ANÁLISES CLINICAS MICROBIOLÓGICAS E IMUNOLÓGICAS

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MORFOLOGIA BACTERIANA
Morfologia bacteriana: são classificadas morfologicamente de acordo com o tamanho,
forma e arranjo e consistem nos menores seres vivos, da ordem de milésimos de
milímetro e, portanto, visíveis apenas com a ajuda de um microscópio. Enquanto
células animais e vegetais podem ter até dezenas de micrômetros, a maioria das
bactérias estudadas nos laboratórios de microbiologia medem em torno 1,0 µm de
diâmetro.
COCOS: Bactérias com formato esférico ou oval e que, de acordo com a sua divisão
celular, são exemplos de cocos de importância médica, Staphylococcus aureus,
Enterococcus spp, Streptococcus sp., Neisseria sp. Esses cocos podem se
apresentar em diferentes arranjos:
• Diplococos: agrupamento de dois cocos. Os Streptococcus pneumoniae
(pneumococo) são diplococos que podem causar pneumonia, meningite, sinusite e
infecção do ouvido médio. Outro exemplo é a Neisseria gonorrhoeae agente
etiológico da gonorreia.
• Estreptococos: Vários cocos agrupados em cadeia, lembrando um colar de
pérolas. As infecções estreptocócicas, causadas por várias espécies de
Streptococcus, podem desencadear diversos sintomas, como: pneumonia,
faringite, febre escarlatina, impetigo e celulite.
• Tétrades: Agrupamento de 4 cocos de forma semelhante a um quadrado.
Exemplo: Micrococcus spp., normalmente, não são patogênicos e integram a
microbiota.
• Sarcina: agrupamento de 8 cocos unidos de forma semelhante a um cubo.
Exemplo: Sarcina ventriculi, um importante patógeno em gatos, cachorros e
bovinos. Em humanos, o potencial patogênico ainda não é muito bem elucidado,
mas tem sido isolado em biopsias gástricas e relacionados com algumas
doenças, como gastrite enfisematosa e perfuração gástrica.
• Estafilococos: cocos agrupados de forma semelhante ao cacho de uvas. Como
exemplo, temos as infecções por bactérias do gênero Staphylococcus aureus,
que causam infecções cutâneas (foliculite, impetigo, abcessos, celulite),
pneumonia, infecções na corrente sanguínea e osteomielite.
MORFOLOGIA BACTERIANA
BASTONETES OU BACILOS: são bactérias que apresentam um formato
cilíndrico ou de bastão (bastonete), podendo ser curtas ou longas e apresentar
extremidade reta ou de ponta arredondada. Normalmente, os bacilos não se agrupam
em tantos arranjos como os cocos, apresentando-se, na maioria das vezes, de forma
isolada. Entretanto, podem apresentar-se, eventualmente, como diplobacilos ou
estreptobacilos.
Algumas doenças causadas por bactérias em formato de bastonete ou bacilos, são:
Tétano - Clostridium tetani
Tuberculose - Mycobacterium tuberculosis
Difteria - Bacilo diftérico
Hanseníase (lepra) - Mycobacterium leprae
É importante destacar que, durante a análise microscópica, alguns bacilos podem ser 
confundidos com cocos, isso ocorre pois são bacilos muito curtos. Esses bacilos 
curtos são chamados de cocobacilos. 
ESPIRALADAS: Bactérias com formato espiralado ou helicoidal e que ocorrem,
predominantemente, como células isoladas. Elas podem ser divididas em espirilos,
espiroquetas e vibriões.
• Espirilos: são móveis (locomovem-se com ajuda de flagelos), apresentam
formato espiral e corpo rígido. Ex: Spirillum minus, que causa Febre da
mordedura do rato em humanos e macacos.
• Espiroquetas: são móveis, mas se locomovem por contrações citoplasmáticas,
apresentam formato em espiral e são mais flexíveis; Ex: Treponema pallidum.
O T. pallium é o agente etiológico da sífilis, uma infecção bacteriana de
transmissão sexual e vertical que pode evoluir para formas mais graves,
comprometendo especialmente os sistemas nervoso e cardiovascular. O
diagnóstico é feito a partir de materiais coletados das lesões primárias causadas
por essa bactéria, que permite a visualização do treponema vivo e móvel, pode ser
feito com material fixado seguido de coloração (pelo método de Fontana de
Tribondeau), mas é de difícil visualização ou por testes imunológicos para
detecção de anticorpos-antitreponêmicos (mais empregado).
• Vibriões: São móveis (locomovem-se com ajuda de flagelos) apresentam
formato de vírgula. Ex: Vibrio cholerae, também conhecido como vibrião
colérico, é o agente causador da cólera.
CITOLOGIA BACTERIANA
As bactérias pertencem ao grupo dos procariotos, não possuem membrana nuclear
(carioteca) e não possuem todo o conjunto de organelas das células eucarióticas.
PAREDE CELULAR: é importante na divisão celular, é responsável pela forma,
rigidez da bactéria e confere proteção osmótica entre os meios externo e interno. A
parede celular possui uma espessura de, aproximadamente, 10 a 20 µm, é porosa,
permitindo a passagem de metabólitos para a membrana plasmática, é formada por
camadas rígidas de peptidoglicanos (mureína), e envolve a membrana citoplasmática
da maioria dos procariotos. As bactérias são classificadas em gram-positivas ou em
gram-negativas, de acordo com a cor de sua parede celular após a realização da
coloração de Gram. A identificação microscópica de bactérias gram-positivas ou
gram-negativas, além de direcionar os testes de identificação, também permitem
que o médico inicie o tratamento empiricamente, antes mesmo de sair o resultado da
cultura e do antibiograma, que demora, no mínimo, 48 horas.
BACTÉRIA GRAM-POSITIVA: possui uma parede celular mais espessa, com
múltiplas camadas de peptideoglicanos, revestindo a membrana citoplasmática.
Além disso, possui outros componentes, como os:
• Ácidos teicoicos: Polímeros de fosfato de poliol, ligados covalentemente ao
peptideoglicano, essenciais para a viabilidade da célula e considerados
fatores importantes na virulência (A capacidade de um microrganismo de
produzir danos que são fatais ou graves, podendo levar ao óbito, como
capacidade de multiplicar, produção de toxinas, produção de proteínas e
enzimas que auxiliam a fuga dos mecanismos de defesa do organismo, dentre
outros).
• Ácidos lipoteicoicos: possuem um ácido graxo e estão ancorados na
membrana plasmática. São considerados antígenos de superfície, permitem a
distinção dos sorotipos bacterianos e a aderência nas superfícies das células
hospedeiras.
Dentre as bactérias gram-positivas, temos as que são partes da microbiota
normal do organismo e que, geralmente, não causam doenças e temos aquelas
que são patogênicas, causando difteria, carbúnculo, listeriose, septicemia,
pneumonia, entre outros tipos de infecção.
CITOLOGIA BACTERIANA
BACTÉRIA GRAM-NEGATIVA: apresenta a parede celular com uma
estrutura mais complexa e, quimicamente, diferente quando comparada à parede
celular de gram-positiva. Esta parede celular é composta de uma fina camada
de peptideoglicanos (5-10% do peso da parede celular) e externamente a esta
fina camada, encontramos uma membrana externa presente apenas nas
bactérias gram-negativas. O espaço entre membranas é chamado como espaço
periplasmático.
Membrana externa: além de manter a estrutura bacteriana é uma barreira de
permeabilidade, confere proteção contra condições ambientais adversas, como
as do sistema digestivo do hospedeiro e resistência a alguns antimicrobianos
como a penicilina. Essa membrana é formada por uma dupla camada lipídica, onde
a camada interna é constituída basicamente de fosfolipídios e a camada externa
possui uma molécula anfipática, o lipopolissacarídeo (LPS) ou endotoxina e
proteínas. O LPS é essencial para a viabilidade das bactérias, funciona como um
potente indutor de respostas imunológicas, ativando linfócitos B e induzindo a
produção de citocinas por macrófagos, células dendríticas e outras células. Por
outro lado, provoca febre e pode causar choque endotoxêmico, sendo chamado
também de endotoxina. As proteínas permitem a difusão de metabolitos
pequenos, antibióticos hidrofílicos, têm função estrutural e atuam como
receptoras para bacteriófagos e outros ligantes.
As bactérias gram-negativas podem causar uma série de infecções graves nos
seres humanos, como peritonite, pneumonia, infecções urinárias, meningite,
dentre outras. Essas bactérias estão cada vez mais resistentes aos
antimicrobianos disponíveis para utilização terapêutica.
EXCEÇÕES:1. Micobactérias: Bacilos que apresentam a camada de peptideoglicanos da
parede celular com estrutura um pouco diferente, pois é formada por
polímeros de arabinogalactano e revestida por uma capa lipídica cerosa de
ácidos micólicos. Devido ao caráter hidrofóbico da parede celular destas
bactérias, a coloração pelo método de Gram não é a de escolha quando se
deseja pesquisar esse tipo de bactéria. No entanto, elas poderão ser
diferenciadas pela característica de álcool-ácido resistência (coloração de
Ziehl Neelsen). Exemplo. Mycobacterium tuberculosis (bacilo da
tuberculose)
2. Micoplasmas: São as menores bactérias encontradas na natureza (cerca de
0,3 µm), não apresentam parede celular e incorporam esteróis do
hospedeiro em sua membrana (Figura 6). O Mycoplasma pneumoniae é um
agente causador comum de pneumonia.
BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS X GRAM NEGATIVAS
CITOLOGIA BACTERIANA
MEMBRANA CELULAR OU MEMBRANA CITOPLASMÁTICA
BACTERIANA: é semipermeável, seletiva, contém várias enzimas, limita o
citoplasma, é constituída de fosfolipídios e proteínas e, portanto, considerada
semelhante à membrana plasmática dos organismos eucarióticos, exceto pelo
fato de não possuírem esteróis.
CITOPLASMA: pode ser dividido em diferentes regiões:
• Citoplasmática: rica em RNA; partículas proteicas e ribossomos
(responsáveis pela síntese proteica).
• Cromatínica: rica em DNA circular dupla fita.
• Porção fluída: com nutrientes dissolvidos.
Algumas bactérias, como o Vibrio cholerae, podem possuir mais de um DNA; e 
outras, como a Borrelia burgdorferi, possuem um DNA linear).
CITOLOGIA BACTERIANA
ELEMENTOS ACESSÓRIOS: São estruturas que podem estar ou não
presentes em determinadas bactérias. Vários desses elementos acessórios são
importantes na virulência, patogenicidade e resistência bacteriana.
