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GRUPO SER EDUCACIONAL CURSO DE GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA BIOQUÍMICA APLICADA Graciele Maria Silva dos Santos ATIVIDADE CONTEXTUALIZADA Junho - Recife 2022 2 2 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 3 2 OBJETIVO ............................................................................................................................ 5 3 METODOLOGIA .................................................................................................................. 6 4 DESENVOLVIMENTO ........................................................................................................ 7 4.1 Contextualizações da Glutationa ..................................................................................... 7 4.2 Ações Bioquímica e Metabólicas da Glutationa ............................................................. 7 4.3 Mecanismo de Ações ......................................................................................................... 8 4.4 Glutationa e Exercícios Físicos ........................................................................................ 8 4.5 Função estruturais da Glutationa (GSH) após a Realização dos Exercícios Físicos... 9 4.6 Resposta da Glutationa em Exercício ........................................................................... 10 5 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................................. 11 REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 12 3 3 1. INTRODUÇÃO A glutationa possui um papel central em biotransformação e em eliminação de enobióticos e em defesa de células contra o estresse oxidativo. Este tripeptídeo encontra-se intracelularmente em altas concentrações, essencialmente em todos os organismos aeróbicos. Embora haja uma infinidade de grandes benefícios do exercício intenso, é tecnicamente um estressor fisiológico, pois cria oxidação, também conhecido como estresse químico, dentro do sistema do corpo. Dessa forma, Santos (2020) considera que a maioria dos atletas bem treinados, incluindo aqueles que não são profissionais, mas se esforçam bastante para melhorar continuamente seu desempenho físico em cada treinamento, praticando e realizando regularmente, mas o estresse de seus treinos e práticas intensivos pode ser sentido por meio de suas atividades físicas. Seja na forma de fadiga, dor muscular, sistema imunológico baixo ou outras manifestações, o exercício intenso apesar de sua abundância de diversão e efeitos benéficos cobra um preço fisiológico. Além disso, Silva (2020) destaca que o exercício intenso, experimentado por atletas e aqueles comprometidos com seu ofício físico, também cobra um preço bioquímico. Pesquisas demonstram que, juntamente com o estresse oxidativo, a atividade intensa diminui os níveis de glutationa, o antioxidante caseiro do corpo. Como a glutationa reprime a oxidação, pois é um doador de eletrólitos (também conhecido como antioxidante), ela doa elétrons para os compostos oxidados que estão faltando um elétron (oxidantes), que são produzidos durante o exercício intenso. Este dar e receber de elétrons são o processo de antioxidantes (como a glutationa) estabilizando os oxidantes instáveis e potencialmente prejudiciais. Quando se trata de exercício exaustivo, a ocorrência de estresse oxidativo está associada à fadiga e danos musculares, além de redução do desempenho físico. Embora o estresse do exercício normalmente não prejudique os seres humanos, ele pode afetar sua capacidade de desempenho (SUREDA et al., 2015). Geraldi (2019) contribui mencionando que os benefícios do esforço físico, melhor condicionamento físico e a aplicação mental que acompanham ser um atleta provavelmente superam o estresse oxidativo temporário e os riscos relacionados à diminuição da glutationa do músculo esquelético após seu treinamento horrível. No entanto, o aumento das espécies reativas de oxigênio e a redução da glutationa resultante podem afetar agudamente o desempenho físico. De acordo com Le Moal et al., (2017), a glutationa é um tripeptídeo composto por três aminoácidos (cisteína, ácido glutâmico e glicina) presente na maioria dos tecidos de mamíferos, ela atua como um antioxidante, um eliminador de radicais livres e um agente desintoxicante. A glutationa também é importante como cofator para a enzima glutationa peroxidase, na captação de aminoácidos e na síntese de leucotrienos. Segundo Banerjee (2017) à medida que a geração de radicais livres excede a capacidade do organismo de neutralizá-los e eliminá-los, ocorre o estresse oxidativo. A glutationa é atualmente um dos antioxidantes mais estudados. Isso provavelmente se deve ao fato de ser sintetizado endogenamente em todo o corpo e ser encontrado basicamente em todas as células, às vezes em concentrações bastante altas. 