ANÁLISES CLINICAS MICROBIOLÓGICAS E IMUNOLÓGICAS

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MORFOLOGIA BACTERIANA
Morfologia bacteriana: são classificadas morfologicamente de acordo com o tamanho,
forma e arranjo e consistem nos menores seres vivos, da ordem de milésimos de
milímetro e, portanto, visíveis apenas com a ajuda de um microscópio. Enquanto
células animais e vegetais podem ter até dezenas de micrômetros, a maioria das
bactérias estudadas nos laboratórios de microbiologia medem em torno 1,0 µm de
diâmetro.
COCOS: Bactérias com formato esférico ou oval e que, de acordo com a sua divisão
celular, são exemplos de cocos de importância médica, Staphylococcus aureus,
Enterococcus spp, Streptococcus sp., Neisseria sp. Esses cocos podem se
apresentar em diferentes arranjos:
• Diplococos: agrupamento de dois cocos. Os Streptococcus pneumoniae
(pneumococo) são diplococos que podem causar pneumonia, meningite, sinusite e
infecção do ouvido médio. Outro exemplo é a Neisseria gonorrhoeae agente
etiológico da gonorreia.
• Estreptococos: Vários cocos agrupados em cadeia, lembrando um colar de
pérolas. As infecções estreptocócicas, causadas por várias espécies de
Streptococcus, podem desencadear diversos sintomas, como: pneumonia,
faringite, febre escarlatina, impetigo e celulite.
• Tétrades: Agrupamento de 4 cocos de forma semelhante a um quadrado.
Exemplo: Micrococcus spp., normalmente, não são patogênicos e integram a
microbiota.
• Sarcina: agrupamento de 8 cocos unidos de forma semelhante a um cubo.
Exemplo: Sarcina ventriculi, um importante patógeno em gatos, cachorros e
bovinos. Em humanos, o potencial patogênico ainda não é muito bem elucidado,
mas tem sido isolado em biopsias gástricas e relacionados com algumas
doenças, como gastrite enfisematosa e perfuração gástrica.
• Estafilococos: cocos agrupados de forma semelhante ao cacho de uvas. Como
exemplo, temos as infecções por bactérias do gênero Staphylococcus aureus,
que causam infecções cutâneas (foliculite, impetigo, abcessos, celulite),
pneumonia, infecções na corrente sanguínea e osteomielite.
MORFOLOGIA BACTERIANA
BASTONETES OU BACILOS: são bactérias que apresentam um formato
cilíndrico ou de bastão (bastonete), podendo ser curtas ou longas e apresentar
extremidade reta ou de ponta arredondada. Normalmente, os bacilos não se agrupam
em tantos arranjos como os cocos, apresentando-se, na maioria das vezes, de forma
isolada. Entretanto, podem apresentar-se, eventualmente, como diplobacilos ou
estreptobacilos.
Algumas doenças causadas por bactérias em formato de bastonete ou bacilos, são:
Tétano - Clostridium tetani
Tuberculose - Mycobacterium tuberculosis
Difteria - Bacilo diftérico
Hanseníase (lepra) - Mycobacterium leprae
É importante destacar que, durante a análise microscópica, alguns bacilos podem ser 
confundidos com cocos, isso ocorre pois são bacilos muito curtos. Esses bacilos 
curtos são chamados de cocobacilos. 
ESPIRALADAS: Bactérias com formato espiralado ou helicoidal e que ocorrem,
predominantemente, como células isoladas. Elas podem ser divididas em espirilos,
espiroquetas e vibriões.
• Espirilos: são móveis (locomovem-se com ajuda de flagelos), apresentam
formato espiral e corpo rígido. Ex: Spirillum minus, que causa Febre da
mordedura do rato em humanos e macacos.
• Espiroquetas: são móveis, mas se locomovem por contrações citoplasmáticas,
apresentam formato em espiral e são mais flexíveis; Ex: Treponema pallidum.
O T. pallium é o agente etiológico da sífilis, uma infecção bacteriana de
transmissão sexual e vertical que pode evoluir para formas mais graves,
comprometendo especialmente os sistemas nervoso e cardiovascular. O
diagnóstico é feito a partir de materiais coletados das lesões primárias causadas
por essa bactéria, que permite a visualização do treponema vivo e móvel, pode ser
feito com material fixado seguido de coloração (pelo método de Fontana de
Tribondeau), mas é de difícil visualização ou por testes imunológicos para
detecção de anticorpos-antitreponêmicos (mais empregado).
• Vibriões: São móveis (locomovem-se com ajuda de flagelos) apresentam
formato de vírgula. Ex: Vibrio cholerae, também conhecido como vibrião
colérico, é o agente causador da cólera.
CITOLOGIA BACTERIANA
As bactérias pertencem ao grupo dos procariotos, não possuem membrana nuclear
(carioteca) e não possuem todo o conjunto de organelas das células eucarióticas.
PAREDE CELULAR: é importante na divisão celular, é responsável pela forma,
rigidez da bactéria e confere proteção osmótica entre os meios externo e interno. A
parede celular possui uma espessura de, aproximadamente, 10 a 20 µm, é porosa,
permitindo a passagem de metabólitos para a membrana plasmática, é formada por
camadas rígidas de peptidoglicanos (mureína), e envolve a membrana citoplasmática
da maioria dos procariotos. As bactérias são classificadas em gram-positivas ou em
gram-negativas, de acordo com a cor de sua parede celular após a realização da
coloração de Gram. A identificação microscópica de bactérias gram-positivas ou
gram-negativas, além de direcionar os testes de identificação, também permitem
que o médico inicie o tratamento empiricamente, antes mesmo de sair o resultado da
cultura e do antibiograma, que demora, no mínimo, 48 horas.
BACTÉRIA GRAM-POSITIVA: possui uma parede celular mais espessa, com
múltiplas camadas de peptideoglicanos, revestindo a membrana citoplasmática.
Além disso, possui outros componentes, como os:
• Ácidos teicoicos: Polímeros de fosfato de poliol, ligados covalentemente ao
peptideoglicano, essenciais para a viabilidade da célula e considerados
fatores importantes na virulência (A capacidade de um microrganismo de
produzir danos que são fatais ou graves, podendo levar ao óbito, como
capacidade de multiplicar, produção de toxinas, produção de proteínas e
enzimas que auxiliam a fuga dos mecanismos de defesa do organismo, dentre
outros).
• Ácidos lipoteicoicos: possuem um ácido graxo e estão ancorados na
membrana plasmática. São considerados antígenos de superfície, permitem a
distinção dos sorotipos bacterianos e a aderência nas superfícies das células
hospedeiras.
Dentre as bactérias gram-positivas, temos as que são partes da microbiota
normal do organismo e que, geralmente, não causam doenças e temos aquelas
que são patogênicas, causando difteria, carbúnculo, listeriose, septicemia,
pneumonia, entre outros tipos de infecção.
CITOLOGIA BACTERIANA
BACTÉRIA GRAM-NEGATIVA: apresenta a parede celular com uma
estrutura mais complexa e, quimicamente, diferente quando comparada à parede
celular de gram-positiva. Esta parede celular é composta de uma fina camada
de peptideoglicanos (5-10% do peso da parede celular) e externamente a esta
fina camada, encontramos uma membrana externa presente apenas nas
bactérias gram-negativas. O espaço entre membranas é chamado como espaço
periplasmático.
Membrana externa: além de manter a estrutura bacteriana é uma barreira de
permeabilidade, confere proteção contra condições ambientais adversas, como
as do sistema digestivo do hospedeiro e resistência a alguns antimicrobianos
como a penicilina. Essa membrana é formada por uma dupla camada lipídica, onde
a camada interna é constituída basicamente de fosfolipídios e a camada externa
possui uma molécula anfipática, o lipopolissacarídeo (LPS) ou endotoxina e
proteínas. O LPS é essencial para a viabilidade das bactérias, funciona como um
potente indutor de respostas imunológicas, ativando linfócitos B e induzindo a
produção de citocinas por macrófagos, células dendríticas e outras células. Por
outro lado, provoca febre e pode causar choque endotoxêmico, sendo chamado
também de endotoxina. As proteínas permitem a difusão de metabolitos
pequenos, antibióticos hidrofílicos, têm função estrutural e atuam como
receptoras para bacteriófagos e outros ligantes.
As bactérias gram-negativas podem causar uma série de infecções graves nos
seres humanos, como peritonite, pneumonia, infecções urinárias, meningite,
dentre outras. Essas bactérias estão cada vez mais resistentes aos
antimicrobianos disponíveis para utilização terapêutica.
EXCEÇÕES:1. Micobactérias: Bacilos que apresentam a camada de peptideoglicanos da
parede celular com estrutura um pouco diferente, pois é formada por
polímeros de arabinogalactano e revestida por uma capa lipídica cerosa de
ácidos micólicos. Devido ao caráter hidrofóbico da parede celular destas
bactérias, a coloração pelo método de Gram não é a de escolha quando se
deseja pesquisar esse tipo de bactéria. No entanto, elas poderão ser
diferenciadas pela característica de álcool-ácido resistência (coloração de
Ziehl Neelsen). Exemplo. Mycobacterium tuberculosis (bacilo da
tuberculose)
2. Micoplasmas: São as menores bactérias encontradas na natureza (cerca de
0,3 µm), não apresentam parede celular e incorporam esteróis do
hospedeiro em sua membrana (Figura 6). O Mycoplasma pneumoniae é um
agente causador comum de pneumonia.
BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS X GRAM NEGATIVAS
CITOLOGIA BACTERIANA
MEMBRANA CELULAR OU MEMBRANA CITOPLASMÁTICA
BACTERIANA: é semipermeável, seletiva, contém várias enzimas, limita o
citoplasma, é constituída de fosfolipídios e proteínas e, portanto, considerada
semelhante à membrana plasmática dos organismos eucarióticos, exceto pelo
fato de não possuírem esteróis.
CITOPLASMA: pode ser dividido em diferentes regiões:
• Citoplasmática: rica em RNA; partículas proteicas e ribossomos
(responsáveis pela síntese proteica).
• Cromatínica: rica em DNA circular dupla fita.
• Porção fluída: com nutrientes dissolvidos.
Algumas bactérias, como o Vibrio cholerae, podem possuir mais de um DNA; e 
outras, como a Borrelia burgdorferi, possuem um DNA linear).
CITOLOGIA BACTERIANA
ELEMENTOS ACESSÓRIOS: São estruturas que podem estar ou não
presentes em determinadas bactérias. Vários desses elementos acessórios são
importantes na virulência, patogenicidade e resistência bacteriana.
• Glicocálice: revestimento composto de polissacarídeos que além de fornecer
um envoltório protetor, evita a fagocitose pelas células de defesa do
organismo, atua como reservatório de nutrientes e, principalmente, auxilia na
aderência bacteriana a algumas superfícies. É chamado de cápsula quando
apresenta estrutura uniforme e encontra-se firmemente aderido à parede
celular ou camada viscosa quando as camadas de polissacarídeos possuem
pouca aderência e apresentam espessura não uniforme. Exemplo: o
Streptococcus mutans, que através da cápsula fixa e perfura o esmalte
dentário.
A determinação dos constituintes da cápsula é fundamental na identificação de 
certas bactérias patogênicas, uma vez que algumas cápsulas são compostas de 
polipeptídios, ao invés de polissacarídeos, como ocorre com o Bacillus anthracis
(agente do carbúnculo/ antrax).
• Flagelos: são estruturas de locomoção presentes em algumas bactérias,
formadas por subunidades proteicas acopladas na forma helicoidal (flagelina)
e que permitem às bactérias “irem” em busca de nutrientes ou fugir de
substâncias tóxicas. O flagelo fica ancorado na membrana citoplasmática
através do seu corpo basal (similar a um gancho), possui um comprimento
geralmente muito maior que o da célula, e podem ser únicos ou múltiplos,
polares (apenas nas extremidades) ou peritríquios (em todo corpo
bacteriano). Embora os flagelos não possam ser visualizados, normalmente,
no microscópio óptico, existem técnicas de coloração que os tornam visíveis
no microscópio óptico e os microbiologistas usam como auxílio no
diagnóstico. Durante a identificação de uma bactéria, a avaliação da
motilidade pode ser utilizada para diferenciar espécies de bactérias.
Exemplo: Em uma cultura de fezes (coprocultura), a presença de bactérias
gram-negativas imóveis é indicativa de Shigella sp. e móveis de Salmonella
sp.
• Pili e fímbrias: são estruturas filamentosas, que lembram fios de cabelo no
lado de fora da bactéria, compostas por subunidades proteicas (pilina), que se
projetam a partir da superfície de uma célula e, geralmente, estão em maior
quantidade do que os flagelos. As fímbrias auxiliam na colonização das
membranas de mucosas como ocorre no caso da Neisseria gonorrhoeae,
agente causador da gonorreia e, no caso da E. coli, nas células do trato
urinário. Os pili sexuais de uma bactéria se ligam a outras bactérias
permitindo a transferência de material genético na conjugação bacteriana.
Esse pili sexuais são codificados por um plasmídeo.
• Esporos (endosporos): produzidos por alguns gêneros de bactérias, como
Bacillus e Clostridium, os esporos são uma estrutura resistente a agentes
físicos e químicos, que é formada em resposta ao meio ambiente, quando este
se torna inadequado para a sobrevivência da bactéria (ex.: escassez de água
ou nutrientes). A resistência da forma esporulada possibilita que a bactéria
sobreviva por longos anos em ambientes desfavoráveis, podendo reverter à
forma vegetativa quando o local se tornar viável novamente para sua
sobrevida. Cada célula forma um único esporo, que é liberado quando a
bactéria morre.
• Plasmídeo: corresponde a um DNA circular extracromossomal, capaz de se
replicar de forma autônoma, localizado no citoplasma da célula bacteriana e que
não é responsável por características essenciais da bactéria. Podem se
apresentar em várias cópias, além de possuir a capacidade de conferir
vantagens adaptativas (por exemplo, resistência a antibióticos), podendo,
inclusive, ser transferidos para outras bactérias.
• Grânulos ou inclusões citoplasmáticas: são grânulos cuja função é de
armazenamento, podendo ser de glicogênio, amido, fosfatos, enxofre etc. e
podem ser visualizados através de colorações especiais, pois, geralmente, são
refringentes.
FATORES DE CRESCIMENTO BACTERIANO
Fatores de crescimento bacteriano: quando inoculadas em meio de cultura
adequado e em condições apropriadas, iniciam processo de duplicação no qual por
divisão binária, ocorre aumento da população de forma logarítmica. O tempo de
geração, ou seja, o tempo necessário para que uma bactéria se duplique varia de
acordo com a espécie bacteriana, podendo ser extremamente curto (E. coli ± 15
minutos) ou bastante longo (M. tuberculosis ± 932 minutos).
Para uma cultura de micobactéria ser considerada negativa, é necessário aguardar 
no mínimo, 45 dias de incubação e não ser visualizado nenhum crescimento.
FASES DE CRESCIMENTO:
• Fase Lag: quando são adicionadas a um meio de cultura (semeadas), elas
necessitam de um tempo para se adaptar ao novo ambiente antes de começar a
se dividir. Neste momento, não há reprodução e a população permanece
temporariamente inalterada. É importante ressaltar que, nesta fase, as células
não estão em latência, uma vez que aumentam no tamanho e fisiologicamente
estão muito ativas.
• Fase Logarítmica (fase Log ou exponencial): as células iniciam a divisão que
ocorre de forma exponencial, regular e constante. A velocidade de crescimento
é máxima nesta fase, e varia de acordo com a cepa e com as condições
ambientais.
• Fase estacionária ou fase Platô: em determinando momento do crescimento
bacteriano, haverá carência de nutrientes e produção de substâncias tóxicas no
meio, dessa forma, o número absoluto de bactérias no meio de cultura
permanecerá constante, resultado do equilíbrio entre bactérias que ainda estão
se duplicando e bactérias que estão morrendo.
• Fase de declínio ou morte: etapa que ocorre morte bacteriana, pois há falta de
nutrientes e de espaço, aliada à toxidez do ambiente que levam os
microrganismos a morrerem mais rápido do que produzirem novas células (a
morte bacteriana nesta fase se dará de forma exponencial ou logarítmica).
Sendo assim, há uma progressiva morte celular até a cultura se tornar estéril.
Fatores ambientais que afetam o crescimento bacteriano: além de nutrientes
apropriados, é necessário conhecer as condições físicas ambientais ideais para o
crescimento bacteriano em meio de cultura. Dentre estes, os principais fatores
são:
• Temperatura: ótima de crescimento é aquela que possibilita o maior
crescimento, durante o menor tempo e varia para cada gênero. As bactérias,
no geral, são classificadas de acordo com sua temperatura ótima decrescimento em:
✓ Psicrófilas: Crescem melhor de 12°C e 20°C.
✓ Mesófilas: crescem melhor de 25°C a 40°C. Neste grupo, está a maioria
dos patógenos bacterianos de importância clínica, já que nesta faixa
encontra-se a temperatura do corpo humano.
✓ Termófilas: crescem melhor de 45°C a 60°C.
A temperatura de crescimento também pode ser usada durante a identificação 
bacteriana. Exemplo: A N. gonorrhoeae e N. Meningitis não crescem na 
temperatura de 22°C, mas as outras espécies de Neisseria sp. são capazes de 
crescer.
• Oxigênio: podem ser divididas de acordo com a necessidade e a tolerância ao
oxigênio:
✓ Aeróbias estritas: só crescem na presença de oxigênio. Ex.: Acinetobacter
sp.
✓ Anaeróbias facultativas: Crescem tanto na presença quanto na ausência de
oxigênio. Ex.: E. coli.
✓ Microaerófilas: Só crescem em ambiente contendo baixas concentrações de
oxigênio (menores que as encontradas no ar atmosférico). Ex.:
Campylobacter sp.
✓ Anaeróbias estritas: Só conseguem crescer na ausência de oxigênio. Em
contato com O2, o crescimento dessas bactérias é inibido ou ocorre morte
bacteriana. Ex.: Clostridium botulinum e Neisseria sp.
Quanto às espécies de Neisseria, o ideal é semear imediatamente após a coleta 
em meio sólido, levar para a estufa 36 °C em jarra com vela ou com gerador de 
CO2 e umidade.
FATORES DE CRESCIMENTO BACTERIANO
• pH: a grande maioria das bactérias cresce bem em meios com pH neutro, em
torno de 6,5 a 7,5, apesar de muitas espécies tolerarem variações de pH entre
4,0 e 9,0. Os meios de cultura geralmente são tamponados para impedir
mudanças bruscas de pH, decorrentes do próprio metabolismo das bactérias.
• Pressão osmótica: é a pressão que deve ser exercida sobre um sistema para
evitar que a passagem de água por osmose, ou seja, para o meio mais
concentrado ocorra. A parede celular, além da rigidez, impede a entrada
excessiva de água. Dessa forma, a pressão osmótica dos meios de cultura pode
afetar diretamente a viabilidade das bactérias. Meios de cultura com pressões
osmóticas menores comparado ao interior da bactéria, normalmente, não
afetam sua viabilidade. De forma diferente, meios de cultura com pressões
osmóticas maiores causam perda de água intracelular, trazendo efeito
bacteriostático ou bactericida.
Halofismo - Certas bactérias isoladas de salmouras, pacotes de sal, alimentos e 
água do mar, chamadas bactérias halofílicas ou halófitas obrigatórias, crescem 
apenas quando o meio contém uma concentração inusitadamente elevada de sal 
(10% a 15%). Isto representa uma resposta especial do microrganismo à pressão 
osmótica.
MEIOS DE CULTURA: COMPOSIÇÃO E CLASSIFICAÇÃO
Meio de cultura: qualquer substância que possua um conjunto de fontes de
nutrientes e que seja utilizada para o cultivo de microrganismos como
macronutrientes (carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e hidrogênio) e
micronutrientes (ferro, zinco, manganês, cálcio, potássio, sódio, cobre, cloro,
cobalto, molibdênio, selênio, magnésio, entre tantos outros), necessários à síntese
biológica de novos organismos. Nos laboratórios clínicos, os meios de cultivo
podem ser comprados totalmente prontos ou então serem preparados.
Semeadura: após a coleta, a amostra biológica é semeada em meios de culturas
capazes de suprir as bactérias com as exigências nutricionais, em condições
ambientais favoráveis (temperatura, pH, pressão osmótica) que possibilitam o
crescimento microbiano para a formação e visualização de colônias.
Classificação dos meios de cultura:
• Estado físico: é a consistência adequada do meio de cultura obtida por uma alga
marinha vermelha chamada ágar-ágar que é um polissacarídeo que atua como
agente solidificante quando dissolvida em água fervente.
✓ Meios sólidos: adição de 1,0 g a 3,0 g % de ágar. A maioria dos microrganismos
crescem formando colônias. Após preparo, autoclavagem, o meio é depositado
nas placas para solidificar, em ambiente estéril.
✓ Meios semissólidos: adição de 0,1 g a 0,7 g %”, separando o 0,7 de g. Dentre as
finalidades, temos a visualização da motilidade bacteriana ou servir como base
de meio de transporte. Ex: Meio SIM (meio de detecção da produção de
enxofre, motilidade e produção de indol) e Cary & Blair.
✓ Meios líquidos: não apresentam ágar, são conhecidos como “caldos” e utilizados
para ativação das culturas, repiques de microrganismos, provas bioquímicas,
dentre outros. Ex: caldo tetrationato e selenito-cistina para cultivo de
salmonelas, caldo tioglicolato para Clostridium perfringens.
• Composição química:
✓ Meios quimicamente definidos: a composição química de todos os seus
constituintes é conhecida (definidos). Ex: Meio AR-103.
✓ Meios Complexos: a exata constituição do meio de cultura não é conhecida.
Esses meios apresentam em sua composição soro, sangue, extratos moídos ou
digeridos de órgãos animais (corações, fígados, cérebros), peixes, leveduras, e
vegetais ou outro componente que não se tem total conhecimento da
composição química. Ex: Ágar sangue.
• Objetivo da utilização:
✓ Meios enriquecidos ou ricos: são os meios que contêm um grande suprimento
de nutrientes pela adição de diversas substâncias como sangue, soro, extratos
de tecidos animais ou vegetais ao caldo ou até mesmo ágar nutritivos, para
permitir o crescimento de bactérias fastidiosas (nutricionalmente exigentes),
como Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella
spp. Ex: O ágar-sangue (ágar nutriente com 5% de eritrócitos de carneiro) e o
ágar-chocolate (ágar nutriente com hemoglobina em pó) são exemplos de meios
enriquecidos utilizados de forma rotineira nos laboratórios de bacteriologia
clínica.
FATORES DE CRESCIMENTO BACTERIANO
✓ Meios Seletivos: apresentam em sua composição substâncias químicas
específicas (inibidores) adicionadas ao caldo ou ao ágar nutritivo que previnem o
crescimento de um determinado grupo de bactérias. É importante ressaltar que
os inibidores atuam em um grupo específico de bactéria, favorecendo apenas o
crescimento da bactéria de interesse. Ex: ágar MacConkey é um meio seletivo
pois tem em sua composição sais biliares e cristais violeta que inibe o
crescimento da maioria das bactérias gram-positivas, permitindo o crescimento
apenas das bactérias gram-negativas.
✓ Meios diferenciais ou indicadores: contêm certos reagentes ou substâncias no
meio que permitem a distinção de diferentes tipos de bactérias. Ex:O Ágar
MacConkey, além de um meio de cultura seletivo, é, frequentemente, utilizado
para diferenciar bacilos gram-negativos isolados de amostras fecais. As
bactérias gram-negativas que fermentam a lactose (um ingrediente do ágar
MacConkey) produzem colônias rosas, como E. coli, enquanto aquelas
incapazes de fermentar a lactose produzem colônias incolores e amarelas,
como Acinetobacter baumanii.
Ágar MacConkey: contém a lactose e um indicador de pH, onde Bactérias que são
capazes de metabolizar a lactose produzem ácidos mistos que alteram o pH do
meio que fica com uma cor rosa/ avermelhado, enquanto que, as bactérias que não
fermentam a lactose, utilizam como fonte de energia a peptona, que ao ser
metabolizada, produz amônia, que eleva o pH do meio e torna as colônias e o meio
amarelados/ sem cor.
Ágar manitol salgado: composto de manitol e alta concentração de sal (7,5% de
NaCL) utilizado para o isolamento de Staphylococcus aureus a partir de
diferentes amostras biológicas. Todas as espécies de Staphylococcus são capazes
de crescer nesse meio, mas o S. aureus é capaz de fermentar o manitol presente
no meio, produzindo ácido, que torna o meio e as colônias amareladas. As outras
espécies de estafilococos, como os Staphylococcus epidermidis e o Bacillus
subtillis não metabolizam o manitol, apresentando assim colônias brancas.
• Meios de transporte: são semissólidos e possuem o mínimo de nutrientes para a
manutenção das bactérias, durante o tempo de transporte, sem que estas se
reproduzam ou acidifiquem o meio. Ex: meio Stuart – permite uma boa
conservação de bactérias patogênicas como Salmonella spp. e Shigella spp.)Diferença da coloração das colônias de bactérias gram-negativas fermentadoras e 
não fermentadoras de lactose em Agar MacConkey.
Colônias de bactérias crescidas em meio ágar sangue
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS (TSA)
TSA: são testes utilizados para detectar uma possível resistência aos antibióticos
em patógenos comuns, nortear a escolha do antibiótico mais adequado a fim de
predizer o sucesso do esquema terapêutico para infecções específicas.
Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (2008): o TSA é sempre
realizado na avaliação das seguintes bactérias:
• Enterobactérias
• Pseudomonas spp.
• Acinetobacter spp.
• Staphylococcus spp.
• Enterococcus spp.
• Streptococcus pneumoniae
• Streptococcus do grupo viridans e beta-hemolítico
• Haemophilus influenzae
• Complexo Burkholderia cepacia
• Stenotrophomonas maltophilia
• Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis
Métodos e padronização: é ditada por organizações especializadas de forma
detalhada, são elas:
• Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, EUA)
• European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST,
Europa)
• Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility testing (BrCAST, Brasil)
• British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC, Reino Unido)
• Comité de L’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-
SFM, França)
MICRODILUIÇÃO EM TUBOS: esse procedimento envolve:
• Preparação e diluição seriada de antimicrobianos (por exemplo, 1, 2, 4, 8 e 16
microgramas/mL) em meio de cultura líquido.
• Inoculação dos tubos contendo antimicrobianos com uma suspensão bacteriana
padronizada em torno de 5 X 105 UFC/mL.
• Incubação por de 18 a 24 horas, a 35°C.
• Exame da presença de turbidez, que evidencia o crescimento microbiano. O
primeiro tubo da série que apresentar aparência límpida (sem turbidez)
representa a concentração inibitória mínima (CIM ou MIC).
A sensibilidade dos microrganismos aos antimicrobianos é representada pela 
concentração inibitória mínima (CIM ou MIC) de cada microrganismo para cada 
antimicrobiano, que corresponde à menor concentração do antimicrobiano capaz 
de inibir o desenvolvimento visível do microrganismo.
A vantagem da macrodiluição em tubo é a geração de um resultado quantitativo
(CIM ou MIC). As desvantagens correspondem ao trabalho manual que leva a
possibilidade de erros durante o preparo de soluções de antibióticos para cada
antibiótico testado, a quantidade relativamente grande de reagentes e o espaço
necessário para cada teste.
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS (TSA)
PROVA DE SENSIBILIDADE COM DISCOS DE PAPEL EM MEIO
SÓLIDO: é chamado de técnica de disco-difusão em ágar ou técnica de Kirby-
Bauer. É um dos métodos de sensibilidade mais simples, prático, confiável e mais
utilizado nos laboratórios de microbiologia, fornecendo resultados qualitativos.
Método de crescimento:
Passo 1: Após crescimento em placa de ágar (24 horas), é selecionado de três a
cinco colônias, bem isoladas, do mesmo tipo morfológico. A superfície de cada
colônia é tocada com uma alça, e os microrganismos são transferidos para um tubo
contendo 4-5 mL de NaCL 0,9% (salina) estéril.
Passo 2: Incuba-se a cultura na salina até alcançar a turbidez de uma solução
padrão de McFarland 0,5.
Definição de escala de MacFarland: Escala de nefelométrica de turvação. Essa é 
uma escala que possibilita verificar a concentração bacteriana pela intensidade de 
turvação do meio. Quanto maior a turvação do meio, maior a concentração 
bacteriana, maior opacidade e mais difícil é a passagem de luz. Essa escala é 
composta de 11 tubos numerados de 0,5 a 10, onde o tubo 0,5 (indica uma 
concentração bacteriana de 1,0 a 2,0 x 108 colônias/mL. e o tubo 10 -30 x 108 
colônias/mL). Ao preparar uma suspensão de bactérias para realização do 
antibiograma é feito a comparação visual com os tubos padrão da escala. A leitura 
é feita a olho nu utilizando um cartão de fundo branco com linhas pretas no fundo, 
ou então através de um espectrofotômetro. 
Inoculação das placas de teste:
Passo 1: Após a preparação da suspensão bacteriana, mergulha-se um swab de
algodão estéril na suspensão. Essa etapa deve ser realizada em até 15 minutos
após ajustar a turbidez da suspensão. O swab deve ser girado várias vezes e
apertado firmemente contra a parede interna do tubo, acima do nível do líquido, o
que ajuda a retirar qualquer excesso de inóculo no swab.