• Glicocálice: revestimento composto de polissacarídeos que além de fornecer
um envoltório protetor, evita a fagocitose pelas células de defesa do
organismo, atua como reservatório de nutrientes e, principalmente, auxilia na
aderência bacteriana a algumas superfícies. É chamado de cápsula quando
apresenta estrutura uniforme e encontra-se firmemente aderido à parede
celular ou camada viscosa quando as camadas de polissacarídeos possuem
pouca aderência e apresentam espessura não uniforme. Exemplo: o
Streptococcus mutans, que através da cápsula fixa e perfura o esmalte
dentário.
A determinação dos constituintes da cápsula é fundamental na identificação de 
certas bactérias patogênicas, uma vez que algumas cápsulas são compostas de 
polipeptídios, ao invés de polissacarídeos, como ocorre com o Bacillus anthracis
(agente do carbúnculo/ antrax).
• Flagelos: são estruturas de locomoção presentes em algumas bactérias,
formadas por subunidades proteicas acopladas na forma helicoidal (flagelina)
e que permitem às bactérias “irem” em busca de nutrientes ou fugir de
substâncias tóxicas. O flagelo fica ancorado na membrana citoplasmática
através do seu corpo basal (similar a um gancho), possui um comprimento
geralmente muito maior que o da célula, e podem ser únicos ou múltiplos,
polares (apenas nas extremidades) ou peritríquios (em todo corpo
bacteriano). Embora os flagelos não possam ser visualizados, normalmente,
no microscópio óptico, existem técnicas de coloração que os tornam visíveis
no microscópio óptico e os microbiologistas usam como auxílio no
diagnóstico. Durante a identificação de uma bactéria, a avaliação da
motilidade pode ser utilizada para diferenciar espécies de bactérias.
Exemplo: Em uma cultura de fezes (coprocultura), a presença de bactérias
gram-negativas imóveis é indicativa de Shigella sp. e móveis de Salmonella
sp.
• Pili e fímbrias: são estruturas filamentosas, que lembram fios de cabelo no
lado de fora da bactéria, compostas por subunidades proteicas (pilina), que se
projetam a partir da superfície de uma célula e, geralmente, estão em maior
quantidade do que os flagelos. As fímbrias auxiliam na colonização das
membranas de mucosas como ocorre no caso da Neisseria gonorrhoeae,
agente causador da gonorreia e, no caso da E. coli, nas células do trato
urinário. Os pili sexuais de uma bactéria se ligam a outras bactérias
permitindo a transferência de material genético na conjugação bacteriana.
Esse pili sexuais são codificados por um plasmídeo.
• Esporos (endosporos): produzidos por alguns gêneros de bactérias, como
Bacillus e Clostridium, os esporos são uma estrutura resistente a agentes
físicos e químicos, que é formada em resposta ao meio ambiente, quando este
se torna inadequado para a sobrevivência da bactéria (ex.: escassez de água
ou nutrientes). A resistência da forma esporulada possibilita que a bactéria
sobreviva por longos anos em ambientes desfavoráveis, podendo reverter à
forma vegetativa quando o local se tornar viável novamente para sua
sobrevida. Cada célula forma um único esporo, que é liberado quando a
bactéria morre.
• Plasmídeo: corresponde a um DNA circular extracromossomal, capaz de se
replicar de forma autônoma, localizado no citoplasma da célula bacteriana e que
não é responsável por características essenciais da bactéria. Podem se
apresentar em várias cópias, além de possuir a capacidade de conferir
vantagens adaptativas (por exemplo, resistência a antibióticos), podendo,
inclusive, ser transferidos para outras bactérias.
• Grânulos ou inclusões citoplasmáticas: são grânulos cuja função é de
armazenamento, podendo ser de glicogênio, amido, fosfatos, enxofre etc. e
podem ser visualizados através de colorações especiais, pois, geralmente, são
refringentes.
FATORES DE CRESCIMENTO BACTERIANO
Fatores de crescimento bacteriano: quando inoculadas em meio de cultura
adequado e em condições apropriadas, iniciam processo de duplicação no qual por
divisão binária, ocorre aumento da população de forma logarítmica. O tempo de
geração, ou seja, o tempo necessário para que uma bactéria se duplique varia de
acordo com a espécie bacteriana, podendo ser extremamente curto (E. coli ± 15
minutos) ou bastante longo (M. tuberculosis ± 932 minutos).
Para uma cultura de micobactéria ser considerada negativa, é necessário aguardar 
no mínimo, 45 dias de incubação e não ser visualizado nenhum crescimento.
FASES DE CRESCIMENTO:
• Fase Lag: quando são adicionadas a um meio de cultura (semeadas), elas
necessitam de um tempo para se adaptar ao novo ambiente antes de começar a
se dividir. Neste momento, não há reprodução e a população permanece
temporariamente inalterada. É importante ressaltar que, nesta fase, as células
não estão em latência, uma vez que aumentam no tamanho e fisiologicamente
estão muito ativas.
• Fase Logarítmica (fase Log ou exponencial): as células iniciam a divisão que
ocorre de forma exponencial, regular e constante. A velocidade de crescimento
é máxima nesta fase, e varia de acordo com a cepa e com as condições
ambientais.
• Fase estacionária ou fase Platô: em determinando momento do crescimento
bacteriano, haverá carência de nutrientes e produção de substâncias tóxicas no
meio, dessa forma, o número absoluto de bactérias no meio de cultura
permanecerá constante, resultado do equilíbrio entre bactérias que ainda estão
se duplicando e bactérias que estão morrendo.
• Fase de declínio ou morte: etapa que ocorre morte bacteriana, pois há falta de
nutrientes e de espaço, aliada à toxidez do ambiente que levam os
microrganismos a morrerem mais rápido do que produzirem novas células (a
morte bacteriana nesta fase se dará de forma exponencial ou logarítmica).
Sendo assim, há uma progressiva morte celular até a cultura se tornar estéril.
Fatores ambientais que afetam o crescimento bacteriano: além de nutrientes
apropriados, é necessário conhecer as condições físicas ambientais ideais para o
crescimento bacteriano em meio de cultura. Dentre estes, os principais fatores
são:
• Temperatura: ótima de crescimento é aquela que possibilita o maior
crescimento, durante o menor tempo e varia para cada gênero. As bactérias,
no geral, são classificadas de acordo com sua temperatura ótima decrescimento em:
✓ Psicrófilas: Crescem melhor de 12°C e 20°C.
✓ Mesófilas: crescem melhor de 25°C a 40°C. Neste grupo, está a maioria
dos patógenos bacterianos de importância clínica, já que nesta faixa
encontra-se a temperatura do corpo humano.
✓ Termófilas: crescem melhor de 45°C a 60°C.
A temperatura de crescimento também pode ser usada durante a identificação 
bacteriana. Exemplo: A N. gonorrhoeae e N. Meningitis não crescem na 
temperatura de 22°C, mas as outras espécies de Neisseria sp. são capazes de 
crescer.
• Oxigênio: podem ser divididas de acordo com a necessidade e a tolerância ao
oxigênio:
✓ Aeróbias estritas: só crescem na presença de oxigênio. Ex.: Acinetobacter
sp.
✓ Anaeróbias facultativas: Crescem tanto na presença quanto na ausência de
oxigênio. Ex.: E. coli.
✓ Microaerófilas: Só crescem em ambiente contendo baixas concentrações de
oxigênio (menores que as encontradas no ar atmosférico). Ex.:
Campylobacter sp.
✓ Anaeróbias estritas: Só conseguem crescer na ausência de oxigênio. Em
contato com O2, o crescimento dessas bactérias é inibido ou ocorre morte
bacteriana. Ex.: Clostridium botulinum e Neisseria sp.
Quanto às espécies de Neisseria, o ideal é semear imediatamente após a coleta 
em meio sólido, levar para a estufa 36 °C em jarra com vela ou com gerador de 
CO2 e umidade.
FATORES DE CRESCIMENTO BACTERIANO
• pH: a grande maioria das bactérias cresce bem em meios com pH neutro, em
torno de 6,5 a 7,5, apesar de muitas espécies tolerarem variações de pH entre
4,0 e 9,0. Os meios de cultura geralmente são tamponados para impedir
mudanças bruscas de pH, decorrentes do próprio metabolismo das bactérias.
• Pressão osmótica: é a pressão que deve ser exercida sobre um sistema para
evitar que a passagem de água por osmose, ou seja, para o meio mais
concentrado ocorra. A parede celular, além da rigidez, impede a entrada
excessiva de água. Dessa forma, a pressão osmótica dos meios de cultura pode
afetar diretamente a viabilidade das bactérias. Meios de cultura com pressões
osmóticas menores comparado ao interior da bactéria, normalmente, não
afetam sua viabilidade. De forma diferente, meios de cultura com pressões
osmóticas maiores causam perda de água intracelular, trazendo efeito
bacteriostático ou bactericida.
Halofismo - Certas bactérias isoladas de salmouras, pacotes de sal, alimentos e 
água do mar, chamadas bactérias halofílicas ou halófitas obrigatórias, crescem 
apenas quando o meio contém uma concentração inusitadamente elevada de sal 
(10% a 15%). Isto representa uma resposta especial do microrganismo à pressão 
osmótica.
MEIOS DE CULTURA: COMPOSIÇÃO E CLASSIFICAÇÃO
Meio de cultura: qualquer substância que possua um conjunto de fontes de
nutrientes e que seja utilizada para o cultivo de microrganismos como
macronutrientes (carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e hidrogênio) e
micronutrientes (ferro, zinco, manganês, cálcio, potássio, sódio, cobre, cloro,
cobalto, molibdênio, selênio, magnésio, entre tantos outros), necessários à síntese
biológica de novos organismos. Nos laboratórios clínicos, os meios de cultivo
podem ser comprados totalmente prontos ou então serem preparados.
Semeadura: após a coleta, a amostra biológica é semeada em meios de culturas
capazes de suprir as bactérias com as exigências nutricionais, em condições
ambientais favoráveis (temperatura, pH, pressão osmótica) que possibilitam o
crescimento microbiano para a formação e visualização de colônias.
Classificação dos meios de cultura:
• Estado físico: é a consistência adequada do meio de cultura obtida por uma alga
marinha vermelha chamada ágar-ágar que é um polissacarídeo que atua como
agente solidificante quando dissolvida em água fervente.
✓ Meios sólidos: adição de 1,0 g a 3,0 g % de ágar. A maioria dos microrganismos
crescem formando colônias. Após preparo, autoclavagem, o meio é depositado
nas placas para solidificar, em ambiente estéril.
