérias contêm uma alta con-
centração (cerca de 60%) de um lipídeo céreo hidrofóbico chamado ácido micólico, em sua pa-
rede que previne a entrada dos corantes, incluindo os utilizados na coloração de Gram. O ácido 
micólico forma uma parede externa a uma camada fina de peptideoglicana. O ácido micólico 
e a peptideoglicana são unidos por um polissacarídeo. A parede hidrofóbica cérea das células 
induz as culturas de Mycobacterium a se agregar e aderir às paredes do frasco de cultura.
ColorAção ÁlCool-ÁCido resistente ou ColorAção de ZieHl- 
neelsen
Trata-se de uma técnica de coloração de bactérias mais agressivas que a técnica de Gram, 
sendo de grande importância em medicina humana e animal. No gênero Mycobacterium, in-
cluem-se os agentes da tuberculose (M. tuberculosis, M. bovise M. avium) e da lepra (M. leprae), 
além de outras espécies, algumas saprófitas e outras de patogenicidade peculiar. Suas carac-
terísticas são do gênero Aerobiose estrita, reprodução lenta, mesmo em condições ótimas 
(seu período de duplicação é de 12 a 18 horas enquanto outras bactérias podem se duplicar 
em 20 minutos). Apresentam reações tintoriais próprias que as fazem conhecidas como “álco-
ol-ácido-resistentes” (B.A.A.R.), evidenciadas pela coloração de Ziehl-Neelsen. Coram-se pela 
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mistura fucsina mais ácido fênico aquecido, que penetra no citoplasma e resistem à descolo-
ração com uma mistura de ácido e álcool.
Outra importante coloração diferencial (que classifica as bactérias em grupos distintos) é 
a coloração álcool-ácido resistente, que se liga fortemente apenas a bactérias que possuemmaterial céreo em suas paredes celulares. Esta coloração é utilizada para identificar todas 
as bactérias do gênero Mycobacterium, incluindo os dois importantes patógenos Mycobacte-
rium tuberculosis, o agente causador da tuberculose, e Mycobacterium leprae, o agente causa-
dor da lepra.
No procedimento de coloração álcool-ácido resistente, o corante vermelho carbolfucsina 
é aplicado a um esfregaço fixado, e a lâmina é aquecida levemente por vários minutos. Nesta 
etapa, o calor permite o aumento da penetração e a retenção do corante nas células. A seguir, 
a lâmina é resfriada e lavada com água. O esfregaço é tratado com álcool-ácido, um descolo-
rante, que remove o corante vermelho das bactérias que não são álcool-ácido resistentes. Os 
micro-organismos álcool-ácido resistentes retêm a cor vermelha, pois a carbolfucsina é mais 
solúvel nos lipídeos da parede celular que no álcool-ácido. Em bactérias que não são álcool-á-
cido resistentes,ou seja, com paredes celulares que não possuem os componentes lipídicos, a 
carbolfucsina é rapidamente removida durante a descoloração, deixando as células incolores. 
O esfregaço é então corado com o contra corante azul de metileno. As células que não são 
álcool-ácido resistentes ficam azuis após a aplicação do contracorante.
Figura 5:Bactérias álcool-ácido resistentes (B.A.A.R.). As bactérias Mycobacterium leprae foram coradas de ver-
melho com uma coloração álcool-ácido. As células que não são álcool-ácido resistentes estão coradas com 
o contracorante azul de metileno.Fonte: Tortora, Funke & Case, Microbiologia.
ColorAção pArA CÁpsulAs
Muitos micro-organismos contêm um revestimento gelatinoso denominado cápsula, que 
atua como fator de virulência e mecanismo de evasão do sistema imune do hospedeiro. Na 
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microbiologia médica, a demonstração da presença de uma cápsula é um modo de determinar 
a virulência do organismo, que é o grau em que um patógeno pode causar doença. A coloração 
da cápsula é mais difícil que outros tipos de procedimentos de coloração, pois os materiais 
capsulares são solúveis em água e podem ser desarranjados ou removidos durante uma la-
vagem vigorosa. Para demonstrar a presença das cápsulas, pode-se misturar as bactérias em 
uma solução contendo uma fina suspensão coloidal de partículas coradas, geralmente com 
tinta nanquim ou nigrosina, para fornecer um fundo contrastante e depois corar as bactérias 
com uma coloração simples, como a safranina (coloração de fundo). Devido à sua composi-
ção química, as cápsulas não reagem com a maioria dos corantes, como a safranina, e desse 
modo aparecem como halos incolores circundando cada célula bacteriana.
Figura 6:A coloração da cápsula fornece um fundo contrastante. Neste exemplo, as cápsulas da bactéria Kle-
bsiella pneumoniae apresentam-se como áreas claras circundando as células coradas. Fonte: Tortora, Funke& 
Case, Microbiologia.
método dA tintA dA CHinA (ColorAção negAtivA)
Como na técnica dos flagelos, deve-se cultivar a bactéria produtora de cápsula em meio 
rico brain heart infusion (BHI). Uma boa sugestão é usar a Klebsiella pneumoniae que produz 
geralmente essa camada externa em abundância; colocar 1 ou 2 gotas da cultura em uma lâ-
mina, depositar na lâmina uma gota de tinta da China ao lado das gotas de cultura, cobrir com 
uma lamínula, comprimindo-a entre folhas de papel de filtro, para se obter uma quantidade bem 
tênue de corante e material. Ao final, basta realizar a observação ao microscópio óptico (40X).