Passo 2: A superfície da placa de ágar Müeller-Hinton é inoculada esfregando o
swab em toda a superfície estéril do ágar. Repete-se o procedimento esfregando
outras duas vezes, girando a placa aproximadamente 60° cada vez, a fim de
assegurar a distribuição uniforme do inóculo. Após a distribuição, passa-se um
swab na margem de toda a placa de ágar, completando pelo menos uma volta
completa.
Passo 3: A tampa pode ser deixada entreaberta de três a cinco minutos de
maneira a permitir que qualquer excesso de umidade seja absorvido antes de se
aplicar os discos impregnados de droga. No entanto, a placa não pode ultrapassar
Passo 3: A tampa pode ser deixada entreaberta de três a cinco minutos de
maneira a permitir que qualquer excesso de umidade seja absorvido antes de se
aplicar os discos impregnados de droga. No entanto, a placa não pode ultrapassar
15 minutos aberta.
Evitar inóculos com alta concentração de bactérias e não utilizar culturas em 
caldo, não diluídas, do dia anterior, ou outros inóculos não padronizados para 
semear nessas placas.
Aplicação de discos a placas de ágar inoculadas:
Passo 1: O conjunto de antibióticos é previamente definido. Esses são discos de
papeis de filtros impregnados com concentrações definidas de antibióticos. Os
discos de antibióticos são colocados na superfície de placa de ágar anteriormente
semeada, com auxílio de uma pinça ou com um dispensador. Ao ser colocado, cada
disco deve ser pressionado de maneira a assegurar o contato completo do disco
com a superfície de ágar. Os discos devem ser distribuídos mantendo a distância
entre os centros de pelo menos 24 mm. Em geral, deve-se colocar 12 discos, no
máximo, em uma placa de 150 mm, ou cinco discos em uma placa de 100 mm.
Algumas drogas difundem-se quase instantaneamente quando em contato com o
meio. O disco não deve ser reaplicado após ter entrado em contato com a
superfície de ágar. Em vez disso, coloque um novo disco em outra parte da placa.
Passo 2: As placas devem ser invertidas e colocadas em uma estufa, a 35° C, até
15 minutos após a aplicação dos discos. No entanto, no caso das cepas de
Haemophilus spp., N. gonorrhoeae e dos estreptococos, as placas não devem ser
incubadas em atmosfera enriquecida com CO2, porque os padrões de
interpretação foram estabelecidos usando incubação em ar ambiente, e o CO2 irá
alterar significativamente o tamanho dos halos de inibição de alguns antibióticos.
Leitura das placas e interpretação dos resultados: A leitura é realizada após 18 a
24 horas de incubação. Inicialmente, analisamos a superfície da placa para verificar
se a semeadura foi satisfatória. Em seguida, os halos (diâmetros) devem ser
medidos, em milímetros, com auxílio de paquímetro ou uma régua. Para isso, a placa
deve ser invertida, e a régua ou o paquímetro apoiado na parte de trás da placa. As
medidas devem ser feitas contra uma fonte luminosa.
MÉTODOS DE VISUALIZAÇÃO E COLORAÇÃO NA PRÁTICA 
LABORATORIAL
Bactérias são seres microscópios vistas apenas pelo microscópios:
• Óptico – permitem aumentos de até 1000 vezes.
• Eletrônicos – permitem aumentos de 10.000 vezes (varredura) e 1.000.000
vezes (transmissão).
Preparação a fresco: é o método de visualização de bactérias vivas sem a
necessidade de empregar coloração a partir de material biológico em suspensão
(uma gota) entre lâmina e lamínula (sem formar bolha), geralmente utilizando um
microscópio de campo escuro. Essa técnica é muito utilizada quando há intenção
de visualizar a mobilidade e a morfologia de bactérias espiraladas, as quais sob
fixação ficam distorcidas, ou até mesmo observaralterações na divisão celular e
formação de esporos. Por não utilizar corantes, as bactérias são vistas sem cor
(incolores), mesmos que estas sejam capazes de produzir cor quando cultivadas em
meios de cultura específicos.
Preparação com coloração: é realizada para uma melhor visualização da
morfologia e citologia, só podem ser fixados na lâmina mortos. A fixação é a etapa
feita a partir do calor, que permite que a bactéria fique aderida à lâmina e evita que
as bactérias sejam lavadas e perdidas durante a coloração. Antes da etapa de
fixação e coloração, é preciso a realização de um bom esfregaço, que deve ser:
• Pouco espesso
• Bem homogêneo
• Realizado em área de segurança biológica, a partir de um caldo ou material
diluído em solução salina, espalhado com alça bacteriológica em lâmina limpa e
seca
Todas as manipulações devem ser feitas seguindo as normas de biossegurança e, 
de forma estéril, para não haver contaminação das amostras e resultados falso 
positivos. Ao final, todos os resíduos produzidos devem ser autoclavados antes de 
descartados.
Classificação das técnicas de coloração:
Coloração simples: utiliza apenas um único corante
Coloração diferencial ou seletivo: utiliza mais de um corante, mordentes e
diferenciador para identificar diferenças entre grupos de bactérias. Exemplo:
Coloração de Gram, de Ziehl-Neelsen e de Albert-Laybourn, Fontana-
Tribondeau. Também existem métodos de coloração pouco utilizados, mas que
podem ser úteis quando há necessidade de evidenciar algumas estruturas
bacterianas, como a coloração de flagelos, esporos e cápsula.
COLORAÇÃO DE GRAM: Esta técnica foi desenvolvida em 1884, pelo médico
dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, e é a mais utilizada em bacteriologia
por permitir distinguir bactérias gram-positivas de bactérias gram-negativas.
Diferenças nas características químicas e estruturais das paredes celulares, bem
como na permeabilidade aos reagentes químicos nestes dois grupos de bactérias
levam a diferenças de coloração. Na técnica de Gram é utilizado:
• Corante básico (violeta genciana, cristal-violeta, metilvioleta).
• Mordente (solução iodo-iodetada, conhecida como lugol) que aumenta a
afinidade da célula pelo primeiro corante utilizado (corante básico). Ocorre
assim a ligação do corante com o lugol e a formação de um composto roxo,
insolúvel que cora o espaço protoplasmático e a parede celular de roxo.
• Agente descolorante (álcool a 95% ou álcool-acetona).
✓ Nas bactérias gram-positivas: as quais o corante está fortemente retido
devido à espessa camada de peptideoglicanos, este não é facilmente removido
pela ação do agente descolorante, por isso permanecem roxas.
✓ Nas bactérias gram-negativas: nas quais o agente descolorante remove a
membrana externa da parede destas bactérias, e devido à fina camada de
peptideoglicanos, estas bactérias não conseguem reter o corante. Na ação do
corante básico (safranina ou fucsina) as bactérias gram-negativas são coradas
de vermelho.
A literatura científica evidencia que os cocos de importância médica são:
• Cocos Gram-positivos (exceção do gênero Neisseria) e os
• Bastonetes gram-negativos (exceção dos gêneros Corynebacterium, Listeria,
Bacillus e Clostridium).
ETAPAS DA COLORAÇÃO DE GRAM
1 ETAPA: é utilizado uma solução salina em uma lâmina onde é
depositada uma amostra da colônia suspeita de forma a ser misturada
nessa solução;
2 ETAPA: é feita a fixação dessa solução contendo a amostra
bacteriana através de uma chama, de forma lenta, promovendo a
secagem da solução, com cuidado para que a mesma não superaqueça e
forme vapor.
3 ETAPA: é aplicado o cristal de violeta, que irá penetrar e corar
todas as células aguardando o período de um minuto para ação desse
corante e em seguida a lâmina é levada na água corrente para a
eliminação do excesso do corante.
4 ETAPA: é aplicado o fixador do corante (lugol) durante o período de
um minuto, para que o mesmo forme uma espécie de cristal que ajuda a
prender o corante nas células. Em seguida é feita a lavagem em água
corrente para retirada do excesso do lugol.
5 ETAPA: é aplicado um descorante (álcool ou cetona) até que todo o
corante tenha sido removido da lâmina. Esse descorante promove a
retirada do corante apenas nas células Gram negativas, pois essa
solução não é capaz de despigmentar as células gram positivas, pois o
cristal violeta é retido em sua espessa camada de peptideoglicano. Em
seguida a lâmina é lavada em água corrente para a remoção do excesso
do descorante.
6 ETAPA: aplicação do contracorante ou segundo corante (fucsina),
capaz de colorir apenas as células que foram descoloridas (gram
negativas). Em seguida é feito o enxágue desse corante em água.
7 ETAPA: após a secagem da lâmina, a mesma é levada no microscópio
onde deverá ser aplicado sobre a lâmina um óleo de imersão ou óleo
mineral que ajudará a focalizar os feixes de luz e permitir a visualização
da mesma.
8 ETAPA: no microscópio é ajustada a lente objetiva 100x para a
visualização, onde será possível identificar o tipo de bactéria e sua
morfologia (ex: bacilos gram negativos corados em vermelho ou cocos
gram positivos corados em roxo).
Coloração de Gram: Vermelho –Gram negativa e Roxo – Gram positiva
COLORAÇÃO DE GRAM
GRAM POSITIVA – ROXO 
São coradas de roxo pelo primeiro corante (cristal de violeta) e não
conseguem ser descoloridas pela ação do descorante (álcool ou cetona),
pois possuem uma camada de peptideoglicano muito grossa que retém o
cristal violeta e não permitem ser descoloridas ou coradas pelo segundo
corante (fucsina).
Cocos Gram-positivos (exceção do gênero Neisseria)
GRAM NEGATIVA – VERMELHO 
São coradas de vermelho ou rosa pelo segundo corante ou também
chamado de contracorante após serem descoloridas pelo descorante
(álcool ou cetona), pois não são capazes de fixar o primeiro corante (cristal
violeta) por possuírem uma camada de peptideoglicano muito fina.
Bastonetes gram-negativos (exceção dos gêneros Corynebacterium,
Listeria, Bacillus e Clostridium).
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
Existem bactérias cuja parede celular fogem da classificação como gram-positivas
e gram-negativas, pois possuem acima da camada de peptideoglicanos, uma camada
denominada Micolato Arabinogalactano, formada por polímeros de
arabinogalactano (açúcares) e revestida por uma porção lipídica de ácidos
micólicos. Esta constituição torna a parede celular hidrofóbica, dificultando a
penetração de corantes aquosos, bem como a ação do lugol e, portanto, impedindo
a identificação e a diferenciação desse tipo de bactéria através da coloração de
Gram.
Em 1882, um bacteriologista chamado Franz Ziehl e um patologista alemão
Friedrich Carl Adolf Neelsen, evidenciaram que alguns gêneros bacterianos, como
Micobacterium e Nocardia são capazes de resistir a descoloração com uma
solução de álcool-ácido, após tratamento com fucsina fenicada aquecida, de forma
que permanecem vermelhas, diferentemente de outras bactérias, que, por não
possuírem esta propriedade, apresentam a cor do corante de fundo, normalmente,
feita com azul de metileno.
Estes gêneros receberam a denominação de BAAR (Bacilos-Álcool-Ácido-
Resistente), e esta capacidade de álcool-ácido-resistência está relacionada à
hidrofobicidade da parede celular, assegurada pela presença de lipídeos como o
ácido micólico. Quanto à coloração, esta ficou conhecida como coloração de Ziehl-
Neelsen.
ETAPAS DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO ZIEHL-NEELSEN:
ETAPA 1: após a confecção do esfregaço, é fixada a amostra na lâmina pelo calor;
ETAPA 2: é depositado a solução de fucsina de Zieel que deve ser aquecida até a
emissão de vapores (sem ferver), esse procedimento deve ser feito 3 vezes e deve
durar até 5 minutos.
ETAPA 3: lavagem da lâmina com água e descoloração com solução de álcool-
ácido clorídrico a 1%.
ETAPA 4: o esfregaço deve ser coberto com azul de metileno, por meio minuto, a
lâmina é lavada com água corrente e, após secar, está pronta para ser observada
no microscópio óptico (objetiva 100 X).
RESULTADO: os BAAR serão visualizados como bastonetesfinos, vermelhos,
sobre fundo corado em azul.
Bacilos (rosa) evidenciados pela coloração de Ziehl-Neelsen
em um paciente com tuberculose pulmonar avançada e AIDS, amostra escarro.
A análise do escarro pela coloração de BAAR é um método simples, barato e
muito importante para o diagnóstico da tuberculose, pois confere um resultado
precoce (quando realizado de forma correta). Além disso, permite o
acompanhamento a evolução do tratamento de pacientes com essa doença.
Pacientes com sinais e sintomas (febre vespertina, tosse persistente por mais de 3
semanas, emagrecimento, com imagem no raio x) que apresentam bacilos gram-
negativos no escarro em amostras coradas pela ZH indicam a presença do M.
tuberculosis. No entanto, é importante destacar que outras micobactérias se
coram por essa técnica e esse método. Para diferenciar as espécies, é necessário
cultura.
Essa técnica pode ser realizada em outras amostras, como: urina, líquidos pleurais,
lavado bronco alveolar, aspirado traqueal, biópsias e líquor.
COLORAÇÃO DE ALBERT-LAYBOURN
Algumas bactérias apresentam corpúsculos citoplasmáticos (corpúsculos
metacromáticos ou corpúsculos de Babes Ernst) nas suas extremidades e que
podem ser corados pelo Lugol forte (com cor marrom), em contraste com o corpo
do bacilo, que se cora em esverdeado/azulado pela solução de Laybourn. Esta
técnica é uma técnica simples que foi sugerida em 1920 por Henry Albert e,
posteriormente, foi modificada por Ross Laybourn, em 1924.
Os corpúsculos citoplasmáticos são encontrados no gênero Corynebacterium
diphtheriae, agente causador de sintomas clínicos característicos da difteria.
Desta forma, a pesquisa por bacilos metacromáticos cuidadosamente coletados da
oro e nasofaringe serve como um método auxiliar no diagnóstico da difteria.
ETAPAS DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO ALBERT-LAYBOURN:
ETAPA 1: após a confecção do esfregaço, este é corado com a solução de Albert-
Layborn durante 5 minutos.
ETAPA 2: o corante deve ser retirado e a lâmina coberta com a solução de Lugol
forte, por 2 minutos.
ETAPA 3: com as lâminas secas, elas podem ser analisadas no microscópio.
RESULTADO: é considerado positivo quando há presença de grânulos
metacromáticos no citoplasma de bacilos com morfologia em paliçada/letras
chinesas. Tais achados sugerem bacilo diftérico e devem ser comunicados
imediatamente ao médico.
Ilustração microscópica de Corynebacterium diphtheria.
COLORAÇÃO DE FONTANA TRIBONDEAU
O método foi desenvolvido em 1920, com objetivo de auxiliar a visualização de
bactérias espiraladas (Leptospira interrogans e treponemas). Essas bactérias são
muito delgadas e não coram completamente pela coloração de Gram. Esta
coloração não é considerada verdadeira, pois consiste em uma técnica de
impregnação pela prata. Atualmente, os laboratórios têm utilizado mais a
microscopia de campo escuro a fresco para visualizá-las.
ETAPAS DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE FONTANA TRIBONDEAU:
ETAPA 1: A partir de esfregaços finos, derramar sobre a lâmina algumas gotas da
solução fixadora (renová-la 3 vezes, por 30 segundos).
ETAPA 2: cobrir com solução mordente, aquecendo a lâmina até emitir vapores.
ETAPA 3: Após 30 segundos, lavar em água corrente, acrescentar o nitrato de
prata amoniacal, aquecendo rapidamente a lâmina até ocorrer novamente a
emissão de vapores, deixando agir por 30 segundos (a preparação toma a cor
marrom).
ETAPA 4: Lavar bem em água corrente, secar com papel de filtro e examinar a
lâmina ao microscópio com a objetiva de imersão (x100).
RESULTADO: As espiroquetas aparecem amarronzadas/negras, sobre um fundo
amarelo-castanho ou marrom claro.
Ilustração microscópica de Leptospira interrogans e treponemas.
COLORAÇÃO PARA FLAGELOS
Os flagelos são estruturas bacterianas responsáveis pela locomoção e são
constituídos por moléculas proteicas denominadas flagelinas. Entretanto, como
são finos, delicados e se despolimerizam com facilidade, é necessário aplicar
algumas técnicas para aumentar o diâmetro dos flagelos, de forma a torná-los
visíveis pela microscopia. A demonstração do flagelo ocorre devido à ligação do
corante ao ácido tânico, tornando-o mais espesso.
ETAPAS DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO PARA FLAGELOS:
ETAPA 1: Cultivar a bactéria em estudo, de acordo com suas preferências físicas,
em uma placa de ágar infusão de cérebro-coração (BHI) ou em ágar tríptico de
soja (com ou sem sangue).
ETAPA 2: Coletar delicadamente uma alíquota do crescimento com uma alça de
platina e transferi-la para um tubo, contendo cerca de 3 mL de água destilada.
Inverter o tubo uma vez para homogeneizar a suspensão. Colocar uma gota desta
suspensão sobre uma lâmina inclinada a 45o e deixar secar ao ar.
ETAPA 3: Cobrir a lâmina com uma mistura de corantes, que inclui fucsina e ácido
tânico (fórmula abaixo), e deixar por 5 minutos, até que um brilho metálico
esverdeado cubra metade da área. Não deixar o corante secar sobre a lâmina.
ETAPA 4: Retirar o corante, enxaguando com água. Secar e observar ao
microscópio, com objetiva de imersão.
COLORAÇÃO PARA ESPOROS COM VERDE MALAQUITA 
(WIRTZ-CONKLIN)
A parede do esporo é impermeável, mas pode ser atravessada por corantes (como
o verde de malaquita) quando submetidos ao aquecimento, o que confere aos
esporos uma cor verde intensa. Associado a isso, essa estrutura não consegue ser
descorada pela ação do álcool, mas as outras estruturas podem ser descoradas.
Para melhorar a visualização e como contraste (contracorante), utiliza-se a
safranina, que cora outras estruturas em vermelho, facilitando a diferenciação dos
esporos.
ETAPAS DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO PARA ESPOROS:
ETAPA 1: Preparar esfregaço e fixar pelo calor.
ETAPA 2: Cobrir o esfregaço com o corante verde malaquita.
ETAPA 3: Aquecer água em um béquer, até a emissão de vapores. Colocar a
lâmina sobre este béquer, mantendo o corante aquecido por 5 minutos.
Alternativamente, cobrir a lâmina com verde malaquita e aproximar de uma chama
até que desprenda vapor, sem deixar que o corante ferva. Afastar do fogo e, após 1
a 2 minutos, repetir a operação por 3 a 4 vezes.
ETAPA 4: Lavar suavemente com água, evitando o choque térmico, que poderá
quebrar a lâmina.
ETAPA 5: Adicionar a solução de safranina por 30 segundos
ETAPA 6: Lavar e secar.
ETAPA 7: Observar ao microscópio com objetiva de imersão. Bactéria C. difficile. Bactéria formadora de esporos.
COLORAÇÃO DE CÁPSULA
A cápsula envolve a parede celular, é produzida por algumas espécies bactérias e
representa uma estrutura muito importante para a patogenicidade da bactéria.
Isso porque, confere a ação antifagocitária, funciona como um mecanismo de fuga
da ação da fagocitose pelas células do sistema imunológico do indivíduo.
A cápsula é uma camada gelatinosa composta de açúcares ou polipeptídeos, com
caráter hidrossolúvel, que pode ser facilmente removida durante as etapas de
lavagem durante a coloração, o que dificulta a sua coloração. Além disso, a fixação
dos esfregaços pelo calor, amplamente utilizado para as outras colorações, pode
levar a contração da célula e a formação de um halo ao redor do microrganismo,
que pode ser facilmente confundido com a cápsula. Entretanto, é possível
visualizar bactérias produtoras de cápsula a partir da coloração pela tinta da
china. Essa coloração é conhecida como coloração negativa, pois a cápsula rejeita
as partículas do corante. Se as bactérias apresentarem cápsula, será possível
verificar microrganismos descoradas envoltas por um halo (cápsula) sobre um
fundo negro.
ETAPAS DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO CAPSULA TINTA DA CHINA:
ETAPA 1: As colônias suspeitas devem ser cultivadas em caldo rico (BHI).
ETAPA 2: Colocar 1 ou 2 gotas de cultura em uma lâmina.
ETAPA 3: Depositar na lâmina uma gota de tinta da China ao lado das gotas de
cultura.
ETAPA 4: Cobrir com uma lamínula, comprimindo-a entre folhas de papel de
filtro, para se obter uma quantidade bem tênue de corante e material.
ETAPA 5: Observar ao microscópio óptico (40X).
Coloração negativa de cápsula.
PRINCIPAIS BACTÉRIAS DE IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Diferenciação de bactériaspelo formato, cor após a coloração de Gram,
necessidade de oxigênio e formação ou não esporos:
Formato: as bactérias são seres unicelulares, e o formato de suas células é
característico de cada espécie. As instruções para a forma da célula estão
guardadas no cromossomo bacteriano, e assim bactérias “filhas” herdam essa
informação da bactéria que lhe deu origem. Portanto, saber a forma da célula de
uma bactéria é uma grande dica para descobrir com qual espécie estamos lidando.
Existem alguns formatos possíveis, como cocos, bacilos e espirais.
Coloração de Gram: permite definir uma cor e evidencia a forma para a maioria
das espécies de bactéria. A técnica diferencia esses microrganismos de acordo
com a porção mais externa da célula: uma camada espessa de peptideoglicano ou
uma membrana de fosfolipídeos. As que têm o peptiodeoglicano na parte externa
se coram de roxo pelo corante cristal violeta, e mantém essa cor até o final do
método. Por isso, são chamadas de Gram-positivas. Já as que possuem uma
membrana externa de fosfolipídeos, perdem a cor roxa em uma etapa do método e
depois são “recoradas” em vermelho, sendo chamadas Gram-negativas.
Utilização do oxigênio: algumas espécies bacterianas usam essa molécula para
produzir energia, outras podem ou não utilizar, e ainda existem aquelas que nunca
usam o oxigênio. Baseado nisso, podemos chamar as bactérias de aeróbicas,
facultativa ou anaeróbicas, respectivamente.
Para algumas bactérias anaeróbicas o oxigênio é tóxico e, por isso, elas se
transformam em esporo quando entram em contato com ele. Também chamado de
endósporo, essa estrutura é uma forma de vida que a célula bacteriana assume
permitindo sua sobrevivência em condições inapropriadas para vida.
Meio de cultura: é um ambiente que proporciona condições ideais para o
crescimento de bactérias. Se o meio de cultura tiver consistência sólida, após um
determinado período, nós conseguimos visualizar colônias. O ágar adicionado em
meios de cultura sólidos é aquele mesmo da gelatina, que pode ser comprado em
lojas de alimentos. Cada colônia é um aglomerado visível de milhões de células
bacterianas.
Temperatura: para o crescimento em meio de cultura de bactérias que causam
infeções em seres humanos é quase sempre próxima de 36°C, já que essa é a nossa
temperatura média corporal. Por isso, quando queremos obter o crescimento de
bactérias em laboratório, costumamos deixar o meio de cultura dentro de estufas
com temperaturas entre 35 e 37°C
Sequência de reagentes usados no método de coloração de Gram. A 
etapa 1 representa as células bacterinas antes de serem coradas e, ao 
final da etapa 5, observamos as cores que as bactérias gram-positivas e 
gram-negativas adquirem após a técnica.
Crescimento bacteriano em meio de cultura Ágar Sangue. Cada ponto no meio de 
cultura é uma colônia que cresceu a partir da amostra clínica com bactéria que foi 
semeada nesse ambiente.
PRINCIPAIS BACTÉRIAS DE IMPORTÂNCIA CLÍNICA
COCOS GRAM-POSITIVOS E GRAM-NEGATIVOS: bactérias chamadas
de cocos apresentam células redondas se observadas ao microscópio. Os cocos
costumam se organizar em arranjos característicos, e isso pode ser usado para sua
identificação laboratorial. Esses arranjos acontecem, pois, após a divisão, as
células ainda continuam bem próximas. Quando a bactéria em forma de coco se
divide para formar novas bactérias (“filhas”), o formato redondo da célula
possibilita que a divisão seja feita em diferentes direções, chamados de planos de
divisão.Quando a divisão acontece em apenas um plano, os cocos podem ser
organizar em fileira ou em duplas e, quando ocorre em várias direções, a
organização fica mais complexa, originando, por exemplo, cachos de células
bacterianas. Dois gêneros muito conhecidos de cocos são os Staphylococcus e os
Streptococcus, que possuem células organizadas em cachos e fileiras,
respectivamente.
Fotografia da imagem observada ao microscópio óptico de uma espécie de 
Staphylococcus. É possível observar aglomerados das células em formas 
de coco, que são chamados de cachos. Perceba que essa espécie é gram-
positiva, pois está corada em roxo.
STAPHYLOCOCCUS: é um gênero de bactérias gram-positivas. No
laboratório, crescem bem em diferentes tipos de meios de cultura, com
concentração normal a baixa de oxigênio. Eles são capazes de fermentar
carboidratos e, consequentemente, liberar substâncias ácidas, o que pode mudar o
pH do meio de cultura onde essa bactéria foi semeada. Uma característica
importante das espécies desse gênero é que elas produzem a enzima catalase, que
decompõe o peróxido de hidrogênio, liberando água e gás oxigênio. Na limpeza de
um ferimento com água oxigenada, o surgimento de bolhas é uma reação típica
produzida pela catalase. Em uma lâmina, uma gota de peróxido de hidrogênio
(H2O2) é colocada em contato com a colônia suspeita. A presença de bolhas
(como na imagem) indica que a bactéria pertence ao gênero Staphylococcus.
Espécie Staphylococcus aureus: é um patógeno humano muito comum, causando
desde pequenas infecções de pele até síndromes tóxicas mais perigosas.
Observadas em cultura, suas colônias têm cor amarela característica, daí o nome
da espécie “aureus”, que remete ao ouro. Elas podem crescer em ambientes com
concentração de sal mais elevada e, por isso, se desenvolvem bem na nossa pele,
mesmo o suor sendo “salgado”. S. aureus também produz o fator de agregação
(chamado de fator clumping) e a enzima coagulase, que levam á coagulação
sanguínea. O teste da coagulase é muito útil na identificação de S. aureus.
Essa espécie pode produz importantes toxinas como a leucocidina de Panton-
Valentine, toxina esfoliativa e a toxina da síndrome do choque tóxico, que
contribuem para os quadros mais graves de infecção.
Espécies de Staphylococcus coagulase: são comuns na nossa microbiota normal e,
em algumas situações específicas, podem causar doenças, como infecções
associadas a cateteres em pessoas com sistema imunológico enfraquecido. Esse
grupo inclui diferentes espécies, mas é comum nos referimos a elas em conjunto,
usando para isso a característica que as diferencia do S. aureus (não produzir a
enzima coagulase).
DIFERENCIAÇÃO ENTRE GÊNEROS STREPTOCOCCUS
A diferenciação dos gêneros Streptococcus pode ser feita 
através da análise do padrão hemolítico ou reação a 
antimicrobianos.
PERFIL HEMOLÍTICO
ALFA: lise parcial das hemácias – S. pneumoniae, S. gruo viridans
BETA: lise total das hemácias – S pyogenes, S. agalactiae
GAMA: não há lise de hemácias – Outros estreptococos e enterococcus
CARACTERÍSTICAS DO GÊNERO STREPTOCOCCUS
PRINCIPAIS BACTÉRIAS DE IMPORTÂNCIA CLÍNICA
STREPTOCOCCUS: é um outro gênero de cocos gram-positivos que utilizam o
oxigênio de forma facultativa. São considerados fastidiosos, pois precisam de
nutrientes adicionais no meio de cultura, como a adição de sangue. Ao contrário
dos Staphylococcus, não produzem a enzima catalase. Muitas espécies desse
grupo são capazes de produzir enzimas que destroem hemácias (hemolisinas). A
atividade dessas enzimas varia entre destruição parcial e destruição completa das
hemácias quando testadas em laboratório.
É comum separar os Streptococcus em grupos para facilitar o estudo desse
gênero. Essa separação pode se basear, tanto no tipo de hemólise que é produzida,
quanto pela presença de determinados açúcares na parede celular de espécies do
gênero. A classificação dos Streptococcus usando como critério os açúcares da
parede celular deu origem aos grupos de Lancefield (usamos letras para nomear
cada grupo).
Fotografia da imagem observada ao microscópio óptico de uma espécie de 
Streptococcus. É possível observar fileiras das células em formas de coco. Perceba 
que essa espécie é gram-positiva pois está corada em roxo. 
• Streptococcus pyogenes: associados a infecções invasivas como erisipela.
• Streptococcus agalactiae: importantes agentes de infecções em recém-
nascidos.
• Streptococcus pneumoniae: agentes de pneumonia bacteriana.
Para diferenciar essas espécies no laboratório, podemos usar meio decultura
suplementado com sangue, que torna o meio mais nutritivo e permite identificar
quando a bactéria gera hemólise (lise/ruptura das hemácias). Sobre S. pneumoniae
vale destacar que os pneumococos (como também são chamados) costumam se
organizar em pares quando observados ao microscópio e que podem possuir
cápsula. Essa cápsula pode ser formada por diferentes tipos de polissacarídeos,
sendo essa constituição usada na classificação da espécie.