✓ Meios semissólidos: adição de 0,1 g a 0,7 g %”, separando o 0,7 de g. Dentre as
finalidades, temos a visualização da motilidade bacteriana ou servir como base
de meio de transporte. Ex: Meio SIM (meio de detecção da produção de
enxofre, motilidade e produção de indol) e Cary & Blair.
✓ Meios líquidos: não apresentam ágar, são conhecidos como “caldos” e utilizados
para ativação das culturas, repiques de microrganismos, provas bioquímicas,
dentre outros. Ex: caldo tetrationato e selenito-cistina para cultivo de
salmonelas, caldo tioglicolato para Clostridium perfringens.
• Composição química:
✓ Meios quimicamente definidos: a composição química de todos os seus
constituintes é conhecida (definidos). Ex: Meio AR-103.
✓ Meios Complexos: a exata constituição do meio de cultura não é conhecida.
Esses meios apresentam em sua composição soro, sangue, extratos moídos ou
digeridos de órgãos animais (corações, fígados, cérebros), peixes, leveduras, e
vegetais ou outro componente que não se tem total conhecimento da
composição química. Ex: Ágar sangue.
• Objetivo da utilização:
✓ Meios enriquecidos ou ricos: são os meios que contêm um grande suprimento
de nutrientes pela adição de diversas substâncias como sangue, soro, extratos
de tecidos animais ou vegetais ao caldo ou até mesmo ágar nutritivos, para
permitir o crescimento de bactérias fastidiosas (nutricionalmente exigentes),
como Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella
spp. Ex: O ágar-sangue (ágar nutriente com 5% de eritrócitos de carneiro) e o
ágar-chocolate (ágar nutriente com hemoglobina em pó) são exemplos de meios
enriquecidos utilizados de forma rotineira nos laboratórios de bacteriologia
clínica.
FATORES DE CRESCIMENTO BACTERIANO
✓ Meios Seletivos: apresentam em sua composição substâncias químicas
específicas (inibidores) adicionadas ao caldo ou ao ágar nutritivo que previnem o
crescimento de um determinado grupo de bactérias. É importante ressaltar que
os inibidores atuam em um grupo específico de bactéria, favorecendo apenas o
crescimento da bactéria de interesse. Ex: ágar MacConkey é um meio seletivo
pois tem em sua composição sais biliares e cristais violeta que inibe o
crescimento da maioria das bactérias gram-positivas, permitindo o crescimento
apenas das bactérias gram-negativas.
✓ Meios diferenciais ou indicadores: contêm certos reagentes ou substâncias no
meio que permitem a distinção de diferentes tipos de bactérias. Ex:O Ágar
MacConkey, além de um meio de cultura seletivo, é, frequentemente, utilizado
para diferenciar bacilos gram-negativos isolados de amostras fecais. As
bactérias gram-negativas que fermentam a lactose (um ingrediente do ágar
MacConkey) produzem colônias rosas, como E. coli, enquanto aquelas
incapazes de fermentar a lactose produzem colônias incolores e amarelas,
como Acinetobacter baumanii.
Ágar MacConkey: contém a lactose e um indicador de pH, onde Bactérias que são
capazes de metabolizar a lactose produzem ácidos mistos que alteram o pH do
meio que fica com uma cor rosa/ avermelhado, enquanto que, as bactérias que não
fermentam a lactose, utilizam como fonte de energia a peptona, que ao ser
metabolizada, produz amônia, que eleva o pH do meio e torna as colônias e o meio
amarelados/ sem cor.
Ágar manitol salgado: composto de manitol e alta concentração de sal (7,5% de
NaCL) utilizado para o isolamento de Staphylococcus aureus a partir de
diferentes amostras biológicas. Todas as espécies de Staphylococcus são capazes
de crescer nesse meio, mas o S. aureus é capaz de fermentar o manitol presente
no meio, produzindo ácido, que torna o meio e as colônias amareladas. As outras
espécies de estafilococos, como os Staphylococcus epidermidis e o Bacillus
subtillis não metabolizam o manitol, apresentando assim colônias brancas.
• Meios de transporte: são semissólidos e possuem o mínimo de nutrientes para a
manutenção das bactérias, durante o tempo de transporte, sem que estas se
reproduzam ou acidifiquem o meio. Ex: meio Stuart – permite uma boa
conservação de bactérias patogênicas como Salmonella spp. e Shigella spp.)Diferença da coloração das colônias de bactérias gram-negativas fermentadoras e 
não fermentadoras de lactose em Agar MacConkey.
Colônias de bactérias crescidas em meio ágar sangue
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS (TSA)
TSA: são testes utilizados para detectar uma possível resistência aos antibióticos
em patógenos comuns, nortear a escolha do antibiótico mais adequado a fim de
predizer o sucesso do esquema terapêutico para infecções específicas.
Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (2008): o TSA é sempre
realizado na avaliação das seguintes bactérias:
• Enterobactérias
• Pseudomonas spp.
• Acinetobacter spp.
• Staphylococcus spp.
• Enterococcus spp.
• Streptococcus pneumoniae
• Streptococcus do grupo viridans e beta-hemolítico
• Haemophilus influenzae
• Complexo Burkholderia cepacia
• Stenotrophomonas maltophilia
• Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis
Métodos e padronização: é ditada por organizações especializadas de forma
detalhada, são elas:
• Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, EUA)
• European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST,
Europa)
• Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility testing (BrCAST, Brasil)
• British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC, Reino Unido)
• Comité de L’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-
SFM, França)
MICRODILUIÇÃO EM TUBOS: esse procedimento envolve:
• Preparação e diluição seriada de antimicrobianos (por exemplo, 1, 2, 4, 8 e 16
microgramas/mL) em meio de cultura líquido.
• Inoculação dos tubos contendo antimicrobianos com uma suspensão bacteriana
padronizada em torno de 5 X 105 UFC/mL.
• Incubação por de 18 a 24 horas, a 35°C.
• Exame da presença de turbidez, que evidencia o crescimento microbiano. O
primeiro tubo da série que apresentar aparência límpida (sem turbidez)
representa a concentração inibitória mínima (CIM ou MIC).
A sensibilidade dos microrganismos aos antimicrobianos é representada pela 
concentração inibitória mínima (CIM ou MIC) de cada microrganismo para cada 
antimicrobiano, que corresponde à menor concentração do antimicrobiano capaz 
de inibir o desenvolvimento visível do microrganismo.
A vantagem da macrodiluição em tubo é a geração de um resultado quantitativo
(CIM ou MIC). As desvantagens correspondem ao trabalho manual que leva a
possibilidade de erros durante o preparo de soluções de antibióticos para cada
antibiótico testado, a quantidade relativamente grande de reagentes e o espaço
necessário para cada teste.
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS (TSA)
PROVA DE SENSIBILIDADE COM DISCOS DE PAPEL EM MEIO
SÓLIDO: é chamado de técnica de disco-difusão em ágar ou técnica de Kirby-
Bauer. É um dos métodos de sensibilidade mais simples, prático, confiável e mais
utilizado nos laboratórios de microbiologia, fornecendo resultados qualitativos.
Método de crescimento:
Passo 1: Após crescimento em placa de ágar (24 horas), é selecionado de três a
cinco colônias, bem isoladas, do mesmo tipo morfológico. A superfície de cada
colônia é tocada com uma alça, e os microrganismos são transferidos para um tubo
contendo 4-5 mL de NaCL 0,9% (salina) estéril.
Passo 2: Incuba-se a cultura na salina até alcançar a turbidez de uma solução
padrão de McFarland 0,5.
Definição de escala de MacFarland: Escala de nefelométrica de turvação. Essa é 
uma escala que possibilita verificar a concentração bacteriana pela intensidade de 
turvação do meio. Quanto maior a turvação do meio, maior a concentração 
bacteriana, maior opacidade e mais difícil é a passagem de luz. Essa escala é 
composta de 11 tubos numerados de 0,5 a 10, onde o tubo 0,5 (indica uma 
concentração bacteriana de 1,0 a 2,0 x 108 colônias/mL. e o tubo 10 -30 x 108 
colônias/mL). Ao preparar uma suspensão de bactérias para realização do 
antibiograma é feito a comparação visual com os tubos padrão da escala. A leitura 
é feita a olho nu utilizando um cartão de fundo branco com linhas pretas no fundo, 
ou então através de um espectrofotômetro. 
Inoculação das placas de teste:
Passo 1: Após a preparação da suspensão bacteriana, mergulha-se um swab de
algodão estéril na suspensão. Essa etapa deve ser realizada em até 15 minutos
após ajustar a turbidez da suspensão. O swab deve ser girado várias vezes e
apertado firmemente contra a parede interna do tubo, acima do nível do líquido, o
que ajuda a retirar qualquer excesso de inóculo no swab.
Passo 2: A superfície da placa de ágar Müeller-Hinton é inoculada esfregando o
swab em toda a superfície estéril do ágar. Repete-se o procedimento esfregando
outras duas vezes, girando a placa aproximadamente 60° cada vez, a fim de
assegurar a distribuição uniforme do inóculo. Após a distribuição, passa-se um
swab na margem de toda a placa de ágar, completando pelo menos uma volta
completa.
Passo 3: A tampa pode ser deixada entreaberta de três a cinco minutos de
maneira a permitir que qualquer excesso de umidade seja absorvido antes de se
aplicar os discos impregnados de droga. No entanto, a placa não pode ultrapassar
Passo 3: A tampa pode ser deixada entreaberta de três a cinco minutos de
maneira a permitir que qualquer excesso de umidade seja absorvido antes de se
aplicar os discos impregnados de droga. No entanto, a placa não pode ultrapassar
15 minutos aberta.
Evitar inóculos com alta concentração de bactérias e não utilizar culturas em 
caldo, não diluídas, do dia anterior, ou outros inóculos não padronizados para 
semear nessas placas.
Aplicação de discos a placas de ágar inoculadas:
Passo 1: O conjunto de antibióticos é previamente definido. Esses são discos de
papeis de filtros impregnados com concentrações definidas de antibióticos. Os
discos de antibióticos são colocados na superfície de placa de ágar anteriormente
semeada, com auxílio de uma pinça ou com um dispensador. Ao ser colocado, cada
disco deve ser pressionado de maneira a assegurar o contato completo do disco
com a superfície de ágar. Os discos devem ser distribuídos mantendo a distância
entre os centros de pelo menos 24 mm. Em geral, deve-se colocar 12 discos, no
máximo, em uma placa de 150 mm, ou cinco discos em uma placa de 100 mm.