método dA tintA dA CHinA Com fuCsinA diluídA
Seguindo a mesma técnica, depositar na lâmina uma gota de tinta da China ao lado das 
gotas de cultura, deslizar uma lâmina sobre a primeira, fazendo um esfregaço, e deixar secar 
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ao ar. Corar com fucsina diluída, durante 2 minutos, e lavar suavemente com água, secar ao ar 
e observar em imersão.
método de Hiss
Neste método para evidenciação de cápsulas, desenvolvido em 1905, utiliza-se, como co-
rante primário, o cristal violeta aplicado a um esfregaço não fixado, assim, o material capsular 
fica corado em roxo. Como descorante e corante de contraste, utiliza-se a solução de sulfato 
de cobre a 20%. Ao contrário da célula bacteriana propriamente dita, a cápsula é neutra e, por 
isso, o corante primário, embora tenha aderido, não é absorvido. Uma vez que os constituintes 
da cápsula são hidrossolúveis e podem ser perdidos durante a lavagem, o sulfato de cobre é 
usado como descorante, removendo o excesso do cristal violeta que aderiu à cápsula e, ao 
mesmo tempo, atua como corante de contraste, pois é absorvido pelo material capsular que 
ele descorou. Assim, a cápsula aparece agora contrastando com o roxo da célula, como uma 
zona mais clara.
Nesta técnica, o esfregaço é preparado para a coloração sem fixar. Cobre-se o esfregaço 
com cristal violeta, deixando agir por 5 a 7 minutos, lavando-o logo depois com uma solução 
de sulfato de cobre a 20%.
ColorAção pArA endosporos (esporos)
Um endosporo é uma estrutura especial resistente, dormente, formada dentro de uma célu-
la que protege as bactérias de condições ambientais adversas e até mesmo extremas. Embora 
os endosporos sejam relativamente incomuns nas células bacterianas, podem ser formados 
por alguns gêneros de bactérias. Os endosporos não podem ser corados pelos métodos co-
muns, como a coloração simples e a coloração de Gram, pois os corantes não penetram a 
parede do endosporo. A coloração mais comumente usada para endosporos é a técnica de 
Schaeffer-Fulton. O verde malaquita, o corante primário, é aplicado a um esfregaço fixado com 
calor e aquecido em vapor por cerca de cinco minutos. O calor auxilia a coloração a penetrar 
na parede do endosporo. Então, a preparação é lavada por cerca de 30 segundos com água, 
para remover o verde malaquita de todas as partes da célula, exceto dos endosporos. A seguir, 
a safranina, o contracorante, é aplicada ao esfregaço para corar as porções da célula que não 
sejam os endosporos. Em um esfregaço corretamente preparado, os endosporos aparecem 
em verde dentro de células vermelhas ou rosadas.
Como os endosporos são altamente refrativos, podem ser detectados no microscópio óp-
tico quando não corados, mas não podem ser diferenciados de inclusões de material armaze-
nado sem uma coloração especial.
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Figura 7: Os endosporos são vistos como formas ovais verdes nessas células em forma de bastão da bacté-
ria Bacilluscereus, utilizando-se a coloração de Schaeffer-Fulton para endosporos. Fonte: Tortora, Funke& Case, 
Microbiologia.
ColorAção de WirtZ-Conklin
A esporulação, processo pelo qual alguns gêneros de bactérias formam esporos, ocor-
re quando as bactériasse encontram em situações críticas para sua sobrevivência, ou seja, 
as condições ambientais são adversas para o crescimento bacteriano. De maneira geral, isto 
ocorre quando há falta de nutrientes, como carbono ou nitrogênio. Os esporos apresentam-se 
sob a forma de corpúsculos esféricos ou ovoides, livres ou no interior da bactéria. Formam-se 
pela invaginação de uma dupla camada de membrana celular, que se fecha para envolver um 
cromossomo e uma pequena quantidade de citoplasma, garantindo a sobrevivência da espé-
cie. Esta camada é responsável pela resistência à coloração e ao ataque dos agentes físicos e 
químicos da esterilização e desinfecção. Por esta razão, para que seja possível corar os espo-
ros, é necessário um tempo prolongado de exposição ao corante verde malaquita, associado 
ao aquecimento, permitindo o rompimento desta barreira obtendo-se, então, o esporo corado 
em verde intenso. São características comuns aos esporos: decréscimo na quantidade total 
de água em comparação com o estado vegetativo, retroatividade, alta resistência a condições 
ambientais adversas, habilidade de germinar e produzir células vegetativas após longos perío-
dos de estocagem.
Na fase esporulada, as bactérias não realizam atividade biosintética e reduzem sua ativi-
dade respiratória. As bactérias podem permanecer viáveis na forma de esporos durante anos, 
se mantidas a temperaturas usuais e em estado seco.
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método pArA ColorAção de esporos WirtZ-Conklin
Esta coloração é feita a partir de esfregaços homogêneos, delgados e fixados em lâminas. 
Primeiramente, o esfregaço é coberto com o corante verde malaquita. A lâmina é colocada 
próxima à chama do bico de Bunsen até que desprenda vapor, sem deixar que o corante ferva. 
Após 1 a 2 minutos, a operação é repetida por 3 a 4 vezes. A lâmina deverá ser suavemente 
lavada com água, evitando o choque térmico, que poderá quebrá-la. A solução de safranina é 
adicionada por 30 segundos, a lâmina é então lavada e seca ao ar. No final, a lâmina é obser-
vada ao microscópio com objetiva de imersão.
As soluções utilizadas neste procedimento são:
Solução A: Verde malaquita a 5%, que consiste em 2,5 g de verde malaquita e 50mL de 
água destilada, misturar e deixar em repouso durante uma noite para dissolver.