ENTEROCOCCUS: também são gram-positivas e não produzem a enzima
catalase, assim como os Streptococcus. Destacam-se por crescer em ampla
variação de temperatura (10 a 45°C) e tolerar concentrações de sal um pouco
elevadas. Enterococcus faecalis é o principal enterococo causador de infecções
humanas, seguido pela espécie Enterococcus faecium. Essas espécies são mais
comuns como causa de infecções em pacientes internados em hospitais, causando
o que chamamos de Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS).
NEISSERIA: bactérias gram-negativas em forma de cocos que causam
importantes infecções em humanos. Esse gênero inclui as espécies Neisseria
gonorrhoeae (responsável pela gonorreia) e Neisseria meningitidis (agente de
meningite bacteriana). Usando o microscópio óptico, observamos que essas
espécies, geralmente, se organizam aos pares, e é comum usarmos os nomes
gonococo e meningococo para referimo-nos a elas. No laboratório, N.
gonorrhoeae e N. meningitidis exigem determinados tipos de nutrientes para
crescer, por isso, as cultivamos em meios de cultura enriquecidos (“ricos”) desses
fatores de crescimento. O tempo para visualizarmos as colônias é um pouco maior
que o normal (48 horas) e, mesmo sendo aeróbicas, é necessário que o ambiente
tenha 5% de CO2 (conseguimos isso colocando as placas de meio de culturas em
garrafas apropriadas).
BACILOS GRAM-NEGATIVOS
Bacilos ou bastonetes: a divisão dessa células acontece apenas no plano vertical e
em seguida, elas se separam e, por isso, não é comum encontrar organizações
celulares típicas. Os bacilos gram-negativos são mais comumente identificados em
laboratório como agentes de infecções humanas quando comparados aos bacilos
gram-positivos.
ENTEROBACTÉRIAS E O DOS BGN NÃO FERMENTADORES: vivem no
nosso intestino, e algumas podem causar infecções. Diferenciar esse grupo dos
BGN não fermentadores pelo fato de serem capazes de fermentar carboidratos.
Isso é importante no laboratório, pois a fermentação produz ácido, esse ácido
modifica o pH do meio de cultura, e podemos detectar essa mudança usando meios
com corantes indicadores de pH. Os BGNs não exigem nutrientes específicos
para seu crescimento, por isso, podem ser cultivadas em diferentes meios de
cultura.
ENTEROBACTÉRIAS E O DOS BGN FERMENTADORES: capazes de
produzir energia através da respiração aeróbica e da fermentação, por isso
crescem em ambientes com ou sem oxigênio, consideradas facultativas.
• Escherichia Coli: convivem em harmonia no intestino humano e causam doenças
só em situações específicas.
• Salmonela e Shigella: Causam doença sempre que presentes em número
suficiente.
• Klebsiella pneumoniae: são conhecidas por causar infecções em pessoas
internadas em hospitais, causando gastroenterites, pneumonia, meningite e
infecções do trato urinário.
ENTEROBACTÉRIAS E O DOS BGN NÃO FERMENTADORES: só
crescem em ambiente com oxigênio, pois realizam apenas a respiração aeróbica,
não são comuns na nossa microbiota normal, mas são amplamente distribuídas no
ambiente. Os principais patógenos humanos desse grupo são as espécies:
• Pseudomonas aeruginosa: são conhecidas causadoras de infecções hospitalar.
Uma característica marcante e bastante conhecida de P. aeruginosa é que suas
colônias costumam ter uma cor esverdeada devido a produção de pigmentos
próprios.
• Acinetobacter baumannii: também é conhecida por causar infecções em
pacientes hospitalares. Destacam-se pela aparência de cocobacilos (bacilos
bem curtos).
BGNS NÃO ENTEROBACTÉRIAS: causam infecções gastrointestinais;
• Vibrio cholerae: sua célula possui formato de vírgula por isso, também é
conhecida como vibrião colérico. O lipopolissacarídeo “O” da sua
membrana externa possui muitas variações, sendo usado para nomear
grupos específicos dentro dessa espécie. Apenas alguns desses grupos
são capazes de provocar a cólera. Isso acontece por conta da produção
de uma toxina, que provoca diarreia profusa, com grande perda de água
durante a evacuação. V. cholerae suporta concentrações elevadas de sal
no ambiente, e costuma crescer rapidamente em meios de cultura ricos
em nutrientes.
• Campylobacter jejuni: que também possui célula curva ou em forma de
vírgula. Essa bactéria é comum na microbiota do intestino de animais, e
causa infecções intestinais em seres humanos após ingestão de alimentos
mal cozidos e água contaminada. Para diagnosticar a presença dessa
bactéria no nosso intestino, basta cultivar fezes em meio de cultura
apropriado, em um ambiente com 5 a 10% de oxigênio e, portanto, são
considerados microaerófilos.
BGN COM CÉLULAS BEM PEQUENAS:
• Bordetella pertussis: agente da coqueluche, uma infecção respiratória
conhecida também como tosse comprida. O diagnóstico dessa doença é
feito, principalmente, com base nos sinais clínicos do paciente. O
crescimento da B. pertussis é lento, então, a placa de meio de cultura
deve ser mantida por até sete dias. Em caso de resultados positivos,
podemos coletar uma parte da colônia e visualizar ao microscópio
pequenos bastonetes gram-negativos.
• Haemophilus influenzae: pequeno bastonete que exige nutrientes
específicos para o seu crescimento, mas as colônias são vistas depois de
um tempo padrão de 24 horas. Essa bactéria faz parte da nossa
microbiota normal do trato respiratório superior, mas pode causar
infecções respiratórias, como faringite e pneumonias e, nos piores casos,
meningites. A presença de uma cápsula de polissacarídeos (açúcares)
envolvendo a célula dessa espécie é usada para definir os “tipos” de H.
influenzae, por exemplo, o H. influenzae tipo b, para qual já existe vacina
disponível.
OUTRAS BACTÉRIAS
OUTRAS BACTÉRIAS: apresentam parede celular atípica e não podem ser
diferenciadas por Gram e, por isso, não se enquadram como gram-positivos ou
gram-negativos.
MICOBACTÉRIAS MYCOBACTERIUM: agente etiológico de doenças
importantes, como a espécie Mycobacterium tuberculosis que é responsável pela
tuberculose. Na parte externa de bactérias do gênero Mycobacterium,
encontramos uma extensa camada de ácido micólico, um tipo de lipídeo com
pouquíssima afinidade pela água (hidrofóbico). Essa propriedade dificulta a
penetração de muitos corantes aquosos na célula, incluindo aqueles usados na
coloração de Gram. Com isso, temos que usar um corante com adição de fenol e
ainda é necessário aquecer a lâmina para aumentar a sua penetração. Uma vez
dentro da célula, o corante não consegue ser retirado nem mesmo se a célula for
exposta a uma solução álcool-ácida (BAAR).
• Mycobacterium tuberculosis: também conhecida como Bacilo de Koch
(BK). Um grupo de diferentes espécies de bactéria forma o complexo
Mycobacterium tuberculosis. Além da M. tuberculosis, esse grupo inclui
M. bovis, M. africanum, M. canetti, M. microti, M. pinnipedi e M. caprae.
Essas outras espécies devem ser consideradas, principalmente, se
estamos lidando com pacientes imunodeficientes.
PARASITAS INTRACELULARES OBRIGATÓRIAS:
• Chlamydia trachomatis: responsável por causar doenças como tracoma,
uretrite, cervicite e pneumonia infantil. Dentro das células humanas
infectadas, essa bactéria produz inclusões citoplasmáticas compactas,
que, após coloração de Giemsa, são observadas como bolinhas bem
coradas no citoplasma da célula. Para o diagnóstico, podemos verificar
essas inclusões pela análise do material clínico ao microscópio, ou ainda, a
detecção de anticorpos específicos contra a C. trachomatis, que são
desenvolvidos pelo sistema imune do doente.
Esquema da parede celular (8) das micobactérias. Os ácidos micólicos estão 
representados pelo número 2, formando uma barreirahidrofóbica. As demais 
estruturas são lipídios (1), polissacarídeos (3), peptidoglicano (4), membrana 
plasmática (5), lipoarabinomanano (LAM) (6) e manosídeo de fosfatidilinositol (7). . Chlamydia trachomatis
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO LABORATORIAL PARA INFECÇÕES 
BACTERIANAS DO TRATO RESPIRATÓRIO
TRATO RESPIRATÓRIO SUPERIOR: FARINGITE, TONSILITE, OTITE E
SINUSITE:
• Streptococcus pyogenes: é um Streptococcus do grupo A de Lancefield,
também chamada de faringite estreptocócica, que acomete as membranas
mucosas da garganta e causa tonsilite, inflamação das tonsilas. Em casos raros,
quando o S. pyogenes adquiriu a capacidade de produzir a toxina eritogênica, a
infecção evolui para febre escarlate, provocando erupções cutâneas de
coloração avermelhada, febre alta e alterações na língua. Outra possível
complicação é a glomerulonefrite, que pode se desenvolver entre uma até
quatro semanas após a faringite estreptocócica. Na glomerulonefrite, os
anticorpos produzidos pelo sistema imune do paciente se combinam com
antígenos produzidos pela bactéria e depois depositam na membrana dos
glomérulos renais, levando a um processo inflamatório nesse local.
Método de diagnóstico: identificar a bactéria a partir de um swab da garganta do
paciente. A forma mais rápida de liberar esse laudo é usando kits de testes rápidos
para detecção de antígenos específicos da bactéria. Esse antígeno é o açúcar da
parede celular exclusivo do grupo A de Lancefild. O antígeno é extraído do swab
pela ação de uma enzima ou substância química, e depois alguma técnica
imunológica, como ensaio imunoenzimático ou aglutinação, permite identificar o
antígeno exclusivo de S. pyogenes.
Outra forma de identificar a bactéria é através da semeadura do swab em meio de
cultura do tipo Ágar Sangue, considerado o método diagnóstico de referência. A
hemolisina produzida pelo S. pyogenes destrói completamente as hemácias do
sangue de carneiro presente nesse meio de cultura. Onde ocorre o crescimento de
colônias, a cor do Ágar Sangue passa de vermelha para transparente, o que
caracteriza β-hemólise, ou hemólise total. Depois de obter colônias, podemos
fazer a coloração de Gram e confirmar que se trata de um coco gram-positivo.
Dois testes importantes caracterizam o S. pyogenes:
✓ Teste do PYR (pyrrolidonil arilamidase): determina a atividade da enzima PYR,
produzida por essa espécie bacteriana, que pode ser detectada usando um
reagente comercialmente disponível.
✓ Sensibilidade à bacitracina: é a sensibilidade ao antibiótico bacitracina, que inibe
o crescimento dessa espécie.
• Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae: principais
bactérias causadoras da otite média e sinusite, infecção da membrana que
recobre seios nasais, cavidades que se localizam ao redor do nariz, maçãs
do rosto e olhos.
Métodos de diagnósticos: tanto para otite média quanto para sinusite, é
difícil obter amostras clínicas válidas do paciente. O método de referência
implica em um procedimento invasivo, e muitas vezes nenhuma bactéria é
detectada. Em ambos os casos, os sinais clínicos e os sintomas do paciente
são a base para o diagnóstico, e para sinusite os exames de imagem são
muito úteis.
TRATO RESPIRATÓRIO INFERIOR: INFECÇÕES AGUDAS
(COQUELUCHE, BRONQUITE, BRONQUIOLITE E PNEUMONIA) E
CRÔNICAS (TUBERCULOSE):
• Bordetella pertussis: bactéria causadora da coqueluche, doença atinge
crianças que não tomam as três doses de vacina DTP ou adultos nos
quais a vacina perdeu o efeito ao longo dos anos. Os sintomas na fase
inicial, conhecida como catarral, se assemelha há um resfriado e evoluí
para a fase paroxística, quando a bactéria adere e destrói os cílios da
traqueia, o que leva ao acúmulo do muco e progressão da tosse que pode
comprometer a respiração. O esforço para a entrada do ar produz um
som uivante na tosse, daí o nome popular “tosse comprida” dessa doença.
Método de diagnóstico: é feito pela cultura do swab colhido da nasofaringe
do doente. A semeadura da amostra precisa ser feita em meio de cultura
suplementado com nutrientes especiais e antibiótico, já que é uma bactéria
com exigências nutricionais. Pode-se usar meios como Ágar Regan-Lowe
ou Ágar Bordet & Gengou. O crescimento da B. pertussis é lento, a
incubação precisa ser feita por até sete dias, em ambiente aeróbico e úmido.
A célula bacteriana se cora fracamente pelo Gram, sendo recomendado
deixar o último corante por dois minutos. Por conta de demora para cultivar
B. pertussis em laboratório, é recomendando aplicar técnicas que acelerem
o diagnóstico. Dentre elas, estão o teste sorológico e o diagnóstico
molecular pela PCR (Reação em Cadeia da Polimerase).
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO LABORATORIAL PARA INFECÇÕES 
BACTERIANAS DO TRATO RESPIRATÓRIO
Bronquite e bronquiolite: são infecções limitadas a traqueia e aos brônquios. As
formas agudas, de início rápido, quase sempre são causadas por vírus. O
diagnóstico microbiológico, com cultivo de bactérias por exemplo, não é indicado
para essas infecções. O tratamento é voltado para reverter os sintomas, como o
uso de broncodiladores.
Streptococcus pneumoniae: é o agente bacteriano mais frequente da pneumonia
pneumocócica, infecção aguda de todo o pulmão. Considerada a pneumonia clássica,
os sintomas como febre alta, dificuldade de respirar e dor lombar surgem logo. A
ocorrência desse tipo de pneumonia pode diminuir ao longo dos próximos anos pelo
acesso a vacinas disponíveis contra alguns sorotipos de pneumococos, que têm
como alvo o açúcar da cápsula bacteriana.
Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa: são bactérias do tipo
Staphylococcus auereus, causadoras de pneumonia, geralmente adquiridas após um
período maior ou igual a 48 horas de admissão no hospital e associadas a situações
em que o paciente está sob ventilação mecânica.
Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae e Legionella pneumophila:
são causadoras de pneumonias bacterianas atípicas. O diagnóstico laboratorial que
define o agente da pneumonia é muito importante, porque é a base para a escolha
do tratamento adequado, diminuindo do risco de óbito.
Material de coleta para o diagnóstico de pneumonias: pode ser escarro, aspirado
traqueal, lavado broncoalveolar, material de biópsia e sangue. Swab das vias aéreas
superiores geralmente não são úteis pois acabam refletindo a microbiota normal.
Em relação ao escarro, deve ser coletado logo pela manhã e encaminhado
diretamente ao laboratório. O aspirado está sujeito a contaminações por
microrganismos que colonizam pacientes entubados ou com ventilação mecânica. Já
o lavado broncoalveolar é mais seguro nesse aspecto.
As biópsias são mais indicadas para imunocomprometidos e crianças que não 
reagem bem ao tratamento. A cultura de sangue é usada quando existe 
suspeita de que a bactéria tenha atingido no sangue do paciente. Todas as 
amostras respiratórias podem ser armazenadas por até 2 horas em 
temperatura ambiente, e até 24 horas em geladeira.
CRITÉRIOS PARA DIAGNÓSTICO DE PNEUMONIA
Primeiramente é preciso investigar a possibilidade de pneumonia
pneumocócica, por ser a mais prevalente.
Método: o material clínico deve ser semeado em Ágar Sangue e incubado na
presença de 5% de CO2. A hemólise parcial aponta para o Streptococcus
pneumoniae, já que essa espécie é α-hemolítica. A partir desse crescimento,
a coloração de Gram pode ser realizada, com a intenção de confirmar a
presença de cocos gram-positivos.
Outros dois testes confirmatórios são a solubilidade em bile e a sensibilidade
a optoquina. A célula do S. pneumoniae sofre lise pela ação dos sais biliares
e é sensível ao antimicrobiano optoquina, o que não acontece com outros
cocos gram-positivos α-hemolíticos.
O teste mais atual para detecção de pneumococos é identificar um antígeno
específico dessa bactéria na urina do paciente, de forma muito rápida e
prática. No entanto, o resultado negativo precisa ser confirmado por cultura
do material. Se a causa da pneumonia não for a espécie S. pneumoniae, a
próxima suspeita deve ser a bactéria Haemophilus influenzae. A coloração
de Gram diretodo escarro é capaz de diferenciar H. influenzae de S.
pneumoniae, pois o primeiro é um cocobacilo gram-negativo, enquanto o
segundo é um coco gram-positivo. Para cultura e observação das colônias,
usamos o meio de cultura Ágar Chocolate, que tem na sua composição
hemácias lisadas, uma rica fonte de nutrientes para bactérias exigentes.
Outro teste importante é verificar a necessidade da bactéria pelo fator X
(hemina ou hematina) e pelo fator V (NAD ou coenzima I). Se a espécie
isolada do material for realmente H. influenzae, ela irá crescer na presença
desses fatores, porque precisa deles.
Teste sorológico: detecta anticorpos no sangue do paciente que foram
produzidos contra a bactéria, mas eles demoram algumas semanas para
aparecer desde o início da infecção.
Teste molecular: identifica o DNA da bactéria. É considerado o método mais
eficiente de diagnóstico para coqueluche. A escolha do método dependerá das
condições oferecidas pelo laboratório clínico e o quadro do paciente.
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO LABORATORIAL PARA INFECÇÕES 
BACTERIANAS DO TRATO RESPIRATÓRIO
Diagnóstico de pneumonias hospitalares: são encaminhados para cultura
diferentes tipos do amostras:
O escarro pode ser corado pela coloração de Gram e visto ao microscópio, um
recurso simples e que pode direcionar as próximas ações. Se forem amostras de
aspirado traqueal e lavado broncoalveolar, semeamos em meios de cultura como
Ágar MacConkey e Ágar Sangue para checar o aparecimento de colônias. Se o
agente for o S. aureus, vamos observar hemólise total em Ágar Sangue, e nenhum
crescimento em Ágar MacConkey. Em casos de bacilos gram-negativos, teremos
crescimento nos dois meios, e o Ágar MacConkey ainda vai nos dar dicas sobre a
fermentação.
Quando confirmada a presença de bastonetes gram-negativos, pode-se suspeitar
de espécies como Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e
Acinetobacter baumannii. Vários testes sobre as características bioquímicas
dessas espécies são necessários para chegar ao verdadeiro agente etiológico.
Colonização x Doença: na colonização, o microrganismo não causa doença, 
enquanto nos casos de infecção, a bactéria altera o estado de saúde do paciente, 
provocando sinais e sintomas. 
• Escarro: quando se trata de infecção, há um número elevado de leucócitos, baixa
contagem de células epiteliais (provenientes da saliva) e um único tipo
morfotintorial se destacará após coloração de Gram (coco gram-positivo OU
bacilos gram-negativos, por exemplo).
• Lavado broncoalveolar e aspirado traqueal: contabilizar o número de colônias
que apareceram no meio de cultura. Para que a infecção seja confirmada, esse
número deve ser superior ao limite mínimo estipulado pelas normas da ANVISA.
Chamamos essa técnica de cultura quantitativa.
Bactérias que causam pneumonias atípicas: não podem ser detectadas por
métodos de diagnóstico microbiológicos convencionais, como a cultura, não se
coram pelo método de Gram, dificilmente pode ser cultivada pelos meios de cultura
tradicionalmente usados no laboratório. A confirmação pode ser feita através de
técnicas imunológicas, que detectam o anticorpo produzido pelo sistema imune do
doente contra a bactéria ou algum antígeno específico do microrganismo ou
diagnóstico molecular, como a PCR, que identifica o material genético da bactéria.
Tuberculose: é uma infecção crônica do trato respiratório inferior. A
doença se inicia quando a bactéria começa a invadir e se multiplicar dentro
dos macrófagos presentes nos alvéolos pulmonares. A doença avança
lentamente, à medida que mais macrófagos são destruídos, o que gera
inflamação e lesão do tecido pulmonar. O papel do sistema imune é
essencial e determina se a doença seguirá para fases mais graves. A
tuberculose incide com maior gravidade em pacientes imunossuprimidos,
como em portadores de HIV.
Material: o principal é o escarro, mas também podem ser enviados líquido
pleural, biópsia, entre outros. Esteja atento aos cuidados com a manipulação
desse material. As medidas de proteção aumentam de acordo com o tipo de
análise que será realizada. As mais básicas envolvem o exame direto do
material ao microscópio, quando é necessário, por exemplo, tratar a amostra
com hipoclorito de sódio a 5% antes de preparar a lâmina, para inativar a
bactéria. Além disso, existem outros detalhes que envolvem cultivo da
bactéria e a avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos, que exigem um
ambiente laboratorial adaptado. A inviabilização com hipoclorito de sódio 5%
é uma opção quando o laboratório não tem cabine de segurança biológica.
Métodos:
Baciloscopia: primeira coloração utilizada para análise dos agentes da
tuberculose, com a amostra de escarro distendida diretamente na lâmina ou
anteriormente com a utilização de agentes mucolíticos que o tornam mais
fluido, como NaOH. O método de coloração mais usado é Ziehl-Neelsen,
onde os bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR), como as micobactérias,
adquirem coloração rosa forte, e outras células ficam coradas em azul,
quando vistos ao microscópio óptico.
Auramina: coloração onde os BAAR coram em amarelo alaranjado e o
restante da lâmina fica escura no microscópio de fluorescência. O resultado
da microscopia pode mostrar ausência de BAAR ou presença. A presença é
registrada de acordo com a quantidade de dessas células por campo de
visão, variado de raros (+) até numerosos (++++). A microscopia é simples,
rápida e de baixo custo, mas alguns casos podem não ser detectados por
esse método.
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO LABORATORIAL PARA INFECÇÕES 
BACTERIANAS DO TRATO RESPIRATÓRIO
Cultura do microrganismo: é considerado o padrão-ouro para o diagnóstico da
tuberculose pulmonar pela confirmação de resultados negativos para casos
suspeitos. Também usamos a cultura para o diagnóstico de tuberculose
extrapulmonar. A cultura de Mycobacterium é trabalhosa, porque essa bactéria
possui um crescimento lento e exige condições específicas. Além disso, algumas
amostras, como escarro e lavado broncoalveolar, precisam ser tratadas antes de
serem semeadas no meio de cultura, para eliminar microrganismos contaminantes.
• Meios de cultura: os meios mais utilizados são Lowenstein-Jensen e
Middlebrook. Devem ser incubados em estufa com 5 a 10% de CO2 por até 8
semanas, com verificação de crescimento de colônias duas vezes nas duas
primeiras semanas, e depois, uma vez por semana. Caso confirmado, segue-se
com a identificação da espécie de Mycobacterium, que se baseia no tempo
necessário para o crescimento visível, na aparência das colônias, na produção de
pigmento quando as colônias são expostas à luz e na realização de certas
análises bioquímicas.
• Testes automatizados: são mais rápidos, porém mais caros. O BACTEC é um
exemplo de teste automatizado que identifica a espécie M. tuberculoses através
da sua inibição pelo composto NAP (ρ-nitro-α- acetylamino-β-
hydroxypropiophenone), liberando o resultado em aproximadamente cinco dias.
• Testes moleculares: incluem a utilização de sondas que se ligam ao RNAr da
espécie alvo, ou ainda a amplificação de determinadas regiões do DNA da
bactéria pela técnica de PCR.
Teste imunológico da prova tuberculínica PPD (Purified Protein Derivative):
utilizado quando o objetivo for rastrear possíveis doentes em uma população de
risco para tuberculose. Esse exame verifica se casos suspeitos apresentam reação
imunológica contra uma proteína purificada da M. tuberculosis, que é injetada nas
camadas superficiais da pele do indivíduo. Se ocorrer reação positiva, a área em
torno da injeção ficará endurecida e vermelha após aproximadamente 72 horas.
Esse teste não significa que a doença está ativa, e sim um contato anterior com a
bactéria. Por isso, pessoas que já se vacinaram com a vacina BCG apresentam
PPD positivo. O PPD como indicativo de casos ativo de tuberculose é mais usado
para pacientes positivos para o vírus HIV e crianças bem novas, com imunidade
baixa.
• Teste de suscetibilidade de M. tuberculosis aos antimicrobianos: é de
grande importância clínica, pois a tuberculose é uma infecção adquiridafora do ambiente hospitalar, mas que apresenta altas taxas de falhas
terapêuticas devido à resistência bacteriana ao tratamento. O teste é
feito para os antimicrobianos que são as primeiras opções terapêuticas,
como isoniazida e rifampicina. Esse teste pode ser feito através de forma
tradicional, verificando o crescimento bacteriano no meio de cultura
Lowenstein-Jensen com antimicrobiano, ou ainda utilizando métodos
comerciais e técnicas moleculares. Em todos os casos, o resultado
indicará se a bactéria isolada do doente é resistente ou sensível à ação de
determinada droga. Se o resultado for resistente, a indicação de
tratamento passa a ser antimicrobianos de segunda linha, como
aminoglicosídeos e etionamida.
PATOGÊNESE DAS INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO
Sistema urinário: sua função é formar a urina, armazená-la e, posteriormente,
eliminá-la. Tudo começa nos rins, onde o sangue é filtrado, através de aglomerados
de pequenos vasos sanguíneos, para formar a urina. Os ureteres levam a urina
formada para a bexiga, onde ela fica armazenada até o momento de sua eliminação.
A liberação da urina ocorre pela uretra. A bexiga se comunica com o meio externo
através da uretra.
Esse funcionamento é muito importante pois elimina substâncias tóxicas ao nosso
organismo e mantém uma quantidade de água suficiente para o nosso corpo. As
patologias que afetam esses órgãos podem, por exemplo, provocar o acúmulo de
substâncias indesejáveis ou a eliminação inadequada de componentes importantes,
além de alterações da pressão sanguínea. Dentre essas patologias, estão as
infecções do trato urinário (ITU).
Doenças do trato urinário (ITU)s: presença e multiplicação de microrganismos nos
órgãos desse sistema. Devido a sua organização, o sistema urinário está em
constante contato com o meio externo, facilitando a entrada dos agentes
infecciosos.
Características do trato urinário dificultam o desenvolvimento de microrganismos
causadores de doença: a força de eliminação da urina é uma barreira mecânica, que
“empurra” para fora a bactéria patogênica, os lactobacilos, bactérias da microbiota
genital de mulheres, produzem ácido lático através do seu metabolismo e mudam o
pH da região. O pH ácido, tanto da região genitália, quanto da urina, é impróprio
para a reprodução de muitos microrganismos, dificultado sua sobrevivência.
Condições que alteram as proteções naturais do organismo que facilitam do
desenvolvimento de infecção: realização de higiene íntima muitas vezes ao dia ou
com sabonetes básicos, uso prolongado, desnecessário ou errado de
antimicrobianos também altera a microbiota genital.
Infecções do sistema urinário: é causada maioritariamente por bactérias,
mas outros microrganismos também podem se desenvolver, como fungos e
protozoários. O fungo da espécie Candida albicans faz parte da microbiota
normal de algumas mulheres, mas pode crescer de forma descontrolada,
causando a candidíase, que pode evoluir para uma infecção urinária.
Meios de contaminação: bactérias podem acessar os rins pelo sangue a
partir de uma infecção que se originou em outra parte do corpo e se
espalhou, chamada de infecção sistêmica, um exemplo é a leptospirose,
causada pela bactéria Leptospira interrogans, essa bactéria pode ser
liberada pela urina de animais e contaminar a água, penetrando no nosso
organismo através de pequenas lesões ou por membranas mucosas, como a
cavidade oral em caso de ingestão.
Bactéria causadora da leptospirose L. interrogans: penetram dentro das
células, onde encontram “abrigo” para fugir do rastreio do sistema imune e
conseguem acessar diferentes órgãos, ganhando tempo para se multiplicar
provocar insuficiência renal, e insuficiência hepática. Essa forma mais grave
é conhecida como Doenc ̧a de Weil.
Contaminação externa: o acesso do microrganismo ocorre pela uretra,
chamada de via ascendente. Devido à proximidade entre o ânus e o início da
uretra, bactérias da microbiota intestinal são agentes de uretrites. Se o
tratamento não for feito de forma correta, é possível que a bactéria tenha
acesso a partes mais altas do sistema urinário, podendo chegar até aos rins.
Isso justifica a recomendação de usar o papel higiênico no sentindo da vulva
(popular vagina) para o ânus, diminuindo a chance de contaminação. Tanto em
homens quanto em mulheres, a espécie mais comum nesse tipo de infecção é
a Escherichia coli, um microrganismo da microbiota intestinal.
O sufixo “ite” é usado para nomear os diferentes tipos de infecções do 
sistema urinário. Portanto, usamos uretrite, cistite, ureterite e pielonefrite 
para nos referirmos a infeções na uretra, bexiga, ureteres e rins, 
respectivamente. Em mulheres, a cistite é mais comum, pois o comprimento 
da uretra é curto, além de se localizar muito próxima ao ânus, facilitando o 
acesso das bactérias a esse órgão. 
PATOGÊNESE DAS INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO
ITUs:
• E. coli uropatogênica: enterobactérias que possui fatores que facilitam sua
aderência à mucosa urinária.
• Staphylococcus coagulase negativo S. saprophyticus: são integrantes da
microbiota da pele.
• Proteus: enterobactéria que desenvolve infecções genitais.