4 4 A glutationa também é um componente essencial para o sistema de defesa natural do corpo. Vírus, bactérias, toxicidade de metais pesados, radiação, certos medicamentos e até mesmo o processo normal de envelhecimento podem causar danos de radicais livres às células saudáveis e esgotar a glutationa. A depleção de glutationa foi correlacionada com uma função imunológica mais baixa e maior vulnerabilidade à infecção devido à capacidade reduzida do fígado de desintoxicar (FORMAN; ZHANG; RINNA, 2009). Com tudo, realizou-se pesquisas bibliográficas com interesse de pesquisar sobre estruturas e funções da glutationa (GSH) após realizar exercícios físicos. A partir dai apresento este relatório com dados descobertos e conhecimentos adquiridos, em saber sobre o tópico seguinte e responsável por apresentar os objetivos as pesquisas, destacando seus pressupostos. A realização de exercícios físicos só aumenta a síntese de ERO, além de promover lesão muscular e inflamação. Após uma sessão de exercícios físicos, inicia-se normalmente a fase de recuperação, quando são observados diversos efeitos positivos à saúde, incluindo o aumento da resistência a novas lesões induz idas ou não por exercícios, fato que é considerado como um processo "adaptativo". Estudos relatam que essa recuperação não é alcançada por indivíduos que se submetem a exercícios intensos e prolongados, ou, ainda, que possuem elevada frequência de treinamento. Alternativas nutricionais têm sido muito estudadas, a fim de reduzir os efeitos promovidos pelo exercício extenuante, dentre as quais está suplementação de vitamina E, vitamina C, creatina e glutamina. Esta revisão tem como objetivo abordar os aspectos atuais envolvendo a formação das ERO, os processos de lesão celular e inflamação, adaptação aos tipos de exercício aeróbio e anaeróbio e possíveis intervenções nutricionais. (CRUZAT, Vinício 2009) 5 5 2. OBJETIVO Tenho o objetivo geral de realizar pesquisas bibliográficas com intuitos de discorrer sobre estruturais e funções da glutationa (GSH) após aos exercícios físicos. Quanto a objetivos específicos, busca-se destacar a contextualizada da glutationa e os exercícios físicos. Destacando a glutationa aos exercícios físicos. 6 6 3. METODOLOGIA O presente estudo se faz numa revisão da literatura, com base nos estudos acerca do seguinte objetivo que é realizar uma pesquisa bibliográfica com o intuito de pesquisas sobre a estrutura e função da glutationa (GSH) após a realização de exercícios físicos. Assim, visando identificar o assunto, foi delineada a estratégia de pesquisa metodológica. Então nesse estudo, utilizou-se a pesquisabibliográfica e a abordagem qualitativa para método de revisão bibliográfica. O processo de desenvolvimento desse tipo de estudo de revisão inclui caracterizar cada estudo selecionado, avaliar qualidades deles, identificar conceitos importantes, comparar análises apresentadas e concluir sobre o que a literatura informa em relação à determinada intervenção, assim apontando ainda problemas e questões que necessitam de novos estudos, tal como cita Teixeira (2005). Quanto ao que se refere na abordagem qualitativa, cita-se a partir de Vergara (2016), que a mesma se refere a tipo de pesquisa que não pode ser mensurável, não foram, portanto, levantados materiais que disponibilizassem estatísticas numéricas. Em tantas pesquisas os caminhos seguiram sistêmicos, distribuídos em varias etapas. Na primeira etapa, foi realizada a delimitação da questão a ser pesquisada. Na segunda etapa, optou-se pela escolha das fontes de dados que mais condiziam com o tema. Os dados foram coletados em artigos e dissertações selecionados em banco de dados eletrônico como Pubmed, Medline, Scielo e Google Acadêmico que fazem referência, incluiu-se estudos publicados no período de 2010 a 2022, no idioma português e inglês. Na terceira etapa foram eleitas palavras-chave como: glutationa (GSH); exercícios físicos; estresse oxidativo; oxidação de GSH. Na quarta etapa, foram buscados e armazenados todos os resultados obtidos, e em seguida foi realizada a seleção dos artigos e dissertação. A quinta etapa consistiu na localização dos materiais teóricos, levando em consideração o critério de inclusão e exclusão, para isso foram utilizados os seguintes descritores: glutationa, exercícios físicos, atividade física, estresse oxidativo, oxidação de GSH. Na sexta etapa houve a extração dos dados dos artigos selecionados, sendo utilizado como critério de inclusão estar direcionados ao tema da pesquisa, os que não contemplaram este critério não foram utilizados. 7 7 4. DESENVOLVIMENTO 4.1 Contextualizações da Glutationa A glutationa, conhecida também como GSH, molécula encontrada facilmente no nosso corpo. A glutationa é diagnosticada no fígado em dois passos, catalisados pela γ-glutamil- cisteina-sintetase e pela glutationa-sintetase. A GSH é distribuída, através da circulação sanguínea, para todos os tecidos, produzida pelo fígado e células nervosas no sistema nervoso central, a glutationa é composta de três aminoácidos: L-cisteína, glicina e L-glutamato (FORMAN; ZHANG; RINNA, 2009). Santos (2020) discorre que se trata de um antioxidante, uma molécula que ajuda a combater os radicais livres. Os radicais livres são moléculas que se formam em resposta a fatores como na dieta e o meio ambiente. Quando existem mais radicais livres do que antioxidantes, ocorre dano celular oxidativo, isso pode levar à inflamação e a uma variedade de problemas de saúde, desde pressão alta e diabetes até doença de Alzheimer e muito mais. 4.2 Ações Bioquímica e Metabólicas da Glutationa A glutationa reduzida (GSH) é um tripeptídeo linear de L-glutamina, L-cisteína e glicina. Tecnicamente NL-gama-glutamil-cisteinil glicina ou L-glutationa, a molécula possui grupo sulfidrila (SH) em porção cisteína, o que explica sua forte caráter doador de elétrons. Com isso, à medida que os elétrons são perdidos, a molécula se torna oxidada e duas dessas moléculas tornam-se ligadas (dimerizadas) por uma ponte dissulfeto para formar dissulfeto de glutationa ou glutationa oxidada (GSSG). Esta ligação é reversível após re-redução (FORMAN; ZHANG; RINNA, 2009). Assim como outros antioxidantes, a glutationa acelera o processo de cicatrização, pois age reduzindo as reações inflamatórias e combate o estresse oxidativo das células. Assim ela mantém os patógenos no meio exterior, evitando que corpos indesejados acessem o organismo. A GSH está sob um rígido controle homeostático tanto intracelular quanto extracelularmente. Um equilíbrio é mantido entre a síntese de GSH, a reciclagem de GSSG/glutationa oxidada e sua utilização (FORMAN; ZHANG; RINNA, 2009). A síntese de GSH envolve duas reações intimamente ligadas, controladas enzimaticamente. Primeiro, a cisteína e o glutamato são combinados pela gama-glutamil cisteinil sintetase. Em segundo lugar, a GSH sintetase combina gama-glutamilcisteína com glicina para gerar GSH (LAITANO et al., 2012). A GSH é usada como cofator por múltiplas enzimas peroxidase, para desintoxicar peróxidos gerados a partir de ataque de radicais de oxigênio em moléculas biológicas; transidrogenases, para reduzir centros oxidados no DNA, proteínas e outras biomoléculas; e glutationa S- transferases (GST) para conjugar GSH com substâncias endógenas (por exemplo, estrogênios), eletrófilos exógenos (por exemplo, óxidos de areno, carbonilas insaturadas, haletos orgânicos) e diversos xenobióticos. A baixa atividade de GST aumenta o risco de doença, mas paradoxalmente, alguns conjugados de GSH podem ser tóxicos (FORMAN; ZHANG; RINNA, 2009). Segundo Rusip et al. (2020) o ataque por radicais livres e outros agentes oxidativos também pode esgotar o GSH. O ciclo redox homeostático da glutationa tenta manter o GSH reabastecido à medida que está sendo consumido. A quantidades disponíveis dos alimentos 8 8 são limitadas (menos de 150 mg/dia) e a depleção oxidativa pode ultrapassar a síntese. Nesse diapasão, menciona-se que o fígado é o maior reservatório de GSH. As células parenquimatosas sintetizam GSH para a conjugação de P450 e inúmeras outras necessidades metabólicas, em seguida, exportam GSH como uma fonte sistêmica de poder redutor de SH. O GSH é transportado na bile para o compartimento luminal intestinal. Os tecidos epiteliais dos túbulos renais, revestimento intestinal e pulmão têm atividade substancial de P450 e capacidade modesta de exportar GSH (SUREDA et al., 2015). 