Experimento 2 - DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE DISSOCIAÇÃO DE INDICADORES POR ESPECTROFOTOMETRIA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
EXPERIMENTO 2: DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE DISSOCIAÇÃO DE
INDICADORES POR ESPECTROFOTOMETRIA
ISADORA MASSUYAMA
IZABELLA KAORI SACOM KUWANO
JOICE DE SOUZA PINHEIRO
JULIA MARIA BORGES EVALDT
LAURA MARIA EFFTING SILVA
LAURA MACIEL COSTA
MARCOS ANTONIO DA SILVA RÄDER
FLORIANÓPOLIS, 2022.
1. OBJETIVOS
- Analisar pela observação visual o efeito do pH na mudança da coloração de diferentes
indicadores;
- Utilizar o espectrofotômetro para determinar a constante de dissociação do indicador
vermelho de metila.
2. INTRODUÇÃO
Os indicadores de ácido-base detém a função de mudar de coloração de acordo com o
pH do meio. Geralmente são constituídos por um ácido ou uma base fraca que consegue
entrar em equilíbrio com sua base ou ácido conjugado. O funcionamento se baseia no
Princípio de Le Chantelier, dessa forma, cada substância possui uma cor e o deslocamento de
equilíbrio resulta na mudança da coloração da solução.
A constante de ionização (Ki) refere-se a uma relação entre as concentrações dos
produtos e dos reagentes nos processos de ionização ou de dissociação. A partir dessa
pode-se saber a concentração de íons [H+] ou [OH- ] na solução, o que permite calcular o pH
ou o pOH. Visto que as fórmulas do potencial hidrogêniônico/hidroxiliônico são: pH = - log
[H+] e pOH = - log [OH-].
Para que a visualização das cores seja possível, ocorre a absorção de radiação
luminosa na região visível do espectro eletromagnético. Por meio do método da
espectrofotometria podem ser identificadas e quantificadas substâncias químicas pela
absorção e transmissão de luz que passa através de uma amostra. O equipamento
espectrofotômetro é capaz de medir a quantidade de energia luminosa absorvida,
possibilitando a determinação da concentração de substâncias através da sua interação com a
luz.
Segundo a Lei de Beer, a concentração da espécie absorvente é proporcional a sua
absorbância (A), pela relação A = ε.b.C, no qual ε é a absortividade, C é a concentra- ção da
espécie e b é o caminho óptico. Logo, por meio de substituições na equação de Henderson-
Hasselbalch, pôde-se deduzir:
Portanto, entende-se que é possível calcular o pKa de uma amostra analisando sua
absorbância.
No experimento realizado e que é mostrado neste relatório, analisamos o efeito do pH
na mudança de coloração de diferentes indicadores, além de determinarmos pela
espectrofotometria a constante de dissociação de um dos indicadores utilizados: o vermelho
de metila.
3. DESCRIÇÃO EXPERIMENTAL
3.1. Materiais
Para este experimento foram utilizadas 2 buretas de 10 mL, 1 pipeta graduada de 10
mL, 1 pipeta volumétrica de 1 mL, 1 béquer de 250 mL e 2 de 50 mL, 13 tubos de ensaio
médios, 100 mL de fosfato de sódio 0,2 mol L -¹, 100 mL de ácido cítrico 0,1 mol L-¹,
soluções tampão (pH 4,0 e 7,0) para calibrar o pHmetro, solução de vermelho de metila
diluído e soluções dos indicadores utilizados.
3.2. Procedimentos
Inicialmente, foram preparados 6 tubos contendo soluções com diferentes
concentrações de ácido cítrico e fosfato de sódio, sendo utilizada uma bureta para
transferência destes líquidos. A concentração utilizada encontra-se na tabela abaixo.
Tabela 1 - Volumes utilizados no preparo de soluções tampão de pH 3 a 8.
Após o preparo destas soluções, estas foram separadas em diferentes tubos de ensaio,
um contendo 3 mL e outro 7 mL. As que possuíam volume de 7 mL foram utilizadas para
conferir o pH utilizando o aparelho pHmetro (previamente calibrado) com intuito de conferir
o valor alcançado teoricamente.
Aos tubos de ensaio contendo 3 mL foram adicionadas 2 gotas de vermelho de metila
diluído. Estas soluções então foram passadas para o espectrofotômetro, com intuito de medir
sua absorbância, podendo assim, chegar em um valor para a concentração dos elementos
utilizados.