ITUs potencialmente mais graves:
• Pielonefrites crônicas: são um risco para o funcionamento renal, pois provoca
pequenas lesões nos rins e facilidade para o acesso à corrente sanguínea, o que
pode provocar bacteremia, ou, infecção da corrente sanguínea. Quando existe
chance de bacteremia, é preciso fazer a cultura do sangue do paciente para
verificar a existência de qualquer crescimento bacteriano.
COLETA, TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO DE URINA
Fase pré-analítica: a coleta ideal depende do tipo de exame que será realizado e
das características do paciente. Para suspeitas de ITU pode ser necessário apenas
a verificação de componentes da urina através de testes rápidos, mas a melhor
forma de confirmar o diagnóstico é identificando o crescimento bacteriano a partir
da urina. Em relação ao paciente, condições associadas à idade e ao estado de
saúde podem impedir que um determinado tipo de coleta seja feito. Cada uma
dessas situações tem suas particularidades, e devemos estar atentos para
recomendar a forma mais adequada, para que isso não afete o resultado que será
liberado. Os métodos de coleta podem variar entre as seguintes opções:
✓ Amostra de jato médio de urina colhida em frascos coletores.
✓ Uso de bolsa coletora em pacientes que não controlam o momento de eliminar a
urinar, como crianças.
✓ Cateteres vesicais, que são procedimentos feitos usando cateteres inseridos
através da uretra até a bexiga. São usados quando o paciente não consegue
urinar espontaneamente ou outras situações que dificultem a coleta tradicional
usando frascos.
✓ Punção suprapúbica, feita pela introdução de uma agulha no interior da bexiga
pela parede do abdômen.
Elementos Anormais e Sedimentos (EAS): é o exame urinário de rotina, que
utiliza a primeira urina da manhã coletada em frascos, que permite analisar
imediatamente vários componentes desse material clínico, como hemácias,
leucócitos e proteínas.
Urinocultura ou cultura de urina: exame para confirmação da ITU, através da
verificação do crescimento em meio de cultura da bactéria responsável pela
infecção, usando para isso a amostra de urina.
Cuidados específicos para cada método de coleta:
Jato médio estéril:
✓ Realizar limpeza com água e sabão neutro da região genitália, tanto
feminina, quanto masculina.
✓ Para homens, retrair o prepúcio e fazer higiene da glande.
✓ Para mulheres, afastar os lábios vulvares durante a coleta.
✓ Usar um frasco coletor estéril fornecido pelo laboratório ou adquirido em
farmácia.
✓ Descartar o primeiro jato de urina.
✓ Colher preferencialmente a primeira urina da manhã e, se não for
possível, coletar a urina após 2 horas da última micção.
✓ Se possível, coletar a urina quando já estiver no laboratório.
Saco coletor:
✓ Realizar a limpeza de toda região que terá contato com o saco coletor
sando água e sabão, e após secar adequadamente.
✓ Trocar o saco com intervalos regulares (o tempo recomendado podevariar).
✓ Se o resultado for positivo, deve-se fazer punção suprapúbica em
crianças.
Cateter vesical:
✓ Higienizar a entrada da vagina.
✓ Desprezar o primeiro jato de urina cateterizada.
Punção suprapúbica: 
✓ Higienizar a pele com substâncias antissépticas antes da coleta.
✓ A bexiga deve estar cheia.
PATOGÊNESE DAS INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO
Armazenamento: o profissional responsável pelas análises no laboratório deve
processar a amostra em até 2 horas após a coleta. Se não for possível, a urina
deve ser armazenada em geladeira, entre 2 e 8°C. Mas atenção, NUNCA congele
a urina, pois isso destrói elementos urinários, como células. Na impossibilidade de
usar refrigerador, são utilizados conservantes químicos, que permitem que a urina
fique em temperatura ambiente. Existem diferentes tipos de conservantes, mas
todos têm seus pontos fracos, portanto, devem ser a última opção. Um exemplo é o
ácido bórico, que pode matar algumas espécies de microrganismos patogênicos,
impossibilitando que eles sejam detectados pela cultura. O tempo que a urina pode
permanecer em geladeira ou sob a ação de conservantes pode variar entre o tipo
de exame que será realizado ou de acordo com a norma padronizada para cada
laboratório, mas, em geral, esse período não pode ser superior a 24 horas.
Testes rápidos: trata-se de um exame muito solicitado pelos médicos, porque
permite a liberação rápida do resultado, considerado que o método de coleta e os
testes feitos são simples de serem executados. Dentre as características da urina
que podem ser rapidamente avaliadas, estão as propriedades físicas, presença de
substâncias químicas e a visualização de componentes da urina. Elas também
auxiliam na confirmação de outras doenças, como cálculos renais e diabetes.
Propriedades físicas da urina: incluem sua cor, cheiro e aparência. Em relação a
cor, nos indivíduos sadios ela varia entre diferentes tons de amarelo dependendo
da quantidade de água ingerida. Não existe uma cor característica de ITU, mas em
alguns casos pode estar vermelha devido a presença de hemácias. O cheiro da
urina de um paciente com ITU pode ter aromas característicos, mas a origem do
odor não é clara. Considerando a aparência, uma pessoa saudável deve ter urina
com aspecto transparente, porém, em casos de ITU ela pode ser tornar turva por
conta do excesso de alguns elementos.
Componentes químicos mais sugestivos de ITU:
• Esterase leucocitária: são enzimas do grupo das esterases são comuns no
interior de leucócitos, que são as células de defesa do nosso corpo. Detectar
uma grande quantidade dessas enzimas aponta para uma intensa atividade dos
leucócitos, que é característica de um estado de infecção.
• Nitrito: é um composto produzido por algumas espécies de bactérias, como a
E.coli, que indica que existem bactérias em intensa atividade naquele sistema
urinário.
Nem toda espécie de bactéria que pode causar ITU produz nitrito, como
aquelas causadas por cocos gram-positivos, portanto, o resultado negativo
não descarta esse diagnóstico. Os testes para a presença de esterase e
nitrito são feitos usando fitas com marcadores que reagem à presença
desses componentes através da mudança de cor.
Fitas reagentes: são usadas nos testes de componentes químicos da urina.
Informações como armazenamento, tempo de contato com a urina,
temperatura, luz, exposição ao ar, estão indicadas pelo fabricante nos
rótulos e instruções técnicas. Além disso, para relacionar a alteração de cor
com um determinado resultado, usamos uma espécie de escala comparativa
que vem na embalagem das fitas reagentes.
PATOGÊNESE DAS INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO
Escala comparativa das fitas reagentes: cada quadradinho de papel filtro que está
preso à fita possui um reagente químico diferente, que irá alterar de cor de acordo
com a concentração de uma determinada substância na urina. Um desses
quadradinhos detecta nitrito, e outro esterase leucocitária.
Análise por microscopia: na detecção de ITU, o foco é a identificação de leucócitos
e bactérias, e nesse caso a urina não deve ser centrifugada. Durante a pesquisa por
leucócitos, deve-se colocar uma pequena quantidade de urina sobre uma lâmina de
vidro e por cima uma lamínula. Usando a lente objetiva de 40x, se forem vistos mais
de cinco leucócitos por campo de visão, é constatada a presença de leucocitúria ou
piúria. Para a identificação de bactérias, é utilizada 10 µl de urina medida por uma
alça bacteriológica calibrada. Essa pequena quantidade será colorida através do
método de Gram. Depois disso, a presença de uma ou mais células de bactérias por
campo usando a objetiva de 100x, será relatado bacteriúria. A leucocitúria e a
bacteriúria não são 100% confiáveis para o diagnóstico de ITU.
✓ Leucocitúria positiva: acontece na grande maioria nos casos de ITU, mas
também pode estar presente em casos de cálculos renais, lúpus eritematoso
sistêmico, tumor de bexiga, dentre outras patologias. Exercício físico exaustivo
ou contaminação da urina com fluidos vaginais também podem gerar leucocitúria.
✓ Bacteriúria positiva: é bastante específica para ITU, ainda que bactérias da
microbiota possam causar confusão em alguns casos. Um outro ponto negativo é
a difícil observação da bactéria e, por isso, casos confirmados de ITU podem ter
bacteriúria negativa no exame microscópico.
Urinocultura: é o exame de referência para confirmar infecções do trato urinário
(ITU). Diferentes meios de cultura podem ser usados para urinocultura, mas todos
com consistência sólida, porque só assim é possível visualizar colônias. Os três
principais meio de cultura são Ágar Sangue de Carneiro, Ágar MacConkey (ou
Ágar Eosina Azul de Metileno -EMB-, que tem as mesmas propriedades) e Ágar
Cistina Lactose Eletrólito Deficiente (CLED). Podemos destacar algumas
diferenças importantes entre esses meios de cultura:
• Ágar Sangue: tem como qualidade marcante a presença de hemácias inteiras,
que são fontes ricas em nutrientes e podem ser usados para o cultivo de
diferentes espécies bacterianas. Outra vantagem é a visualização de hemólise
por ação de certas espécies de bactérias, como alguns Streptococcus e o
Staphylococcus aureus.
• Ágar MacConkey: é importante saber que se trata de um meio seletivo
para bactérias gram-negativas, portanto, gram-positivos não crescem
nesse ambiente. Além disso, possui corantes na sua composição que
diferenciam, através da cor, bactérias que realizam ou não a fermentação
do açúcar lactose.
• Ágar CLED: é muito usado porque, além de ser diferencial para a
fermentação de lactose, como o MacConkey, ele também impede que
certas espécies de bactéria (como as do gênero Proteus) cresçam se
espalhando por toda placa, e assim, conseguimos observar colônias mais
definidas.
• Meios cromogênicos: permitem a identificação presuntiva de alguns
agentes de ITU pela sua coloração característica após crescimento,
graças à ação de certos substratos do meio.
Métodos de semeadura:
Abordagem dupla: semeadura da amostra de urina em dois tipos de meio, um
seletivo e outro não seletivo, para direcionar a identificação da espécie
bacteriana responsável pela infecção. Por exemplo, se houver crescimento
em MacConkey já sabemos que é um gram-negativo e elimina a necessidade
do Gram. Por outro lado, se não ocorre crescimento de colônias no Ágar
MacConkey mas elas aparecem em CLED ou Ágar Sangue, provavelmente,
a espécie bacteriana é um gram-positivo. Se o responsável pela ITU for um
Staphylococcus coagulase negativo, não veremos colônias no Ágar
MacConkey, mas sim em Ágar Sangue e em Ágar CLED. Se a bactéria
isolada for uma Escherichia coli, veremos colônias em qualquer um desses
meios, além do que as colônias terão uma coloração rosa pink em
MacConkey, devido à fermentação da lactose.
No entanto, o gasto com meios de cultura aumenta muito, e usar o meio 
seletivo associados ao resultado da coloração de Gram é a opção mais 
comum e de menor custo.
PATOGÊNESE DAS INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO
PRINCIPAIS TÉCNICAS DE CULTIVO DE BACTÉRIAS USANDO 
AMOSTRAS DE URINA: 
cada quadradinhode papel filtro que está preso à fita possui um reagente químico
diferente, que irá alterar de cor de acordo com a concentração de uma
determinada substância na urina. Um desses quadradinhos detecta nitrito, e outro
esterase leucocitária.
Técnicas de contagem de colônia: oferecem resultados quantitativos, definindo um
número de bactérias por mL de urina. Esse resultado é importante para o
diagnóstico de ITU e para o acompanhamento do sucesso da terapia
antimicrobiana.
Lamino-cultivo: é útil para definir a presença ou ausência de microrganismos, mas
por não ser exato em relação ao número de bactéria é considerado
semiquantitativo. É uma técnica mais simples que a contagem de colônias em placa
de Petri, usado no diagnóstico de ITU. Para realizá-la, a urina deve ser coletada
usando um frasco cuja tampa está ligada a um suporte plástico em formato de
lâmina. O suporte plástico possui duas faces com meios de cultura diferentes, como
Ágar MacConkey e Ágar CLED. Ao tampar o frasco após a coleta, a lâmina entra
em contato com a urina e depois é incubada na estufa de 35-37°C durante 24
horas. Essa técnica facilita o transporte e a semeadura da amostra. No entanto, a
superfície para contagem de colônias é pequena e, muitas vezes, não observamos
colônias definidas. Por isso, o lamino-cultivo não substitui a contagem de colônia
como método quantitativo. A melhor aplicação dessa técnica consiste em detectar
o crescimento bacteriano e identificar os principais gêneros responsáveis por ITU,
como a E. coli.
Contagem de colônias por técnica de semeadura superficial: utilizamos uma alça
calibrada, que serve serve para selecionar uma quantidade definida de urina a fim
de padronização do teste. O material da alça deve ser platina ou plástico
descartável para evitar interferentes. No caso de utilizar alça de platina, ela deve
ser exclusiva para esse procedimento, além de ter a calibração checada com
frequência. A alça deve ser inserida no frasco contendo urina homogeneizada, na
posição vertical. Com a alça carregada de urina, é feita uma linha reta no centro da
placa, e depois, a distribuição do material de modo que em estrias formando um
ângulo de 90°C com a linha central.
• Tempo de incubação: o material semeado deve ser incubado em estufa de
35-37°C durante 24 horas. Esse tempo pode ser maior em situações
específicas. Após o crescimento bacteriano, passamos para a etapa de
contagem que colônias.
• Resultado: é representado pelo número de colônias bacterianas que se
desenvolveram no meio cultura. Para alças calibradas com 1 µL, uma
única colônia que cresceu no meio de cultura representa 1.000 colônias
por 1 mL de urina. Cada colônia contada é chamada de UFC (Unidade
Formadora de Colônia), pois assumimos que ela se originou a partir de
apenas uma célula bacteriana que se multiplicou a ponto de enxergamos
seu crescimento. Para confirmar um quadro de ITU, a contagem precisa
corresponder a mais de 100.000 (105) UFC por mililitro de urina. No
caso da alça calibrada com 1 µL, precisamos contar mais de 100 colônias.
Devemos ter atenção com esse limite mínimo para o diagnóstico, porque
existem situações onde contagem menores indicam ITU, por exemplo, se a
amostra for coletada por punção suprapúbica. Para amostras com baixa
chance de contaminação, costumamos diminuir o limite mínimo para
considerar uma infecção. Isso também acontece para pneumonias quando
a amostra é um lavado broncoalveolar.
Técnica de semeadura em profundidade: baseia-se em diferentes diluições
da amostra de urina que depois são incorporadas ao meio de cultura. As
diluições da urina são feitas em solução salina de forma seriada, ou seja, as
concentrações de urina nas diluições são progressivamente menores. Essa
mistura é depositada na placa de Petri com meio de cultura ainda líquido
(42°C), e depois a mistura se solidifica. A incubação é realizada a 35-37°C
durante 24 horas. O crescimento de colônias acontece em profundidade,
não só na superfície do meio de cultura. O resultado é dado pelo número de
colônias que se desenvolveram, multiplicado por quantas vezes a amostra de
urina foi diluída. Por exemplo, se observamos 1.000 colônias para a urina
diluída 100 vezes, o resultado será 105 UFC/mL. Percebe-se que essa
técnica é muito trabalhosa e, por isso, ela é pouco usada, apesar de ser
confiável para um resultado quantitativo.
PATOGÊNESE DAS INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO
Diversidade na aparência das colônias: pode indicar contaminação, pois significa
que diferentes microrganismos se desenvolveram a partir da amostra de urina.
Para contagens entre 104 e 105 UFC/mL, se dois ou mais tipos de colônias se
sobressaem, é provável que tenha ocorrido contaminação no momento da coleta.
Para contagens superiores a 105 UFC/mL, se existem até duas colônias
predominantes, seguimos com os próximos testes. Mas se três ou mais colônias se
destacam na contagem de 105 UFC/ml, assumimos que houve contaminação
grosseira da amostra. Em casos de contaminação, é preciso solicitar uma nova
amostra e refazer a urinocultura. Então, lembre-se de instruir muito bem o
paciente ou profissional que irá fazer a coleta.
Etapas após a identificação ITU:
• Identificação bioquímica e sorológica do microrganismo: definirá a espécie de
bactéria responsável pela infecção. Se o número de colônias contadas for
pequeno, é indicado que forneçamos apenas a morfologia mínima da bactéria
encontrada, como, por exemplo, bacilos gram-negativos ou cocos gram-
positivos.
• Teste de suscetibilidade aos antimicrobianos: também chamado de antibiograma,
apontará os medicamentos com maior chance de sucesso no tratamento de uma
infecção bacteriana. O método mais usado para os patógenos que costumam
causar ITU é o método de disco difusão. Nesse teste, discos impregnados com
antimicrobianos são depositados sob o meio de cultura, onde previamente já foi
semeada a bactéria. Basicamente, é verificado após 18 a 24 horas, se a bactéria
consegue ou não crescer perto dos discos. Para realizar esse exame, é
importante seguir toda a padronização recomendada pelos órgãos oficiais,
incluindo a utilização do meio de cultura apropriado, Ágar Mueller-Hinton. O
resultado desse teste nos mostrará se a bactéria resiste ou não a ação dos
antimicrobianos testados, e isso guiará a melhor terapia para o paciente,
evitando os casos em que o antimicrobiano é ineficiente e a infecção pode
avançar para partes superiores do sistema urinário.
UROCULTURA - LAMINOCULTIVO
IDENTIFICAÇÃO DAS PRINCIPAIS BACTÉRIAS ASSOCIADAS A INFECÇÕES SISTÊMICAS 
(HEMOCULTURAS)
Exame de hemocultura: busca identificar e isolar a presença de microrganismos na
corrente sanguínea de paciente com suspeita de sepse e auxiliar na terapia
antimicrobiana mais eficaz.
Coleta de sangue: começa com a solicitação de uma hemocultura pela identificação
de quais pacientes necessitam deste exame, de acordo com os sintomas
apresentados pelo paciente em que há suspeita de sepse:
✓ Febre alta (>38°C) e calafrios;
✓ Temperatura baixa (<36°C) associado aos sintomas:
✓ Diminuição da pressão arterial;
✓ Aumento da frequência cardíaca;
✓ Número muito alto ou muito baixo de glóbulos brancos no sangue.
Fatores de risco: idade avançada, recém-nascidos, sistema imunológico debilitado,
tempo de hospitalização, procedimentos invasivos, tais como uso de cateter,
infusões, agulhas, entre outros, suspeita de endocardite (infecção do tecido interno
do coração), doenças crônicas como diabetes e cirrose, além de pacientes com
câncer ou AIDS.
Coleta de sangue para hemocultura: pode ser realizada através de punção venosa,
utilizando agulha e seringa, ou pelos métodos a vácuos. Considerar:
✓ Os procedimentos de descontaminação do local da coleta para que não ocorra
contaminação do material;
✓ Os procedimentos de biossegurança e o
✓ Uso correto de EPI (Equipamentos de proteção individual) para evitar possíveis
problemas.
A antissepsia pode ser realizada utilizando soluções:
✓ Clorexidina alcoólica (0,5%),
✓ Tintura de iodo (1-2%);
✓ PVPI (10%),
✓ Álcool isopropanol 92%;
✓ Álcool 70%.Deve-se preparar o material para coleta considerando:
✓ Identificação dos frascos (nome do paciente, data e hora da coleta, via de coleta,
sítio de coleta e tomar cuidado para não cobrir o código de barras do frasco de
hemocultura);
✓ Realizar a assepsia da tampa do frasco.
Recomendações:
✓ Evitar coleta pelo cateter pelo alto risco de contaminação, punção venosa
é a mais recomendada. O cateter somente é coletado quando existe
suspeita de infecção sanguínea pelo uso dele.
✓ A coleta deve ser realizada antes da antibioticoterapia (para não ocorrer
morte bacteriana antes da sua detecção). Caso o paciente já esteja
tomando antibióticos, a coleta deve ser feita antes da administração da
próxima dose.
✓ Antes do pico febril (pois, a febre é uma resposta do sistema imunológico
contra a infecção) e se houver outro foco infeccioso, fazer uma coleta
deste também.
✓ Recomenda-se no mínimo 2 frascos e máximo de 4 frascos de sangue,
mas vai depender de cada paciente e da suspeita, verificar às
recomendações do médico que solicitou o exame.
✓ Deve-se coletar de sítios diferentes, por exemplo, braço esquerdo e
braço direito, para aumentar a probabilidade de detecção e diminuir a taxa
de contaminação. O volume coletado varia de 5 a 10 mL de sangue para
adultos e 1 a 5 mL para crianças em cada frasco.
✓ O primeiro frasco é utilizado para procura de bactérias anaeróbicas e
outro para cultura de bactérias aeróbicas, após a coleta deve-se
homogeneizar o meio.
✓ Cada frasco possui meios de cultura que vão favorecer o crescimento de
cada tipo de bactéria. Quando existe suspeita de infecção por dispositivos
intravenosos, como o cateter, pode-se coletar a ponta do cateter e
mandar para análises microbiológicas também.
✓ Para isso, deve-se cortar o segmento que estava inserido no paciente
com tesoura estéril e colocar em frasco estéril, mandar para o
laboratório. Após a coleta, o material deve ser levado imediatamente para
o laboratório em temperatura ambiente.
IDENTIFICAÇÃO DAS PRINCIPAIS BACTÉRIAS ASSOCIADAS A INFECÇÕES SISTÊMICAS 
(HEMOCULTURAS)
Cateter são fontes de infecção da corrente sanguínea pela capacidade de algumas 
bactérias em formar biofilme. É importante causa de infecção sistêmica em 
pacientes imunodebilitados internados em UTI e a contaminação pode vir da 
própria microbiota da pele do paciente, das mãos do profissional de saúde, 
contaminação do fluido de infusão ou até mesmo pela colonização do dispositivo.
Semeadura em meio de cultura: os meios de cultura são combinações ricas em
nutrientes que permitem o crescimento de microrganismos em laboratório. Apesar
disso, existem microrganismos ditos fastidiosos (demoram a crescer em meios de
culturas disponíveis atualmente) e o diagnóstico destes são mais demorados e
difíceis.
Microrganismos apresentam exigências nutricionais diversas e, como não se sabe o
agente causador da infecção, é necessário utilizar meios ricos em nutrientes que
permitirão o crescimento da maioria dos microrganismos.
• Meios líquidos: os caldos (meios líquidos), como o caldo BHI (Brain Heat
Infusion), caldo TSB (Trypticase Soy Broth), Caldo Columbia, todos meios ricos
em nutrientes que permitem o crescimento da maioria dos microrganismos.
Geralmente, os frascos para coleta de sangue para aeróbicos conterão caldo
BHI ou Caldo TSB; e os frascos para anaeróbicos, o Caldo Columbia. Ambos
terão um anticoagulante, geralmente, o SPS.
• Meios sólidos: contém Ágar, incluem o Ágar Chocolate (com sangue
hemolisado, para microrganismos fastidiosos), Ágar Sangue (com sangue de
cavalo ou carneiro), Ágar MacConkey ou Ágar EMB (seletivo para bactérias
gram-negativas e diferencial pela fermentação da lactose). Existem diferentes
meios de culturas para isolamento e identificação bacteriana, sua escolha
dependerá do meio padronizado pelo laboratório de microbiologia.
Hemocultura: após a coleta, os frascos são enviados ao laboratório de
microbiologia e incubados a 35-37°C em estufa. Existem diferentes formas
de processamento das hemoculturas e a escolha dependerá de cada
laboratório, bem como a demanda de solicitação.
Hemocultura manual: os frascos coletados são incubados por 7 dias por 35-
37°C com 3 subcultivos dos frascos com a constante observação da
aparência da hemocultura no frasco a fim de se detectar turbidez, produção
de gás, bolhas, grumos etc, pois são indicativos de crescimento bacteriano no
frasco. Após 24 horas de incubação, é realizada a primeira semeadura nos
meios Ágar chocolate, Ágar Sangue e Ágar McConkey ou Ágar EMB pela
técnica de esgotamento. Os frascos e os meios de cultura são incubados por
24 horas à 35-37°C, ou seja, é realizado o subcultivo do frasco em meios de
cultura sólidos. Se, após 24 horas, for observado crescimento bacteriano
nos meios, através da formação de colônias, segue-se para a identificação
(provas bioquímicas e coloração de Gram) e o antibiograma. Se for negativo,
um outro subcultivo deve ser realizado semeando a amostra no meio de
cultura e incubando por mais 24 horas a 35-37°C (aqui já temos 48 horas
desde a coleta). Se no segundo subcultivo tiver crescimento microbiano,
seguimos para a identificação e antibiograma. Se der negativo, ele segue
para um terceiro subcultivo nos meios de cultura e incubação novamente por
mais tempo a 35-37°C.
Frasco de anaeróbicos deve-se incubar em tensão de anaerobiose (sem
oxigênio). Se após este período apresentar crescimento microbiano, segue
para identificação e antibiograma. Se der negativo, pode-se descartar o
frasco e liberar o resultado como negativo. Esses três subcultivos são
chamados de culturas cegas, pois não se sabe se há crescimento no frasco.
Microrganismos fastidiosos demoram mais tempo para crescer, como por
exemplo espécies do gênero Mycobacterium, quando tiver suspeita de
infecção por espécies fastidiosas o tempo de incubação é maior.
IDENTIFICAÇÃO DAS PRINCIPAIS BACTÉRIAS ASSOCIADAS A INFECÇÕES SISTÊMICAS 
(HEMOCULTURAS)
• Hemocultura automatizada: nos sistemas automatizados, o frasco vai para o
aparelho que é capaz de detectar o crescimento mínimo de microrganismos no
frasco. Quando o crescimento é detectado, o aparelho emite um sinal e assim
é realizada a semeadura nos meios de cultura Ágar Chocolate, Ágar Sangue
e Ágar McConckey ou Ágar EMB, seguindo para identificação e
antibiograma. Os sistemas automatizados apresentam maior rapidez (tempo
máximo de 5 dias dependendo da suspeita do microrganismo), não há
necessidade de muitas semeaduras e, com isso, menor risco de contaminação.
Como exemplo dos sistemas automatizados, podemos citar o BacT/Alert da
BioMérieux e BACTEC da BD.
Quando há suspeita de infecção por uso de cateter, a cultura é feita em paralelo 
à hemocultura, onde, com auxílio de uma pinça estéril, o segmento do cateter é 
rolado sobre a superfície do Ágar Sangue e incubado por 24 horas a 35-37°C, 
logo após é visualizado o crescimento microbiano. Recomenda-se deixar o meio 
de cultura incubado por mais 48 ou 72 horas caso não haja crescimento.
Interpretação dos resultados: as infecções sistêmicas podem ter três origens:
• Infecções primárias da corrente sanguínea (sem foco de infecção primário
identificável);
• Infecções secundárias da corrente sanguínea (com infecção primária
identificada em outra localização);
• Infecções da corrente sanguínea associadas à utilização de cateter (o cateter
é a fonte da contaminação).
Os principais focos de infecções secundárias:
✓ Trato geniturinário;
✓ Trato respiratório;
✓ Trato intestinal;
✓ Pele e abscessos.
Na maioria das vezes, as bacteremias são causadas por uma única bactéria,
infecções ditas polimicrobianas (mais de uma bactéria) são raras.
Principais bactérias encontradas em hemoculturas com valor preditivo positivo
alto (>90%), ou seja, a probabilidade da hemocultura de fato ser uma bacteremia
verdadeira ou septicemia quando isolada do sangue, incluem: Staphylococcus
aureus (gram-positivas), Escherichia coli e demais enterobactérias (gram-
negativas), Neisseria meningitidis (gram-negativas), Pseudomonas aeruginosa(gram-negativas), Streptococcus pneumoniae (gram-positivas), Brucella spp.
(gram-negativas), Streptococcus pyogenes (gram-postivas), Straptococcus
agalactiae (gram-positivas), Listeria monocytogenes (gram-positivas),
Haemophilus influenzae (gram-negativo). Bactérias anaeróbicas são raras de
acontecer, cerca de 1% das sepses são causadas por elas e incluem espécies do
gênero Bacterioides spp. (gram-negativas).
Microrganismos com valores preditivos positivos variáveis, ou seja, diferentes
chances de ser uma bacteremia verdadeira, incluem Streptptococcus viridans
(38%), Enterococcus spp. (78%) e Staphylococcus coagulase negativa (15%).
Enquanto a presença de Corynebacterium spp., Micrococcus spp., Bacillus spp.,
e Propionibacterium acnes são constantemente associadas à contaminação,
com apenas 5% de chance de ser uma bacteremia verdadeira.
Para suspeita de microrganismos fastidiosos ou fungos incubar por mais 10 dias.
IDENTIFICAÇÃO DAS PRINCIPAIS BACTÉRIAS ASSOCIADAS A INFECÇÕES SISTÊMICAS 
(HEMOCULTURAS)
• Hemocultura automatizada: nos sistemas automatizados, o frasco vai para o
aparelho que é capaz de detectar o crescimento mínimo de microrganismos no
frasco. Quando o crescimento é detectado, o aparelho emite um sinal e assim
é realizada a semeadura nos meios de cultura Ágar Chocolate, Ágar Sangue
e Ágar McConckey ou Ágar EMB, seguindo para identificação e
antibiograma. Os sistemas automatizados apresentam maior rapidez (tempo
máximo de 5 dias dependendo da suspeita do microrganismo), não há
necessidade de muitas semeaduras e, com isso, menor risco de contaminação.