Solução B: Safranina (50 g de solução estoque de Safranina e Etanol 95% (2000mL). Solu-
ção de trabalho: Solução estoque de Safranina (300 mL) e água destilada (2700 mL).
ColorAção dos flAgelos
Os flagelos bacterianos são estruturas de locomoção muito pequenas para serem visu-
alizadas com um microscópio óptico sem coloração. Um procedimento tedioso e delicado 
de coloração utiliza um mordente e o corante carbolfucsina para aumentar os diâmetros dos 
flagelos até que eles se tornem visíveis no microscópio óptico. Os microbiologistas utilizam o 
número e o arranjo dos flagelos como auxiliares de diagnóstico.
ColorAção de fontAnA triBondeAu
É considerado um método de coloração não verdadeiro; foi desenvolvido em 1920. É uma 
técnica de impregnação pela prata usada para auxiliar na visualização de bactérias espiraladas 
as quais são muito finas e se coram de forma insuficiente pelo Gram como por exemplo, Lep-
tospira interrogans e treponemas. Na realização dessa técnica, as espiroquetas aparecerem na 
cor marrom-escura ou negra em um fundo amarelo-castanho ou marrom claro.
Espiroquetas são gGram-negativos, em forma de espiral eles são únicos na morfologia e 
locomoção, o seu tamanho é medido por medição do seu comprimento e largura, que de modo 
geral é de 5 a 500 microns de comprimento e de 0,1 a 3 microns de largura. Possuem periplas-
ma e endoflagelos. Endoflagelos são flagelos enrolados em torno das células protoplastos 
helicoidais entre membrana externa. Essas espiroquetas são organismos extremamente sen-
síveis na técnica especial.
Método de Coloração: A partir de esfregaços homogêneos, delgados e fixados em lâminas. 
Nesta técnica, o esfregaço é coberto com a solução fixadora, que deverá ser renovada três 
vezes, por 30 segundos. A lâmina é coberta com solução mordente, aquecendo-a até emitir 
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vapores. Após 30 segundos, deve-se lavar a lâmina em água corrente. A lâmina é tratada pela 
solução impregnadora de prata (nitrato de prata amoniacal), por rápido aquecimento até a 
emissão de vapores, deixa-se agir por 30 segundos (a preparação toma a cor marrom). A lâmi-
na é seca ao ar e examinada ao microscópio com a objetiva de imersão.
Solução de Coloração Líquido de Ruge (Fixador): Ácido acético glacial (1 ml), formalina 
40% (2 ml), água destilada (100 ml). Mordente: Água tânico (5 g), ácido fênico(fundido) (1 ml), 
água destilada (100 ml). Nitrato de Prata Amoniacal (solução impregnadora): Nitrato de prata 
(5 g), água destilada (100 ml).
Figura 8: Os flagelos aparecem como extensões ondulantes a partir das extremidades dessa célula da bactéria 
Spirillumvolutans. Em relação ao corpo da célula, os flagelos encontram-se muito mais espessos que o normal, 
pois ocorreu o acúmulo de camadas do corante devido ao tratamento da amostra com um mordente.Fonte: 
Tortora, Funke& Case, Microbiologia.
ColorAção de AlBert-lAyBourn
Inicialmente foi sugerida por Henry Albert, em 1920, e modificada por Ross Laybourn, em 
1924. Baseia-se no fato de algumas bactérias apresentarem corpúsculos citoplasmáticos lo-
calizados nas regiões polares, chamados corpúsculos metacromáticos ou corpúsculos de Ba-
bes Ernst, que se coram pelo Lugol forte de cor marrom, evidenciando-se, em contraste com 
o corpo bacilar, que se cora em verde-azulado pela solução de Laybourn. Tais características 
são observadas nas corinebactérias e sua presença é associada aos sintomas clínicos carac-
terísticos da difteria, o que possibilita um diagnóstico presuntivo da doença, pela microscopia 
ótica. Portanto, este método é auxiliar no diagnóstico da difteria. Seu diagnóstico é geralmente 
clínico, mas a pesquisa de bacilos metacromáticos cuidadosamente coletados a partir da face 
anterior da pseudomembrana pode ser um importante auxiliar diagnóstico. O cultivo de corine-
bactérias é possível, mas seu uso clínico é bastante reduzido. O exame direto de esfregaço de 
naso e orofaringe é padrão outro para triagem de infecção pelo Corynebacteriumdiphtheriae. A 
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positividade é sugerida pela presença de bacilos Gram-positivos pleomorfos, em grande núme-
ro, com morfologia e distribuição características.
A difteria é uma doença infecciosa causada por uma bactéria conhecida como Corynebac-
teriumdiphtheriae, transmitida de pessoa para pessoa por meio das vias respiratórias ou atra-
vés de contato físico. As bactérias formam placas amareladas quese alojam nas amígdalas, 
laringe, faringe, nariz e até mesmo na conjuntiva e na pele. A doença pode ser prevenida atra-
vés da vacinação. A difteria afeta mais crianças do que adultos. Apesar de ser mais comum 
em pessoas mais jovens, a mortalidade da doença afeta de 5 a 10% das crianças e 20% adultos 
com mais de 40 anos de idade.
Método de coloração de Albert-Laybourn: O esfregaço é coberto por 3 a 5 minutos, com a 
solução de Albert-Layborn. A lâmica não poderá ser lavada; deve-se apenas escorrer o excesso 
da solução. Logo após, deve-se cobrir a lâmina com solução Lugol forte, por aproximadamente 
2 minutos, e examiná-la ao microscópio com a objetiva de imersão.