4.3 Mecanismo de Ações Assim como Le Moal et al., (2017) a GSH é um protetor celular extremamente importante. Ele extingue diretamente os radicais livres de hidroxila reativos, outros radicais livres centrados em oxigênio e centros radicais de DNA e outras biomoléculas. O GSH é um protetor primário de pele, cristalino, córnea e retina contra danos causados pela radiação e outras bases bioquímicas da desintoxicação do P450 no fígado, rins, pulmões, intestino, epitélios e outros órgãos. Com isso, Banerjee (2017) concorda que a GSH e seus metabólitos interagem com sínteses energéticas e de neurotransmissores através de várias vias metabólicas proeminentes. A disponibilidade de GSH regula negativamente o potencial pró-inflamatório de leucotrienos e outros eicosanóides. Os metabólitos S-nitrosos recentemente descobertos, gerados in vivo a partir de GSH e NO (óxido nítrico), diversificam ainda mais o impacto do GSH no metabolismo. 4.4 Glutationa e Exercícios Físicos Muitos Atletas passam muitas horas participando de treinamentos pesados e prolongados a cada semana. Est insistência de treino de alto impacto requer o uso extremamente eficiente de oxigênio no músculo esquelético e muitas vezes cria um dilema oxidativo que pode aumentar a produção de radicais livres (SUREDA et al., 2015). Para Silva (2020) a produção extra de radicais livres abre o corpo para problemas de acompanhamento, mas não limitado a: Estresse oxidativo, Resposta inflamatória insalubre, Função imunológica suprimida, Aumento da dor, Desempenho de exercício prejudicado. Para neutralizar os danos dos radicais livres, as defesas antioxidantes do corpo geralmente assumem o controle para proteger os tecidos do hospedeiro. Se os recursos antioxidantes se esgotarem, inflamação e imunossupressão podem ocorrer antes que os tecidos do atleta tenham tempo de se recuperar do exercício ou evento de treinamento. A glutationaadequada (GSH), o principal antioxidante do corpo, é essencial para que os linfócitos do sistema imunológico funcionem adequadamente. O estresse oxidativo e o acúmulo de radicais livres podem levar a um desafio sustentado de imunocitos e resultar na depleção de glutationa intracelular. A GSH também é essencial para a contração muscular aeróbica, de modo que a competição entre os sistemas imunológico e muscular pelos precursores do GSH pode se desenvolver posteriormente (SUREDA et al., 2015). 9 9 Tal como destacam Santos (2020), essa competição por glutationa pode resultar em um dos dois cenários: O músculo esquelético pode ficar privado de glutationa suficiente para sustentar um metabolismo aeróbico normal durante exercícios intensos ou de resistência e depleção de glutationa pode resultar em uma breve imunossupressão após o período de exercício intenso. Com isso, menciona-se que através do estudo, Hwang et al. (2018), foi possível identificar que a glutationa normalmente não é um suplemento para apoiar a massa e a força muscular, mas de acordo com um estudo randomizado, duplo-cego e controlado por placebo publicado pelos autores em 2018 no Journal of the International Society of Sports Nutrition, a glutationa pode ser a chave participante na construção de massa muscular e força. Neste estudo, 75 homens treinados em resistência foram aleatoriamente designados para ingerir 200 mg/dia de glutationa + 2 gramas/dia de L-citrulina (GSH + CIT), 2 gramas/dia de L-citrulina-malato ou placebo de celulose diariamente enquanto também participava de 8 semanas de treinamento de resistência. A composição corporal e a força muscular foram testadas antes e após 4 e 8 semanas de treinamento resistido e suplementação. Após 4 semanas, a massa muscular magra e a força foram positivamente correlacionadas ( p< 0,05) e aumentou significativamente no grupo GSH + CIT, mas não nos grupos L-citrulina-malato ou celulose placebo. Vale afirma que esse estudo foi realizado em sujeitos já praticantes de treinamento resistido regular (homens, idades de 18 a 35 anos, que realizaram treinamento resistido pelo menos três vezes por semana durante um ano), portanto não podemos necessariamente extrapolar os resultados para indivíduos que não participam deste tipo de atividade. Com tudo, percebe-se que o papel da glutationa pode ir além de seu papel antioxidante. As evidências sugerem que podem ser um complemento útil para os protocolos de construção muscular e, como resultado, reduzir potencialmente o risco de vários problemas de saúde relacionados à idade. 