Como exemplo dos sistemas automatizados, podemos citar o BacT/Alert da
BioMérieux e BACTEC da BD.
Quando há suspeita de infecção por uso de cateter, a cultura é feita em paralelo 
à hemocultura, onde, com auxílio de uma pinça estéril, o segmento do cateter é 
rolado sobre a superfície do Ágar Sangue e incubado por 24 horas a 35-37°C, 
logo após é visualizado o crescimento microbiano. Recomenda-se deixar o meio 
de cultura incubado por mais 48 ou 72 horas caso não haja crescimento.
Interpretação dos resultados: as infecções sistêmicas podem ter três origens:
• Infecções primárias da corrente sanguínea (sem foco de infecção primário
identificável);
• Infecções secundárias da corrente sanguínea (com infecção primária
identificada em outra localização);
• Infecções da corrente sanguínea associadas à utilização de cateter (o
cateter é a fonte da contaminação).
Os principais focos de infecções secundárias:
✓ Trato geniturinário;
✓ Trato respiratório;
✓ Trato intestinal;
✓ Pele e abscessos.
Na maioria das vezes, as bacteremias são causadas por uma única bactéria,
infecções ditas polimicrobianas (mais de uma bactéria) são raras.
Principais bactérias encontradas em hemoculturas com valor preditivo positivo
alto (>90%), ou seja, a probabilidade da hemocultura de fato ser uma bacteremia
verdadeira ou septicemia quando isolada do sangue, incluem: Staphylococcus
aureus (gram-positivas), Escherichia coli e demais enterobactérias (gram-
negativas), Neisseria meningitidis (gram-negativas), Pseudomonas aeruginosa
(gram-negativas), Streptococcus pneumoniae (gram-positivas), Brucella spp.
(gram-negativas), Streptococcus pyogenes (gram-postivas), Straptococcus
agalactiae (gram-positivas), Listeria monocytogenes (gram-positivas),
Haemophilus influenzae (gram-negativo). Bactérias anaeróbicas são raras de
acontecer, cerca de 1% das sepses são causadas por elas e incluem espécies do
gênero Bacterioides spp. (gram-negativas).
Microrganismos com valores preditivos positivos variáveis, ou seja, diferentes
chances de ser uma bacteremia verdadeira, incluem Streptptococcus viridans
(38%), Enterococcus spp. (78%) e Staphylococcus coagulase negativa (15%).
Enquanto a presença de Corynebacterium spp., Micrococcus spp., Bacillus spp.,
e Propionibacterium acnes são constantemente associadas à contaminação,
com apenas 5% de chance de ser uma bacteremia verdadeira.
PRINCIPAIS BACTÉRIAS ASSOCIADAS A INFECÇÕES DO TRATO GASTROINTESTINAL 
(COPROCULTURA)
Diarréia: quadro de fezes aquosas com mais de duas evacuações ou fora do que é
habitual do indivíduo. Podem ser classificadas em: diarreia aguda (<14 dias), diarreia
persistente (>14 dias) e diarreia crônica (>30 dias), sendo a aguda a mais comum.
Todas as idades serem cometidas por este quadro, porém existe uma prevalência
em crianças menores de 5 anos e gestantes. A maioria dos quadros de diarreia são
autolimitantes, alguns podem evoluir para casos mais graves e requerem atenção
médica e exames adicionais para o seu diagnóstico e tratamento.
As diarreias infecciosas possuem uma gama de agentes causadores, entre elas,
vírus, protozoários, helmintos e bactérias, as mais graves, geralmente, são
causadas por bactérias. A diarreia de origem bacteriana pode gerar um quadro
grave de desidratação, problemas neurológicos, insuficiência renal e até a morte se
não for tratada.
Síndrome disenteriforme e coleriforme: a diarreia causada por bactérias em dois
quadros clínicos, chamados de síndrome disenteriforme e coleriforme. Essas
síndromes ocorrerão de acordo com o tipo de patógeno ou toxinas acometidas.
• Síndrome disenteriforme: é caracterizada por uma diarreia do tipo inflamatória,
com visível sangue nas fezes, dor abdominal, perda de peso, podendo gerar febre
(com exceção da E. coli enterohemorragica). O sangue nas fezes é proveniente
de citotoxinas ou bactérias enteroinvasivas que destroem ou invadem o trato
gastrointestinal.
• Síndrome coleriforme: tem como característica uma diarreia aquosa aguda, com
três ou mais fezes líquidas ou semilíquidas por dia dentro de um intervalo de até
14 dias (a maioria dura menos de 7 dias), não apresentam sangue visível, podendo
apresentar vômito, náuseas, febre e falta de apetite. Suas consequências são
desidratação grave. São processos característicos de bactérias que produzem
enterotoxinas (toxinas que agem sobre o intestino).
Patogenia da diarreia bacteriana: o sítio de infecção, o patógeno e o mecanismo de
patogenicidade podem ser relacionados com os casos clínicos. Podem ser
classificados em:
• Patógenos que produzem enterotoxinas: causam diarreia aquosa pela troca
iônica e interação com as funções dos enterócitos (células epiteliais do intestino
grosso e delgado).
• Patógenos produtores de citotoxinas: destroem os enterócitos, causando uma
inflamação intestinal com todos os sintomas inflamatórios, levando sangue nas
fezes e febre.
• Patógenos enteroaderentes: patógenos que invadem a mucosa intestinal
e se aderem a esta, alterando a função normal dos enterócitos, levando a
um quadro inflamatório.
As principais formas de transmissão destes patógenos é pela via oral, de
animais para pessoas, de pessoa-pessoa ou pela ingestão de alimentos
contaminados. Alguns indícios (fatores de riscos) podem estar associados,
como membros da família ou pessoas próximas com diarreia, viagem recente,
atendimento médico frequente, fontes de abastecimento de água, dieta
(contaminação de alimentos, bem comum) e uso anterior de antimicrobiano.
Os principais patógenos associados a quadros diarreicos podem ser
relacionados às síndromes disenteriforme e coleriforme de acordo com sua
patogenia. Os patógenos que produzem citotoxinas e/ou invadem e se
aderem à mucosa intestinal levarão a um quadro inflamatório característico
da síndrome disenteriforme e incluem espécies Salmonella spp.,
Campylobacter spp., Shigella spp., E. coli enterohemorrágica
(frequentemente associada ao sorotipo 0157:H7) , E. coli enteroinvasiva,
Yersinia spp., Clostridium difficile, Bacillus cereus. Enquanto os mais
comuns em gerar a síndrome coleriforme incluem E. coli enterotoxigênica, E.
coli enteropatogênica e enteroinvasiva, Vibrio cholerae.
Coprocultura: exame baseado na pesquisa de bactérias nas fezes, mas não é
qualquer bactéria, afinal, sabemos que as fezes contêm uma grande
quantidade destes microrganismos (incluindo a E. coli). A pesquisa é
direcionada a determinados patógenos comumente associados a este quadroinfeccioso e na quantidade de determinadas bactérias nas fezes.
Algumas bactérias não fazem parte da microbiota e podem causar infecção
quando ocorre um descontrole no seu crescimento, como, por exemplo, pelo
uso de antimicrobianos, que podem levar à morte de algumas bactérias da
microbiota. O descontrole da microbiota intestinal é chamado de disbiose e
pode favorecer o crescimento de algumas espécies, é o que acontece com
infecções por C. difficile, em que a intensa proliferação dessa bactéria acaba
produzindo uma grande quantidade de toxinas que leva ao quadro diarreico.
PRINCIPAIS BACTÉRIAS ASSOCIADAS A INFECÇÕES DO TRATO GASTROINTESTINAL 
(COPROCULTURA)
Coleta de fezes para a coprocultura: é feita utilizando um coletor de fezes
universal estéril, evitando contato da amostra com urina ou água do vaso sanitário.
A coleta deve ser feita, preferencialmente, antes do uso de antibióticos, sem a
necessidade de encher o pote de coleta, deve-se tomar cuidado para não vazar
material.
Recomendações: O pote coletor deve ser encaminhado para o laboratório dentro
de uma hora, se não for possível, deixar refrigerado por até 6 horas. Existem alguns
meios de cultura de transporte que possuem conservantes, dando tempo de análise
de 24 a 48 horas. Na análise, deve-se dar prioridade a porções contendo muco,
sangue ou pus, quando presentes, pois neles estão grande quantidade do patógeno
causador. Não deverá ser aceita amostras provenientes de fraudas, com urina ou
qualquer outro líquido e após 3 dias de quadro infeccioso.
A escolha dos meios de cultura utilizados para pesquisa de bactérias depende da
suspeita clínica e incluem:
✓ Ágar McConkey e Ágar EMB para pesquisa de Enterobactérias Gram-
negativas;
✓ Ágar SS (Salmonella Shigella), Ágar HE (Entérico de Hektoen) e Ágar XLD
(Desoxicolato-Lisina-Xilose) para detecção de Salmonela spp.
✓ Shigella spp., Ágar Campy para detecção de Campylobacter spp.,
✓ Ágar CIN (Novobiocina-Irgasan-Cefsulodina) para detecção de Yersinia spp.,
Ágar RCBS (Tiossulfato, Citrato, Bílis e Sacarose) para detecção de Vibrio
spp.
✓ Além dos meios de cultura sólidos, a amostra também é semeada em um meio
enriquecido e seletivo para patógenos entéricos, como caldo Selenito, Caldo
Tetrationato, caldo Campy-tioglicolato (para Campylobacter spp.) e caldo GN
(para Shigella e Salmonella).
Os diferentes meios de cultura favorecem o crescimento dos principais patógenos
associados a essas infecções, inibem ou diminuem o crescimento de bactérias
provenientes da microbiota.
➢ Em caso de amostra líquida ou swab, deve ser semeado direto nos meios de
cultura.
➢ Em caso de fezes sólidas, deve-se diluir a amostra em solução salina 10%
tamponada.
Após semear as amostras nos meios de cultura selecionados, elas são
incubadas a 35-37°C por 18 a 24 horas. Caso exista crescimento no meio
de cultura, a amostra segue para a identificação e antibiograma. Caso não
haja crescimento, uma nova amostra é semeada do caldo de enriquecimento e
incubada novamente por 35-37°C por 18 a 24 horas. Após esse período, em
caso positivo (observado o crescimento), segue-se para a identificação e, em
caso negativo, o resultado é liberado como negativo.
Diagnóstico bioquímico: devido à grande diversidade de microrganismos
encontrados na coprocultura, é necessária a realização de provas
bioquímicas para confirmação se o crescimento microbiano visualizado é, de
fato, um enteropatógeno. Assim, as provas bioquímicas são grandes aliadas
para a identificação de patógenos nestas infecções e se baseiam na
capacidade de as bactérias utilizarem determinados substratos para seu
crescimento, ou seja, através do seu metabolismo é possível identificar
gêneros ou espécies bacterianas e seu real papel na patogênese das
infecções gastrointestinais. Entre as principais provas bioquímicas, podemos
destacar:
• Teste de oxidase: o teste da oxidase verifica se os isolados bacterianos
apresentam a enzima citocromo oxidase, estas enzimas estão associadas
à cadeia transportadora de elétrons. O teste pode ser realizado pingando
uma gota de solução de Dimetil p-fenilenodiamina cloridrato sobre a
colônia ou impregnando uma tira de papel filtro com a solução e aplicando
a amostra sobre. As tiras de oxidases podem ser compradas. A cor
azul/violeta indica positividade no teste. E. coli e demais enterobactérias
são negativas, enquanto Campylobacter spp. e Vibrio spp. são positivos.
• Fermentação de açúcares: esse teste é utilizado para saber qual é o
metabolismo bacteriano para obtenção de energia: via oxidativa (aeróbica)
ou via fermentativa (anaeróbica). Para isso, podem ser utilizadas
diferentes fontes de açúcares, como a glicose, a sacarose e a lactose.
✓ Bactérias que realizam a fermentação: obtêm menos energia e produzem
um ácido como produto do seu metabolismo, com possível formação de
gás.
PRINCIPAIS BACTÉRIAS ASSOCIADAS A INFECÇÕES DO TRATO GASTROINTESTINAL 
(COPROCULTURA)
✓ Bactérias não-fermentadoras: crescerão no meio de cultura, mas não produzem
ácido no final e, portanto, não alteram o pH do meio. Bactérias fermentadoras
crescerão no meio e produzirão ácido, mudam o pH e alteram a coloração do
meio. O meio mais utilizado é o Ágar TSI. A cor original do meio é vermelha, se
o meio possui crescimento sem alteração da cor indica que a bactéria é não-
fermentadora. Quando temos a acidificação do meio, este fica amarelado,
indicando uma alteração de pH pela produção de ácido e que a bactéria
apresenta um metabolismo fermentativo. Também é possível ver a produção de
gás e H2S neste meio. A E. coli fermentam a glicose, sacarose e lactose.
Salmonella e Shigella fermentam somente a glicose.
• Produção de gás sulfídrico ou sulfeto de hidrogênio (H2S): esse teste detecta a
capacidade da bactéria em liberar o enxofre, por ação enzimática, de
determinados aminoácidos. Ao realizar esta reação, ocorre a produção de gás
sulfídrico ou sulfeto de hidrogênio que reage com íons de ferro ou chumbo
contidos no meio, formando um precipitado negro e resultando em positividade
para o isolado em questão. Podem ser utilizados para o teste o Ágar TSI (Triplo
Açúcar de Ferro), meio SIM (Sulfato de hidrogênio, Indol e Motilidade), meio
AIL (Instituto Adolfo Lutz). Grupo bacteriano mais importante em infecções
gastrointestinais positivo para este teste inclui a Salmonella spp. e C. difficile.
• Motilidade: é um teste fisiológico, que testa a capacidade da bactéria em se
mover em meio semissólido devido à presença de flagelos. Os meios mais
utilizados para isso incluem o meio SIM, meio MILI (Motilidade, Indol e Lisina).
Apresentam motilidade no meio: E. coli, Salmonella spp., Compylobacter spp.,
Vibrio spp.
• Produção de indol: verifica a capacidade da degradação do aminoácido
triptofano pela produção da enzima triptofanase, resultando na produção de
indol, ácido pirúvico e hidróxido de amônia. A produção de indol é detectada,
utilizando os reagentes de Kovac (solução de p-dimetilaminobenzadeído) que
reagem com indol, formando uma coloração rosa dentro de 5 minutos e dando
positividade para o teste. Pode ser realizada no meio SIM ou no meio MILI. E.
coli e Vibrio cholerae são positivos.
• Degradação da ureia: ocorre pela ação da enzima urease, bactérias que
possuem esta enzima têm a capacidade de degradar a ureia em amônia e CO2.
Os meios utilizados para este teste incluem ureia e um indicador de pH.
Conforme a ureia é quebrada, o meio torna-se mais alcalino e muda de cor para
rosa, mostrando positividade do teste.
• Prova Vermelho de Metila (VM): detecta o metabolismo bacteriano. A glicose é a
principal fonte de energia celular, algumas bactérias podem utilizar a glicose para
obtenção de energia pela via oxidativa (aeróbica) ou pela via fermentativa
(anaeróbica). Na via fermentativa, o produto do metabolismo da glicose é um
ácido, o qual se acumula no meio, alterando o pH que é observado através de um
indicador de pH. Logo, se ocorre alteração de cor, a bactéria é dita fermentadora,
caso não, dita oxidativa ou não fermentadora.
• Prova de Voges-Proskauer (VP):também detecta a via bioquímica da utilização
da glicose. As amostras positivas que apresentam o teste positivo utilizam a via
fermentativa para degradação da glicose do tipo butilenoglicólica, em que os
produtos desta reação são diacetil. A cor avermelhada indica que o teste é
positivo e que as bactérias que utilizam a via fermentativa butilenoglicólica. B.
cereus apresenta positividade neste teste.
• Utilização de citrato: a prova detecta a capacidade de algumas bactérias em
utilizar o citrato como única fonte de carbono. O meio comumente utilizado para
este teste é o Citrato de Simmons, um meio sólido contendo citrato que tem
como indicador de pH, o azul de bromotimol. A entrada do citrato na bactéria e
sua degradação pela citratase resulta em oxaloacetato e acetato, alcalinizando o
meio. O meio é originalmente verde e, ao ser alcalinizado, muda de cor para o azul.
B. cereus, indicando ser positivo.
• Descarboxilação de aminoácidos: algumas bactérias possuem enzimas específicas
para descarboxilação de aminoácidos, ou seja, removem CO2 dos aminoácidos,
resultando em aminas alcalinas. Os aminoácidos mais utilizados neste teste são a
lisina, arginina e ornitina (LAO). São preparados um tubo para cada aminoácido e
um tubo controle, sem aminoácidos. Assim as diferentes bactérias podem ter
lisina-descarboxilase, arginina-descarboxilase e/ou ornitina-descarboxilase. A
atividade de cada uma dessas enzimas será detectada no meio pela alteração de
pH e da coloração e comparado com o grupo controle (sem aminoácidos). O meio
mais utilizado é o de Moller, que apresenta uma cor violeta quando positivo. E.
coli são lisina positiva e variável para arginina e ornitina.
• Meios adicionais ainda podem ser realizados dependendo da necessidade do
laboratório. Algumas características que podem ser observadas com esses meios
adicionais são: crescimento em altas concentrações de sal (NaCl), desaminação
da fenilalanina, degradação do malonato, entre outros. Além disso, a sorotipagem
também é útil para identificação de alguns sorogrupos de enteropatógenos.
TESTES COPROCULTURA
Teste de oxidase.
Fermentação de açúcares no meio ágar TSI., lado 
esquerdo negativo.
Ágar TSI do lado esquerdo, negativo para o teste. Mobilidade bacteriana em meio SIM. 
Produção de indol. Degradação da ureia. 
PRINCIPAIS PROCEDIMENTOS PARA O DIAGNÓSTICO DE MENINGITE
Membranas que revestem o SNC: o SNC comanda todas as funções do nosso
organismo, até mesmo o ato de pensar e raciocinar. Esse sistema é formado por
encéfalo (cérebro, cerebelo, bulbo, ponte tálamo e hipotálamo) e medula espinhal,
que liga todo o corpo ao encéfalo permitindo os impulsos de movimentos. Esse
sistema é muito bem protegido pelo o crânio e a coluna vertebral, estruturas ocas
que contêm o líquido cefalorraquidiano e as membranas que revestem esse sistema,
conhecidas como meninges. As que meninges revestem todo esse sistema são
compostas por 3 membranas. Após o crânio (tecido ósseo), temos a primeira
membrana a dura-máter, no meio temos a aracnoide e em contato com o encéfalo
temos a pia-máter.
Dura-máter: é a membrana mais superficial, resistente, vasculariza e inervada.
Aracnoide: é a mediana, delicada e faz parte da absorção do líquor.
Pia-máter: é a interna, aderida ao encéfalo e à medula, fina e dando sustentação ao
órgão.
MENINGITE ASSÉPTICA E BACTERIANA
Meningite é um processo inflamatório infeccioso que acomete as meninges, podendo
ser classificada de duas formas:
• Meningites sépticas ou bacterianas: são causadas pela presença da bactéria na
meninge que estimula um processo inflamatório com seus sinais e sintomas. Este
tipo de meningite, geralmente, é mais grave. As bactérias podem acessar as
meninges causando um processo inflamatório através da corrente sanguínea (via
hematogênica) após uma infecção primária por pneumonia, infecções de face,
garganta, ouvido, nariz ou olhos, ou por infecção sistêmica, como na bacteremia ou
através de traumatismos. Ao atingirem as meninges, inicia-se o processo
inflamatório, levando a um infiltrado de células e líquido, gerando uma hipertensão
intracraniana. Essas alterações são percebidas na composição do líquor, que se
apresenta turvo nesses casos.
• Meningites assépticas: não são causadas por bactérias, sim, por vírus, fungos,
protozoários, entre outros fatores.
Coleta do líquor: é realizada por punção lombar e segue para análises bioquímicas,
microbiológicas e citológicas no laboratório. Na análise microbiológica, o tubo é
centrifugado e o sedimento utilizado para as análises. Inicialmente, realiza-se uma
coloração de Gram e Ziehl e meios de cultura de enriquecimentos são utilizados para
o crescimento, como Ágar Sangue e Ágar chocolate. Para suspeita de micobactérias,
devemos realizar o cultivo nos meios Ogawa-Kudoh ou Lowentein Jesen. Para
anaeróbicos, utilizar o caldo Tioglicolato, com as devidas condições de anaerobiose.
Agentes etiológicos: mais comuns nas causas da meningite bacteriana podem variar
de acordo com a idade do paciente:
✓ Crianças com menos de 4 semanas de vida incluem as espécies de Streptococcus
grupo B (Cocos gram-positivos anaeróbicos facultativos) e algumas
enterobactérias, como a E. coli (Bacilo gram-negativo fermentador).
✓ Crianças entre 4 a 12 semanas, as causas mais comuns incluem Streptococcus
grupo B, Streptococcus pneumoniae (Cocos gram-positivos anaeróbicos
facultativos), Salmonella spp. (Bacilos gram-negativos fermentadores), L.
monocytogenes (Bacilos gram-positivos anaeróbicos facultativos) e Hemophikus
influenzae (Cocobacilo gram-negativo).
✓ Acima de 3 anos as causas mais comuns são Streptococcus pneumoniae e
Neisseria meningitidis (Diplococos gram-negativos aeróbicos).
PRINCIPAIS PROCEDIMENTOS PARA O DIAGNÓSTICO DAS ISTS
Infecções Sexualmente Transmissíveis ISTs: são todas as infecções transmitidas
por contato sexual (oral, vaginal ou anal), mas não só, existem casos de transmissão
da mãe para a criança por via transplacentária, durante o parto ou amamentação,
além de casos de infecções por contato com lesão ou feridas sobre a pele ou
mucosa. Uma ampla gama de patógenos podem estar associados a estas infecções.
ISTs e coleta de amostras para diagnóstico: o termo utilizado atualmente é
Infecções Sexualmente Transmissíveis ISTs, ao invés de Doenças Sexualmente
Transmissíveis DSTs. Essa troca ocorreu pelo fato de uma doença ocorrer quando
se tem os sinais e sintomas visíveis. Já o termo infecção significa a presença do
agente etiológico no organismo, ou seja, uma pessoa pode estar infectada, mas não
apresentar os sinais e sintomas que caracterizam a doença.
Existem mais de 30 agentes etiológicos de ISTs que incluem bactérias, vírus e
parasitas. Dentre as diversas ISTs, as mais comuns incluem as causadas por
clamídias e a gonorreia, ambas causadas por bactérias. Podendo ocorrer a
coinfecção por possuírem os mesmos fatores de risco, que incluem sexo com vários
parceiros e o não uso de preservativos, e a presença de uma doença parece
favorecer uma segunda infecção pela outra.
Chlamydia trachomatis: popularmente conhecida como clamídia, é uma bactéria
gram-negativa, que não se cora pelo método de Gram, intracelular (vive dentro da
célula do hospedeiro). Apresenta amplo quadro clínico, que inclui:
✓ Em homens: inflamação da uretra (uretrite) nos homens, podendo evoluir para
prostatite (infecção na próstata), se migrar pela circulação sanguínea pode
chegar até as articulações, gerando a artrite infecciosa, conjuntivite e lesão de
pele e mucosas.
✓ Em mulheres: pode causar inflamação da uretra, a uretrite, no epitélio vaginal, a
vaginite, e ao atingir o colo do útero, pode gerar uma cervite, e se disseminar,
pode gerar ainda a doença inflamatória pélvica, infertilidade e gravidez ectópica.
✓ Em gestantes: podem causar problemas de parto precoce e morte neonatal.
✓ Em recém-nascidos: pode gerar conjuntivite de inclusão que, se não tratada,
pode evoluir para uma pneumonia. A infecção neste caso é adquirida durante o
parto através do canal vaginal. A infecção pode gerar dorao urinar, corrimento
amarelo ou turvo devido à formação de pus durante o processo inflamatório,
sangramento espontâneo e dor durante a relação sexual.
Testes para o diagnóstico de C. trachomatis: é uma bactéria de difícil cultivo devido
ao fato de viver dentro das células do hospedeiro. Desse modo, para este patógeno,
é recomendado o uso de testes imunológicos ou testes moleculares, sendo os testes
moleculares ainda mais capazes de detectar a bactéria do que os imunológicos.
Métodos de coloração direta não são possíveis devido ao pequeno tamanho da
bactéria e sua vida intracelular.
Cultura de Chlamydia: é algo dispendioso e requer muitos cuidados pelo fato de ser
uma bactéria intracelular, o cultivo de uma célula eucarionte é necessário para que
elas consigam crescer, é realizada a cultura de células das linhagens McCoy, HeLa
229 ou BHK, em que a amostra coletada é inoculada sobre a superfície destas
células. Após 3 dias de incubação, é realizada a coloração por iodo ou Giemsa,
buscando as alterações celulares causadas pela presença da Chlamydia, como a
presença de corpúsculos de inclusão citoplasmáticos (vacúolos citoplasmáticos). Por
esse motivo, os testes moleculares se tornam úteis para o diagnóstico na maioria dos
laboratórios, tendo boa sensibilidade e especificidade.
Teste para diagnostico de infecções por Chlamydia e uretrite gonocócica: existem
várias metodologias para o diagnostico destas ISTs e incluem meios de cultura,
testes imunológicos (detecção de anticorpos ou antígenos) e testes moleculares
(detecção do material genético da bactéria). As vantagens de se realizar a cultura
incluem a preservação da bactéria para estudos adicionais, como o antibiograma e
estudos de epidemiologia.
SISTEMA IMUNOLÓGICO
O sistema imunológico é um conjunto de tecidos, células e moléculas que atuam de
forma coordenada para nos defender de microrganismos que podem nos causar
infecções ou doenças. Além disso, o sistema imunológico é capaz de reconhecer e
eliminar do nosso organismo células tumorais ou que sofreram algum dano que
prejudique sua função normal. Em casos de transplante de órgãos, de tecidos e nas
transfusões sanguíneas, o sistema imunológico também pode reconhecer esses
elementos como não próprios e desencadear a resposta imune.
ÓRGÃOS LINFOIDES E CÉLULAS DO SISTEMA IMUNE: O sistema
imunológico é composto por diferentes órgãos, que são classificados como órgãos
geradores ou primários e órgãos periféricos ou secundários. A medula óssea é um
órgão gerador, no qual há produção de todos os elementos figurados do sangue a
partir da célula hematopoiética pluripotente.
Timo: outro órgão gerador, ocorre a maturação de linfócitos T.
Órgãos linfoides periféricos: ocorre a apresentação de antígenos aos linfócitos,
possibilitando o início da resposta imune adquirida. Nos linfonodos, os linfócitos B
e T encontram os antígenos coletados pela linfa dos tecidos periféricos e, no baço,
os antígenos capturados no sangue encontram os linfócitos.
Além de formarem aglomerados que dão origem a órgãos linfoides, as células das
imunidades inata e adquirida encontram-se como células circulantes no sangue e
na linfa. As células do sistema imunológico que circulam no sangue pertencem à
série leucocitária e compreendem os linfócitos, granulócitos e monócitos.
Os leucócitos permanecem temporariamente no sangue e migram para o tecido
conjuntivo através das paredes dos capilares e vênulas, processo conhecido como
diapedese ou transmigração. Uma vez nos tecidos, essas células desempenharão
funções específicas.
Os leucócitos são agrupados em granulócitos e agranulócitos de acordo com suas
características morfológicas. Os granulócitos são os neutrófilos, eosinófilos e
basófilos, e os agranulócitos são os monócitos e linfócitos.
Hematopoie
se
HEMATOPOIESE
SISTEMA IMUNOLÓGICO
SÉRIE GRANULOCÍTICA:
• Basófilos: contêm grânulos com enzimas hidrolíticas, fatores quimiotáticos,
heparina e histamina em seu citoplasma e receptores de imunoglobulina em sua
superfície, desempenhando papel importante, principalmente nas reações
alérgicas (hipersensibilidade do tipo I) e anafiláticas.
✓ Basofilia: número de células anormalmente aumentado no sangue. Colite
ulcerativa, asma, sinusite e rinite, artrite, insuficiência renal crônica, anemia
hemolítica, leucemia mieloide crônica, quimioterapia, remoção do baço.
✓ Basopenia: Número de células anormalmente diminuído no sangue. Urticária,
hipertireoidismo, síndrome de Cushing, uso de corticosteroides, ovulação ou
gestação, estresse.
• Eosinófilos: apresentam grânulos que contêm enzimas hidrolíticas (peroxidase,
histaminase, arilsulfatase) e outras proteínas. Essas células migram do sangue
para os tecidos periféricos, sendo encontradas especialmente no revestimento
de mucosas dos tratos respiratório, gastrointestinal e genitourinário, podendo
aumentar em número sob condições inflamatórias. Além disso, estão envolvidos
no combate a infecções parasitárias causadas por helmintos e na produção de
citocinas que modulam respostas inflamatórias nas reações alérgicas.
• Neutrófilos: constituem a população mais numerosa de leucócitos no sangue e
compõem a primeira linha de defesa do hospedeiro, destacando-se sua grande
capacidade fagocítica. O acúmulo de neutrófilos mortos e bactérias degradadas
no sítio de infecção forma o pus.
✓ Neutrofilia: infecções bacterianas, apendicite, gestação, estresse.