Soluções utilizadas no método: Solução de Albert-Laybourn: Azul de toluidina (0,15 g), ver-
de de malaquita(0,20 g), ácido acético glacial (1 mL), álcool 95º (2 ml), água destilada (100 ml). 
Solução de Lugol Forte: Iodo metálico (2,0 g), iodeto de potássio (3,0 g), água destilada (300 
ml). Após o preparo a solução corante deverá ser guardada em frasco âmbar ao abrigo da luz.
Figura 9: Bactérias do gênero Corinebacterium coradas pelo método Albert-Laybourn. Observe as células cora-
das pelo Lugol em marrom fortee os corpos bacilares corados em verde. Fonte: Academia de Ciência e Tecnolo-
gia, São José do Rio Preto.
Outros métodos diferenciais ou modificações dos métodos discutidos podem ser utiliza-
dos para evidenciar diversos gêneros bacterianos. Atualmente, por exemplo, em vez do cristal 
violeta, é preconizada pelo Ministério da Saúde a utilização da violeta de metila que, inclusive, 
já fixa a amostra na lâmina sem necessitar da fixação na chama do bico de Bunsen. Todas as 
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mudanças que são realizadas nestes métodos e a criação de novas técnicas têm o intuito de 
melhorar e clarificar a visualização bacteriana no microscópio ótico de campo claro. Na rotina 
laboratorial, os métodos apresentados nesta aula serão os de maior utilização e de aplicação 
mais global. Outro fator importante é o controle de qualidade das substâncias a serem utiliza-
das e das técnicas. Sempre que for realizá-las, o ideal é ter colônias de bactérias “padrão”, com 
comportamento conhecido diante dos corantes/reagentes que serão usados no teste. Elas 
servirão de parâmetro do funcionamento da coloração, auxiliando também na comparação do 
resultado esperado com o obtido na amostra em teste.
Agora que fizemos todo o embasamento teórico a respeito dos tipos de coloração, te convido 
a fazer comigo um destaque dos conteúdos mais cobrados em relação a este tema. Vamos lá?
destAques soBre ColetA de AmostrAs pArA exAmes e métodos de Colo-
rAção
ColorAção grAm
Sabemos que praticamente todo procedimento laboratorial exige etapas pré-analíticas e a 
coloração é uma delas. O uso da cor facilita a visualização em geral. Imagine do que é micros-
cópico... Por isso, o dinamarquês Hans Christian Joachim Gram
criou essa técnica que é de longe a mais usada em laboratório de micro.
Como cai na prova??? Isso, já vamos começar por aí!
001. (IDECAN/MUNICÍPIO DE MATIAS CARDOSO/MG) A coloração de Gram é um dos mais 
importantes métodos utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo 
quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. Por essa téc-
nica, um esfregaço de células procarióticas fixadas pelo calor recebe o corante cristal violeta e, 
depois, o lugol (à base de iodo). Essas duas substâncias se combinam no citoplasma da célula 
procariótica, que passa a ter coloração violeta-escura ou púrpura. A seguir, adiciona-se álco-
ol, que tem a capacidade de descolorir as células que foram coradas. No entanto, diferenças 
estruturais na parede celular dos procariontes afetam a retenção ou o escape da combinação 
entre o corante violeta e o iodo, quando se adiciona o álcool. Portanto, a retenção da cor nas 
células, quando ocorre, refere-se às bactérias
a) Gram-negativas, devido à presença de parede celular com camada delgada de peptideogli-
cano associada a uma camada mais externa de composição lipoproteica.
b) Gram-negativas, devido à presença de parede celular formada por uma camada espessa de 
peptideoglicano.
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c) Gram-positivas, devido à presença de parede celular com camada delgada de peptideoglica-
no associada a uma camada mais externa de composição lipoproteica.
d) Gram-positivas, devido à presença de parede celular com camada espessa de peptideogli-
cano associada a uma camada mais externa de composição lipoproteica.
e) Gram-positivas, devido à presença de parede celular formada por uma camada espessa de 
peptideoglicano.
A alternativa correta é a letra e. Os erros das demais alternativas estão destacados em negrito.
Letra e.
Excelente questão para começar o assunto de Coloração, pois em primeiro lugar já mostra 
que o assunto cai, em segundo lugar mostra o princípio da técnica e a leitura do resultado. Va-
mos lá: CHEGA DE ERRAR QUESTÕES DE GRAM na prova!
Gram
Obs.: � Olha como é simples: Gram coloriu uma lâmina com bactérias fixadas por calor com 
um corante roxo (cristal violeta) e assim todas ficaram roxinhas. Para garantir que o 
corante ficasse mesmo dentro da célula, ele adicionou o lugol (que é à base de iodo) 
e forma um complexo sólido dentro das bactérias. Todas permaneceram roxas, mas 
após a lavagem com álcool algumas descoraram (ou seja, ficaram negativas) e as 
outras permaneceram roxas (positivas). Para conseguir visualizar as que descoraram 
ele adicionou um outro corante, as vezes chamado em provas de contracorante, só 
para revelar a presença daquelas bactérias ali. (Já pensou se não fosse revelado? 
Como saberíamos a forma delas por exemplo, se estavam incolores?) Por isso, no final 
ele usou a fucsina ou safranina, deixando as que eram incolores (negativas) da cor rosa.
Só isso!!! Ah! Olha que linda fica a lâmina corada!!!
