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MICOLOGIA CLÍNICA APRESENTAÇÃO UNIDADE 1 – MICOLOGIA BÁSICA CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS FUNGOS CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS FUNGOS IMPORTÂNCIA DOS FUNGOS IMPORTÂNCIA DOS FUNGOS IMPORTÂNCIA DOS FUNGOS IMPORTÂNCIA DOS FUNGOS IMPORTÂNCIA DOS FUNGOS FUNGOS DE INTERESSE CLÍNICO CARACTERÍSTICAS CELULARES CARACTERÍSTICAS CELULARES CARACTERÍSTICAS CELULARES CARACTERÍSTICAS CELULARES CARACTERÍSTICAS CELULARES CARACTERÍSTICAS CELULARES CARACTERÍSTICAS CELULARES CARACTERÍSTICAS CELULARES CÁPSULA ● natureza polissacarídea ● na porção mais externa da célula fúngica ● envolve a parede celular FUNÇÃO: ● auxilia o fungo na sua aderência ao tecido que ele infecta ● armazena água e nutrientes ● fornece proteção ao fungo. ● age nos fungos como um fator de virulência ● é de extrema importância principalmente do ponto de vista de diagnóstico METABOLISMO Desprovidos de clorofila, diferentemente das plantas, os fungos são seres heterotróficos, ou seja, não são capazes de sintetizar o próprio alimento. Saprófitas 🡪 degradando matéria orgânica em decomposição (morta) Parasita 🡪 os fungos, além de degradar matéria orgânica morta, também apresentam a capacidade de degradar matéria orgânica viva. O parasitismo também é designado pela interação entre duas espécies, em que apenas uma delas, o parasita se beneficia, enquanto o hospedeiro sofre danos. Ao decomporem matéria vegetal morta, os fungos reciclam elementos vitais. Esse processo ocorre através da utilização de enzimas extracelulares como as celulases. Todos os fungos são quimio-heterotróficos, necessitando de componentes orgânicos como fontes de energia. Para realizarem as atividades metabólicas, os fungos retiram compostos carbonados e nitrogênio. METABOLISMO Sob o ponto de vista metabólico, os fungos são bioquimicamente versáteis, produzindo metabólitos primários (por exemplo: ácido cítrico, etanol e glicerol), assim como metabólitos secundários (por exemplo: antibióticos e aflatoxinas). MICOLOGIA CLÍNICA TÓPICO 2:BIOLOGIA DOS FUNGOS CRESCIMENTO FÚNGICO CRESCIMENTO FÚNGICO CRESCIMENTO FÚNGICO CRESCIMENTO FÚNGICO CRESCIMENTO FÚNGICO FUNGOS FILAMENTOSOS FUNGOS FILAMENTOSOS FUNGOS FILAMENTOSOS As hifas, ainda, podem ser classificadas de acordo com outra característica visual, sua coloração. Elas podem ser transparentes, também chamadas de hifas hialinas ou podem apresentam uma coloração enegrecida ou marrom, então são denominadas como hifas demáceas FUNGOS FILAMENTOSOS A última classificação das hifas está relacionada à localização e à função das hifas. As hifas que estão em contato com o substrato orgânico ou, então, estão aderidas ao meio de cultura em uma placa, apresentam a função de nutrição do fungo e são chamadas de hifas vegetativas. Já as hifas que estão formando a parte mais externa da colônia têm a função de reprodução, promovendo a esporulação das estruturas fúngicas, essas são chamadas de hifas aéreas FUNGOS LEVEDURIFORMES FUNGOS LEVEDURIFORMES hifa verdadeira não apresenta constrição entre célula-mãe e o filamento pseudo-hifas apresentam constrições ao longo do filamento, como podemos facilmente FUNGOS LEVEDURIFORMES FUNGOS LEVEDURIFORMES A reprodução assexuada é denominada anamórfica ou imperfeita e ocorre através da produção de esporos. REPRODUÇÃO ASSEXUADA Esporgângio = vesículas que guardam os esporangiósporos. ● função de manter os esporos unidos até a maturação estar completa e, então, liberá-los todos de uma vez no ambiente. Esporangióforo = hifa especializada que brota da hifa fúngica ● responsável pela formação da columela na porção distal. A partir da columela que os esporangiósporos serão formados Conídios = esporos de vida livre, não precisam de uma vesícula. ● conídio significa pó → esporos são facilmente liberados e flutuam no ar como poeira. ● permanecem aderidos às fiálides e são destacados e liberados no ambiente conforme amadurecem. Conidióforo = tipo de hifa especializada, que brota da hifa fúngica ● região distal dos conidióforos forma-se a vesícula → estrutura semelhante a columela, onde as fiálides estão ancoradas Artroconídios: esporos que se formam pelo simples desmembramento das hifas septadas Além das classificações de conídios, eles ainda podem ser classificados de acordo