4. RESULTADOS E TRATAMENTO DE DADOS
Os dados e seus respectivos tratamentos podem ser observados abaixo.
Tabela 2 - Determinação do pH experimental e da cor aparente
Determinação do pH experimental e da cor aparente
Solução pH teórico pH experimental Cor observada
experimentalmente
01 3,0 3,20 alaranjado
02 4,0 4,60 azul
03 4,5 5,12 vermelho
04 5,0 5,63 amarelo
05 6,0 6,36 verde
06 a 8,0 8,11 vermelho
06 b 8,0 811 incolor
Fonte: O autor.
Tabela 3 - Determinação da absorbância de soluções com diferentes pHs contendo Vermelho de Metila
Determinação da absorbância de soluções com diferentes pHs contendo Vermelho de
Metila
Solução Absorbância
01 0,264
02 0,217
03 0,115
04 0,060
05 0,039
06 0,032
Fonte: O autor.
1- Defina a constante de dissociação ácida pKa e básica pKb para uma substância.
Explique fazendo a dissociação da molécula do vermelho de metila no equilíbrio
ácido/base.
HIn ⇌ +𝐻+ 𝐼𝑛−
Ka = aplica-se -log[𝐻
+].[𝐼𝑛−]
[𝐻𝐼𝑛]
pKa = -log [ ] - log𝐻+ [𝐼𝑛
−]
[𝐻𝐼𝑛]
pKa = pH - log [â𝑛𝑖𝑜𝑛][á𝑐𝑖𝑑𝑜]
E da mesma forma para pKb, só que agora o íon está envolvido.𝑂𝐻−
pKb = pOH - log [𝑐á𝑡𝑖𝑜𝑛][𝑏𝑎𝑠𝑒]
Analogamente para o vermelho de metila em sua dissociação representada abaixo.
Figura 1 - Dissociação do Vermelho de Metila
Fonte: Wikipedia [1]
pKa = pH - log [â𝑛𝑖𝑜𝑛](𝑒𝑠𝑡𝑟𝑢𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑎 𝑒𝑠𝑞𝑢𝑒𝑟𝑑𝑎)[á𝑐𝑖𝑑𝑜](𝑒𝑠𝑡𝑟𝑢𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑎 𝑑𝑖𝑟𝑒𝑖𝑡𝑎) 
2- Discuta os resultados obtidos na Tabela 3 em relação ao pH teórico e experimental e a
cor da solução de indicador teórico e experimental.
Solução 1:
A cor observada (alaranjado) quando comparada com a faixa de cor teórica (2,9 - 4,6) nos
indica que o pH esteja em torno de 4,6. O pH experimental observado foi 3,20, um pouco
menor quando comparado com o que foi analisado pelos indicadores, mas ainda assim está
dentro da faixa de cor teórica, indicando que está no período de mudança entre as cores. O
pH teórico (3,0) foi próximo do experimental.
Solução 2:
A cor observada (azul) quando comparada com a faixa de cor teórica (2,8 - 4,6) nos indica
que o pH esteja em torno de 4,6, e o pH experimental foi justamente 4,6, que também é
próximo do teórico (6,0).
Solução 3:
A cor observada (vermelho) quando comparada com a faixa de cor teórica (4,2 - 6,3) nos
indica que o pH esteja em torno de 4,2. O pH experimental observado foi 5,12, um pouco
elevado quando comparado com o que foi analisado pelos indicadores, mas ainda assim está
dentro da faixa de cor teórica, indicando que está no período de mudança entre as cores. O
pH teórico (4,5) também se afastou um pouco do experimental (5,12).
Solução 4:
A cor observada (amarelo) quando comparada com a faixa de cor teórica (5,2 - 6,8) nos
indica que o pH esteja em torno de 5,2. O pH experimental observado foi 5,63, bem próximo
do esperado pelas cores e do teórico (5,0).
Solução 5:
A cor observada (verde) quando comparada com a faixa de cor teórica (6,0 - 7,6) nos indica
que o pH esteja entre essa faixa, já que as cores do indicador são amarelo e azul, e o
observado foi a mistura das duas (verde). O pH experimental observado foi 6,36, realmente
entre a faixa de pH das cores e próximo do valor teórico (6,0).