Algumas drogas difundem-se quase instantaneamente quando em contato com o
meio. O disco não deve ser reaplicado após ter entrado em contato com a
superfície de ágar. Em vez disso, coloque um novo disco em outra parte da placa.
Passo 2: As placas devem ser invertidas e colocadas em uma estufa, a 35° C, até
15 minutos após a aplicação dos discos. No entanto, no caso das cepas de
Haemophilus spp., N. gonorrhoeae e dos estreptococos, as placas não devem ser
incubadas em atmosfera enriquecida com CO2, porque os padrões de
interpretação foram estabelecidos usando incubação em ar ambiente, e o CO2 irá
alterar significativamente o tamanho dos halos de inibição de alguns antibióticos.
Leitura das placas e interpretação dos resultados: A leitura é realizada após 18 a
24 horas de incubação. Inicialmente, analisamos a superfície da placa para verificar
se a semeadura foi satisfatória. Em seguida, os halos (diâmetros) devem ser
medidos, em milímetros, com auxílio de paquímetro ou uma régua. Para isso, a placa
deve ser invertida, e a régua ou o paquímetro apoiado na parte de trás da placa. As
medidas devem ser feitas contra uma fonte luminosa.
MÉTODOS DE VISUALIZAÇÃO E COLORAÇÃO NA PRÁTICA 
LABORATORIAL
Bactérias são seres microscópios vistas apenas pelo microscópios:
• Óptico – permitem aumentos de até 1000 vezes.
• Eletrônicos – permitem aumentos de 10.000 vezes (varredura) e 1.000.000
vezes (transmissão).
Preparação a fresco: é o método de visualização de bactérias vivas sem a
necessidade de empregar coloração a partir de material biológico em suspensão
(uma gota) entre lâmina e lamínula (sem formar bolha), geralmente utilizando um
microscópio de campo escuro. Essa técnica é muito utilizada quando há intenção
de visualizar a mobilidade e a morfologia de bactérias espiraladas, as quais sob
fixação ficam distorcidas, ou até mesmo observaralterações na divisão celular e
formação de esporos. Por não utilizar corantes, as bactérias são vistas sem cor
(incolores), mesmos que estas sejam capazes de produzir cor quando cultivadas em
meios de cultura específicos.
Preparação com coloração: é realizada para uma melhor visualização da
morfologia e citologia, só podem ser fixados na lâmina mortos. A fixação é a etapa
feita a partir do calor, que permite que a bactéria fique aderida à lâmina e evita que
as bactérias sejam lavadas e perdidas durante a coloração. Antes da etapa de
fixação e coloração, é preciso a realização de um bom esfregaço, que deve ser:
• Pouco espesso
• Bem homogêneo
• Realizado em área de segurança biológica, a partir de um caldo ou material
diluído em solução salina, espalhado com alça bacteriológica em lâmina limpa e
seca
Todas as manipulações devem ser feitas seguindo as normas de biossegurança e, 
de forma estéril, para não haver contaminação das amostras e resultados falso 
positivos. Ao final, todos os resíduos produzidos devem ser autoclavados antes de 
descartados.
Classificação das técnicas de coloração:
Coloração simples: utiliza apenas um único corante
Coloração diferencial ou seletivo: utiliza mais de um corante, mordentes e
diferenciador para identificar diferenças entre grupos de bactérias. Exemplo:
Coloração de Gram, de Ziehl-Neelsen e de Albert-Laybourn, Fontana-
Tribondeau. Também existem métodos de coloração pouco utilizados, mas que
podem ser úteis quando há necessidade de evidenciar algumas estruturas
bacterianas, como a coloração de flagelos, esporos e cápsula.
COLORAÇÃO DE GRAM: Esta técnica foi desenvolvida em 1884, pelo médico
dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, e é a mais utilizada em bacteriologia
por permitir distinguir bactérias gram-positivas de bactérias gram-negativas.
Diferenças nas características químicas e estruturais das paredes celulares, bem
como na permeabilidade aos reagentes químicos nestes dois grupos de bactérias
levam a diferenças de coloração. Na técnica de Gram é utilizado:
• Corante básico (violeta genciana, cristal-violeta, metilvioleta).
• Mordente (solução iodo-iodetada, conhecida como lugol) que aumenta a
afinidade da célula pelo primeiro corante utilizado (corante básico). Ocorre
assim a ligação do corante com o lugol e a formação de um composto roxo,
insolúvel que cora o espaço protoplasmático e a parede celular de roxo.
• Agente descolorante (álcool a 95% ou álcool-acetona).
✓ Nas bactérias gram-positivas: as quais o corante está fortemente retido
devido à espessa camada de peptideoglicanos, este não é facilmente removido
pela ação do agente descolorante, por isso permanecem roxas.
✓ Nas bactérias gram-negativas: nas quais o agente descolorante remove a
membrana externa da parede destas bactérias, e devido à fina camada de
peptideoglicanos, estas bactérias não conseguem reter o corante. Na ação do
corante básico (safranina ou fucsina) as bactérias gram-negativas são coradas
de vermelho.
A literatura científica evidencia que os cocos de importância médica são:
• Cocos Gram-positivos (exceção do gênero Neisseria) e os
• Bastonetes gram-negativos (exceção dos gêneros Corynebacterium, Listeria,
Bacillus e Clostridium).
ETAPAS DA COLORAÇÃO DE GRAM
1 ETAPA: é utilizado uma solução salina em uma lâmina onde é
depositada uma amostra da colônia suspeita de forma a ser misturada
nessa solução;
2 ETAPA: é feita a fixação dessa solução contendo a amostra
bacteriana através de uma chama, de forma lenta, promovendo a
secagem da solução, com cuidado para que a mesma não superaqueça e
forme vapor.
3 ETAPA: é aplicado o cristal de violeta, que irá penetrar e corar
todas as células aguardando o período de um minuto para ação desse
corante e em seguida a lâmina é levada na água corrente para a
eliminação do excesso do corante.
4 ETAPA: é aplicado o fixador do corante (lugol) durante o período de
um minuto, para que o mesmo forme uma espécie de cristal que ajuda a
prender o corante nas células. Em seguida é feita a lavagem em água
corrente para retirada do excesso do lugol.
5 ETAPA: é aplicado um descorante (álcool ou cetona) até que todo o
corante tenha sido removido da lâmina. Esse descorante promove a
retirada do corante apenas nas células Gram negativas, pois essa
solução não é capaz de despigmentar as células gram positivas, pois o
cristal violeta é retido em sua espessa camada de peptideoglicano. Em
seguida a lâmina é lavada em água corrente para a remoção do excesso
do descorante.
6 ETAPA: aplicação do contracorante ou segundo corante (fucsina),
capaz de colorir apenas as células que foram descoloridas (gram
negativas). Em seguida é feito o enxágue desse corante em água.
7 ETAPA: após a secagem da lâmina, a mesma é levada no microscópio
onde deverá ser aplicado sobre a lâmina um óleo de imersão ou óleo
mineral que ajudará a focalizar os feixes de luz e permitir a visualização
da mesma.
8 ETAPA: no microscópio é ajustada a lente objetiva 100x para a
visualização, onde será possível identificar o tipo de bactéria e sua
morfologia (ex: bacilos gram negativos corados em vermelho ou cocos
gram positivos corados em roxo).
Coloração de Gram: Vermelho –Gram negativa e Roxo – Gram positiva
COLORAÇÃO DE GRAM
GRAM POSITIVA – ROXO 
São coradas de roxo pelo primeiro corante (cristal de violeta) e não
conseguem ser descoloridas pela ação do descorante (álcool ou cetona),
pois possuem uma camada de peptideoglicano muito grossa que retém o
cristal violeta e não permitem ser descoloridas ou coradas pelo segundo
corante (fucsina).
Cocos Gram-positivos (exceção do gênero Neisseria)
GRAM NEGATIVA – VERMELHO 
São coradas de vermelho ou rosa pelo segundo corante ou também
chamado de contracorante após serem descoloridas pelo descorante
(álcool ou cetona), pois não são capazes de fixar o primeiro corante (cristal
violeta) por possuírem uma camada de peptideoglicano muito fina.
Bastonetes gram-negativos (exceção dos gêneros Corynebacterium,
Listeria, Bacillus e Clostridium).
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
Existem bactérias cuja parede celular fogem da classificação como gram-positivas
e gram-negativas, pois possuem acima da camada de peptideoglicanos, uma camada
denominada Micolato Arabinogalactano, formada por polímeros de
arabinogalactano (açúcares) e revestida por uma porção lipídica de ácidos
micólicos. Esta constituição torna a parede celular hidrofóbica, dificultando a
penetração de corantes aquosos, bem como a ação do lugol e, portanto, impedindo
a identificação e a diferenciação desse tipo de bactéria através da coloração de
Gram.
Em 1882, um bacteriologista chamado Franz Ziehl e um patologista alemão
Friedrich Carl Adolf Neelsen, evidenciaram que alguns gêneros bacterianos, como
Micobacterium e Nocardia são capazes de resistir a descoloração com uma
solução de álcool-ácido, após tratamento com fucsina fenicada aquecida, de forma
que permanecem vermelhas, diferentemente de outras bactérias, que, por não
possuírem esta propriedade, apresentam a cor do corante de fundo, normalmente,
feita com azul de metileno.
Estes gêneros receberam a denominação de BAAR (Bacilos-Álcool-Ácido-
Resistente), e esta capacidade de álcool-ácido-resistência está relacionada à
hidrofobicidade da parede celular, assegurada pela presença de lipídeos como o
ácido micólico. Quanto à coloração, esta ficou conhecida como coloração de Ziehl-
Neelsen.
ETAPAS DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO ZIEHL-NEELSEN:
ETAPA 1: após a confecção do esfregaço, é fixada a amostra na lâmina pelo calor;
ETAPA 2: é depositado a solução de fucsina de Zieel que deve ser aquecida até a
emissão de vapores (sem ferver), esse procedimento deve ser feito 3 vezes e deve
durar até 5 minutos.
ETAPA 3: lavagem da lâmina com água e descoloração com solução de álcool-
ácido clorídrico a 1%.
ETAPA 4: o esfregaço deve ser coberto com azul de metileno, por meio minuto, a
lâmina é lavada com água corrente e, após secar, está pronta para ser observada
no microscópio óptico (objetiva 100 X).
RESULTADO: os BAAR serão visualizados como bastonetesfinos, vermelhos,
sobre fundo corado em azul.