✓ Neutropenia: câncer, esplenomegalia, doenças autoimunes, quimioterapia,
radioterapia, deficiência de vitamina B12 ou folato.
SÉRIE AGRANULOCÍTICA:
• Monócitos: são as maiores células observadas em esfregaços sanguíneos. Esses
tipos celulares podem ser recrutados rapidamente da corrente sanguínea para os
sítios de inflamação, e, ao entrar nos tecidos, os monócitos diferenciam-se em
macrófagos. Desempenham funções tanto na imunidade inata, como a fagocitose
e morte de microrganismos por meio da produção de espécies reativas de
oxigênio e digestão proteolítica, como na adquirida, pois apresentam antígenos
aos linfócitos.
• Linfócitos: são células geralmente pequenas, classificadas em diversos tipos, os
quais diferem nas funções e em seus produtos proteicos. As principais
populações são:
HEMATOPOIESE
SISTEMA IMUNOLÓGICO
Resposta imune inata: é a primeira linha de defesa, constituída pela imunidade inata
ou natural, composta por:
✓ Barreiras naturais (pele, mucosas, enzimas);
✓ Linfócitos T, Células fagocíticas, em especial neutrófilos e macrófagos;
✓ Proteínas de fase aguda, como a proteína C reativa (PCR);
✓ Componentes do sistema complemento.
• Proteínas de fase aguda: podem ser úteis como biomarcadores de condições
patológicas. Sintetizada pelos hepatócitos em resposta a citocinas inflamatórias
como a IL-6, a PCR tem sido utilizada como marcador de resposta de fase
aguda, uma vez que seus níveis séricos aumentam rapidamente após lesão e/ou
necrose tecidual, infecção ou outros processos inflamatórios.
• A PCR: tem especial utilidade na investigação e no acompanhamento de
isquemia ou infarto agudo do miocárdio, queimaduras, doenças renais,
hematológicas e reumatológicas.
Imunidade adquirida ou adaptativa: desenvolve-se posteriormente à ação da
imunidade inata, e seus componentes celulares são capazes de reconhecer
antígenos de forma específica. Esse tipo de resposta confere memória protetora
contra o mesmo antígeno, isto é, durante uma segunda exposição, frequentemente a
resposta é mais rápida do que na infecção primária.
• Antígeno reconhecido: uma resposta pode ser desencadeada por meio da
produção de anticorpos pelos plasmócitos.
• Linfócitos B: são as células responsáveis pela produção de anticorpos, conhecida
como célula de memória.
Imunógeno: é um antígeno capaz de de ativar uma resposta imunológica. Cada
antígeno possui sítios de reconhecimento aos quais os anticorpos ou receptores de
linfócitos B se ligam. Os antígenos podem ser moléculas simples ou complexas,
como:
✓ Metabólitos intermediários de carboidratos, lipídeos e hormônios.
✓ Macromoléculas, como carboidratos complexos,fosfolipídeos, ácidos nucleicos
e proteínas.
Imunoglobulinas: são conhecidas como anticorpos, caracterizam-se por serem
moléculas proteicas que atuam como receptores de membrana dos linfócitos B
(BCR) ou podem se apresentar em sua forma solúvel, sendo sintetizadas por
plasmócitos (linfócitos B diferenciados). Os anticorpos podem atuar em diferentes
processos, tais como:
✓ Neutralização de microrganismos ou toxinas.
✓ Opsonização de patógenos, possibilitando o aumento da fagocitose e da
toxicidade mediada por células dependentes de anticorpos.
✓ Ativação do sistema complemento.
✓ Ativação de mastócitos nas infecções por helmintos.
Imunocomplexos: são formados pela ligação do antígeno e anticorpo de forma
altamente específica.
As imunoglobulinas podem ser classificadas em cinco diferentes isotipos: IgA, IgD,
IgE, IgG e IgM.
As classes e a quantidade de anticorpos podem variar de acordo com o tipo de
resposta imunológica.
IgM: é denominada “anticorpo frio”, pois sua fixação ao antígeno é máxima em baixas
temperaturas e praticamente nula a 37 °C; é sintetizada de forma mais rápida e em
maior quantidade na resposta primária. A detecção de IgM indica infecção aguda ou
recente, podem permanecer de três a seis meses no organismo.
IgG: é denominada “anticorpo quente”, pois sua fixação é ótima a 37 °C, sendo
produzida de forma tardia e em menor quantidade. A detecção de IgG indica que
houve contato com o antígeno há algum tempo, resistem por tempo mais prolongado
ou permanecem durante toda a vida.
Todos os anticorpos encontrados no plasma são originados de clones de linfócitos
B, que diferenciados em plasmócitos, produzem anticorpos policlonais uma vez que
são produtos de clones diferentes e cada um desses clones produz anticorpos de
especificidade única. Os anticorpos monoclonais ou mAbs são produzidos a partir de
um único clone de linfócito B, que passa a produzir sempre os mesmos anticorpos
em resposta a um antígeno.
Anticorpos monoclonais: podem ser produzidos em grande quantidade em
laboratório a partir de linfócitos B gerados por camundongos cujo sistema
imunológico tenha sido estimulado por antígenos de interesse. As novas gerações
de mAbs quiméricos e humanizados usam camundongos geneticamente modificados
para produzir uma molécula híbrida, o que diminui a probabilidade de reação do
sistema imunológico humano contra proteínas do camundongo. Os mAbs são
utilizados como ferramentas diagnósticas e terapêuticas. Como exemplos, temos:
infliximab ou entanercept para o controle da inflamação na artrite reumatoide e
doença de Crohn; trastuzumab para tratamento de câncer de mama; muromonab-
CD3 para diminuição da rejeição de transplante renal, entre outros.
IMUNOGLOBULINAS
✓ IgD: Receptor de membrana de linfócitos B.
✓ IgE: Infecções parasitárias;
✓ Alergias e reações de hipersensibilidades;
✓ IgG: Opsonização;
✓ Ativação do sistema complemento;
✓ Único isotipo que atravessa a placenta.
✓ Estimulação da fagocitose;
✓ Memorização, principal atuante quando
infectado pela segunda vez.
MONÔMERO DÍMERO
✓ IgA: Imunidade de mucosas
✓ Presente nas secreções (saliva, leite materno);
✓ Impede a absorção de antígenos a partir dos
alimentos;
PENTÂMERO
✓ IgM: Receptor de membrana de linfócitos B;
✓ Ativação do sistema complemento.
✓ Infecção ativa;
✓ Fase aguda da infecção;
✓ Primeira a ser secretada;
✓ Aparece em sua maioria nas respostas ás
infecções bacterianas e virais;
SISTEMA IMUNOLÓGICO
INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
A ligação do anticorpo ao antígeno ocorre em um sítio específico, denominado
epítopo ou determinante antigênico. Uma macromolécula que apresenta muitos
epítopos iguais é chamada de antígeno polivalente. Os epítopos podem ser
classificados de acordo com sua estrutura em:
✓ Determinantes lineares: formados com aproximadamente seis aminoácidos em
sequência linear.
✓ Determinantes conformacionais: formados por aminoácidos que não estão em
sequência, sendo encontrados na forma de proteína dobrada.
A interação antígeno-anticorpo (Ag-Ac) é semelhante à interação de enzimas com
seus substratos (modelo chave e fechadura) ou de hormônios com seus receptores,
mas com algumas diferenças. O anticorpo não provoca alteração química
irreversível na molécula do antígeno; assim, o produto formado (Ag-Ac) pode se
dissociar em dois componentes, ficando cada um deles livre em solução. Além disso,
os antígenos apresentam estruturas químicas que favorecem a complementaridade
com o anticorpo por meio de ligações não covalentes reversíveis.
A associação antígeno e anticorpo apresenta diferentes peculiaridades; um
anticorpo pode apresentar distintas afinidades, avidez e especificidade a uma gama
de moléculas.
• Afinidade: é determinada pela força de ligação resultante entre um anticorpo e
um único epítopo do antígeno e depende da complementariedade entre as duas
moléculas. Anticorpos com alta afinidade apresentam grande similaridade ao
antígeno, interagindo por meio de ligações fortes e duradouras; anticorpos com
baixa afinidade dissociam-se rapidamente, pois estabelecem ligações mais fracas.
• Avidez: é determinada pela força resultante de interações múltiplas entre uma
molécula de anticorpo e os epítopos de um antígeno complexo. Assim, quanto
maior a avidez, melhor o efeito biológico final do anticorpo, porém a afinidade
será menor. A baixa afinidade de um anticorpo pode ser compensada por uma
avidez elevada, como acontece em uma molécula de IgM, que, por ser
pentamérica, apresenta diferentes sítios de ligação.
• Especificidade: Consiste na habilidade do anticorpo de distinguir seu imunógeno
de outros antígenos.
Relação entre imunocomplexos Ag-Ac: sofre influência da temperatura e tempo de
reação. O tamanho dos complexos está relacionado à concentração do antígeno e
do anticorpo.
✓ Reações entre Ag-Ac: polivalentes são mais estáveis, sendo detectadas mais
facilmente.
✓ Antígeno particulado: é observada a aglutinação do antígeno pelo anticorpo.
✓ Antígeno apresentado na forma solúvel: é observada a precipitação de um
antígeno após a produção de grandes complexos Ag-Ac insolúveis.
Reatividade cruzada: alguns anticorpos tem habilidade de interagir com mais de um
epítopo com propriedades químicas similares, ocorrendo ligações mais fracas com
regiões semelhantes, mas não idênticas, do antígeno que o induziu. Esse tipo de
ligação é chamado de reação cruzada. Muitos vírus e diversas bactérias podem
apresentar epítopos idênticos ou similares a componentes normais da célula
hospedeira. Os antígenos microbianos estimulam anticorpos que reagem de maneira
cruzada com os componentes da célula hospedeira e resultam em uma reação
autoimune que lesiona o tecido.
Um exemplo é a bactéria Streptococcus pyogenes, que expressa proteínas na
parede celular (antígenos M). Os anticorpos produzidos contra antígenos M reagem
de forma cruzada com várias proteínas do miocárdio e do músculo esquelético,
causando lesões cardíacas e renais que levam ao desenvolvimento da febre
reumática. Além disso, sabe-se que algumas bactérias intestinais têm substâncias
quimicamente semelhantes que apresentam reatividade antigênica cruzada com
antígenos A e/ou B expressos na superfície dos eritrócitos.
INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS
INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
Técnicas imunológicas são utilizadas no diagnóstico clínico de doenças
infectocontagiosas, no monitoramento de tratamento por quimioterapia e
radioterapia e para a determinação do grupo sanguíneo. Essas técnicas possibilitam
a detecção ou quantificação de anticorpos, antígenos e outras moléculas
provenientes da interação Ag-Ac em amostras biológicas. Os testes utilizados para
a detecção de anticorpos ou antígenos podem ser primários ou secundários.
• Primários: verificam a interação direta entre Ag-Ac. Exemplos:
radioimunoensaio, imunofluorescência, ELISA.
• Secundários: detectam as consequências da interação entre Ag-Ac ou
mudanças no estado físico do antígeno. Exemplos: imunodifusão, aglutinação,
precipitação, fixação de complemento.
O imunodiagnósticoapresenta diversas aplicações e vantagens como, rapidez,
possibilidade de automação, kits comerciais padronizados, custo operacional
relativamente baixo.
Imuno-hematologia: é uma das áreas que utiliza técnicas de imunodiagnóstico para
estudar e classificar os grupos sanguíneos por meio de reações imunológicas entre
aglutinógenos e anticorpos. Os testes imuno-hematológicos pré-transfusionais
realizados no sangue do doador e receptor são fundamentais e críticos para a
realização de uma transfusão segura. Além disso, os testes imuno-hematológicos
são rotineiramente empregados para verificar a compatibilidade sanguínea entre
mãe e filho. As metodologias mais utilizadas na imuno-hematologia são as técnicas
em tubo, microplacas e gel teste.
• Técnica em tubo: são utilizados tubos de vidro ou plásticos, onde são colocados
os reagentes e as amostras e, após centrifugação, é verificada a presença de
aglutinação.
• Microplacas: apresentam o mesmo fundamento que a técnica em tubo, mas as
reações são realizadas em microplacas de acrílico com fundo em “U” ou fundo em
“V”.
• Gel teste: a reação é feita em um cartão contendo microtubos com gel
(Sephadex 6100 ou poliacrilamida), que possibilitam que os complexos formados
após a interação Ag-Ac fiquem retidos na coluna do gel quando submetidos à
centrifugação. A presença de aglutinação (botão de hemácias) retirada no gel
indica que o teste é positivo. O gel teste apresenta uma vantagem em relação
aos outros, pois a reação é estável e permite que o cartão fique guardado por até
48 horas, possibilitando revisão do resultado.
Fatores podem influenciar a qualidade dos ensaios imuno-hematológicos:
✓ O sangue deve ser coletado de forma adequada em tubo apropriado.
✓ Devem ser utilizadas vidrarias limpas e sem resíduos de detergente, pois a
presença de interferentes pode favorecer a formação de aglutinatos, levando a
resultados falso-positivos.
✓ Deve ser utilizada a técnica adequada para separação do soro.
✓ As suspensões de hemácias com Salina (NaCl 0,9%) devem ser preparadas
corretamente, uma vez que concentrações muito abaixo ou acima da ideal podem
levar a resultados falsos negativos.
✓ É essencial verificar a qualidade dos reagentes e equipamentos empregados.
✓ Devem ser utilizados ensaios técnicos padronizados.
PRÁTICAS IMUNO-HEMATOLÓGICAS PARA CLASSIFICAÇÃO DO 
SISTEMA ABO
Para a classificação sanguínea em relação ao sistema ABO, é obrigatória a
realização de duas provas, chamadas de prova direta e reversa:
• Prova direta ou teste de Beth-Vincent: pesquisa de antígenos fixados nas
hemácias do indivíduo utilizando soros (anticorpos anti-A, anti-B e anti-A, B)
que apresentam a capacidade de reconhecer e ligar-se aos antígenos
eritrocitários, permitindo a definição dos grupos sanguíneos: A, B, AB, O.
• Prova reversa ou teste de Simonin: pesquisa do anticorpo presente no soro (ou
plasma) do indivíduo, feito com hemácias com o tipo sanguíneo A e B conhecido.
Essa prova é uma contraprova essencial para a conclusão da tipagem sanguínea,
devendo ser sempre realizada, exceto em bebês com idade inferior a quatro
meses de idade, isto porque os anticorpos do sistema ABO estão ausentes ao
nascimento, sendo detectados após os primeiros meses de vida.
Exceções: Anticorpo B: geralmente apresenta título mais fraco que os demais
anticorpos. As provas direta e reversa são complementares entre si. É possível
ocorrerem discrepâncias por alterações nos antígenos, no soro/plasma ou devido a
erros laboratoriais.
TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS
• Bebês: com menos de quatro meses de idade há a presença de anticorpos
maternos durante a classificação sanguínea.
• Pacientes imunodeprimidos: durante a prova reversa, pode não haver os
anticorpos devido à sua baixa produção nesses pacientes.
Existem também subgrupos dos grupos A, B e AB. Os subgrupos do antígeno A e B
apresentam algumas mutações no gene que codifica essas moléculas, o que leva a
uma menor expressão e presença desses antígenos na membrana dos eritrócitos.
Durante a classificação direta em pacientes com esses subgrupos, a baixa expressão
desses antígenos gera uma reação fraca nos testes imunológicos, gerando
discrepâncias entre a prova direta e a reversa. Em bancos de sangue, a distinção
entre os subgrupos A e B não apresenta relevância, pois normalmente a transfusão
desses sorogrupos não leva a uma reação transfusional.
PRÁTICAS IMUNO-HEMATOLÓGICAS: CLASSIFICAÇÃO DO SISTEMA 
RHD E PESQUISA DE D FRACO
Classificação do RhD: refere-se somente à presença ou ausência do antígeno RhD,
não existindo prova reversa, pois os indivíduos não apresentam anticorpos naturais
contra o antígeno Rh. A classificação do Rh é feita pela tipagem direta, com a
utilização de soros comerciais contendo anticorpos anti-D monoclonais ou
policlonais, que identificam a presença de antígenos na superfície dos eritrócitos,
classificando os indivíduos como RhD positivo (aglutinação direta) e RhD negativo
(ausência de aglutinação).
O reagente anti-D apresenta natureza proteica, por isso é necessária a utilização
de um controle negativo, que consiste na mesma base proteica do reagente antiD,
mas não contém o anticorpo. Se o controle for positivo, a reação não pode ser
considerada válida, uma vez que houve aglutinação sem a presença do anticorpo. A
tipagem Rh pode ser realizada pelo método em tubo, lâmina, microplaca ou em gel.
O antígeno RhD exibe um extenso polimorfismo, podendo se apresentar como D
normal, com fraca expressão (D fraco) devido a substituições de aminoácidos na
proteína D ou como um antígeno modificado (D parcial) pela ausência de um ou mais
epítopos. Em testes sorológicos de rotina para tipagem Rh, é difícil distinguir entre
o D fraco e o D parcial, sendo necessários estudos moleculares.
A pesquisa de D fraco deve ser feita sempre que a classificação do RhD for
negativa, isto é, quando não houver aglutinação. A classificação correta do sistema
RhD e de suas variantes tem grande relevância, uma vez que esse antígeno é o mais
imunogênico quando comparado aos demais antígenos eritrocitários conhecidos até
o momento.
TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS
IMUNO-HEMATOLÓGICAS: TESTE DE COOMBS: o teste da
antiglobulina humana ou teste de Coombs foi descoberto em 1945 e
destina-se à pesquisa de anticorpos e proteínas do sistema complemento. O
sistema imunológico pode produzir anticorpos contra eritrócitos nos
seguintes casos:
✓ Anemia hemolítica
✓ Leucemia linfocítica crônica
✓ DHRN
✓ Mononucleose infecciosa
✓ Sífilis
✓ Lúpus eritematoso sistêmico
✓ Reação transfusional
Teste de coombs direto ou teste da antiglobulina direto (TAD): é um teste
que detecta anticorpos (gamaglobulinas) do tipo IgG ou fração do sistema
complemento que estão ligados às hemácias. Esses anticorpos podem ser
produzidos pelo próprio organismo ou recebidos durante uma transfusão de
sangue.
• Prática: O TAD é realizado com suspensão a 5% de eritrócitos do
paciente em soro fisiológico e adição do soro de Coombs (anticorpo anti-
Ig humano, que reconhece uma região do IgG). Posteriormente, a mistura
é centrifugada para a verificação da aglutinação. A presença de
aglutinação (TAD positivo) indica sensibilização (anticorpos ligados a
hemácias).
• Aplicações: uma das maiores aplicações do teste de Coombs direto é na
pesquisa da DHRN nas mães com o fator Rh negativo com o recém-
nascido com fator Rh positivo, a realização do TAD permite verificar se
a mãe produziu anticorpos anti-Rh e se estes atingiram o bebê, podendo
levar ao desenvolvimento da doença. É também indicada em casos de
anemia hemolítica autoimune, anemia induzida por medicamentos e na
reação transfusional. O TAD positivo não significa que o paciente
necessariamente apresenta anemia hemolítica autoimune e o teste
negativo não exclui hemólise imune. Assim, todo paciente com TAD
positivo deve ser submetido a uma avaliação clínica criteriosa e a testes
adicionais.
Teste de coombs indireto ou teste da antiglobulina indireto (TAI): é frequentemente
utilizado na identificação e detecção de anticorpos presentes no soro. Esses anticorpospodem atacar os eritrócitos, mas não estão ligados a eles, sendo chamados de anticorpos
irregulares, incompletos ou não aglutinantes. Normalmente, realiza-se este teste para
detectar a presença de anticorpos no sangue de um receptor ou doador antes de uma
transfusão ou no acompanhamento pré-natal, sendo possível proteger os bebês no início
da gestação, caso a mãe tenha sangue Rh negativo.
• Prática é realizado incubando-se o soro ou plasma do paciente com hemácias
reagentes de triagem e, após incubação a 37 °C com potencializadores, como albumina,
o soro de Coombs é adicionado, misturado e centrifugado para a verificação da
aglutinação.
• Aplicações: é utilizado como uma triagem para pesquisa de anticorpos irregulares; caso
o TAI apresente resultado negativo, isso indica que a amostra testada não tem
anticorpos livres (irregulares), que reagiriam com eritrócitos. Quando o TAI é positivo
indica a presença desses anticorpos, sendo necessários testes adicionais para
identificar qual anticorpo foi formado, pesquisando-se os diferentes tipos de antígenos
eritrocitários (sistemas Rh, Duffy, Lewis, Kell, MNS, dentre outros). Na gestante ou
na mulher Rh negativa que esteja planejando engravidar, o teste de triagem positivo
pode ser indicativo da presença de um anticorpo anti-Rh, ou seja, sugere que a mãe foi
sensibilizada, e deve ser realizada a testagem sanguínea no feto e o acompanhamento
médico para evitar riscos ao bebê. Caso o teste seja negativo, isso indica que a mãe
não foi sensibilizada. Durante o pré-natal, esse teste é sempre solicitado.
COMPATIBILIDADE ENTRE DOADORES E RECEPTORES DE SANGUE
Durante os exames transfusionais para transfusões de concentrados de hemácias (CH),
deve ser feita a classificação sanguínea (ABO e Rh), pesquisa de anticorpos irregulares
(TAI) no receptor e no doador e a prova cruzada, que consiste em verificar se o receptor
tem anticorpos contra algum antígeno eritrocitário do doador, o que pode levar a uma
reação transfusional. Para isso, é realizada a testagem do soro ou plasma do paciente
(receptor) com as hemácias do possível doador e é verificada a presença de aglutinação.
Caso haja aglutinação, o receptor não pode receber aquela bolsa de CH e o sangue de
outros doadores deve ser compatibilizados. Caso a pesquisa de anticorpos irregulares
(TAI) no paciente (receptor) seja positiva, mostrando a presença de anticorpos
irregulares, e a prova cruzada, negativa, o paciente pode receber o sangue, pois, como não
ocorreu aglutinação na prova cruzada, o doador não apresenta antígenos eritrocitários
que interajam com o anticorpo irregular produzido pelo paciente. No entanto, é preciso
realizar testes adicionais para descobrir qual anticorpo irregular o paciente desenvolveu.
DIAGNÓSTICOS SOROLÓGICOS
Os métodos sorológicos são desenvolvidos a partir do reconhecimento antígeno-
anticorpo. Os antígenos são qualquer molécula estranha ao organismo, como
fungos, bactérias, vírus e protozoários, que estimulam a produção de
imunoglobulinas. A ligação do anticorpo ao antígeno é altamente específica e
ocorre em um sítio denominado epítopo. Assim, os testes sorológicos utilizados
para detectar a presença de um anticorpo (anti-X) são desenvolvidos
apresentando em sua composição o epítopo do antígeno específico (X), isso
garante que a reação ocorra apenas quando o soro testado apresentar o
anticorpo (anti-X) em investigação. Além de verificar a presença ou a ausência de
um determinado anticorpo, esses testes foram adaptados para detectar um
antígeno, a presença de enzimas e hormônios.
✓ Os testes sorológicos são uma ferramenta auxiliar para:
✓ Diagnosticar infecções
✓ Avaliar a compatibilidade entre doadores de sangue e de órgãos
✓ Verificar a evolução de uma doença e a soroconversão durante uma imunização
ativa (vacina) ou infecção
✓ Detectar antígenos tumorais
Contribuem para o diagnóstico de infecções causadas por patógenos difíceis de
visualizar a partir de fluidos biológicos ou alojados em uma estrutura tecidual do
hospedeiro, dispensando a necessidade de realizar exames mais invasivos, além de
derem de fácil execução, apresentam baixo custo, em alguns casos, há
possibilidade de automação e conferem resultados e diagnóstico rápidos,
possibilitando um tratamento imediato.
Classificação dos testes sorológicos: pode ser classificado apenas como avaliação
da presença de anticorpos contra um antígeno apenas como positivo ou negativo,
ou com um valor atribuído, de acordo com o método:
✓ Método qualitativo: indica a presença ou ausência de uma resposta, ou seja,
apenas classifica aquela análise como positiva ou negativa, reagente ou não
reagente, mas não é possível identificar valores mensuráveis.
✓ Método quantitativo: indica a quantidade de antígenos, ou anticorpos, que pode
ser expressa das seguintes maneiras:
• No formato de cruzes (positivo +/++++; ++/++++; +++/++++; ++++/++++, onde 4
“+” indicam o máximo de positividade do método)
• Titulações (1:2, 1:4, 1:8; 1:16, dentre outros)
• Densidades ópticas de reações colorimétricas
• Unidades de medidas (UI/mL, % e mg/ mL) que apresentem o valor absoluto do
analito
VDRL: é solicitado para a determinação da titulação de anticorpos, realizado de
maneira qualitativa (detecta a presença ou ausência da doença, como uma triagem)
ou quantitativa, que determina o título do anticorpo, uma ferramenta essencial
para acompanhar a eficiência do tratamento. No VDRL quantitativo, a presença
de floculação a partir da diluição 1:4 indica que a doença está ativa.
A titulação é mensurada através de diluição seriada o soro em análise é diluído
diversas vezes (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64....) e é verificado até que na diluição
ocorre a reação. O título do anticorpo é dado pela última diluição que apresentou
reação, onde teve a floculação. Quanto maior for a diluição em que é observada a
reação (soros mais diluídos), maior a quantidade de anticorpos, ou seja, o título.
Exemplos de testes diagnósticos quantitativos:
✓ VDRL quantitativo;
✓ Ensaios imunocromatográficos;
✓ Imunofluorescência;
✓ ELISA para detecção de anticorpos IgM e IgG de diferentes tipos de vírus e
detecção de antígenos;
Importância do diagnóstico individual: os métodos sorológicos na pesquisa de
anticorpos, ou antígenos, são empregados para tentar conhecer o agente
causador de uma infecção, auxiliando no diagnóstico de uma suspeita clínica
principal. Os indivíduos podem ter respostas diferentes frente ao mesmo invasor,
variando a sintomatologia, o perfil e a quantidade de anticorpos produzidos. Um
exemplo dessa situação é a infecção pelo novo coronavírus, que apresenta
pacientes sintomáticos leves, graves, com perfis e quantidade de produção de
anticorpos diferentes. Além disso, esses exames ajudam a entender os processos
patológicos com sinais e sintomas clínicos confundíveis. Esses exames também
contribuem na:
• Diferenciação da fase de uma doença
• Avaliação de prognóstico e eficácia terapêutica
• Definição e seleção de doadores de órgãos e sangue
• Investigação da imunidade contra um antígeno específico após o contato ou uma
campanha de vacinação
DIAGNÓSTICOS SOROLÓGICOS
Processo de soroconversão: é o termo dado para indicar que um organismo
produziu anticorpos após o contato com um antígeno. Durante uma resposta
imunológica, o contato com um antígeno geralmente induz a produção de
anticorpos, mas a detecção destes pelos métodos sorológicos disponíveis pode
demorar semanas ou até meses. O período entre a produção e a detecção dos
anticorpos pelos métodos é chamado de janela imunológica, janela sorológica ou
janela de soroconversão. Nesse intervalo, mesmo que um paciente esteja
infectado, a pesquisa de anticorpos será negativa.
Durante a investigação diagnóstica, um paciente sintomático ou assintomático
para determinada doença, pode apresentar níveis de anticorpos detectáveis, ou
não detectáveis. Dizemos que houve um processo de soroconversão quando o
resultado de um primeiro teste sorológico para a detecção de anticorpos contra
um antígeno hipotético X for negativo e ode um segundo exame, feito algum tempo
depois, for positivo.
HIV: após a infecção pelo HIV, ocorre intensa replicação viral. Nas primeiras 3
semanas, fase em que ocorre a disseminação do vírus pelo corpo com
contaminação dos órgãos linfoides, podem aparecer sintomas relacionados a uma
síndrome retroviral aguda, como: febre, adenopatia, faringite, mialgia, exantema,
náuseas, vômitos, sudorese, dentre outros, sintomas caraterísticos de uma gripe.
Em seguida, ocorre a fase de latência, que pode durar semanas, meses ou anos.
Nessa fase, o exame clínico e laboratorial passa a ser normal e a pessoa não tem
mais sintomas. Com o passar dos anos, à medida que a infecção progride e os
sintomas passam a ser mais frequentes, começam a surgir as infecções
oportunistas. É apenas nessa fase que o paciente percebe que está infectado.
O organismo começa a produzir anticorpos anti-HIV entre 30-60 dias após a
infecção. Os primeiros testes sorológicos desenvolvidos para confirmação
sorológica do HIV (primeira geração) apenas conseguiam detectar a presença dos
anticorpos anti-HIV após 6 meses da infecção. Atualmente, a confirmação
sorológica depende do tipo de imunoensaio utilizado, nos ensaios de ELISA (de
quarta geração) mais modernos são capazes de detectar a presença de antígenos
e anticorpos ao mesmo tempo, a janela imunológica é de aproximadamente 15 dias.
A evolução na concentração plasmática dos marcadores da infecção pelo HIV, o
anticorpo IgM apresenta um pico após 4 semanas da infecção (30 dias), diferente
do RNA viral, que é visto nas primeiras semanas e pode ser detectado através de
técnicas moleculares.