Solução 6a:
A cor observada (vermelho) quando comparada com a faixa de cor teórica (7,2 - 8,8) nos
indica que o pH esteja em torno de 8,8. O pH experimental observado foi 8,11, bem próximo
do esperado pelas cores e do teórico (8,0).
Solução 6b:
A cor observada (incolor) quando comparada com a faixa de cor teórica (8,3 - 10,0) nos
indica que o pH esteja em torno de 8,3. O pH experimental observado foi 8,11, bem próximo
do esperado pelas cores e do teórico (8,0).
É possível estimar o pH de uma solução aquosa pela cor obtida quando da adição de um
indicador cujo pKa é conhecido?
Sim, isso é possível porque a faixa de pH em que é perceptível a mudança de cor é
igual a pKa ± 1, e já que conhece-se o pKA e a cor obtida experimentalmente isso possibilita
identificar o pH aproximado daquela solução.
O que são espectros de absorção?Explique (Voguel, pg. 542).
Quando uma solução de uma determinada substância é submetida a leituras de
absorbância ao longo de uma faixa de comprimentos de onda eletromagnética, se obtém
informações referentes à capacidade do composto em absorver luz.
O espectro de absorção é a representação gráfica que relaciona comprimento de onda
( ) e absorbância, ou seja, informa o conjunto de ondas e frequências absorvidas pelaλ
substância quando incidimos sobre ela uma radiação com espectro contínuo. Dessa forma, é
possível caracterizar e verificar qual a faixa de comprimento de onda em que um determinado
composto apresenta sua maior afinidade de absorção.
Segundo Voguel, a absorção de uma substância é impactada com frequência pela
presença de um cromóforo. Um cromóforo é um grupo funcional que contêm invariavelmente
ligações duplas ou triplas, grupos nitro e nitroso, grupo azo e os grupos carbonila e
tiocarbonila e tem um espectro de absorção característico na região visível ou ultravioleta. Se
o cromóforo for conjugado com outro da mesma espécie, ou de espécies diferentes, a
adsorção será realçada e aparecerá uma nova banda de absorção em um comprimento de onda
maior
Que tipos de moléculas apresentam absorção no ultravioleta e/ou no visível?
Diversos compostos orgânicos com funções como álcoois, éteres, aminas, alcenos,
alcinos, compostos carbonílicos, de enxofre e com anéis aromáticos constituem grupos
cromóforos e absorvem radiação ultravioleta e visível. Cromóforos ou grupo cromóforo é a
parte ou conjunto de átomos de uma molécula, denominados de grupos funcionais orgânicos
que absorvem na região do ultravioleta ou visível.
3- Com os dados de absorbância obtidos dos espectros de UV-Vis, determine a constante
de dissociação (Ka) e pKa do indicador por meio da Equação 5. A constante de
dissociação corresponde à média aritmética dos quatro valores encontrados. Para os
cálculos (Eq. 5) assuma que o valor da absorbância (A) em pH 3 corresponde a AHin e,
em pH 8, a AIn-. O valor de A será obtido em cada um dos outros espectros (Figura 2A)
em um comprimento de onda específico, por exemplo, em 520 nm (Fig 2A).
pKa = pH - log
(𝐴) − (𝐴
𝐻𝐼𝑛
)
(𝐴
𝐼𝑛−
) − (𝐴)( )
Solução 2:
pKa = 4,60 - log = 5,190,217 − 0,2640,032 − 0,217( )
Ka = = = 6,45.10−𝑝𝐾𝑎 10−5,19 10−6
Solução 3:
pKa = 5,12 - log = 4,860,115 − 0,2640,032 − 0,115( )
Ka = = = 1,38.10−𝑝𝐾𝑎 10−4,86 10−5
Solução 4:
pKa = 5,63 - log = 4,770,060 − 0,2640,032 − 0,060( )
Ka = = = 1,69.10−𝑝𝐾𝑎 10−4,77 10−5
Solução 5:
pKa = 6,36 - log = 4,850,039 − 0,2640,032 − 0,039( )
Ka = = = 1,41.10−𝑝𝐾𝑎 10−4,85 10−5
Média = = 4,91 (valor de pKa calculado algebricamente)5,19 + 4,86 + 4,77 + 4,854
4. Faça um gráfico como o da Figura 2 B e determine o pKa por regressão linear, Eq. 5
(y=ax + b).