Bacilos (rosa) evidenciados pela coloração de Ziehl-Neelsen
em um paciente com tuberculose pulmonar avançada e AIDS, amostra escarro.
A análise do escarro pela coloração de BAAR é um método simples, barato e
muito importante para o diagnóstico da tuberculose, pois confere um resultado
precoce (quando realizado de forma correta). Além disso, permite o
acompanhamento a evolução do tratamento de pacientes com essa doença.
Pacientes com sinais e sintomas (febre vespertina, tosse persistente por mais de 3
semanas, emagrecimento, com imagem no raio x) que apresentam bacilos gram-
negativos no escarro em amostras coradas pela ZH indicam a presença do M.
tuberculosis. No entanto, é importante destacar que outras micobactérias se
coram por essa técnica e esse método. Para diferenciar as espécies, é necessário
cultura.
Essa técnica pode ser realizada em outras amostras, como: urina, líquidos pleurais,
lavado bronco alveolar, aspirado traqueal, biópsias e líquor.
COLORAÇÃO DE ALBERT-LAYBOURN
Algumas bactérias apresentam corpúsculos citoplasmáticos (corpúsculos
metacromáticos ou corpúsculos de Babes Ernst) nas suas extremidades e que
podem ser corados pelo Lugol forte (com cor marrom), em contraste com o corpo
do bacilo, que se cora em esverdeado/azulado pela solução de Laybourn. Esta
técnica é uma técnica simples que foi sugerida em 1920 por Henry Albert e,
posteriormente, foi modificada por Ross Laybourn, em 1924.
Os corpúsculos citoplasmáticos são encontrados no gênero Corynebacterium
diphtheriae, agente causador de sintomas clínicos característicos da difteria.
Desta forma, a pesquisa por bacilos metacromáticos cuidadosamente coletados da
oro e nasofaringe serve como um método auxiliar no diagnóstico da difteria.
ETAPAS DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO ALBERT-LAYBOURN:
ETAPA 1: após a confecção do esfregaço, este é corado com a solução de Albert-
Layborn durante 5 minutos.
ETAPA 2: o corante deve ser retirado e a lâmina coberta com a solução de Lugol
forte, por 2 minutos.
ETAPA 3: com as lâminas secas, elas podem ser analisadas no microscópio.
RESULTADO: é considerado positivo quando há presença de grânulos
metacromáticos no citoplasma de bacilos com morfologia em paliçada/letras
chinesas. Tais achados sugerem bacilo diftérico e devem ser comunicados
imediatamente ao médico.
Ilustração microscópica de Corynebacterium diphtheria.
COLORAÇÃO DE FONTANA TRIBONDEAU
O método foi desenvolvido em 1920, com objetivo de auxiliar a visualização de
bactérias espiraladas (Leptospira interrogans e treponemas). Essas bactérias são
muito delgadas e não coram completamente pela coloração de Gram. Esta
coloração não é considerada verdadeira, pois consiste em uma técnica de
impregnação pela prata. Atualmente, os laboratórios têm utilizado mais a
microscopia de campo escuro a fresco para visualizá-las.
ETAPAS DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE FONTANA TRIBONDEAU:
ETAPA 1: A partir de esfregaços finos, derramar sobre a lâmina algumas gotas da
solução fixadora (renová-la 3 vezes, por 30 segundos).
ETAPA 2: cobrir com solução mordente, aquecendo a lâmina até emitir vapores.
ETAPA 3: Após 30 segundos, lavar em água corrente, acrescentar o nitrato de
prata amoniacal, aquecendo rapidamente a lâmina até ocorrer novamente a
emissão de vapores, deixando agir por 30 segundos (a preparação toma a cor
marrom).
ETAPA 4: Lavar bem em água corrente, secar com papel de filtro e examinar a
lâmina ao microscópio com a objetiva de imersão (x100).
RESULTADO: As espiroquetas aparecem amarronzadas/negras, sobre um fundo
amarelo-castanho ou marrom claro.
Ilustração microscópica de Leptospira interrogans e treponemas.
COLORAÇÃO PARA FLAGELOS
Os flagelos são estruturas bacterianas responsáveis pela locomoção e são
constituídos por moléculas proteicas denominadas flagelinas. Entretanto, como
são finos, delicados e se despolimerizam com facilidade, é necessário aplicar
algumas técnicas para aumentar o diâmetro dos flagelos, de forma a torná-los
visíveis pela microscopia. A demonstração do flagelo ocorre devido à ligação do
corante ao ácido tânico, tornando-o mais espesso.
ETAPAS DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO PARA FLAGELOS:
ETAPA 1: Cultivar a bactéria em estudo, de acordo com suas preferências físicas,
em uma placa de ágar infusão de cérebro-coração (BHI) ou em ágar tríptico de
soja (com ou sem sangue).
ETAPA 2: Coletar delicadamente uma alíquota do crescimento com uma alça de
platina e transferi-la para um tubo, contendo cerca de 3 mL de água destilada.
Inverter o tubo uma vez para homogeneizar a suspensão. Colocar uma gota desta
suspensão sobre uma lâmina inclinada a 45o e deixar secar ao ar.
ETAPA 3: Cobrir a lâmina com uma mistura de corantes, que inclui fucsina e ácido
tânico (fórmula abaixo), e deixar por 5 minutos, até que um brilho metálico
esverdeado cubra metade da área. Não deixar o corante secar sobre a lâmina.
ETAPA 4: Retirar o corante, enxaguando com água. Secar e observar ao
microscópio, com objetiva de imersão.
COLORAÇÃO PARA ESPOROS COM VERDE MALAQUITA 
(WIRTZ-CONKLIN)
A parede do esporo é impermeável, mas pode ser atravessada por corantes (como
o verde de malaquita) quando submetidos ao aquecimento, o que confere aos
esporos uma cor verde intensa. Associado a isso, essa estrutura não consegue ser
descorada pela ação do álcool, mas as outras estruturas podem ser descoradas.
Para melhorar a visualização e como contraste (contracorante), utiliza-se a
safranina, que cora outras estruturas em vermelho, facilitando a diferenciação dos
esporos.
ETAPAS DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO PARA ESPOROS:
ETAPA 1: Preparar esfregaço e fixar pelo calor.
ETAPA 2: Cobrir o esfregaço com o corante verde malaquita.
ETAPA 3: Aquecer água em um béquer, até a emissão de vapores. Colocar a
lâmina sobre este béquer, mantendo o corante aquecido por 5 minutos.
Alternativamente, cobrir a lâmina com verde malaquita e aproximar de uma chama
até que desprenda vapor, sem deixar que o corante ferva. Afastar do fogo e, após 1
a 2 minutos, repetir a operação por 3 a 4 vezes.
ETAPA 4: Lavar suavemente com água, evitando o choque térmico, que poderá
quebrar a lâmina.
ETAPA 5: Adicionar a solução de safranina por 30 segundos
ETAPA 6: Lavar e secar.
ETAPA 7: Observar ao microscópio com objetiva de imersão. Bactéria C. difficile. Bactéria formadora de esporos.
COLORAÇÃO DE CÁPSULA
A cápsula envolve a parede celular, é produzida por algumas espécies bactérias e
representa uma estrutura muito importante para a patogenicidade da bactéria.
Isso porque, confere a ação antifagocitária, funciona como um mecanismo de fuga
da ação da fagocitose pelas células do sistema imunológico do indivíduo.
A cápsula é uma camada gelatinosa composta de açúcares ou polipeptídeos, com
caráter hidrossolúvel, que pode ser facilmente removida durante as etapas de
lavagem durante a coloração, o que dificulta a sua coloração. Além disso, a fixação
dos esfregaços pelo calor, amplamente utilizado para as outras colorações, pode
levar a contração da célula e a formação de um halo ao redor do microrganismo,
que pode ser facilmente confundido com a cápsula. Entretanto, é possível
visualizar bactérias produtoras de cápsula a partir da coloração pela tinta da
china. Essa coloração é conhecida como coloração negativa, pois a cápsula rejeita
as partículas do corante. Se as bactérias apresentarem cápsula, será possível
verificar microrganismos descoradas envoltas por um halo (cápsula) sobre um
fundo negro.
ETAPAS DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO CAPSULA TINTA DA CHINA:
ETAPA 1: As colônias suspeitas devem ser cultivadas em caldo rico (BHI).
ETAPA 2: Colocar 1 ou 2 gotas de cultura em uma lâmina.
ETAPA 3: Depositar na lâmina uma gota de tinta da China ao lado das gotas de
cultura.
ETAPA 4: Cobrir com uma lamínula, comprimindo-a entre folhas de papel de
filtro, para se obter uma quantidade bem tênue de corante e material.
ETAPA 5: Observar ao microscópio óptico (40X).
Coloração negativa de cápsula.
PRINCIPAIS BACTÉRIAS DE IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Diferenciação de bactériaspelo formato, cor após a coloração de Gram,
necessidade de oxigênio e formação ou não esporos:
Formato: as bactérias são seres unicelulares, e o formato de suas células é
característico de cada espécie. As instruções para a forma da célula estão
guardadas no cromossomo bacteriano, e assim bactérias “filhas” herdam essa
informação da bactéria que lhe deu origem. Portanto, saber a forma da célula de
uma bactéria é uma grande dica para descobrir com qual espécie estamos lidando.
Existem alguns formatos possíveis, como cocos, bacilos e espirais.
Coloração de Gram: permite definir uma cor e evidencia a forma para a maioria
das espécies de bactéria. A técnica diferencia esses microrganismos de acordo
com a porção mais externa da célula: uma camada espessa de peptideoglicano ou
uma membrana de fosfolipídeos. As que têm o peptiodeoglicano na parte externa
se coram de roxo pelo corante cristal violeta, e mantém essa cor até o final do
método. Por isso, são chamadas de Gram-positivas. Já as que possuem uma
membrana externa de fosfolipídeos, perdem a cor roxa em uma etapa do método e
depois são “recoradas” em vermelho, sendo chamadas Gram-negativas.
Utilização do oxigênio: algumas espécies bacterianas usam essa molécula para
produzir energia, outras podem ou não utilizar, e ainda existem aquelas que nunca
usam o oxigênio. Baseado nisso, podemos chamar as bactérias de aeróbicas,
facultativa ou anaeróbicas, respectivamente.
Para algumas bactérias anaeróbicas o oxigênio é tóxico e, por isso, elas se
transformam em esporo quando entram em contato com ele. Também chamado de
endósporo, essa estrutura é uma forma de vida que a célula bacteriana assume
permitindo sua sobrevivência em condições inapropriadas para vida.