Fase clínica e prognóstico da doença: pode apresentar diferentes fases e graus
de acometimento, desde manifestações leves ou até mesmo graves, e pode evoluir
para cura ou cronicidade:
• Fase inicial: ainda não há doença, mas existe o risco de adoecer
• Fase pré-clínica: apresenta doença, mas sem sintomas; há alterações
patológicas
• Fase clínica: a doença apresenta graus de acometimento avançados;
• Fase de incapacidade residual: doença progride para a morte ou as alterações
se estabilizam
DIAGNÓSTICOS SOROLÓGICOS
Marcador solológico: termo utilizado no diagnóstico laboratorial para detecção de
os anticorpos ou antígenos que possibilitam o diagnóstico de uma patologia ou
infecção.
Dengue: na sorologia para dengue são utilizados os marcadores sorológicos: os
anticorpos IgM e IgG e a identificação precoce de um antígeno NS1, que
corresponde a uma proteína não estrutural do vírus e está presente nos 4
sorotipos diferentes do vírus.
Infecções por parasitas: em casos em que IgM e IgG não podem ser detectados, é
necessária a pesquisa de outras imunoglobulinas, como da IgA e IgE para melhor
detecção em infecções por protozoários e helmintos. Essas imunoglobulinas
possuem vida média na circulação menor do que o IgM, como no diagnóstico de
toxoplasmose, doença causada pelo Toxoplasma gondii (um protozoário), que é
realizado por métodos sorológicos. Um resultado de IgM positivo ou negativo não
afasta a possibilidade de a doença estar na fase aguda, uma vez que os anticorpos
do tipo IgM aparecem nas 2 primeiras semanas após a infecção, e podem manter-
se elevado durante anos. O IgG demora de 1 a 2 meses para ser detectado após a
infecção, mas permanece alto e estável durante anos.
Teste de avidez de anticorpos do tipo IgG: esse teste mede a capacidade de
interação entre o anticorpo com o antígeno e possibilita inferir sobre as respostas
agudas e crônicas, pois uma resposta imunológica primária é caracterizada por
uma baixa avidez e na resposta crônica a avidez encontra-se mais alta.
Variáveis fundamentais para entender a ação de um agente infeccioso sobre uma
população:
• Sobrevida: Quantidade de pacientes que sobrevivem à doença
• Letalidade: Quantidade de pacientes que vêm a óbito em uma população
• Mortalidade/doença específica: É a análise dos marcadores sorológicos de
uma doença e o percentual de óbitos causados por ela
• Remissão: Fase da doença em que não são encontrados sintomas clínicos,
porém não é possível afirmar a cura do paciente, pois ainda são detectados
marcadores sorológicos
• Recorrência: Doença que, a princípio, estava curada, mas depois de um tempo,
os sinais e sintomas clínicos e os marcadores sorológicos reaparecem
• Prognóstico: analise de uma população por um mesmo período, iniciado a partir
de um ponto chamado de tempo zero, que possibilita a verificação, o
desenvolvimento e o tempo de aparecimento dos sintomas de uma determinada
doença.
Rastreio imunológico:
➢ A imunoglobulina IgM é a primeira a ser produzida após um estímulo imunogênico,
aumentando significativamente seus níveis plasmáticos durante a fase aguda da
doença. A detecção de IgM na corrente sanguínea é um indicativo de infecção
recente, mas essa imunoglobulina pode permanecer de 3-6 meses no organismo.
➢ Ao longo da infecção e do prognóstico da doença, ocorre a diminuição da
concentração plasmática de IgM e o aumento da produção e detecção da
imunoglobulina do tipo IgG, encontrada no final de um processo agudo,
permanecendo com níveis plasmáticos elevados durante longos períodos na fase
denominada crônica e após a cura da doença. Essa imunoglobulina é associada à
memória imunológica e pode permanecer elevada durante a vida toda
DIAGNÓSTICOS SOROLÓGICOS
Rejeição à enxertos:
• Rejeição hiperaguda: ocorre minutos ou dias após o transplante, é causada pela
ação de anticorpos IgM contra antígenos do sistema ABO, HLA ou antígenos
expressos no endotélio vascular.
• Rejeição aguda: ocorre poucos dias ou semanas após o transplante, é mediada
pelas células T e pelos anticorpos que respondem especialmente ao MHC.
• Rejeição crônica: ocorre seis meses a um ano após o transplante através da
imunidade celular e humoral adquirida, que cria respostas contra o enxerto.
Aplicabilidade dos testes imunológicos realizados na seleção de doadores e
receptores de sangue e órgãos:
• Tipagem sanguínea (ABO):Teste utilizado para identificar tipo sanguíneo e
fator Rh
• Reatividade contra painel (PRA): utilizado para avaliar status imunológico do
paciente, detecção de moléculas HLA reconhecida pelo paciente.
• Prova cruzada: verifica se o sangue do doador apresenta incompatibilidade
com o receptor
• Tipagem de tecidos: Detecta compatibilidade entre o HLA do doador e do
receptor.
Diagnóstico coletivo: Os exames sorológicos, quando aplicados ao coletivo,
permitem analisar a situação imunológica em uma população e geram dados
epidemiológicos importantes, pois avaliam a população em meio a infecções
endêmicas, como dengue, zika, HIV, sífilis, dentre outros. A avaliação coletiva é
importante em grandes surtos, pois possibilita uma fotografia do panorama da
infecção na população e auxilia no acompanhamento, desenvolvimento de medidas
de saúde pública, políticas e socioeconômica de combate ao surto.
➢ Soroprevalência: refere-se ao número de pessoas que apresentam anticorpos
detectáveis contra um agente infeccioso, ou seja, a reação de soropositividade
desenvolvida a partir da soroconversão.
➢ Soroepidemiologia: acompanha os pacientes, através dos exames de
diagnóstico, que apresentaram marcadores sorológicos (anticorpos) contra
algum microrganismo, associando esses dados aos fatores sociais, ambientais e
econômicos; assim, é possível estudar as melhores estratégias para a saúde
pública da população.
Eficácia terapêutica: é a eficiência na produção de anticorpos protetores após uma
infecção ou vacinação (imunização ativa, quando é oferecido ao organismo um vírus
morto, ou atenuado, para estimular a produção de anticorpos do tipo IgG de
memória)
Métodos de avaliação da eficácia terapêutica:
✓ Ausência dos sintomas e pela presença de níveis séricos de IgG e níveis não
detectáveis de IgM.
✓ Exame quantitativo de VDRL, no qual a queda do título de anticorpos produzidos
em contato com a bactéria indica que o tratamento está funcionando.
✓ Dosagem de anticorpos IgG depois de pelo menos 1 mês da vacinação ou após
anos, avaliando a necessidadede uma segunda dose.
Os estudos clínicos para a liberação da vacina, normalmente, refazem a sorologia 
dos participantes de pesquisa após 10 anos do primeiro esquema de vacinação para 
verificar se os indivíduos permanecem protegidos ao longo desses anos e se é 
necessária uma nova dose.
Sorologia na gestação: durante o pré-natal, as mulheres são submetidas a
diferentes exames sorológicos, realizando a dosagem de IgM e IgG para a rubéola,
toxoplasmose, hepatite B, sífilis e tétano. A partir desses exames, é possível avaliar
se a gestante está protegida, pois apresenta a memória imunológica (detecta IgG),
ou se contraiu alguma doença durante a gestação, pela detecção do IgM.
Diagnóstico sorológico na seleção de doadores e receptores de sangue e órgãos:
Para saber se uma pessoa pode ser transplantada ou transfundida, são realizados
exames sorológicos para detecção de doenças infectocontagiosas e a prova de
compatibilidade, que pesquisa a presença de antígenos do doador que interagem com
anticorpos do receptor. Os doadores e receptores de órgãos precisam apresentar
características biológicas similares, buscando a diminuição ou neutralização da
rejeição do órgão/tecido transplantado. Os antígenos responsáveis pela rejeição
dos transplantes são denominados aloantígenos, que são conhecidos como antígenos
de histocompatibilidade e se dividem em:
✓ Complexo de Histocompatibilidade Principal (MHC) I: encontrado em todas as
células nucleadas
✓ Complexo de Histocompatibilidade Principal (MHC) II: constitui células
apresentadoras de antígeno como macrófagos, células dendríticas e linfócitos.
MÉTODOS DE CONTROLE DE QUALIDADE
Avaliação dos métodos sorológicos: depende da ausência de desvios na análise
(validade ou acurácia do método) e da precisão dos resultados. Desse modo, os
métodos de diagnósticos têm que ser avaliados quanto à reprodutibilidade e à
acurácia.
Reprodutibilidade: representa a capacidade dos métodos de produzir resultados
iguais, mesmo em condições distintas de análises, sendo precisos e confiáveis. Um
teste sorológico é de alta reprodutibilidade quando, após análises repetidas em
uma mesma amostra ou amostras provenientes de um mesmo paciente, são
encontrados resultados similares.
Erros aleatórios: durante a avaliação de um método, se este não apresentar
reprodutibilidade de resultados, seu valor e sua utilidade para implementação
como teste de diagnóstico são mínimos. Os erros aleatórios são inerentes ao
observador e às variações entre os sujeitos.
• Variação entre os sujeitos individualmente: a verificação de uma determinada
análise em um mesmo indivíduo pode variar ao longo dia, dependendo da condição
em que é medida, resultando em resultados distintos. Exemplo: Depois de uma
atividade física, a pressão arterial será diferente da medida quando o paciente
está em repouso.
• Variação na interpretação de um mesmo exame realizado em momentos
diferentes. Exemplo: Ao realizar a leitura de uma lâmina em dois momentos
diferentes, podemos encontrar resultados diversos.
• Variação na interpretação entre dois técnicos, ou seja, dois observadores podem
interpretar um resultado de modo diferente.
Acurácia: é a sua capacidade de fornecer resultados verdadeiros, ou seja, quanto
aquele método é útil para predizer ou diagnosticar um evento que se propôs de
maneira qualitativa ou quantitativa. Para determinar a acurácia de um método,
deve-se comparar o resultado do teste com os resultados de um padrão, que pode
ser a clínica do paciente, exames disponíveis ou um ensaio que possa servir como
referência (considerado padrão-ouro).
Não podemos confundir acurácia de um teste com reprodutibilidade. A precisão 
indica a reprodutibilidade de um método; já a exatidão aponta o quanto esse 
método apresenta resultados verdadeiros. 
Para garantir a eficácia dos testes sorológicos é necessário avaliar uma série de
parâmetros e controles para garantir que o resultado encontrado seja verdadeiro,
seja de qualidade e expresse a realidade do indivíduo, diminuindo as chances de
resultados e diagnósticos falhos. Para isso, durante a padronização de um teste
sorológico, são analisados diferentes parâmetros (reprodutibilidade, acurácia,
sensibilidade, especificidade, eficiência, valor preditivo positivo, valor preditivo
negativo e razão de verossimilhança) que controlam a qualidade do resultado que é
fornecido pelo teste.
Principais aspectos em laboratório de imunologia que garantam um controle da
qualidade das análises e uma padronização dos métodos:
Banco de soros: é a organização e armazenamento dos soros, seja para uma
possível retestagem, seja devido ao seu potencial terapêutico (medicamento), eles
são guardados em um banco, uma espécie de biblioteca, também conhecida como
sorotecas. Essa organização facilita o rápido levantamento dos soros testados em
uma rotina laboratorial e garantem a rastreabilidade dos resultados encontrados.
Bibliotecas (coleção catalogada de soros): são utilizadas para armazenar amostras
representativas de uma população e assim preservar as características
imunológicas. Quando os soros são armazenados com essa finalidade, é necessário a
permissão do comitê de ética.
São separados pelo tipo de agente infeccioso que se deseja investigar. Os tubos
armazenados apresentam a identificação do paciente (nome completo ou iniciais e/ou
o número do exame laboratorial), data da coleta da amostra e tipo de microrganismos
investigados. Essas amostras então são acondicionadas em tubos por um período de
5 a 10 anos e mantidas em congelamento (-20 °C) até serem utilizadas e/ou
descartadas futuramente. No caso de um laboratório de pesquisa, esses soros ficam
separados de acordo com suas similaridades e podem ser importantes para estudos
futuros, devendo ficar armazenados a uma temperatura de -80 °C.
Bancos de sangue: segundo a Resolução da diretoria colegiada (RDC N°34/ 2014),
os bancos de sangue devem armazenar a plasmateca, ou soroteca, dos doadores por
pelo menos 6 meses na temperatura de -20 °C. No entanto, em alguns banco de
sangues, esse armazenamento é feito por mais de 5 anos, para que, caso um paciente
receba um componente sanguíneo negativo para todas as doenças
infectocontagiosas e, depois de alguns meses da transfusão, apresente exame
sorológico positivo para HIV, por exemplo, ou caso haja qualquer dúvida nos
resultados sorológicos, o doador deverá ser encontrado e novos exames deverão
ser realizados com o soro armazenado na plasmateca e com a amostra atual, a fim de
verificar se a contaminação foi através da transfusão.
MÉTODOS DE CONTROLE DE QUALIDADE
Teste sorológico considerado ideal para uma análise: deve fornecer a resposta
correta, ser rápido, seguro, simples, inócuo, confiável e de baixo custo. Os
resultados possíveis encontrados durante uma validação de um novo teste são:
✓ Resultado verdadeiramente positivo: quando não há dúvidas da positividade do
teste;
✓ Resultados falso positivo: quando o teste é positivo, mas o paciente não
apresenta a infecção
✓ Resultado verdadeiramente negativo: quando não há dúvida da negatividade do
teste
✓ Resultado falso negativo: quando, apesar de o teste ser negativo, o paciente
apresenta infecção
Durante a validação de um novo teste sorológico, deve se relacioná-lo ao teste
considerado padrão-ouro
A validação de um teste rápido novo para a detecção de anticorpos para a dengue do
tipo IgM e IgG, deve, além de realizar o teste sorológico, ser comparado com o
padrão-ouro preconizado, que seria a detecção de antígenos virais (NS1)
observados logo no início da infecção, ou então compará-lo com o resultado de um
exame sorológico já validado, verificando a acurácia e a reprodutibilidade do teste
novo com o padrão. No caso da dengue, um teste rápido para identificar o antígeno
NS1 pode ser comparado com a detecção molecular da partícula viral.
Teste rápido: é um ensaio imunocromático qualitativo que detecta anticorpos:
Etapa 1: Uma amostra é depositada em uma área pré-determinada, que está
impregnada com um anticorpo (A) complexado ao ouro coloidal.A presença do
antígeno na amostra possibilita a ligação com o anticorpo complexado ao ouro (A) e
posterior migração por capilaridade pela fita teste de nitrocelulose.
Etapa 2: Ao migrar, o anticorpo A vai se complexar, tanto com o anticorpo B
(reconhece o antígeno), quanto com o anticorpo C (reconhece o anticorpo A),
gerando uma cor e formando assim 2 bandas coloridas (teste positivo).
Etapa 3: Caso não haja o antígeno na amostra, não teremos a ligação de nenhum
antígeno com os anticorpos A e B, mas teremos a ligação do anticorpo A com o
anticorpo C, resultando em apenas 1 banda (resultado negativo).
Resultados esperados durante a validação de testes sorológicos novos em comparação a 
um teste de referência (padrão-ouro).
Parâmetros para avaliar o desempenho do método:
• Eficiência do teste: capacidade do teste detectar os pacientes que
apresentam ou não a doença, ou seja, quantos indivíduos são
verdadeiramente positivos e negativos dentro de uma população total.
Mede quanto o teste apresenta resultados fidedignos.
MÉTODOS DE CONTROLE DE QUALIDADE
Exemplo - Um exame sorológico para verificar a presença de anticorpos IgM
contra o COVID-19 foi realizado em 1000 indivíduos, onde foram detectados
100 testes positivos e 900 negativos.
Um teste de diagnóstico ideal deve ter alta sensibilidade (evitar falso negativo) e
alta especificidade (evitar resultados falso positivo). Os problemas encontrados
durante a avaliação da sensibilidade ou especificidade de um teste estão
relacionados a erros sistemáticos inerentes aos métodos. Os erros sistemáticos
podem ser:
• Pré-analíticos: Correspondem a toda fase anterior à análise e à chegada ao
laboratório. Exemplos: problemas na coleta, no transporte, no armazenamento,
na conservação e nas características da amostra (hemólise, lipídico,
contaminado).
• Analíticos: Correspondem à análise em si, a erros de pipetagem, nos
equipamentos (manutenção e calibração), nos reagentes disponíveis (validade,
contaminação, diluição).
• Pós-analíticos: Correspondem a erros na interpretação dos resultados.
Exemplo: erros de cálculos, interpretação e transcrição.
Parâmetros de valores de predição (VP): indicam a probabilidade de um
determinado paciente que apresentar diagnóstico positivo ou negativo esteja
verdadeiramente doente ou sadio. O VP é dividido em valor preditivo positivo e
valor preditivo negativo.
• VPP: Indica a probabilidade de um doente ter efetivamente a doença. Das 275
pessoas positivas, 210 estavam realmente doentes, assim, temos que: VPP =
210/275 = 0,76
• VPN: Indica a probabilidade de uma pessoa sadia não ter a doença, das 225
pessoas com resultado negativo, apenas 200 estavam sem a doença: então
200/225 =0,89
• Sensibilidade: Indica quanto um teste consegue determinar em um grupo
de indivíduos aqueles que realmente se encontram verdadeiramente
positivos.
Os casos com resultado falso negativo são interpretados como uma falha 
na sensibilidade do ensaio. Um teste altamente sensível, dificilmente, deixa 
de encontrar pessoas doentes e, por isso, é usado para a triagem de uma 
doença nas rotinas laboratoriais. 
• Especificidade: indica quanto o teste consegue determinar em um grupo
de indivíduos aqueles que não estão doentes, os verdadeiramente
negativos.
Quanto maior a especificidade, menor a taxa de falso positivo, e menos 
pessoas estarão expostas a tratamentos indevidos. Um teste altamente 
específico, dificilmente, classificará indivíduos sadios como doentes, por 
isso, é usado nos testes confirmatórios de uma doença.
Exemplo – Triagem sorológica para HIV: é realizada a partir de exames
com alta sensibilidade. Todos os exames positivos são confirmados com
testes altamente específicos, como o Western blot (técnica que detecta
proteínas em amostras após a eletroforese, transferência para uma
membrana de nitrocelulose, e o reconhecimento do antígeno e do
anticorpo).
Possibilidade 1: Digamos que um
teste apresente sensibilidade de
80% e foram encontradas 100
pessoas positivas. Concluímos dos
100 pacientes positivos, 80 são
de fato positivos e 20 são falso
negativos, ou seja, estão doentes
e não são detectados no exame.
Possibilidade 2: Digamos que um
teste apresente 80% de
especificidade e encontre 900
pacientes não infectados.
Concluímos que, dos 900 pacientes,
720 são negativos e 180 são falso
positivos, ou seja, são positivos no
teste, mas não estão infectados.
x
MÉTODOS DE CONTROLE DE QUALIDADE
Quanto maior o valor do preditivo positivo, maior é a prevalência da doença em 
uma determinada população. 
Verificação do desempenho de um teste: pode ser calculado pela razão de
verossimilhança. Esse parâmetro indica quantas vezes é possível a detecção de
um teste positivo ou negativo e é muito utilizado nas análises de pré-testes,
quando queremos estabelecer um novo método de diagnóstico. Essa medida pode
ser positiva ou negativa. Quando os dados são avaliados em sensibilidade, essa
medida pode ser calculada a partir desses dois parâmetros.
Razão de verossimilhança positiva 
(RV +) Verifica quantas vezes é 
mais provável encontrar um 
resultado positivo em pessoas 
doentes quando comparadas com 
não doentes. Quanto maior a RV 
+, melhor é o teste. Calculado 
como: 
Razão de verossimilhança negativa 
(RV -) Verifica quantas vezes é mais 
provável encontrar um resultado 
negativo em pessoas doentes, 
quando comparadas com não 
doentes. x
MÉTODOS LABORATORIAIS IMUNOLÓGICOS COM REAGENTES NÃO MARCADOS
Os métodos laboratoriais imunológicos que utilizam imunorreagentes livres de
marcação são técnicas que possibilitam uma interação antígeno e anticorpo,
promovendo aglutinação pelo reconhecimento de anticorpos com antígenos solúveis
e a formação de precipitados insolúveis.
De modo diferente, quando o antígeno está ligado à superfície celular, o resultado da
interação com o anticorpo pode ser a lise celular.
Dentre as técnicas imunológicas com reagentes não marcados, destacam-se:
• Reações de precipitação: são técnicas que consistem no reconhecimento de
antígenos solúveis com seus anticorpos complementares que também estão em
solução, originando um agregado que não se solubiliza e é visível pela formação
dos imunocomplexos (complexos formados de imunoglobulina que se liga a
antígenos solúveis. Para que a reação de precipitação seja visível, um fator
determinante é a concentração de antígeno e anticorpo presentes. Quando as
concentrações dessas duas moléculas são equivalentes, ocorre uma precipitação
máxima e, assim, é possível visualizar a precipitação. Chamamos esse fenômeno
de zona de equivalência. De forma diferente, quando existe excesso de antígeno
ou anticorpo, a interação diminui e a formação de precipitado também, gerando
resultados falso-negativos. Quando temos excesso de anticorpos, ocorrem
reações que não são visíveis a olho nu, esse fenômeno é chamado de prozona.
Interação entre antígeno e anticorpo, resultando em aglutinação. Excesso de 
anticorpos, o que 
resulta em 
precipitados pequenos 
que não são visíveis a 
olho nu, efeito 
prozona. 
Zona de 
equivalência, com 
concentrações de 
antígeno e anticorpo 
equivalentes e 
precipitação máxima 
e visível. 
Excesso de antígeno 
também gera 
precipitados 
pequenos, não 
visíveis a olho nu, 
efeito pós-zona. 
Nas reações de precipitação, para verificar a interação antígeno e anticorpo,
são utilizados diferentes meios reacionais, como, por exemplo, o meio líquido ou
semissólido. Quando realizadas em meio semissólido, essas reações são
dividias em imunodifusão e imunoeletroforese. As principais vantagens dessa
técnica são rapidez, fácil execução, baixo custo, podem ser testadas diferentes
amostras e boa especificidade. No entanto, elas apresentam uma baixa
sensibilidade.
MÉTODOS LABORATORIAIS IMUNOLÓGICOS COM REAGENTES NÃO MARCADOS
Reação de precipitação em meio líquido, técnica de precipitina e/ou do anel: A
precipitação ocorre em tubos de ensaio ou em capilares e visa pesquisar a presença
de antígenos. Para isso, os tubos apresentam uma solução de anticorpos já
conhecida,também chamada de soro hiperimune e nele, cuidadosamente, é adicionado
uma amostra, para formar duas fases: uma inferior, com o soro hiperimune, e outra
superior, com a amostra. Se o antígeno pesquisado estiver presente na amostra,
este migrará em direção ao soro, formando um gradiente de concentração. Quando
ocorrer a interação antígeno e anticorpo e esta estiver na zona de equivalência, é
possível verificar a formação de um precipitado visível. Tal técnica é mais utilizada
em laboratórios de pesquisa.
Imunodifusão: consiste na migração de antígenos solúveis em uma matriz gelatinosa
(ágar ou um gel de agarose) que contém um anticorpo em sua composição. É
importante ressaltar que algumas técnicas podem pesquisar anticorpos solúveis em
uma matriz que apresente o antígeno correspondente. Quando as moléculas estão
livres, a difusão permanece constante, mas, quando ocorre a interação de antígenos
solúveis com os anticorpos, o precipitado formado fica preso no gel de acordo com o
peso molecular desse complexo e assim, podem ser visualizados.
Esquema de reações de precipitação em meio líquido. . 
Parâmetros para imunodifusão:
✓ Concentração;
✓ Pureza e tamanho dos poros do gel;
✓ Concentração dos antígenos e anticorpos;
✓ Tempo de difusão;
✓ Temperatura; especificidade e avidez da interação antígeno e anticorpo.
• Imunodifusão simples ou imunodifusão unidirecional em meio semissólido:
Quando um dos componentes (Ag ou Ac) fica fixado ao gel, enquanto o
outro vai migrando até que se forme os imunocomplexos. O antígeno é
colocado sobreposto a uma coluna de ágar, contendo o soro hiperimune. As
moléculas do antígeno irão penetrar no ágar e se difundirem com uma
velocidade diferente para cada substância, dependendo do peso molecular.
Após o tempo de incubação de normalmente uma semana, será possível
observar o que chamamos de disco (banda) ou zona de precipitação
Imunodifusão dupla ou imunodifusão de Ouchterlony: Quando o antígeno e o
anticorpo migram ao mesmo tempo, um em direção ao outro para a formação
do imunocomplexos. Esse teste é realizado em uma lâmina de vidro ou placa de
Petri, que é coberta por uma camada fina de gel, com dois orifícios, onde em
um é colocado o antígeno e no outro o anticorpo, caso haja formação de
imunocomplexos, há o aparecimento de bandas ou linhas de precipitação. Essa
é uma técnica semiqualitativa, que pode ser utilizada para o diagnóstico de
doenças infectocontagiosas, como candidíase, histoplasmose e aspergilose.
Após a imunodifusão, podemos utilizar um corante para marcar as proteínas, a
fim de visualizar melhor as linhas de precipitação. A utilização desses
corantes é preconizada quando temos uma baixa concentração de antígenos e
anticorpos, o que torna as bandas não visíveis.
MÉTODOS LABORATORIAIS IMUNOLÓGICOS COM REAGENTES NÃO MARCADOS
Imunodifusão radial simples (imunodifusão de MANCINI): Quando o movimento do
antígeno ocorre em todas as direções em um meio semissólido. Para isso, uma lâmina
de vidro ou uma placa de Petri é coberta com um gel impregnado de anticorpo
distribuído uniformemente, em seguida, as amostras em investigação são colocadas
em pequenos orifícios. Os antígenos presentes na amostra irão se difundir de forma
radial e, à medida que vão encontrando os anticorpos, há formação de
imunocomplexos e de um halo de precipitação ao redor do orifício (na forma de anel).
Quanto maior a concentração do antígeno, maior é o tamanho do halo.
Além das amostras testes, nessa técnica, são utilizadas soluções padrões com
concentrações conhecidas de antígenos. A partir do tamanho dos halos de
precipitação obtidos com os antígenos controles (padrão), podemos originar uma
curva padrão e descobrir a concentração de antígenos presentes em amostras de
soros de pacientes, possibilitando uma análise quantitativa. Essa técnica pode ser
utilizada para quantificação de proteínas, como:
✓ Imunoglobulinas
✓ Proteínas séricas
✓ Fatores do complemento
✓ Proteínas de fase aguda (PCR)
Imunodifusão dupla. Imunoeletroforese (método de Grabar e Williams): é uma técnica de
imunopreciptação em meio semissólido (gel) que associa as técnicas de
imunodifusão e a eletroforese. Como vimos, a imunodifusão verificará a difusão
do antígeno (ou anticorpo) sobre uma superfície gelatinosa composta de
anticorpos (ou antígeno) e a formação de zona de precipitação, indicando o
reconhecimento antígeno-anticorpo.
Imunodifusão radial.
MÉTODOS LABORATORIAIS IMUNOLÓGICOS COM REAGENTES NÃO MARCADOS
A eletroforese é uma técnica que consiste na migração e separação de moléculas de
acordo com a carga após a geração de um campo elétrico. Ela utiliza diferentes
meios de suporte, como fitas ou membranas de poliacetato de celulose e géis de
agarose.
No nosso organismo, diversas moléculas, como proteínas, aminoácidos, polipeptídios,
nucleotídeos e ácido nucleico, apresentam grupos funcionais ionizáveis que adquirem
cargas (positiva ou negativa) em um determinado pH. Assim, quando um campo
elétrico é gerado, as moléculas migrarão para o polo positivo ou negativo de acordo
com a sua carga líquida. Para verificação de proteínas, normalmente, é utilizado um
tampão com pH entre 8,2 e 8,6 e, nessa solução, as moléculas são carregadas
negativamente e migram em direção ao ânodo. As imunoglobulinas, em média, têm
pouca carga neste pH e, portanto, migram pouco desde o ponto de aplicação da
amostra (origem). Além disso, a migração também depende do tamanho e
conformação das moléculas, proteínas de alto peso molecular migram menos que as
de baixo peso molecular.
Essa técnica é amplamente utilizada para:
✓ Verificação analítica, como na avaliação de proteína sérica
✓ Análises preparatórias, ou seja, na purificação de proteína
✓ Detecção específica de enzimas e suas isoformas (por meio de sua atividade
particular)
✓ Detecção de antígenos (em combinação com uma variedade de técnicas
imunológicas)
As proteínas separadas por eletroforese podem ser fixadas e coradas com vários
tipos de corantes, como o preto de amido 10 B (azul escuro); Ponceau-S (vermelho);
Coomassie G-250 (azul claro) ou Coomassie R-250 (violeta azul).
Etapas da imunoeletroforese:
Etapa 1: Separação das proteínas. Um gel é preparado, colocado em uma cuba
de eletroforese, e o tampão é escolhido para que as partículas a serem
analisadas fiquem com as cargas negativas e migrem para o polo positivo. As
amostras a serem testadas (misturas de anticorpos ou antígenos) são
aplicadas no gel.