5. Obtenha da literatura o valor teórico da constante do indicador e calcule o erro
experimental do pKa. Compare o pKa do indicador calculado algebricamente (questão
2) e com o gráfico, (questão 3). Discuta os dois resultados em relação ao erro percentual
obtido.
pKa teórico = 5,1. pKa gráfico = 5,007
pKa calculado = 4,91
Erro absoluto: |5,1 - 4,91| = 0,19
Erro relativo: 0,19/5,1 x 100 = 3,72%
Os valores ficaram próximos entre si, sendo que o valor de pKa do gráfico ficou mais
próximo do valor teórico do que o pKa calculado.
6. O que é ponto isosbéstico? É possível observar a existência de ponto isosbéstico nos
espectros de absorbância que você obteve experimentalmente para o vermelho de
metila? Compare com a Figura 2A.
Ponto isosbéstico é quando as soluções com concentrações diferentes apresentam a
mesma absorbância em um comprimento de onda fixo. Na figura 2, o ponto isosbéstico se
localiza na faixa de 470-480nm.
No gráfico, é possível observar a dissociação do indicador pela variação da coloração
das soluções, conforme seu pH. Essa variação faz com que cada pH possua seu próprio valor
de absorbância.
7. Com o valor do pKa obtido experimentalmente calcule a variação da energia livre de
Gibbs G para a dissociação do vermelho de metila. Considere a eq G = -RTlnKa,∆ ∆
qual o significado do resultado obtido, discuta. R = 8,314 J/MolK; T = 298K.
pKa = -log Ka
4,91 = -logKa
Ka= 10*-4,91
Ka = 1,23x10*-5
dG = -8,314 x 298 x ln(1,23x10*-5)
dG = + 28.01 kJ/molK
Segundo o resultado da equação, o dG é positivo, ou seja, a reação não acontece de forma
espontânea. Como dG>0, a reação tende ao reagente.
8. O pH é um dos fatores mais importantes no processo de formulação de fármacos por
causa de seus efeitos sobre a solubilidade e a estabilidade dos princípios ativos.
Relacione situações que exemplifiquem a importância do controle do pH na área
farmacêutica.
O ajuste de pH significa baixá-lo ou elevá-lo a valores apropriados para solubilizar
uma substância, estabilizar e promover sua ação. Esses ajustes são fundamentais para a
compatibilidade fisiológica com o pH da pele (pele: pH = 5,5; axilas: pH = 6,1 - 6,8; vagina:
pH = 4,0 - 4,5).
Caso haja a necessidade de manter o pH da formulação em valores inalteráveis
durante o período de uso, se faz necessário utilizar um sistema tampão. Dependendo da faixa
de pH da formulação, da compatibilidade, da via de administração e da forma farmacêutica,
existem vários tipos de tampão que podem ser úteis dentro dessas faixas:
● Tampão citrato: pH 2,5 - 6,5
● Tampão fosfato: pH 6,0 - 8,0
● Tampão de bicarbonato de sódio: pH 8,0 - 9,0
O tampão citrato é, geralmente, o mais utilizado em formulações tópicas, pois
compreende uma boa faixa de pH do organismo.
Por exemplo, para fazer 100g de um creme de pH = 3,0 é preciso de 5,74% de ácido
cítrico monohidratado e de 1,76% de citrato de sódio dihidratado. Já para um creme de pH =
5,5 é necessário 0,98% de ácido cítrico monohidratado e de 8,42% de citrato de sódio
dihidratado.
9. Que tipos de resíduos químicos foram gerados neste experimento e como foram
tratados. Explique. Veja item 4.
Neste experimento, foram gerados como resíduos químicos soluções tampão,
contendo diferentes concentrações de fosfato dissódico ( e ácido cítrico (C₆H₈O₇)𝑁𝑎
2 
𝐻𝑃𝑂
4
)
e com seus respectivos indicadores. Levando em consideração que, a faixa permitida para
descarte de efluentes deve apresentar um pH entre 5-9 e o pH das soluções preparadas
variaram de 3-8, todas as soluções foram colocadas em um frasco para o ajuste de seu pH,
com o auxílio de um pH-metro e com a adição de gotas de ácidos ou bases para a regulagem
de pH das que fossem necessário. Além disso, para as soluções que foram adicionados os
indicadores (corantes), foram colocadas em um recipiente com carvão ativado, para a
coloração das soluções serem removidas através da adsorção com carvão ativado. Portanto,
esperou-se a decantação até a solução tornar-se incolor e o líquido sobrenadante descartado e
o sólido, carvão e corante, descartado como sólido inerte para que ocorra sua incineração ou
para que seja reutilizado pelos próximos grupos. Além disso, as soluções manipuladas eram
diluídas e de material não-tóxico e biodegradável.