Meio de cultura: é um ambiente que proporciona condições ideais para o
crescimento de bactérias. Se o meio de cultura tiver consistência sólida, após um
determinado período, nós conseguimos visualizar colônias. O ágar adicionado em
meios de cultura sólidos é aquele mesmo da gelatina, que pode ser comprado em
lojas de alimentos. Cada colônia é um aglomerado visível de milhões de células
bacterianas.
Temperatura: para o crescimento em meio de cultura de bactérias que causam
infeções em seres humanos é quase sempre próxima de 36°C, já que essa é a nossa
temperatura média corporal. Por isso, quando queremos obter o crescimento de
bactérias em laboratório, costumamos deixar o meio de cultura dentro de estufas
com temperaturas entre 35 e 37°C
Sequência de reagentes usados no método de coloração de Gram. A 
etapa 1 representa as células bacterinas antes de serem coradas e, ao 
final da etapa 5, observamos as cores que as bactérias gram-positivas e 
gram-negativas adquirem após a técnica.
Crescimento bacteriano em meio de cultura Ágar Sangue. Cada ponto no meio de 
cultura é uma colônia que cresceu a partir da amostra clínica com bactéria que foi 
semeada nesse ambiente.
PRINCIPAIS BACTÉRIAS DE IMPORTÂNCIA CLÍNICA
COCOS GRAM-POSITIVOS E GRAM-NEGATIVOS: bactérias chamadas
de cocos apresentam células redondas se observadas ao microscópio. Os cocos
costumam se organizar em arranjos característicos, e isso pode ser usado para sua
identificação laboratorial. Esses arranjos acontecem, pois, após a divisão, as
células ainda continuam bem próximas. Quando a bactéria em forma de coco se
divide para formar novas bactérias (“filhas”), o formato redondo da célula
possibilita que a divisão seja feita em diferentes direções, chamados de planos de
divisão.Quando a divisão acontece em apenas um plano, os cocos podem ser
organizar em fileira ou em duplas e, quando ocorre em várias direções, a
organização fica mais complexa, originando, por exemplo, cachos de células
bacterianas. Dois gêneros muito conhecidos de cocos são os Staphylococcus e os
Streptococcus, que possuem células organizadas em cachos e fileiras,
respectivamente.
Fotografia da imagem observada ao microscópio óptico de uma espécie de 
Staphylococcus. É possível observar aglomerados das células em formas 
de coco, que são chamados de cachos. Perceba que essa espécie é gram-
positiva, pois está corada em roxo.
STAPHYLOCOCCUS: é um gênero de bactérias gram-positivas. No
laboratório, crescem bem em diferentes tipos de meios de cultura, com
concentração normal a baixa de oxigênio. Eles são capazes de fermentar
carboidratos e, consequentemente, liberar substâncias ácidas, o que pode mudar o
pH do meio de cultura onde essa bactéria foi semeada. Uma característica
importante das espécies desse gênero é que elas produzem a enzima catalase, que
decompõe o peróxido de hidrogênio, liberando água e gás oxigênio. Na limpeza de
um ferimento com água oxigenada, o surgimento de bolhas é uma reação típica
produzida pela catalase. Em uma lâmina, uma gota de peróxido de hidrogênio
(H2O2) é colocada em contato com a colônia suspeita. A presença de bolhas
(como na imagem) indica que a bactéria pertence ao gênero Staphylococcus.
Espécie Staphylococcus aureus: é um patógeno humano muito comum, causando
desde pequenas infecções de pele até síndromes tóxicas mais perigosas.
Observadas em cultura, suas colônias têm cor amarela característica, daí o nome
da espécie “aureus”, que remete ao ouro. Elas podem crescer em ambientes com
concentração de sal mais elevada e, por isso, se desenvolvem bem na nossa pele,
mesmo o suor sendo “salgado”. S. aureus também produz o fator de agregação
(chamado de fator clumping) e a enzima coagulase, que levam á coagulação
sanguínea. O teste da coagulase é muito útil na identificação de S. aureus.
Essa espécie pode produz importantes toxinas como a leucocidina de Panton-
Valentine, toxina esfoliativa e a toxina da síndrome do choque tóxico, que
contribuem para os quadros mais graves de infecção.
Espécies de Staphylococcus coagulase: são comuns na nossa microbiota normal e,
em algumas situações específicas, podem causar doenças, como infecções
associadas a cateteres em pessoas com sistema imunológico enfraquecido. Esse
grupo inclui diferentes espécies, mas é comum nos referimos a elas em conjunto,
usando para isso a característica que as diferencia do S. aureus (não produzir a
enzima coagulase).
DIFERENCIAÇÃO ENTRE GÊNEROS STREPTOCOCCUS
A diferenciação dos gêneros Streptococcus pode ser feita 
através da análise do padrão hemolítico ou reação a 
antimicrobianos.
PERFIL HEMOLÍTICO
ALFA: lise parcial das hemácias – S. pneumoniae, S. gruo viridans
BETA: lise total das hemácias – S pyogenes, S. agalactiae
GAMA: não há lise de hemácias – Outros estreptococos e enterococcus
CARACTERÍSTICAS DO GÊNERO STREPTOCOCCUS
PRINCIPAIS BACTÉRIAS DE IMPORTÂNCIA CLÍNICA
STREPTOCOCCUS: é um outro gênero de cocos gram-positivos que utilizam o
oxigênio de forma facultativa. São considerados fastidiosos, pois precisam de
nutrientes adicionais no meio de cultura, como a adição de sangue. Ao contrário
dos Staphylococcus, não produzem a enzima catalase. Muitas espécies desse
grupo são capazes de produzir enzimas que destroem hemácias (hemolisinas). A
atividade dessas enzimas varia entre destruição parcial e destruição completa das
hemácias quando testadas em laboratório.
É comum separar os Streptococcus em grupos para facilitar o estudo desse
gênero. Essa separação pode se basear, tanto no tipo de hemólise que é produzida,
quanto pela presença de determinados açúcares na parede celular de espécies do
gênero. A classificação dos Streptococcus usando como critério os açúcares da
parede celular deu origem aos grupos de Lancefield (usamos letras para nomear
cada grupo).
Fotografia da imagem observada ao microscópio óptico de uma espécie de 
Streptococcus. É possível observar fileiras das células em formas de coco. Perceba 
que essa espécie é gram-positiva pois está corada em roxo. 
• Streptococcus pyogenes: associados a infecções invasivas como erisipela.
• Streptococcus agalactiae: importantes agentes de infecções em recém-
nascidos.
• Streptococcus pneumoniae: agentes de pneumonia bacteriana.
Para diferenciar essas espécies no laboratório, podemos usar meio decultura
suplementado com sangue, que torna o meio mais nutritivo e permite identificar
quando a bactéria gera hemólise (lise/ruptura das hemácias). Sobre S. pneumoniae
vale destacar que os pneumococos (como também são chamados) costumam se
organizar em pares quando observados ao microscópio e que podem possuir
cápsula. Essa cápsula pode ser formada por diferentes tipos de polissacarídeos,
sendo essa constituição usada na classificação da espécie.
ENTEROCOCCUS: também são gram-positivas e não produzem a enzima
catalase, assim como os Streptococcus. Destacam-se por crescer em ampla
variação de temperatura (10 a 45°C) e tolerar concentrações de sal um pouco
elevadas. Enterococcus faecalis é o principal enterococo causador de infecções
humanas, seguido pela espécie Enterococcus faecium. Essas espécies são mais
comuns como causa de infecções em pacientes internados em hospitais, causando
o que chamamos de Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS).
NEISSERIA: bactérias gram-negativas em forma de cocos que causam
importantes infecções em humanos. Esse gênero inclui as espécies Neisseria
gonorrhoeae (responsável pela gonorreia) e Neisseria meningitidis (agente de
meningite bacteriana). Usando o microscópio óptico, observamos que essas
espécies, geralmente, se organizam aos pares, e é comum usarmos os nomes
gonococo e meningococo para referimo-nos a elas. No laboratório, N.
gonorrhoeae e N. meningitidis exigem determinados tipos de nutrientes para
crescer, por isso, as cultivamos em meios de cultura enriquecidos (“ricos”) desses
fatores de crescimento. O tempo para visualizarmos as colônias é um pouco maior
que o normal (48 horas) e, mesmo sendo aeróbicas, é necessário que o ambiente
tenha 5% de CO2 (conseguimos isso colocando as placas de meio de culturas em
garrafas apropriadas).
BACILOS GRAM-NEGATIVOS
Bacilos ou bastonetes: a divisão dessa células acontece apenas no plano vertical e
em seguida, elas se separam e, por isso, não é comum encontrar organizações
celulares típicas. Os bacilos gram-negativos são mais comumente identificados em
laboratório como agentes de infecções humanas quando comparados aos bacilos
gram-positivos.
ENTEROBACTÉRIAS E O DOS BGN NÃO FERMENTADORES: vivem no
nosso intestino, e algumas podem causar infecções. Diferenciar esse grupo dos
BGN não fermentadores pelo fato de serem capazes de fermentar carboidratos.
Isso é importante no laboratório, pois a fermentação produz ácido, esse ácido
modifica o pH do meio de cultura, e podemos detectar essa mudança usando meios
com corantes indicadores de pH. Os BGNs não exigem nutrientes específicos
para seu crescimento, por isso, podem ser cultivadas em diferentes meios de
cultura.
ENTEROBACTÉRIAS E O DOS BGN FERMENTADORES: capazes de
produzir energia através da respiração aeróbica e da fermentação, por isso
crescem em ambientes com ou sem oxigênio, consideradas facultativas.
• Escherichia Coli: convivem em harmonia no intestino humano e causam doenças
só em situações específicas.
• Salmonela e Shigella: Causam doença sempre que presentes em número
suficiente.
• Klebsiella pneumoniae: são conhecidas por causar infecções em pessoas
internadas em hospitais, causando gastroenterites, pneumonia, meningite e
infecções do trato urinário.
ENTEROBACTÉRIAS E O DOS BGN NÃO FERMENTADORES: só
crescem em ambiente com oxigênio, pois realizam apenas a respiração aeróbica,
não são comuns na nossa microbiota normal, mas são amplamente distribuídas no
ambiente. Os principais patógenos humanos desse grupo são as espécies:
• Pseudomonas aeruginosa: são conhecidas causadoras de infecções hospitalar.
Uma característica marcante e bastante conhecida de P. aeruginosa é que suas
colônias costumam ter uma cor esverdeada devido a produção de pigmentos
próprios.