com a forma como são produzidos: artroconídios, clamidoconídios ou blastoconídios. Clamidoconídios : arredondados e com parede celular espessa → resistência ao calor e à dessecação Blastoconídio: esporos formados por brotamento, que também pode ser conhecido como gemulação, normalmente encontrada nas leveduras pseudo-hifa - quando o broto não se separa pseudomicélio - conjunto de pseudo-hifas Essa característica pode ser uma forma que os fungos utilizam para invadir os tecidos, como é o caso do fungo Candida albicans, que faz parte da microbiota humana, em seu processo infeccioso REPRODUÇÃO FÚNGICA Os esporos sexuados são estruturas haploides, quando dois esporos sexuais haploides se fundem eles formam uma estrutura chamada de gametângios, gerando uma célula diploide que, a partir da fusão, gerará uma recombinação de genes e um novo ser. A classe dos zigomicetos produzem os esporos sexuados chamados de zigosporo. Os zigomicetos são fungos filamentosos, exemplo é o Rhizopus stolonifer, o conhecido mofo preto do pão REPRODUÇÃO FÚNGICA Fase sexuada 1. hifas de duas cepas diferentes entram em contato uma com a outra 2. gametas se formam nas extremidades das hifas. Da união das hifas ocorre o processo chamado de plasmogamia, onde os zigosporos são recombinados em células diploides chamada de zigoto. 3. a partir do zigoto então forma-se o esporângio que liberará uma nova recombinação de esporangiósporos ao ambiente REPRODUÇÃO FÚNGICA Os ascomicetos incluem fungos com hifas septadas e algumas leveduras. Seus esporos assexuais normalmente são conídios produzidos em longas cadeias a partir do conidióforo Reprodução sexuada 1. inicia-se basicamente como nos zigomicetos. A hifas do micélio vegetativo se formam, e nas suas extremidades os gametas haploides são gerados. 2. Os gametas quando se encontram no processo de plasmogamia, se fundem através da cariogamia. Do processo da fusão dos gametas são formados os ascósporos. 3. Um ascósporo se origina da fusão do núcleo de duas células que podem ser morfologicamente similares ou diferentes. 4. Esses esporos recombinados sofrem consequentes mitoses e, por fim, são liberados dos sacos que também são chamados de ascos. 5. Ao serem liberados, quando caem em locais propícios eles se desenvolvem através do brotamento das hifas, e a partir de então o ciclo recomeça http://www.youtube.com/watch?v=LSbBsu4P588 MICOLOGIA CLÍNICA TÓPICO 3: TÉCNICAS LABORATORIAIS EM MICOLOGIA TÉCNICAS LABORATORIAIS EM MICOLOGIA • Existem várias técnicas que são utilizadas para estabelecer e confirmar o diagnóstico de uma infecção fúngica. • A correta interpretação dos resultados laboratoriais não depende apenas de um profissional experiente, depende também da qualidade da coleta. • A amostra inicialmente passa pela fase pré-analítica quando é identificado a indicação de coleta, o armazenamento e transporte até o laboratório. • Em seguida, a fase analítica corresponde a todo o processo de identificação do microrganismo. • Esse processo engloba primeiramente a visualização do fungo diretamente do material biológico, também chamado de teste a fresco e, posteriormente, isolamento do microrganismo em cultivo, chamado de cultura fúngica TÉCNICAS LABORATORIAIS EM MICOLOGIA EXAME DIRETO • A identificação das espécies fúngicas requer uma série de etapas para o diagnóstico clínico. • A primeira etapa consiste na realização de um dos testes mais baratos e fáceis de serem realizados no laboratório clínico: o exame direto.• Também conhecido como micológico direto ou exame à fresco, é a técnica mais amplamente utilizada e ela revelará se existem estruturas que indiquem a presença de fungos no material coletado. • É extremamente útil no diagnóstico das micoses superficiais, cutâneas e subcutâneas. • A identificação ocorre a partir de uma avaliação microscópica, utilizando lâmina e lamínula EXAME DIRETO • As amostras que são consideradas espessas, como: pele, unha, pelos, secreções, crostas e biópsias deverão ser posicionadas entre lâmina e lamínula com uma gota de um agente clarificante. • A utilização deste clarificante serve basicamente para deixar a amostras mais transparente para que então possamos visualizar as estruturas fúngicas. Para essas amostras espessas é utilizada a solução de hidróxido de potássio (KOH) a 20%. • Algumas estruturas fúngicas