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Métodos de Coloração para Exames de Microbiologia
MICROBIOLOGIA
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Lâmina – Coloração Gram
Agora observe o desenho a seguir SUPERsimples que demonstra a diferença estrutural da 
parede bacteriana e que justifica tal comportamento durante a coloração. Veja:
esquemA diferenCiAl dAs pAredes BACteriAnAs grAm + e -
GRAM
POSITIVA
(ROXA)
GRAM
NEGATIV
A(ROSA)
MEMBRANA
MUREÍNA
LPS
Gram +: GROSSA
GRAM -: FINA
A Bactéria Gram positiva tem apenas duas camadas:
A membrana celular (azul) e a parede celular de peptideoglicano (verde) que é formada por 
mureína + N-acetilglicosamida. Essa camada, porém, é bem mais espessa nelas do que nas 
bactérias gGram-negativas.
Para lembrar isso, observe que o nome da estrutura química que dá essa proteção maior é 
MUREÍNA, lembrando de MURO (que também traz proteção).
A bactériaGram-positiva tem três camadas:
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Métodos de Coloração para Exames de Microbiologia
MICROBIOLOGIA
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As mesmas que a Gramgran-positiva, ou seja, membrana celular e peptideoglicano, porém 
essa última mais fina do que a da Gram +, ou seja seu “MURO” é mais fino, por isso ela precisa 
também de uma mais externa de lipopolissacarídeos.
Entre elas existe um espaço, chamado espaço periplasmático.
O que faz a bactéria Gram + reter o corante e a Gram - perder o
corante?
G+ retém porque o 
cristal violeta+ lugol 
formam complexo que 
fica preso noespesso 
“muro” de
peptideoglicano.
G- perde porque o álcool
solubiliza os lipídeos da
membrana extra de LPP. 
O peptideoglicano da G- é 
muitofino e não retém o
corante
002. (FUNCERN/IFRN/BIÓLOGO) A parede celular é uma estrutura externa à membrana plas-
mática e é importante para os organismos microbianos. Cada grupo de organismos tem pecu-
liaridades na estrutura de sua parede celular. Assim, a opção que apresenta, respectivamente, 
os componentes exclusivos de parede de bactéria Gram-positiva, Gram-negativa e de parede 
celular de fungo é:
a) ácido teicóico, membrana externa fosfolipídica e peptídeoglicano.
b) ácido teicóico, membrana externa fosfolipídica e mananas.
c) peptideoglicano, mananas e membrana externa fosfolipídica.
d) ácido teicóico, mananas e membrana externa fosfolipídica.
A alternativa correta é a letra b e os erros estão destacados em negrito.
Letra b.
Não se assuste! Eu coloquei essa questão apenas para fechar o assunto com essas obser-
vações e mostrar que não é exagero não!!! Cai em prova!
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Métodos de Coloração para Exames de Microbiologia
MICROBIOLOGIA
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Componentes exClusivos ds BACtériAs
• GRAM POSITIVAS: Ácido tecoico, exotoxina
• GRAM NEGATIVAS: Antígeno O, endotoxina
Difícil lembrar esses nomes??? QUE TAL MEMORIZAR???
Olha, se a banca perguntar se tem ácido tecoico, você irá pen-
sar assim:
“Sim” é um sinal positivo , ou seja, as gGram-positivas têm 
o ácido tecoico, e “Não” é um sinal negativo , ou seja as 
GramGram-negativas não têm o ácido
tecoico.
Quanto à endo ou exotoxina, é só pensar que o prefixo que tem 
o N corresponde às Gram-Negativas (cuja inicial é N), sendo, 
portanto, ENDO. E o outro é o das Gram-Positivas (EXO).
Por fim, em relação ao Antígeno O, é só pensar que ele é o res-
ponsável pela maior patogenicidade das bactérias Gram-Ne-
gativas!!! Você se lembra de que elas são mais patogênicas do 
que as Positivas, não é??
Releia a questão e observe que, mesmo que você não saiba que mananas são estruturas 
exclusivas de fungos, acertaria a questão por exclusão, visto as demais alternativas.
COMPONENTE GRAM POSITIVA (ROXA) GRAM NEGATIVA (ROSA)
ÁCIDO TECÓICO SIM NÃO 
ENDOTOXINA NÃO SIM
EXOTOXINA SIM NÃO
ANTÍGENO O 
(PATOGENICIDADE) NÃO SIM
Falando em fungos e outras estruturas... Existe uma dificuldade de visualização de mico-
bactérias pela coloração Gram, porque elas possuem na sua parede celular uma grande con-
centração de lipídeos, devido à presença de ceras e ácidos graxos (ácidos micólicos), assim é 
utilizado um método que é justamente o próximo tópico da nossa aula.
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Métodos de Coloração para Exames de Microbiologia
MICROBIOLOGIA
Pollyana Lyra
ColorAção de ZieHl-neelsen (BAAr)
Galerinha, sigam o mesmo raciocínio da coloração Gram... Colorir e descorar! Mas, aqui, 
colore-se com o corante fucsina (rosa ou vermelho) e descora-se com uma mistura de áccol + 
ácido (clorídrico). Se as micobactérias forem resistentes a essa mistura, são consideradas po-
sitivas (pois ficam ainda coradas com o corante inicial e permanecem com a coloração rosa). 
Se elas não forem resistentes, irão descorar e ficar na cor do fundo da lâmia (azul) devido ao 
azul de metileno. Fácil, fácil, não é??? Vai um esqueminha para fixar...