• Acinetobacter baumannii: também é conhecida por causar infecções em
pacientes hospitalares. Destacam-se pela aparência de cocobacilos (bacilos
bem curtos).
BGNS NÃO ENTEROBACTÉRIAS: causam infecções gastrointestinais;
• Vibrio cholerae: sua célula possui formato de vírgula por isso, também é
conhecida como vibrião colérico. O lipopolissacarídeo “O” da sua
membrana externa possui muitas variações, sendo usado para nomear
grupos específicos dentro dessa espécie. Apenas alguns desses grupos
são capazes de provocar a cólera. Isso acontece por conta da produção
de uma toxina, que provoca diarreia profusa, com grande perda de água
durante a evacuação. V. cholerae suporta concentrações elevadas de sal
no ambiente, e costuma crescer rapidamente em meios de cultura ricos
em nutrientes.
• Campylobacter jejuni: que também possui célula curva ou em forma de
vírgula. Essa bactéria é comum na microbiota do intestino de animais, e
causa infecções intestinais em seres humanos após ingestão de alimentos
mal cozidos e água contaminada. Para diagnosticar a presença dessa
bactéria no nosso intestino, basta cultivar fezes em meio de cultura
apropriado, em um ambiente com 5 a 10% de oxigênio e, portanto, são
considerados microaerófilos.
BGN COM CÉLULAS BEM PEQUENAS:
• Bordetella pertussis: agente da coqueluche, uma infecção respiratória
conhecida também como tosse comprida. O diagnóstico dessa doença é
feito, principalmente, com base nos sinais clínicos do paciente. O
crescimento da B. pertussis é lento, então, a placa de meio de cultura
deve ser mantida por até sete dias. Em caso de resultados positivos,
podemos coletar uma parte da colônia e visualizar ao microscópio
pequenos bastonetes gram-negativos.
• Haemophilus influenzae: pequeno bastonete que exige nutrientes
específicos para o seu crescimento, mas as colônias são vistas depois de
um tempo padrão de 24 horas. Essa bactéria faz parte da nossa
microbiota normal do trato respiratório superior, mas pode causar
infecções respiratórias, como faringite e pneumonias e, nos piores casos,
meningites. A presença de uma cápsula de polissacarídeos (açúcares)
envolvendo a célula dessa espécie é usada para definir os “tipos” de H.
influenzae, por exemplo, o H. influenzae tipo b, para qual já existe vacina
disponível.
OUTRAS BACTÉRIAS
OUTRAS BACTÉRIAS: apresentam parede celular atípica e não podem ser
diferenciadas por Gram e, por isso, não se enquadram como gram-positivos ou
gram-negativos.
MICOBACTÉRIAS MYCOBACTERIUM: agente etiológico de doenças
importantes, como a espécie Mycobacterium tuberculosis que é responsável pela
tuberculose. Na parte externa de bactérias do gênero Mycobacterium,
encontramos uma extensa camada de ácido micólico, um tipo de lipídeo com
pouquíssima afinidade pela água (hidrofóbico). Essa propriedade dificulta a
penetração de muitos corantes aquosos na célula, incluindo aqueles usados na
coloração de Gram. Com isso, temos que usar um corante com adição de fenol e
ainda é necessário aquecer a lâmina para aumentar a sua penetração. Uma vez
dentro da célula, o corante não consegue ser retirado nem mesmo se a célula for
exposta a uma solução álcool-ácida (BAAR).
• Mycobacterium tuberculosis: também conhecida como Bacilo de Koch
(BK). Um grupo de diferentes espécies de bactéria forma o complexo
Mycobacterium tuberculosis. Além da M. tuberculosis, esse grupo inclui
M. bovis, M. africanum, M. canetti, M. microti, M. pinnipedi e M. caprae.
Essas outras espécies devem ser consideradas, principalmente, se
estamos lidando com pacientes imunodeficientes.
PARASITAS INTRACELULARES OBRIGATÓRIAS:
• Chlamydia trachomatis: responsável por causar doenças como tracoma,
uretrite, cervicite e pneumonia infantil. Dentro das células humanas
infectadas, essa bactéria produz inclusões citoplasmáticas compactas,
que, após coloração de Giemsa, são observadas como bolinhas bem
coradas no citoplasma da célula. Para o diagnóstico, podemos verificar
essas inclusões pela análise do material clínico ao microscópio, ou ainda, a
detecção de anticorpos específicos contra a C. trachomatis, que são
desenvolvidos pelo sistema imune do doente.
Esquema da parede celular (8) das micobactérias. Os ácidos micólicos estão 
representados pelo número 2, formando uma barreirahidrofóbica. As demais 
estruturas são lipídios (1), polissacarídeos (3), peptidoglicano (4), membrana 
plasmática (5), lipoarabinomanano (LAM) (6) e manosídeo de fosfatidilinositol (7). . Chlamydia trachomatis
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO LABORATORIAL PARA INFECÇÕES 
BACTERIANAS DO TRATO RESPIRATÓRIO
TRATO RESPIRATÓRIO SUPERIOR: FARINGITE, TONSILITE, OTITE E
SINUSITE:
• Streptococcus pyogenes: é um Streptococcus do grupo A de Lancefield,
também chamada de faringite estreptocócica, que acomete as membranas
mucosas da garganta e causa tonsilite, inflamação das tonsilas. Em casos raros,
quando o S. pyogenes adquiriu a capacidade de produzir a toxina eritogênica, a
infecção evolui para febre escarlate, provocando erupções cutâneas de
coloração avermelhada, febre alta e alterações na língua. Outra possível
complicação é a glomerulonefrite, que pode se desenvolver entre uma até
quatro semanas após a faringite estreptocócica. Na glomerulonefrite, os
anticorpos produzidos pelo sistema imune do paciente se combinam com
antígenos produzidos pela bactéria e depois depositam na membrana dos
glomérulos renais, levando a um processo inflamatório nesse local.
Método de diagnóstico: identificar a bactéria a partir de um swab da garganta do
paciente. A forma mais rápida de liberar esse laudo é usando kits de testes rápidos
para detecção de antígenos específicos da bactéria. Esse antígeno é o açúcar da
parede celular exclusivo do grupo A de Lancefild. O antígeno é extraído do swab
pela ação de uma enzima ou substância química, e depois alguma técnica
imunológica, como ensaio imunoenzimático ou aglutinação, permite identificar o
antígeno exclusivo de S. pyogenes.
Outra forma de identificar a bactéria é através da semeadura do swab em meio de
cultura do tipo Ágar Sangue, considerado o método diagnóstico de referência. A
hemolisina produzida pelo S. pyogenes destrói completamente as hemácias do
sangue de carneiro presente nesse meio de cultura. Onde ocorre o crescimento de
colônias, a cor do Ágar Sangue passa de vermelha para transparente, o que
caracteriza β-hemólise, ou hemólise total. Depois de obter colônias, podemos
fazer a coloração de Gram e confirmar que se trata de um coco gram-positivo.
Dois testes importantes caracterizam o S. pyogenes:
✓ Teste do PYR (pyrrolidonil arilamidase): determina a atividade da enzima PYR,
produzida por essa espécie bacteriana, que pode ser detectada usando um
reagente comercialmente disponível.
✓ Sensibilidade à bacitracina: é a sensibilidade ao antibiótico bacitracina, que inibe
o crescimento dessa espécie.
• Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae: principais
bactérias causadoras da otite média e sinusite, infecção da membrana que
recobre seios nasais, cavidades que se localizam ao redor do nariz, maçãs
do rosto e olhos.
Métodos de diagnósticos: tanto para otite média quanto para sinusite, é
difícil obter amostras clínicas válidas do paciente. O método de referência
implica em um procedimento invasivo, e muitas vezes nenhuma bactéria é
detectada. Em ambos os casos, os sinais clínicos e os sintomas do paciente
são a base para o diagnóstico, e para sinusite os exames de imagem são
muito úteis.
TRATO RESPIRATÓRIO INFERIOR: INFECÇÕES AGUDAS
(COQUELUCHE, BRONQUITE, BRONQUIOLITE E PNEUMONIA) E
CRÔNICAS (TUBERCULOSE):
• Bordetella pertussis: bactéria causadora da coqueluche, doença atinge
crianças que não tomam as três doses de vacina DTP ou adultos nos
quais a vacina perdeu o efeito ao longo dos anos. Os sintomas na fase
inicial, conhecida como catarral, se assemelha há um resfriado e evoluí
para a fase paroxística, quando a bactéria adere e destrói os cílios da
traqueia, o que leva ao acúmulo do muco e progressão da tosse que pode
comprometer a respiração. O esforço para a entrada do ar produz um
som uivante na tosse, daí o nome popular “tosse comprida” dessa doença.
Método de diagnóstico: é feito pela cultura do swab colhido da nasofaringe
do doente. A semeadura da amostra precisa ser feita em meio de cultura
suplementado com nutrientes especiais e antibiótico, já que é uma bactéria
com exigências nutricionais. Pode-se usar meios como Ágar Regan-Lowe
ou Ágar Bordet & Gengou. O crescimento da B. pertussis é lento, a
incubação precisa ser feita por até sete dias, em ambiente aeróbico e úmido.
A célula bacteriana se cora fracamente pelo Gram, sendo recomendado
deixar o último corante por dois minutos. Por conta de demora para cultivar
B. pertussis em laboratório, é recomendando aplicar técnicas que acelerem
o diagnóstico. Dentre elas, estão o teste sorológico e o diagnóstico
molecular pela PCR (Reação em Cadeia da Polimerase).
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO LABORATORIAL PARA INFECÇÕES 
BACTERIANAS DO TRATO RESPIRATÓRIO
Bronquite e bronquiolite: são infecções limitadas a traqueia e aos brônquios. As
formas agudas, de início rápido, quase sempre são causadas por vírus. O
diagnóstico microbiológico, com cultivo de bactérias por exemplo, não é indicado
para essas infecções. O tratamento é voltado para reverter os sintomas, como o
uso de broncodiladores.
Streptococcus pneumoniae: é o agente bacteriano mais frequente da pneumonia
pneumocócica, infecção aguda de todo o pulmão. Considerada a pneumonia clássica,
os sintomas como febre alta, dificuldade de respirar e dor lombar surgem logo. A
ocorrência desse tipo de pneumonia pode diminuir ao longo dos próximos anos pelo
acesso a vacinas disponíveis contra alguns sorotipos de pneumococos, que têm
como alvo o açúcar da cápsula bacteriana.
Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa: são bactérias do tipo
Staphylococcus auereus, causadoras de pneumonia, geralmente adquiridas após um
período maior ou igual a 48 horas de admissão no hospital e associadas a situações
em que o paciente está sob ventilação mecânica.
Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae e Legionella pneumophila:
são causadoras de pneumonias bacterianas atípicas. O diagnóstico laboratorial que
define o agente da pneumonia é muito importante, porque é a base para a escolha
do tratamento adequado, diminuindo do risco de óbito.
Material de coleta para o diagnóstico de pneumonias: pode ser escarro, aspirado
traqueal, lavado broncoalveolar, material de biópsia e sangue. Swab das vias aéreas
superiores geralmente não são úteis pois acabam refletindo a microbiota normal.
Em relação ao escarro, deve ser coletado logo pela manhã e encaminhado
diretamente ao laboratório. O aspirado está sujeito a contaminações por
microrganismos que colonizam pacientes entubados ou com ventilação mecânica. Já
o lavado broncoalveolar é mais seguro nesse aspecto.
As biópsias são mais indicadas para imunocomprometidos e crianças que não 
reagem bem ao tratamento. A cultura de sangue é usada quando existe 
suspeita de que a bactéria tenha atingido no sangue do paciente. Todas as 
amostras respiratórias podem ser armazenadas por até 2 horas em 
temperatura ambiente, e até 24 horas em geladeira.
CRITÉRIOS PARA DIAGNÓSTICO DE PNEUMONIA
Primeiramente é preciso investigar a possibilidade de pneumonia
pneumocócica, por ser a mais prevalente.
Método: o material clínico deve ser semeado em Ágar Sangue e incubado na
presença de 5% de CO2. A hemólise parcial aponta para o Streptococcus
pneumoniae, já que essa espécie é α-hemolítica. A partir desse crescimento,
a coloração de Gram pode ser realizada, com a intenção de confirmar a
presença de cocos gram-positivos.
Outros dois testes confirmatórios são a solubilidade em bile e a sensibilidade
a optoquina. A célula do S. pneumoniae sofre lise pela ação dos sais biliares
e é sensível ao antimicrobiano optoquina, o que não acontece com outros
cocos gram-positivos α-hemolíticos.
O teste mais atual para detecção de pneumococos é identificar um antígeno
específico dessa bactéria na urina do paciente, de forma muito rápida e
prática. No entanto, o resultado negativo precisa ser confirmado por cultura
do material. Se a causa da pneumonia não for a espécie S. pneumoniae, a
próxima suspeita deve ser a bactéria Haemophilus influenzae. A coloração
de Gram diretodo escarro é capaz de diferenciar H. influenzae de S.
pneumoniae, pois o primeiro é um cocobacilo gram-negativo, enquanto o
segundo é um coco gram-positivo. Para cultura e observação das colônias,
usamos o meio de cultura Ágar Chocolate, que tem na sua composição
hemácias lisadas, uma rica fonte de nutrientes para bactérias exigentes.
Outro teste importante é verificar a necessidade da bactéria pelo fator X
(hemina ou hematina) e pelo fator V (NAD ou coenzima I). Se a espécie
isolada do material for realmente H. influenzae, ela irá crescer na presença
desses fatores, porque precisa deles.
Teste sorológico: detecta anticorpos no sangue do paciente que foram
produzidos contra a bactéria, mas eles demoram algumas semanas para
aparecer desde o início da infecção.
Teste molecular: identifica o DNA da bactéria. É considerado o método mais
eficiente de diagnóstico para coqueluche. A escolha do método dependerá das
condições oferecidas pelo laboratório clínico e o quadro do paciente.
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO LABORATORIAL PARA INFECÇÕES 
BACTERIANAS DO TRATO RESPIRATÓRIO
Diagnóstico de pneumonias hospitalares: são encaminhados para cultura
diferentes tipos do amostras:
O escarro pode ser corado pela coloração de Gram e visto ao microscópio, um
recurso simples e que pode direcionar as próximas ações. Se forem amostras de
aspirado traqueal e lavado broncoalveolar, semeamos em meios de cultura como
Ágar MacConkey e Ágar Sangue para checar o aparecimento de colônias. Se o
agente for o S. aureus, vamos observar hemólise total em Ágar Sangue, e nenhum
crescimento em Ágar MacConkey. Em casos de bacilos gram-negativos, teremos
crescimento nos dois meios, e o Ágar MacConkey ainda vai nos dar dicas sobre a
fermentação.
Quando confirmada a presença de bastonetes gram-negativos, pode-se suspeitar
de espécies como Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e
Acinetobacter baumannii. Vários testes sobre as características bioquímicas
dessas espécies são necessários para chegar ao verdadeiro agente etiológico.
Colonização x Doença: na colonização, o microrganismo não causa doença, 
enquanto nos casos de infecção, a bactéria altera o estado de saúde do paciente, 
provocando sinais e sintomas. 
• Escarro: quando se trata de infecção, há um número elevado de leucócitos, baixa
contagem de células epiteliais (provenientes da saliva) e um único tipo
morfotintorial se destacará após coloração de Gram (coco gram-positivo OU
bacilos gram-negativos, por exemplo).
• Lavado broncoalveolar e aspirado traqueal: contabilizar o número de colônias
que apareceram no meio de cultura. Para que a infecção seja confirmada, esse
número deve ser superior ao limite mínimo estipulado pelas normas da ANVISA.
Chamamos essa técnica de cultura quantitativa.
Bactérias que causam pneumonias atípicas: não podem ser detectadas por
métodos de diagnóstico microbiológicos convencionais, como a cultura, não se
coram pelo método de Gram, dificilmente pode ser cultivada pelos meios de cultura
tradicionalmente usados no laboratório. A confirmação pode ser feita através de
técnicas imunológicas, que detectam o anticorpo produzido pelo sistema imune do
doente contra a bactéria ou algum antígeno específico do microrganismo ou
diagnóstico molecular, como a PCR, que identifica o material genético da bactéria.
Tuberculose: é uma infecção crônica do trato respiratório inferior. A
doença se inicia quando a bactéria começa a invadir e se multiplicar dentro
dos macrófagos presentes nos alvéolos pulmonares. A doença avança
lentamente, à medida que mais macrófagos são destruídos, o que gera
inflamação e lesão do tecido pulmonar. O papel do sistema imune é
essencial e determina se a doença seguirá para fases mais graves. A
tuberculose incide com maior gravidade em pacientes imunossuprimidos,
como em portadores de HIV.
Material: o principal é o escarro, mas também podem ser enviados líquido
pleural, biópsia, entre outros. Esteja atento aos cuidados com a manipulação
desse material. As medidas de proteção aumentam de acordo com o tipo de
análise que será realizada. As mais básicas envolvem o exame direto do
material ao microscópio, quando é necessário, por exemplo, tratar a amostra
com hipoclorito de sódio a 5% antes de preparar a lâmina, para inativar a
bactéria. Além disso, existem outros detalhes que envolvem cultivo da
bactéria e a avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos, que exigem um
ambiente laboratorial adaptado. A inviabilização com hipoclorito de sódio 5%
é uma opção quando o laboratório não tem cabine de segurança biológica.
Métodos:
Baciloscopia: primeira coloração utilizada para análise dos agentes da
tuberculose, com a amostra de escarro distendida diretamente na lâmina ou
anteriormente com a utilização de agentes mucolíticos que o tornam mais
fluido, como NaOH. O método de coloração mais usado é Ziehl-Neelsen,
onde os bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR), como as micobactérias,
adquirem coloração rosa forte, e outras células ficam coradas em azul,
quando vistos ao microscópio óptico.
Auramina: coloração onde os BAAR coram em amarelo alaranjado e o
restante da lâmina fica escura no microscópio de fluorescência. O resultado
da microscopia pode mostrar ausência de BAAR ou presença. A presença é
registrada de acordo com a quantidade de dessas células por campo de
visão, variado de raros (+) até numerosos (++++). A microscopia é simples,
rápida e de baixo custo, mas alguns casos podem não ser detectados por
esse método.
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO LABORATORIAL PARA INFECÇÕES 
BACTERIANAS DO TRATO RESPIRATÓRIO
Cultura do microrganismo: é considerado o padrão-ouro para o diagnóstico da
tuberculose pulmonar pela confirmação de resultados negativos para casos
suspeitos. Também usamos a cultura para o diagnóstico de tuberculose
extrapulmonar. A cultura de Mycobacterium é trabalhosa, porque essa bactéria
possui um crescimento lento e exige condições específicas. Além disso, algumas
amostras, como escarro e lavado broncoalveolar, precisam ser tratadas antes de
serem semeadas no meio de cultura, para eliminar microrganismos contaminantes.
• Meios de cultura: os meios mais utilizados são Lowenstein-Jensen e
Middlebrook. Devem ser incubados em estufa com 5 a 10% de CO2 por até 8
semanas, com verificação de crescimento de colônias duas vezes nas duas
primeiras semanas, e depois, uma vez por semana. Caso confirmado, segue-se
com a identificação da espécie de Mycobacterium, que se baseia no tempo
necessário para o crescimento visível, na aparência das colônias, na produção de
pigmento quando as colônias são expostas à luz e na realização de certas
análises bioquímicas.
• Testes automatizados: são mais rápidos, porém mais caros. O BACTEC é um
exemplo de teste automatizado que identifica a espécie M. tuberculoses através
da sua inibição pelo composto NAP (ρ-nitro-α- acetylamino-β-
hydroxypropiophenone), liberando o resultado em aproximadamente cinco dias.
• Testes moleculares: incluem a utilização de sondas que se ligam ao RNAr da
espécie alvo, ou ainda a amplificação de determinadas regiões do DNA da
bactéria pela técnica de PCR.
Teste imunológico da prova tuberculínica PPD (Purified Protein Derivative):
utilizado quando o objetivo for rastrear possíveis doentes em uma população de
risco para tuberculose. Esse exame verifica se casos suspeitos apresentam reação
imunológica contra uma proteína purificada da M. tuberculosis, que é injetada nas
camadas superficiais da pele do indivíduo. Se ocorrer reação positiva, a área em
torno da injeção ficará endurecida e vermelha após aproximadamente 72 horas.
Esse teste não significa que a doença está ativa, e sim um contato anterior com a
bactéria. Por isso, pessoas que já se vacinaram com a vacina BCG apresentam
PPD positivo. O PPD como indicativo de casos ativo de tuberculose é mais usado
para pacientes positivos para o vírus HIV e crianças bem novas, com imunidade
baixa.
• Teste de suscetibilidade de M. tuberculosis aos antimicrobianos: é de
grande importância clínica, pois a tuberculose é uma infecção adquirida