4.5 Função estruturais da Glutationa (GSH) após a Realização dos Exercícios Físicos. Nos assuntos anteriores ficou evidente que pessoas fisicamente ativas são frequentemente deficientes em glutationa. Geraldi (2019) discorre que durante o exercício, os níveis de glutationa se acabam rapidamente devido ao aumento da absorção pelos tecidos, quando se exercita, maior o esgotamento. Isso torna o estresse oxidativo mais drástico e generalizado, o que pode ocorrer muitos problemas, como dores musculares e articulares, fraqueza e vulnerabilidade a infecçõess e lesões. Após treinos, o estresse oxidativo afeta principalmente os músculos, o que causa fadiga muscular, e que depende da quantidade de força que seus músculos podem realizar. Por causa disso, a capacidade de progredir durante o exercício diminui e pode precisar ser suspensa completamente. O tempo para reparar o tecido também é afetado pelos níveis reduzidos de glutationa, causando dores mais intensas e durações mais longas, dores musculares e articulares e lesões. A suplementação de glutationa combate esse estresse oxidativo, diminuindo o cansaço muscular e auxiliando na recuperação para atividades físicas intensas ou duradouras (SUREDA et al., 2015). Nos estudos, a suplementação de glutationa resultou níveis mais elevados de biogênese de PGC-1α e mtDNA no músculo esquelético de camundongos e preveniu a redução induzida pelo exercício no pH intermuscular em camundongos. Além disso, em humanos, a suplementação de glutationa suprimiu os parâmetros relacionados à fadiga durante e após o exercício. Embora tenha sido bem documentado que a glutationa desempenha um papel central na rede antioxidante nas células animais e o equilíbrio redox pode atuar como um marcador do status antioxidante em várias condições patológicas e fisiológicas, incluindo o exercício. 10 10 Por tanto, o papel da glutationa exógena nas alterações fenotípicas relacionadas ao exercício físico não foi explorado. Até onde foi possível observar, o estudo e o primeiro a demonstrar que a suplementação de glutationa melhora o metabolismo aeróbico no músculo esquelético, levando à redução da fadiga muscular induzida pelo exercício. Esses resultados encontrados em Aoi et al. (2015) sugerem que a suplementação de glutationa melhorou o metabolismo lipídico e a acidificação nos músculos esqueléticos durante o exercício, levando a uma menor fadiga muscular. 4.6 Resposta da Glutationa em Exercício Silva (2020) considera que devido ao seu papel no combate ao aumento da peroxidação lipídica que ocorre durante o estresse oxidativo, especialmente durante o exercício intenso, a resposta da glutationa tem sido frequentemente estudada. Homens treinados que se exercitaram até a exaustão em uma esteira aumentaram as quantidades sanguíneas de glutationa oxidada imediatamente após o exercício, sugerindo um aumento no estresse oxidativo, mas retornaram ao repouso após 1 h. Com isso, Santos (2020) concordam que um nível diminuído de glutationa no plasma o resultado de uma utilização aumentada dela dentro do músculo, para combater ou "apagar" quaisquer radicais livres circulantes. O potencial da glutationa para minimizar ou reduzir os radicais livres é aparente a partir das mudanças relatadas no status da glutationa após o exercício, em resposta a sessões de exercício, os níveis circulantes de glutationa reduzida diminuem enquanto os níveis de glutationa oxidada aumentam. Considerando as mudanças na química redox que ocorrem como resultado de um aumento no exercício, a capacidade do corpo de manter um equilíbrio adequado de glutationa é bastante importante. Felizmente, Rusip et al. (2020) acreditam que em resposta ao treinamento físico regular, os níveis de repouso de glutationa aumentam como uma adaptação do corpo para lidar efetivamente com o aumento de radicais livres que comumente resulta secundário ao treinamento físico. Enquanto muitos desses estudos utilizaram exercícios baseados em resistência, muito da mesma resposta é esperada ao usar exercícios baseados em resistência. Até o momento, poucos estudos foram concluídos que utilizaram um programa típico de treinamento de