Bactérias álcool-ácido resistentes (BAAR): vermelho ou rosa
Bactérias não álcool-ácido resistentes (BNAAR): azul
ComportAmento dos BACilos frente A CAdA CorAnte
Soluções em ordem 
de aplicação BAAR BNAAR
Fucsina de Ziehl Bactérias coradas em vermelho
Bactérias coradas em 
vermelho
Álcool-ácido clorídrico
A fucsina se fixa nos lipídeos 
complexos e não abandona 
a célula, que permanece 
vermelha
A fucsina não se fixa nos 
componentes da parede 
celular e abandona a célula, 
que permanece sem corante 
em seu interior
Azul de metileno A célula não é afetada e permanece vermelha
A célula adquire o corante, 
tornando-se azul (cor do 
fundo)
Não se esqueçam, essa coloração é usada para bactéricas que se coram mal pela colora-
ção GRAM, em especial os bacilos da LEPRA e da TUBERCULOSE.
Lâmina BAAR
ColetA de AmostrAs pArA exAme miCroBiológiCo
Como já mencionado, a fase pré-analítica é fundamental para a acurácia do exame e diag-
nóstico microbiológico. Isso porque qualquer célula ou contaminante pode alterar a conclusão 
do médico e por consequência a terapia escolhida.
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Métodos de Coloração para Exames de Microbiologia
MICROBIOLOGIA
Pollyana Lyra
Cuidado com a escolha:
da suspeita clínica, do
agente pesquisado, do
momento clínico para
coleta do teste a ser feito
Terapia antimicrobiana:
coletar antes de iniciar ou
modificar a medicação.
ORIENTAÇÕES
DA
ANVISA
NÃO
ESQUECER:
APÓS A COLETA:
Conferir
se volume é suficiente,
transportar rapidamente
para o laboratório.
Orientar o paciente,
identificar amostra (nuncana 
tampa), usar EPI, ser
Treinado, usar frasco
estéril
Algumas bactérias são especialmente sensíveis às condições ambientais, incluindo Shigella 
spp, Neisseria gonorrhoeae, N. meningitides, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumo-
niae e anaeróbios.
Obs.: � Nunca refrigerar amostras de líquor, amostras genitais, oculares ou da orelha interna;
Conforme as normas de biossegurança, todo material será colhido, acondicionado, trans-
portado, processado e descartado como potencialmente infectante, independentemente do 
diagnóstico do paciente. Para evitar a exposição de risco biológico, observar as rotinas de 
cada procedimento e usar os EPIs indicados.
O meio de transporte serve para manter a viabilidade das bactérias, porém sem permitir 
a multiplicação (p. ex., Stuart, Amies, Cary Blair) durante o trânsito entre o local de coleta e o 
laboratório, mas isso vamos ver melhor na aula de meios de cultura...
Vejamos agora a forma de coleta adequada para alguns dos principais exames micro-
biológicos.
Hemocultura
É necessário rigor na execução da técnica, uma vez que há possibilidade de crescimento 
de contaminantes da pele (usar clorexidinae álcool na antissepsia).
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Métodos de Coloração para Exames de Microbiologia
MICROBIOLOGIA
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SERINGA E AGULHA, 
DISPOSITIVOSÀ VÁCUO
Secreção de Ferida Cutânea ou Cirúrgica, Abscesso ou Fístula
A secreção pode ser coletada de duas maneiras:
1. por aspiração da secreção utilizando seringa e agulha estéreis ou somente a seringa.
2. com swab (menos recomendada).
SERINGA E AGULHA, SWAB
Biópsia
No caso de ferida ou lesão cutânea, a cultura de pequeno fragmento de tecido (biópsia) 
fornece resultado mais representativo em relação ao swab.
Utiliza-se o bisturi ou tesoura evitando áreas de tecido necrosado e pus, os quais devem 
ser removidos.
BISTURI, TESOURA, SWAB
Urocultura
A urina na bexiga é estéril, porém, com exceção da coleta suprapúbica, todos os métodos 
propiciam a contaminação da urina com a microbiota uretral. A coleta de urina do jato médio 
é o método.
É o mais utilizado, por não ser invasivo e pela relativa confiabilidade, quando realizada 
dentro de técnica adequada, mas também pode ser feita a coleta por meio do cateter vesical.
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MICROBIOLOGIA
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COLETOR UNIVERSAL, SERINGA,
CATETER
As amostras abaixo não são tão frequentes em provas, mas vale a pena dar uma lida.
Líquidos Orgânicos Estéreis
São exemplos o líquido pleural, sinovial, bile e outros... Deve-se fazer antissepsia da pele 
(solução alcoólica de clorexidina ou PVP-I) e realizar a aspiração do material com seringa e 
agulha estéril.
SERINGA E AGULHA
Líquor
A punção lombar deve ser feita sob condições estritas de assepsia.
Ah, e lembrando... Tanto Neisserias como Haemophilus não resistem às temperaturas bai-
xas, daí porque o líquor para cultura não deve ficar em geladeira.
SERINGA E AGULHA
Escarro
Evitar coletar saliva ou material de vias aéreas superiores. Coletar pela manhã com o pa-
ciente em jejum, após higiene oral (escovar os dentes sem o uso de pasta dental e fazer garga-
rejos). O escarro deve ser coletado após tosse profunda e depositado diretamente em frasco 
esterilizado de boca larga com tampa rosqueada.
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MICROBIOLOGIA
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Secreção de Orofaringe (Swab)
Usado para pesquisa de Streptococcus pyogenes.
Fezes (Swab, Evacuação Espontânea)
Devem ser coletadas no início ou fase aguda da doença, quando os patógenos estão usual-
mente presentes em maior número. Preferir as porções mucóides e sanguinolentas do material.