Etapa 2: Nesse aparato, é aplicada uma diferença de potencial, que será
responsável pela migração e separação das moléculas de acordo com a carga,
tamanho e conformação
Etapa 3: Após a corrida eletroforética, é feita a imunodifusão de cada
componente que foi separado no gel. Para isso, é cortada uma canaleta entre
os poços onde é colocado o antígeno ou anticorpo correspondente
Etapa 4: À medida que ocorre uma interação antígeno-anticorpo, vamos ter
uma linha de precipitação em forma de arco na região de equivalência. Cada
banda formada representa a formação de um complexo imune específico
Essa é uma técnica qualitativa e semiquantitativa que possibilita distinguir
substâncias de acordo com suas cargas elétricas, seus pesos moleculares,
tamanhos, sua conformação espacial, concentração e suas propriedades
antigênicas. Ela é muito empregada no diagnóstico de gamopatias monoclonais,
como o mieloma múltiplo e macroglobulinemia.
Etapa 1 Etapa 2
Etapa 3 Etapa 4
MÉTODOS LABORATORIAIS IMUNOLÓGICOS COM REAGENTES NÃO MARCADOS
O mieloma múltiplo é uma neoplasia da medula óssea que leva à proliferação das
células B e ao aumento descontrolado da produção de anticorpos monoclonais
(normalmente, do tipo IgG ou IgA) e fragmentos deles, chamados de proteína M.
Nessa doença, as proteínas monoclonais de IgM, IgA, IgD e IgE podem estar
presentes em quantidades relativamente pequenas quando comparadas à IgG. Um
resultado de imunoeletroforese que não detecta a porção da cadeia leve das
imunoglobulinas não-IgG, mostra uma alteração no padrão de produção desses
anticorpos, o que é indicativode gamopatias como o mieloma.
A partir da técnica de Grabar e Williams, outras metodologias foram desenvolvidas,
são elas:
Reação de imunoeletroforese unidimensional simples (eletroforese de foguete ou
técnica de Laurell): É uma adaptação da técnica de Graber e Williams, onde a
eletroforese e a imunodifusão ocorrem ao mesmo tempo com o deslocamento apenas
da substância que se deseja analisar. Para isso, uma pequena camada de gel
incorporada com o anticorpo ou antígeno é preparada sobre uma lâmina de vidro. As
amostras são aplicadas em poços pré-formados, o tampão é escolhido para que as
partículas a serem analisadas fiquem com as cargas negativas e migrem para o polo
positivo e esse conjunto é submetido à eletroforese. Durante a eletroforese, à
medida que a substância vai migrando a partir do orifício de aplicação, ocorre a
separação das moléculas e o reconhecimento do antígeno-anticorpo , com a
formação das linhas de precipitação em formato de cone ou foguete. Isto porque, no
início, há uma grande concentração da substância de interesse, que ao longo da
corrida eletroforética vai diminuindo até que se esgote. É importante ressaltar que,
durante a técnica, não ocorre a migração da substância que está incorporada ao gel.
Reação de imunoeletroforese dupla bidimensional (contraimunoeletroforese): Nesta
técnica, antígenos e anticorpos migram ao mesmo tempo por eletroforese, no mesmo
eixo, mas em direções opostas, resultando na precipitação no local onde ocorre o
reconhecimento antígeno e anticorpo. A reação de contraimunoeletroforese só é
possível quando antígenos e anticorpos migram em sentidos opostos durante a
eletroforese, ou seja, os anticorpos migram para o polo negativo (cátodo), enquanto
os antígenos migram para o polo positivo (ânodo). Nesse método, podemos realizar
várias análises em somente uma lâmina, é uma metodologia rápida e mais sensível que
a imunodifusão, além de poder ser realizado em membranas de acetato de celulose.
Reação de imunoeletroforese dupla bidirecional.
Reações de aglutinação: consistem na formação de um agregado visível após a
interação de anticorpos específicos com partículas insolúveis que contêm diferentes
determinantes antigênicos (local de ligação do anticorpo, ou epítopo) ligados à
superfície dessas partículas. Diferente da precipitação, onde os anticorpos e
antígenos são solúveis, nessa técnica, pelo menos uma substância deve ser insolúvel.
Partículas insolúveis: podem ser um antígeno insolúvel, antígenos expressos na
superfície das membras plasmáticas, como os antígenos presente na membrana dos
eritrocitários, ou então partículas cobertas com os antígenos (exemplo: látex).
Essa técnica apresenta alta especificidade e reprodutibilidade, é de fácil execução,
simples e barata, mas apresenta baixa sensibilidade. É amplamente utilizada para
tipagem sanguínea, provas de compatibilidade transfusional, detecção de hormônios,
detectar patógenos e no diagnóstico das doenças autoimunes. Essas reações são
divididas em: reações de aglutinação direta, indireta, reações de inibição da
aglutinação.
MÉTODOS LABORATORIAIS IMUNOLÓGICOS COM REAGENTES NÃO MARCADOS
Aglutinação direta: é a interação direta entre antígenos presentes na superfície de
uma célula com o anticorpo correspondente. Os antígenos podem estar na sua forma
integra ou fragmentada. No entanto, para ocorrer uma aglutinação visível, é
necessário que o anticorpo reconheça pelo menos dois sítios antigênicos (bivalente),
o que permite a ligação simultânea com mais de um antígeno formando interações
cruzadas e um agrupado de partículas visíveis. Exemplo: classificação sanguínea,
prova de compatibilidade, teste de Coombs direto e indireto e sorotipagem
bacteriana são exemplos dessa técnica. Quando desejamos encontrar um anticorpo
específico, devemos fazer diluições seriadas das amostras frente a uma
concentração fixa e conhecida do antígeno correspondente. Após o tempo de
incubação, o resultado é expresso como título do anticorpo, ou seja, a última diluição
em que é possível verificar a aglutinação.
Aglutinação passiva ou indireta: essa reação consiste no reconhecimento de
anticorpos presentes no soro com antígenos presentes artificialmente em partículas
inertes (látex ou gelatina) ou então hemácias, que são sensibilizadas por adsorção
passiva e desempenham uma função de suporte. Quando uma amostra de soro ou
plasma apresenta um anticorpo que reconheça os antígenos correspondentes nas
hemácias ou nas partículas inertes que formem pontes entre as partículas vizinhas,
irá ocorrer a aglutinação. Esse teste apresenta diversas aplicabilidades. Como para
a detecção do fator reumatoide.
A artrite reumatoide é uma doença autoimune que leva à inflamação crônica nas
articulações, à ativação desregulada de células B e T e à produção de
autoanticorpos, moléculas que reconhecem a região Fc das imunoglobulinas
produzidas no nosso organismo, chamado de fator reumatoide que normalmente
é uma variante de IgM. Na pesquisa do fator reumatoide, o látex é sensibilizado
com anticorpo do tipo IgM, IgG, IgM e IgA, e essa partícula é reagida com o soro
do paciente. Se o soro apresentar o fator reumatoide, teremos a aglutinação.
Reações de inibição da aglutinação: ocorre uma competição entre os antígenos
presentes na superfície de hemácias ou de partículas inertes e antígenos solúveis
pelo sítio de ligação com o anticorpo, diminuindo assim a capacidade de interação e
aglutinação. Dessa forma, a reação é positiva quando não temos aglutinação. A
competição acontece entre dois antígenos semelhantes, pelo local de ligação com
o anticorpo, ou entre dois anticorpos diferentes pela ligação ao mesmo antígeno.
A interação acontecerá entre o antígeno e o anticorpo que apresente uma reação
mais estável.
Inibição da aglutinação direta de hemácias por antígenos virais: durante uma
infecção viral, alguns vírus apresentam a capacidade de se ligar a receptores
localizados na superfície de hemácias danificadas. Assim, essa propriedade é
utilizada para a dosagem de anticorpos contra os vírus durante a evolução de uma
doença.
Um paciente com uma suspeita de infecção viral faz um exame de sangue para
confirmar a presença de anticorpos contra esse vírus. O soro desse paciente é
então diluído e colocado em contato com quantidades fixas de antígenos virais e
hemácias. Teremos uma competição da ligação dos anticorpos aos antígenos livres
e os que estão ligados a hemácias. À medida que ocorre a ligação antígeno livre e
anticorpo, a aglutinação diminui. Em seguida, verificamos qual foi a diluição que não
houve mais a aglutinação das hemácias, ou seja, a inibição da propriedade
aglutinante, e esse representa o título do anticorpo.
Reação de inibição passiva de partículas inertes (látex): ocorre pela inibição da
ligação entre antígenos ancorados na sua superfície do látex e seus anticorpos
correspondentes, quando existem anticorpos solúveis que competem inibindo a
aglutinação.
Uma paciente está com suspeita de gravidez e realiza a coleta da urina para o
teste. Normalmente, o teste de gravidez detecta o hormônio da gonodotrofina
coriônica (hHCG) em uma reação de inibição de aglutinação.
MÉTODOS LABORATORIAIS IMUNOLÓGICOS COM REAGENTES NÃO MARCADOS
A presença de hemólise indica que, na primeira etapa, não houve a formação do
imunocomplexo e a fixação do complemento, ficando as moléculas do sistema
complemento livres e capazes de interagir com o complexo hemácias-hemolisinas.
De forma diferente, a ausência de hemólise informa que houve a formação do
imunocomplexo e a fixação das moléculas do sistema complemento, ou seja, uma
reação positiva. É importante ressaltar que, nessa reação, os antígenos e
anticorpos isolados não podem ativar o sistema complemento, pois geraria
resultados falhos.
O sistema hemácia-hemolisina funciona como um sistema revelador.
Reação de fixação do complemento: é a identificação e quantificação da presença
de antígenos e anticorpos em uma amostra através da formação de
imunocomplexos e a avaliação da capacidade desses complexos em fixar econsumir as moléculas do sistema complemento in vitro.
Essa técnica é barata, simples e utilizada para o diagnóstico de alguns agentes
infecciosos como a histoplasmose e a coccidioidomicose. No entanto, esses
testes estão sendo substituídos pelos ensaios enzimáticos, que são mais sensíveis,
e são empregados apenas como testes confirmatórios. O teste é realizado em
duas etapas.
Etapa 1: Ocorre a formação dos imunocomplexos (interação antígeno e anticorpo)
e a ligação (fixação) com as moléculas do sistema complemento.
Etapa 2: As hemácias ligadas aos anticorpos antieritrócitos (hemolisinas) são
adicionadas e, após um período, observamos se ocorreu ou não a hemólise.
Esquema mostrando a reação de fixação do complemento.
MÉTODOS LABORATORIAIS IMUNOLÓGICOS COM REAGENTES MARCADOS
• Imunofluorescência direta: é utilizada para detectar antígenos em biopsias de
tecidos, como também a presença de células, bactérias, vírus, fungos e
protozoários, pelo reconhecimento de antígenos por anticorpo
correspondente que está conjugado com uma substância fluorescente, que
indica a presença de fluorescência indica que a amostra tem a substância
pesquisada. A análise por esse método costuma ser qualitativa
• Imunofluorescência indireta: é utilizado para o diagnóstico e o
acompanhamento de diferentes doenças pelo reconhecimento de diferentes
imunoglobulinas ligadas a um antígeno específico, pela utilização de anticorpo
secundário conjugado com o radical fluorescente. A principal vantagem desse
método é a diminuição dos custos, uma vez que o anticorpo secundário pode
ser empregado para o reconhecimento de qualquer anticorpo humano e
utilizado para diferentes análises. Além disso, é um método mais sensível e
específico quando comparado à imunofluorescência direta.
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Em 1941, uma equipe de pesquisadores liderados por Albert H. Coons, desejando
analisar as técnicas imunológicas com auxílio de corantes, utilizou radicais
fluorescentes, pois a coloração com os reagentes comuns conferia uma fraca
intensidade. Nessa época, já era conhecida a capacidade dos anticorpos de ligar-
se aos radicais químicos sem alterar sua conformação e capacidade de interagir
com os antígenos. Foi desenvolvido assim o teste de imunofluorescência.
Luminescência: capacidade de algumas substâncias em armazenar energia
luminosa e liberá-la depois.
Fosforescência: quando a substância consegue armazenar energia luminosa por
longos períodos até a sua emissão.
Fluorescência: quando a substância armazena energia luminosa por curto período
até sua emissão.
Corantes fluorescentes mais utilizados: rodamina e a fluoresceína.
Após a coloração, essas amostras podem ser analisadas:
A imunofluorescência representa um grande avanço na imunologia clínica, pois
permitiu a detecção de substâncias de forma direta, mesmo que em pequenas
concentrações, e utilizando pequenas quantidades de corantes fluorescentes, uma
vez que esses corantes emitem grande quantidade de energia. Antes, a detecção
de um antígeno ou anticorpo era realizado através de Reações secundárias, ou
seja, após a formação de um imunocomplexo, sendo necessária grandes
quantidades de antígenos e anticorpos para sua visualização.
A partir dessa técnica, diferentes métodos foram descritos, como a
imunoflorescência direta e indireta.
Teste de imunofluorescência. Em (A) e (B) fotos de células marcadas pela 
imunofluorescência. 
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA-ENZYME LINKED IMMUNOSORBET ASSAY)
Vantagens e desvantagens: o método de ELISA, quando realizado em condições
excelentes (enzimas ativas, antígenos puros e anticorpo conjugado), é capaz de
apresentar uma sensibilidade muito similar à do radioimunoensaio, porém com
vantagem de não se utilizar elementos radioativos. Ele consegue detectar
quantidades muito pequenas de antígenos ou anticorpos. No entanto, alguns
reagentes utilizados são teratogênicos e podem ter interferentes de enzimas
endógenas quando utilizadas como antígenos células inteiras e íntegras.
ELISA direto: método utilizado para pesquisar a presença de antígenos. É
empregado em testes imuno-histoquímicos, que buscam em amostra de tecidos
obtidas por biopsias detectar proteínas, enzimas, receptores, alterações celulares
etc. Para isso, o tecido ou amostra (com os antígenos pesquisados) é fixado a uma
superfície e, em seguida, é adicionado um anticorpo conjugado com uma enzima
(anticorpos primários) correspondente ao antígeno que investigamos. Quando
temos a presença do antígeno, há o reconhecimento com o anticorpo-conjugado
e, ao adicionar o substrato da enzima, teremos uma coloração.
Em 1971, foi introduzido pelos pesquisadores Van Weermen e Schurs e Engvall e
Perlmann o método imunoenzimático para detecção e quantificação de antígenos
e anticorpos específicos. Esses pesquisadores verificaram que a interação
antígeno e anticorpo poderia ser detectada e quantificada utilizando como
substância reveladora um conjunto enzima-substrato, que, na presença de uma
espécie doadora de elétrons (cromógeno), forma produtos coloridos. Além disso,
observaram que as proteínas poderiam ser imobilizadas em superfícies sólidas
como a de poliestireno. Essa foi a base para o desenvolvimento dessa técnica.
Método de ELISA: é capaz de detectar antígenos ou anticorpos. Ele é realizado
em placas plásticas de 96 poços (placas de microdiluições) formadas de
poliestireno e que seguem uma sequência de procedimentos:
Etapa 1: Inicialmente, a placa é previamente sensibilizada com a substância
(antígeno e anticorpo) específica que é complementar à molécula que desejamos
identificar.
Etapa 2: Após a sensibilização, nem todos os espaços da placa são cobertos,
restando alguns espaços vazios que podem ser ocupados por qualquer outra
molécula gerando ligações inespecíficas e resultados falso positivos. Assim, é
feito um bloqueio com soro albumina bovina (BSA), a ovalbumina, a caseína ou um
complexo proteico, como o soro de cobaia dos espaços vazios da placa.
Etapa 3: Durante a execução do método, são realizadas várias lavagens (manual,
por meio automático ou por um sistema a vácuo) importantes para a retirada dos
excessos de reagentes que não estão ligados a nenhuma molécula, impedindo
assim qualquer tipo de ligação cruzada e interferências.
Etapa 4: é utilizada antígenos conjugados com enzimas e anticorpos ou anti-
anticorpos conjugados com enzimas. As enzimas mais empregadas são a fosfatase
alcalina e peroxidase. Para revelar e verificar se ocorreu interação antígeno-
anticorpo conjugado com a enzima é oferecido o substrato dessa enzima e um
componente doador de elétrons (cromógeno). Quando há interação, a enzima
quebra o substrato e o produto formado atua no cromógeno, gerando uma cor.
Agora, quando a alteração de cor não é verificada, indica que a interação não
ocorreu, não tendo assim no meio reacional a enzima para agir no substrato.
Etapa 5: A leitura pode ser qualitativa, apenas verificando a alteração de cor, ou
então pode ser realizada a leitura em espectrofotômetro, o que converte as
diferentes intensidades de cor em valores numéricos (valores de densidade
óptica). Quanto maior a cor obtida, maior é a concentração da enzima conjugada e
assim, maior a concentração da substância na amostra investigada.
Método de ELISA direto. (A) Esquema mostrando a técnica. (B) Esquema mostrando a 
interação antígeno-anticorpo marcado, uma reação positiva e uma reação negativa. . 
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA-ENZYME LINKED IMMUNOSORBET ASSAY)
ELISA Indireto: utilizado para pesquisar a concentração de anticorpos presentes
em uma amostra de soro ou plasma. Para isso, os antígenos são imobilizados na
fase sólida. A interação antígeno-anticorpo será evidenciada pela utilização de
um segundo anticorpo que está conjugado com a enzima e reconhece o anticorpo
ligado ao antígeno. A reação será visualizada após a adição do substrato da
enzima. É empregado no diagnóstico de doenças infectocontagiosas como AIDS e
doença de chagas. Essa técnica pode ser adaptada para a pesquisa de antígenos
em uma amostra biológica e échamada de ELISA Sanduíche. Para isso:
Etapa1: a placa é sensibilizada com o anticorpo (anticorpos de captura).
Etapa2: depois, o anticorpo de captura reconhece o antígeno presente na
amostra biológica.
Etapa3: em seguida, a reação é revelada com um anticorpo-conjugado que
reconhece o antígeno ligado ao anticorpo de captura.
Exemplo: É empregado no teste de gravidez para detecção do hormônio
gonodotrofina coriônica no soro.
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA-ENZYME LINKED IMMUNOSORBET ASSAY)
ELISA Competitivo: pesquisa antígenos nas amostras através da competição com
antígenos conjugados com a enzima. Para isso:
Etapa 1: a placa é sensibilizada com o anticorpo de captura.
Etapa 2: são adicionados ao mesmo tempo a amostra em investigação e
quantidades fixas de antígenos conjugados em que ambos competirão pela ligação
ao anticorpo, que se liga àquela molécula que estiver em maior concentração.
Etapa 3: após a adição do substrato da enzima, a interação anticorpo de captura e
antígeno marcado gera uma cor, quanto maior a intensidade de coloração, mais
antígenos conjugados estão ligados e menor é a concentração de antígenos na
amostra. Agora, quanto menor a intensidade de cor, maior é a concentração de
antígenos na amostra em investigação e menor a ligação dos antígenos conjugados
ao anticorpo de captura. O ELISA Competitivo pode ser:
• Direto: Pesquisa antígenos
• Indireto: Pesquisa anticorpos
Ocorre através de uma competição simultânea, quando a substância marcada e a
investigada são adicionadas ao mesmo tempo, ou uma saturação sequencial,
quando a substância em investigação é adicionada primeiro e depois é adicionado o
antígeno ou o anticorpo conjugado.
RADIOIMUNOENSAIO
Em 1956, foi desenvolvida a técnica radioimunoensaio para a detecção da insulina.
Essa representa a primeira metodologia padronizada que utiliza reagentes
marcados para a detecção de moléculas na ordem de nano e picogramas.
Radioimunoensaio RIE: é semelhante ao ELISA competitivo, no entanto, utiliza
substâncias marcadas com o radioisótopo. O radioisótopo mais empregado é o
iodo-125. O termo Radioimunoensaio (RIE) é usado apenas quando a substância
marcada é o antígeno.
Imunorradiométrico (IRMA): é utilizado quando o anticorpo que está marcado.
A detecção de antígenos ou anticorpos ocorre pela competição pelo sítio de
ligação entre a substância marcada com radioisótopo e a substância que se deseja
analisar. Os antígenos ou anticorpos são adicionados à fase sólida e
acrescentados às moléculas marcadas com radioisótopo junto com a amostra do
paciente. A quantificação é realizada em aparelho específico para a detecção da
radioatividade.
Quanto maior for a leitura da radioatividade, maior a formação de
imunocomplexos com a substância marcada e menor é a concentração do antígeno
ou anticorpo investigado.
Aplicação: utilizado para dosar polipeptídeos, catecolaminas, esteroides,
hormônios, drogas, vitaminas, verificar a presença de vírus como o da hepatite B e
a presença de alguns marcadores tumorais.
Vantagens desse teste:
Alta especificidade e sensibilidade.
É rápido, barato.
Requer pouco volume de amostra
para testagem.
Permite dosagem de substâncias
em pequenas concentrações.
Desvantagem desse teste
Apresenta um alto risco ao 
operador.
É necessário um grande 
investimento em biossegurança e 
descarte de material radioativo.
Grande instabilidade dos 
radioisótopos.
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TESTES IMUNOCROMATOGRÁFICOS
Os testes imunocromatográficos realizam a detecção da interação antígeno-
anticorpo pela difusão cromatográfica, onde o complexo formado gera uma cor, e a
partir deles, podemos detectar antígenos ou anticorpo e são muito utilizados para
a detecção de várias doenças, como: HIV, Hepatite, COVID. Essa metodologia é
de fácil execução, baixo custo, que conferem resultados rápidos, versáteis,
dispensa equipamentos e que podem ser realizados em diferentes amostras, como
o soro, plasma, sangue total, saliva, swab de nasofaringe e orofaringe, urina e
fezes. Entretanto, apresentam baixa sensibilidade.
É realizado em um cassete constituído por uma membrana porosa de celulose
modificada e membranas absorventes de fibra de vidro. Envolvendo a membrana,
temos um dispositivo plástico que contém os locais de aplicação das amostras e
verificação dos resultados. Ele é constituído por uma fase sólida, onde ocorre a
interação antígeno-anticorpo e é o local onde estão presentes os elementos de
captura fixados na membrana e uma fase móvel com o deslocamento das
substâncias por capilaridade.
Etapa1: Inicialmente, para a detecção de antígenos, a amostra é colocada em uma
região pré-determinada da membrana. Nessa área, estão presentes anticorpos
conjugados normalmente com ouro coloidal (coloração rosa) ou prata coloidal
(azul marinho), que serão responsáveis pela revelação da interação antígeno-
anticorpo.
Etapa2: Após aplicação, a amostra migra em direção as regiões testes (T) e
controle (C).
Etapa3: Caso haja reconhecimento entre o antígeno-anticorpo conjugado, esse
complexo será retido pela ligação com os anticorpos presentes na região T, que
reconhecem os epítopos do antígeno em investigação e gera uma linha colorida.
Caso não haja interação, essa linha colorida não aparecerá.
É importante ressaltar que, após a região teste, temos uma região controle, com
anticorpos anti-IgG que são capazes de se ligar a todos os anticorpos livres
presentes na amostra. O aparecimento da linha controle é essencial, pois indica
que houve migração da amostra e deve estar presente nos resultados positivos e
negativos. O não aparecimento da linha controle invalidada o teste (Figura 17).
IMUNO-HISTOQUÍMICA
O teste de imuno-histoquímica é uma técnica que combina a imunologia, histologia
e química e tem como finalidade o reconhecimento de proteínas de alta afinidade
durante os exames histopatológicos. Esse teste é empregado em cortes de
tecidos obtidos após a biópsia para a detecção de doenças degenerativas ou
parasitárias, identificação de substâncias e análises de estruturas dos tecidos
normais e alteradas durante a evolução da doença. Atualmente, existe uma série
de anticorpos capazes de reconhecer com alta especificidade proteínas do tecido
e que garantem um diagnóstico mais fidedigno. Existem dois tipos de técnicas que
podem ser aplicadas para a imuno-histoquímica:
Técnica direta: reconhece os antígenos presentes em um corte de tecido a partir
de anticorpos ligados a um marcador (anticorpos primários). Os cortes de tecidos
são colocados em contato com os anticorpos primários e, após um tempo de
incubação, é realizada a leitura em microscópios adequados. Os antígenos
pesquisados no tecido serão observados pelo aparecimento de uma cor, indicando
que houve reconhecimento pelo anticorpo. Os anticorpos não ligados são
removidos por lavagens realizadas durante a técnica.
Técnica indireta: reconhece proteínas pela ligação com um anticorpo (primário
não marcado) específico ao antígeno em investigação e depois essa interação é
revelada pela utilização de um anticorpo anti-IgG marcado (anticorpo secundário)
e a amostra é observada em um microscópio adequado. Em sistemas reveladores
na IHQ, são utilizadas reações enzimáticas, com destaque para o sistema avidina-
biotina-enzima-cromógeno.
Nessas reações, o anticorpo secundário é complexado à biotina, e é adicionado ao
meio reacional à estreptavidina ligada a uma peroxidase. A estreptavidina tem
afinidade à biotina e liga-se a ela e, consequentemente, ao anticorpo secundário.
Em seguida, é adicionado ao meio reacional a 3,3-diaminobenzina, que reage com a
peroxidase, reduzindo o DAB que se precipita no local de reação e gera uma cor
marrom- ferruginosa. A coloração marrom indica que houve interação antígeno-
anticorpo.
TESTE DE HIPERSENSIBILIDADE CELULAR CUTÂNEA TARDIA
É uma técnica de análise da imunidade celular in vitro feita pela linfoproliferação
e citometria de fluxo e in vivo a partir do teste de hipersensibilidade celular
cutânea tardia. O teste de hipersensibilidade tardia é um método simples e pode
ser empregado para confirmarexposição prévia a alguns agentes infecciosos,
como Mycobacterium tuberculosis, Hanseníase, Leishmania, Candida albicans,
Paracoccidioides brasiliensis, dentre outros. Para isso:
Etapa 1: são aplicados no antebraço do paciente 0,1 mL de antígeno específico
com agulhas e seringas estéreis, por via intradérmica.
Etapa 2: no outro antebraço, é aplicado a mesma quantidade de Soro fisiológico
0,9% estéril (salina) como controle.
Etapa 3: após 48-72 horas, é realizada a leitura, onde é medido o diâmetro do
endurecimento. Normalmente, caroços superiores a 5 mm são indicativos de uma
reação imune celular no local e da exposição ao antígeno pesquisado, mas o
tamanho depende do tipo de antígeno. Um teste positivo não indica que o paciente
esteja doente ou que obrigatoriamente tenha tido uma infecção. O aparecimento
do eritema e do endurecimento indica a presença de células de memória do tipo
Th1, por uma doença que já foi curada ou uma infecção assintomática, onde o
participante não apresentou sintomas. O teste negativo indica a ausência de
contato com aquele agente infeccioso.
Alguns exemplos do emprego do teste hipersensibilidade celular cutânea tardia,
ou teste de PPD (derivado proteico purificado) que pesquisa:
• Exposição ao Mycobacterium tuberculosis, com o antígeno tuberculina,
conhecido como teste de Mantoux.
• Exposição à hanseníase com o antígeno lepromina, ou antígeno de Mitsuda.
• Exposição a Candida albicans com os antígenos candidina ou oidiomicina.
• Exposição a Paracoccidioides brasiliensis com o antígeno paracoccidioidina.
• Leishmaniose tegumentar com o extrato de protozoário como antígeno, o
famoso teste de Montenegro.
Essa metodologia é indicada para avaliar a diminuição da imunidade celular do tipo
th1 (anergia) em indivíduos que não respondem mais a microrganismos não
patogênicos, situação que é observada em pacientes imunossuprimidos pelo uso de
drogas e doenças, como neoplasias, AIDS, doenças autoimunes. Alguns produtos
químicos quando aplicados ao antebraço provocam uma sensibilização e uma
reação imune no local. Essa propriedade tem sido utilizada para analisar casos de
anergia e a droga mais empregada é o DNCB. Esse é um teste que não é de
rotina e deve ser feito apenas com pacientes com suspeita de ausência de
resposta imune celular.
CITOMETRIA DE FLUXO
Técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas
suspensas em meio líquido em fluxo. Permite a análise de vários parâmetros
simultaneamente. Através de um aparelho de detecção óptico-eletrônico são
possíveis análise de características físicas e/ou químicas de uma célula.
Citometria e a Imunologia
A imunologia utiliza a citometria de fluxo para a detecção ou identificação de sub-
tipos de células implicadas na imunidade.
QUIMIOLUMINESCÊNCIA
É uma técnica de análise através da emissão de luz não acompanhada da emissão
de calor em consequência de uma reação química.
Dois produtos químicos reagem para formar em intermediário excitado (de alta
energia), que se decompõe libertando parte da sua energia como fitóns de luz. As
reações quimioluminescentes habitualmente não liberam muito calor, uma vez que
a energia é libertada sob forma de luz.
O luminol produz uma luz quando reage com um agente oxidante.
• Exames feitos por quimiolusminência são basicamente automatizados;
• Quantificam Ag ou Ac presentes no soro. São muito usados para dosagem de
hormônios, marcadores tumorais e dosagem de anticorpos séricos.
• A técnica se baseia na ligação Ag-Ac. Como no Elisa, um dos reagentes é
conjugado com uma substância que quando ativada, emite luz visível. A luz
emitida é proporcional a concentração da molécula pesquisada.
• Os tipos mais usados: competição e sanduiche.