podem ser observadas neste teste como as leveduras, hifas, artroconídios e entre outras EXAME DIRETO • Além da análise a fresco com o KOH, também é possível realizar a coloração das amostras, podem ser usadas as colorações com nanquim , Gram, Leishman, entre outras. CULTURA • Após a realização do exame micológico direto, a técnica do cultivo em ágar poderá ser usada para isolamento do agente etiológico. • Para realizar a cultura, a amostra deverá ser semeada em movimentos de estrias, também chamada de semeadura de esgotamento sobre a superfície de meios sólidos de cultura. • O ágar mais utilizado no laboratório de micologia é o ágar Sabouraud dextrose (ASD), ele é relativamente mais barato que os demais e permitir o crescimento de todos os fungos de interesse médico CULTURA • Outros meios de cultura podem ser utilizados para o crescimento de fungos, como o ágar batata PDA . • Um outro meio bastante difundido entre os laboratórios de análises clínicas, é o meio cromogênico para diferenciação de espécies de Candida sp • Hemocultura IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS • A macroscopia da colônia nos permite realizar a primeira diferenciação entre os fungos filamentosos e fungos leveduriforme, devido à característica de colônias. • Fungo filamentoso 🡪 cresce em colônias grandes que tomam praticamente toda a placa de cultura • Fungos leveduriformes 🡪 crescem em colônias semelhante às colônias bacterianas, pequenas e isoladas IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS Com o crescimento das colônias, a identificação macroscópica é baseada nas características da colônia, por exemplo: • Tamanho da colônia. • Bordas. • Textura. • Relevo. • Coloração da colônia. • Coloração do reverso da colônia TEXTURA ALGODONOSO ARENOSA AVELUDADO RELEVO CEREBRIFORME RUGOSO UMBILICADO IDENTIFICAÇÃO FÚNGICA • Algumas informações a respeito do aspecto, da coloração da colônia e do reverso do ágar são importantes para auxiliar em todo o processo de identificação fúngica, porém, essa análise sozinha não tem o poder de descriminar as espécies. • Portanto, a identificação do gênero e espécies de fungo não será possível apenas pela macroscopia da colônia. • Para resolver tal impasse, deve-se realizar o diagnóstico microscópico da colônia, retirando uma pequena porção da colônia e observando no microscópio óptico 🡪 esgarçamento MICROCULTIVO • Caso a análise da macroscopia e microscopia da colônia não sejam suficientes para a determinação da espécie ou do gênero do fungo, uma das alternativas que pode ser empregada é o microcultivo. MICROCULTIVO • A placa de microcultivo é então incubada, a 25 °C para fungos filamentosos e a 36 °C para leveduras. • Após ser observada o crescimento satisfatório do fungo, a lamínula é retirada com cuidado do ágar e posiciona em uma nova lâmina, contendo uma gota de lactofenol azul de algodão e submetida à pesquisa de conídios do fungo através da microscopia óptica. • A identificação de alguns fungos depende também de provas bioquímicas. http://www.youtube.com/watch?v=T-cu8D0DpyU http://www.youtube.com/watch?v=uUPWFjdCRag TESTES ADICIONAIS • Algumas provas biológicas podem ser empregadas a fim de identificar o perfil nutricional, avaliação sorológica, estrutura antigênica e biologia molecular podem ser utilizadas como recursos para o resultado diagnóstico. • Um desses testes é a prova do tubo germinativo, utilizado para identificação de Candida albicans. • Prova do tubo germinativo é realizada a partir de uma alçada da colônia isolada que será inoculada em um tubo de ensaio contendo 0,5 mL de soro humano. Essa suspensão deve ser incubada a 37 °C durante período máximo de três horas. • Esse prazo é importante e não deve ser ultrapassado pois, após esse período, outras espécies de Candida, bem como outros gêneros de leveduras também formarão o tubo germinativo. • Então, deve-se seguir a técnica depositando uma gota da suspensão sobre lâmina, cobrir com lamínula e examinar ao microscópio óptico. A presença de tubo germinativo, que poderá ser identificado através de um pequeno filamento que brota do blastoconídio, sem formar constrição com a célula-mãe, permite a identificação presuntiva de Candida albicans TESTES ADICIONAIS http://www.youtube.com/watch?v=HSghoOggJBA
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