Conservação
O método de conservação dependerá do microrganismo pesquisado, do tipo de amostra e 
da técnica utilizada. Pode ser químico (p. ex., formalina para fezes) ou refrigeração.
resumo de formAs de ColetA
EXAME FORMA DE COLETA
Secreção de ferida 
cutânea ou cirúrgica, 
abscesso ou fístula
Fragmento de 
tecido (pele, tecido 
subcutâneo)
Urocultura
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MICROBIOLOGIA
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EXAME FORMA DE COLETA
Hemocultura, líquidos 
orgânicos estéreis, 
líquor
Pessoal, encerramos nossa aula. Espero que tenham gostado e que permaneçam perseve-
rantes nos estudos. Vamos juntos, em busca do êxito nessa luta!
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Métodos de Coloração para Exames de Microbiologia
MICROBIOLOGIA
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EXERCÍCIOS
001. (IDECAN/PREF. SIMONÉSIA/MG FARMACÊUTICO/BIOQUÍMICO) Sobre a técnica de 
coloração de Gram, assinale a alternativa correta.
a) Os micro-organismos são expostos a uma coloração a quente com carbolfucsina concen-
trada por 5 minutos.
b) Bactérias Gram-negativas não perdem o corante violeta durante a descoloração e, por isso, 
adquirem coloração rosa.
c) Bactérias Gram-positivas retêm o corante violeta por resistirem à descoloração e ficam co-
radas em azul escuro / roxo.
d) Bactérias Gram-positivas perdem o corante violeta durante a descoloração e adquirem a 
coloração azul escuro / roxo.
002. (COVEST/UFPE/BIOMÉDICO) Um estagiário do laboratório de Microbiologia Clínica re-
cebeu uma lâmina contendo esfregaço de Escherichia coli e uma lâmina contendo esfregaço 
de Staphylococcus aureus para serem coradas pela coloração de Gram (cristal violeta, lugol, 
álcool, fucsina diluída). Após fixar os esfregaços pelo calor, o estagiário realizou a coloração, 
porém inverteu a ordem da utilização dos corantes (fucsina, álcool diluído, cristal violeta, lu-
gol). Qual foi o resultado da coloração observado ao microscópio para E. coli e S. aureus, res-
pectivamente?
a) Bacilos vermelho-claros e cocos vermelho-escuros.
b) Bacilos vermelho-claros e bacilos violeta-escuros.
c) Bacilos e cocos vermelho-claros.
d) Bacilos e cocos violeta-escuros.
e) Cocos vermelho-claros e cocos violeta-escuros.
003. (COVEST/UFPE/BIOMÉDICO) A técnica de coloração diferencial mais importante em 
bacteriologia é o método de Gram. Este método explora o fato de células com propriedades 
diferentes apresentarem coloração diferente. Assim, as bactérias podem se comportar como 
Gram-positivas ou como Gram-negativas. Nesse contexto, analise as afirmativas abaixo.
1. A camada de peptideoglicano é muito mais espessa nas bactérias Gram- positivas, e essas 
bactérias podem possuir uma camada de ácido teicoico.
2. Os micro-organismos Gram-negativos possuem uma camada externa composta de lipopo-
lissacarídeos, lipoproteínas e fosfolipídios.
3. Apenas os micro-organismos Gram-positivos têm uma membrana externa contendo endo-
toxina (lipopolissacarídeo).
4. Os micro-organismos Gram-positivos e os Gram-negativos contêm peptideoglicano; contu-
do, nos primeiros, a parede é única e fina e nos segundos a parede é múltipla e espessa.
Estão corretas, apenas:
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MICROBIOLOGIA
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a) 1 e 4.
b) 1 e 3.
c) 2 e 3.
d) 3 e 4.
e) 1 e 2.
004. (AOCP/EBSERH/HC-UFG/BIOMÁDICO)Em relação às bactérias, é correto afirmar que:
a) As bactérias Gram-negativas possuem espessa camada que é firmemente aderida à cario-
teca de sua própria célula.
b) Certos organismos Gram-positivos e Gram-negativos podem apresentar também uma cáp-
sula, ou camada de glicocálice, internamente à parede celular. Essa cápsula torna a bactéria 
vulnerável à fagocitose por monócitos, podendo dificultar sua fixação tecidos do hospedeiro.
c) Os organismos Gram-positivos são assim denominados devido às características de colora-
ção próprias da sua finíssima camada externa de peptidoglicano, além disso, esses micro-or-
ganismos possuem amplo complexo de Golgi e mitocôndrias em seu interior.
d) As bactérias são classificadas em Gram-positivas ou Gram-negativas em função da diferen-
ça na arquitetura da parede celular. A parede celular Gram-positiva consiste em uma camada 
espessa de peptidoglicano (~30 nm), enquanto a parede celular da Gram-negativa apresenta 
camada mais fina de peptidoglicano (~10nm) e sua estrutura e composição da membrana 
mais complexas.
e) Bactérias como as microbactérias têm glicolipídeos múltiplos que lhes conferem uma apa-
rência de bolor, acarretando desvantagens biológicas, impedindo a infecção ao hospedeiro.
005. (UFT/COPESE/prefeitura de guarataí/Biomédico) “A Gram-Bretanha e a Ásia estão enfren-
tando um surto de escarlatina que intriga especialistas. De acordo com a Autoridade de Saúde 
Pública da Inglaterra (PHE, na sigla em inglês), em 2015, foram registrados 17.586 casos da 
infecção no país e o número só não ultrapassa os registros de 1967, com 19.305 notificações. 