10. Assista ao vídeo https://www.youtube.com/watch?v=ZCgzeWQqrIs. Descreva o
funcionamento do aparelho de UV-Vis. Você usou um espectrofotômetro na região do
visível para verificar a dissociação do indicador ácido- base vermelho de metila. Porque
isso foi possível?
O vídeo não pode ser acessado, é um vídeo indisponível, privado. No aparelho,
normalmente há a presença de duas fontes de luz, uma lâmpada de deutério que emite luz na
região UV (não consegue-se enxergar) e outra de tungstênio, que emite luz na região VIS, de
todas as cores. Então, essas luzes, através de um espelho, chegam até o monocromador, que é
a parte do espectrofotômetro que isola o comprimento de onda de interesse e elimina a
radiação de segunda ordem. O aparelho também possui um compartimento de amostra, que é
onde a cubeta é colocada com a solução de analito ou padrão. Apresenta um detector, que
converte a luz transmitida através da amostraem sinal elétrico, um microprocessador que
converte esse sinal elétrico em uma leitura digital (como absorbância, transmitância) e um
display, que é o visor de resultados em absorbância, transmitância.
Foi possível analisar a dissociação do indicador vermelho de metila, através do
espectrofotômetro, pois a coloração é influenciada pelo seu pKa em relação ao pH da
solução. O vermelho de metila apresenta diferentes colorações quando dissociado se
comparado a quando não-dissociado. Quando o pKin (pK do indicador) for inferior ao pH do
meio, sua cor será manifestada em sua forma ionizada, no caso do vermelho de metila
apresenta cor amarela nessa forma. E quando o pKin for superior em relação ao pH do meio,
sua coloração se manifestará em sua forma não-ionizada, no caso deste indicador, se
apresenta na cor vermelha. Portanto, pôde-se verificar essa dissociação, devido à absorção da
luz.
11. Através de espectrofotometria pode-se determinar o pKa de aminoácidos e
proteínas? Explique. Descreva outro método experimental que poderia ser usado para
determinar o pKa.
Existem alguns aminoácidos que possuem um anel benzênico, como é o caso da
fenilalanina e da tirosina, que por possuírem ligações duplas de carbono, são capazes de
absorver luz na região visível, por conterem grupos cromóforos. As proteínas são constituídas
por várias cadeias de aminoácidos que absorvem luz somente na região do ultravioleta. Logo,
para proteínas, por espectrofotometria não seria possível determinar o pKa.
Outros métodos que poderiam ser utilizados seriam uma curva de titulação, titulação
potenciométrica, cromatografia líquida.
5. CONCLUSÃO
Conclui-se, portanto, que foi possível observar alterações nas tonalidades das cores
das soluções que possuíam indicadores, causadas pelas diferenças de concentração de íons
H+. Sendo assim, alterações graduais na tonalidade representam uma combinação de cores
referentes ao indicador na forma protonada e desprotonada, ou seja, tonalidades extremas.
Ademais, com o auxílio de um espectrofotômetro de absorção ultravioleta visível
(UV-Vis) foi possível determinar a medida qualitativa de diversos espectros de absorbância
do vermelho de metila.
Na área farmacêutica, o pH é um importante fator de controle em formulações
líquidas, pois afeta diretamente a solubilidade do fármaco e, portanto, na estabilidade e
posterior absorção, além disso, em soluções orais, o pH inapropriado pode levar a alterações
no teor e prejuízos da atividade terapêutica. A espectrofotometria também é de grande
importância para as ciências farmacêuticas, já que é utilizada para medição de cor em uma
grande variedade de aplicações, garantindo, por exemplo, que a cor seja consistente com a
dose de um fármaco. O espectrofotômetro é utilizado também para medir determinados
ingredientes em uma droga, medir o crescimento bacteriano, ou diagnosticar um paciente
com base na quantidade de ácido úrico presente em sua urina.
6. BIBLIOGRAFIA
[1] Methyl red. Wikipedia. Disponível em: https://en.wikipedia.org/wiki/Methyl_red. Acesso
em: 24 de set. de 2022.
https://en.wikipedia.org/wiki/Methyl_red