resistência, mas alguns estudos usando principalmente contrações excêntricas foram realizadas. De acordo com Hwang et al. (2018) a degradação da glutationa leva principalmente aos seus aminoácidos constituintes (como, cisteína, glicina), que podem ser usados posteriormente para a síntese de glutationa dentro da célula. Pesquisas que envolvem a glutationa sugerem fortemente que ela tem um papel importante na prevenção da peroxidação lipídica associada ao estresse oxidativo, o que posteriormente torna a manutenção de um equilíbrio ideal de glutationa necessária para extinguir efetivamente a peroxidação das membranas lipídicas. A suplementação com glutationa teve pouco sucesso, pois a biodisponibilidade da glutationa é baixa devido ao seu transporte transitório por toda a rede celular. Atualmente, acredita-se que a biodisponibilidade da glutationa seja extremamente baixa devido às enzimas hidrolíticas que quebram a glutationa após a ingestão (FORMAN; ZHANG; RINNA, 2009). 11 11 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS O estudo demonstraque os músculos e corpo podem manter níveis altos de glutationa, ou ao menos tem amplos blocos de construções de aminoácidos e precursores de glutationa que produzir a glutationa, é possível melhorar a recuperação pós-treino ou pós-atividade. Assim, identifica-se que a glutationa é um tripeptídeo sendo composto por glutamato, cisteína e glicina, é sintetizada principalmente nas células hepáticas. É um armazenamento em forma oxidada ou reduzida em concentrações em maioria de células, a glutationa envolvida na regulação de diversas funções fisiológicas, em particular, funções de antioxidante e desintoxicação. A glutationa reduzida é facilmente oxidada em espécies reativas do oxigênio e subsequentemente diminuída novamente pela glutationa redutase, e balanço redox da glutationa com isso tem se usado no marcador do status antioxidante em diversas condições. Os exercícios físicos diminui a forma e aumenta a forma oxidada da glutationa. Além do que, o exercício prolongado diminui o conteúdo total de glutationa no plasma e nos tecidos ao longo do tempo, o que sugere que a glutationa pode estar associada ao metabolismo energético aeróbico e à manutenção da contração muscular. No metabolismo de energia e nutrientes o músculo esquelético desempenha alguns papeis importante na fadiga muscular. No particular, a fonte de energia pode afetar o desempenho muscular. Em exemplo, a fonte de energia em base de carboidratos resulta na diminuição do pH muscular devido ao aumento da produção de ácido lático, o que tem à contração muscular prejudicada. Em tanto, quando a energia gasta durante exercícios e derivada de lipídios, em grande quantidade de energia pode ser continuamente fornecida via metabolismo aeróbico. Com o aumento da utilização de lipídios nas mitocôndrias das células musculares esqueléticas está associado em contração muscular contínua, e em número e atividade das mitocôndrias influencia a utilização de ácidos graxos nas células musculares. A conclusão e o desenvolvimento de radicais livres e estresse oxidativo porem o exercício é uma consideração bastante importante para um grande desempenho, recuperação a saúde. Atualmente, a relação entre estresse oxidativo e exercício prolongado, não habitual e de alta intensidade não está totalmente determinada. Ainda mais, existem pesquisas que ilustram uma possível relação entre radicais livres e estresse oxidativo com outras doenças e vias de destruição celular. Sistemas de proteólise e apoptose são duas das principais vias nas quais o estresse oxidativo parece desempenhar um papel substancial na extensão em que eles são ativos no músculo esquelético. Uma grande abordagem comum procurada para o estresse oxidativo é a administração exógena de compostos que acredita terem propriedades antioxidantes. Grandes pesquisas mais neste momento precisam ser conduzidas para algumas mudanças observadas dentro das células musculares esqueléticas após a exposição a exercícios prejudiciais intensos e desacostumados 12 12 REFERÊNCIAS BANERJEE, R. Redox metabolism and life. Journal of Redox Biochemistry, v.12, n.03, 2017. FORMAN, H. J.; ZHANG, H.; RINNA, A. Glutathione: overview of its protective roles, measurement, and biosynthesis. Molecular aspects of medicine, v. 30, n. 1, p. 1-12, 2009. 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