A escarlatina é uma infecção bacteriana, causada por estreptococos do grupo A, que atinge 
principalmente crianças”
Referente às características das bactérias, é CORRETO afirmar que:
a) A diferenciação entre as bactérias é realizada exclusivamente pelas suas características 
morfológicas.
b) Os aspectos microscópicos, incluindo o tamanho, forma e os arranjos dos organismos (co-
cos, bastonetes, curvos ou espiralados), determinam a capacidade das bactérias de resistir a 
certos antibióticos.
c) Coloração de Gram é um teste rápido que permite aos clínicos a diferenciação entre as duas 
mais importantes classes de bactérias.
d) As bactérias Gram negativas têm a camada de peptidoglicano espessa contendo ácido tei-
coico e ácidos lipoteicoicos.
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Métodos de Coloração para Exames de Microbiologia
MICROBIOLOGIA
Pollyana Lyra
006. (FAFIPA/SERVIÇO DE BIOMEDICINA/PREF. LONDRINA/PR) A coleta de materiais bioló-
gicos para exames de microbiologia deve seguir as seguintes recomendações:
a) Identificar o material do paciente adequadamente.
b) Informar dificuldades que possam ocorrer durante a coleta, como material insuficiente 
para análise adequada.
c) Informar sobre o uso de antimicrobianos prévios à coleta do material pelo paciente.
d) No geral, os procedimentos de coleta seguem protocolos específicos que facilitam o cultivo 
dos micro-organismos suspeitos, de acordo com o sítio a ser investigado.
e) Todas estão corretas.
007. (FAFIPA/SERVIÇO DE BIOMEDICINA/PREF. LONDRINA/PR) Sobre o método de Ziehl-
-Nielsen para bacterioscopia direta, pode-se afirmar que:
a) Esta metodologia categoriza as bactérias em álcool-ácido resistentes e não álcool-ácido 
resistentes.
b) O corante empregado é o Albert-Layborn, capaz de penetrar no interior do Mycobacterium 
tuberculosis.
c) É sempre utilizada em associação com o método de impregnação em prata.
d) Deve ser confirmado por microscopia de campo escuro ou pelo método de tinta nanquim.
e) Utiliza um corante que pode se tornar fluorescente na microscopia óptica.
008. (BIOMÉDICO/PREF. NATAL-RN) A respeito da coloração bacteriana de Gram:
a) As bactérias que possuem a camada de lipídios associados a polissacarídeos não são co-
radas pela coloração de Gram.
b) Escherichia coli e Staphylococcus aureus são bactérias Gram-negativas.
c) Bactérias Gram negativas são aquelas que apresentam uma camada lipídica não corada 
pelo corante devido à afinidade entre a pigmentação e a camada de fosfolipídeos.
d) As bactérias Gram-positivas têm parede celular espessa e única de peptidoglicanos, que, ao 
contato com a coloração de Gram, adquire cor púrpura ou azul.
009. Na técnica de coloração do Gram a função do lugol é:
a) Corante primário.
b) Descorante.
c) Mordente.
d) Contraste.
010. (INÉDITA/2022) O corante utilizado para corar o Mycobacterium é:
a) Cristal violeta.
b) Carbolfucsina.
c) Azul de metileno.
d) Iodo.
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Métodos de Coloração para Exames de Microbiologia
MICROBIOLOGIA
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011. (INÉDITA/2022) A técnica de coloração para o Mycobacterium tuberculosis é:
a) Método de Gram.
b) Método de Laybourn.
c) Fontana e Tribondeau.
d) Coloração de Ziehl- Neelsen.
012. (INÉDITA/2022) A pesquisa direta do bacilo da tuberculose ou bacilo de Koch a partir de 
esfregaço do escarro corado pela técnica de Ziehl-Neelsen se fundamenta:
a) Pela fixação dos microrganismos por aquecimento da fucsina fenicada e descoloração pela 
mistura álcool-ácido.
b) Coloração do B.K. pelo cristal violeta e lugol e resistência ao processo de descoloração com 
álcool à 95%.
c) Coloração dos microrganismos presentes no escarro pela fucsina fenicada aquecida e resis-
tência à descoloração pela mistura álcool-ácido.
d) Coloração dos microrganismos presentes no escarro pelo cristal violeta e descoloração pela 
mistura álcool-ácido.
013. (INÉDITA/2022) A Nocardia do ponto de vista tintorial é:
a) Bacilo Gram negativo.
b) Cocobacilo Gram negativo.
c) Bacilo Gram positivo filamentoso.
d) Nenhuma das alternativas.
014. (IBADE/PREFEITURA DE MINISTRO ANDREAZZA-RO/TÉCNICO EM LABORATÓ-
RIO/2020) Há uma técnica de coloração adequada para corar os bacilos álcool-ácido resis-
tentes (BAAR). Estes bacilos são assim denominados porque possuem paredes celulares com 
alto teor de lipídeos, que, quando tratadas pelo corante fucsina fenicada, coram-se de verme-
lho e resistem ao descoramento subsequente por uma solução de álcool-ácido forte (diferen-
ciador). Outras bactérias, que não possuem tais paredes celulares ricas em lipídeos, têm a sua 
coloração pela fucsina descorada pela solução de álcool-ácido e coram-se em azul pela adição 
de fundo do azul de metileno. A técnica descrita no texto é conhecida como:
a) método de coloração de Ziehl-Neelsen, útil na identificação de
Mycobacterium tuberculosis.
b) método de coloração de Gram, útil na identificação de bactérias não álcool-ácido resistentes.
c) método de coloração Wright Giemsa, útil na identificação de
Mycobacterium tuberculosis.
d) método de coloração de Ziehl-Neelsen, útil na identificação de bactérias não álcool-ácido 
resistentes.
e) método de coloração de Gram, útil na identificação de Mycobacterium tuberculosis.
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015. (IBADE/PREFEITURA DE MINISTRO ANDREAZZA-RO/TÉCNICO