Antibiograma: Teste de Sensibilidade aos Antibióticos

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Prática 5. Antibiograma 
(Teste de sensibilidade dos microrganismos aos agentes antimicrobianos) 
Agentes quimioterápicos são agentes químicos utilizados no tratamento de doenças 
infecciosas. Seus modos de ação implicam na interferência com o metabolismo 
microbiano sem causar efeito lesivo à célula hospedeira. 
 
Antibióticos - São sintetizados e secretados por certas bactérias, actinomicetes e fungos 
que matam ou inibem o crescimento de outros microrganismos. Atualmente, alguns 
antibióticos são sintetizados ou modificados em laboratórios, contudo, originam-se dos 
organismos vivos. 
 
Exemplos: 
Ampicilina- Impede a incorporação do ácido murâmico no componente mucocomplexo 
da parede da célula, inibindo assim, a síntese da parede celular. 
Estreptomicina - Tem afinidade pelos ribossomos bacterianos, causando erros de leitura 
no códon do mRNA, interferindo assim, na síntese proteica. 
Cloranfenicol - Tem afinidade pelos ribossomos bacterianos, impedindo a formação da 
ligação peptídica entre os aminoácidos durante a síntese proteica. 
Tetraciclina - Tem afinidade pelos ribossomos bacterianos, impedindo a ligação de 
hidrogênio entre o anticódon no complexo aminoácido-tRNA e o códon no mRNA durante 
a síntese proteica. 
Agentes ou drogas sintéticas são agentes químioterápicos sintetizadas em laboratório. 
Exemplos: 
Sulfadiazina (sulfanamida) - tem o efeito de inibição competitiva. Isto é, o componente 
ativo da droga, age como um antimetabólico que compete com um metabólito essencial, o 
ácido p-aminobenzóico (PABA), durante a síntese do ácido fólico na célula bacteriana. O 
ácido fólico é uma coenzima celular essencial para a síntese de aminoácidos e purinas. 
 
 
Antibiograma: Método de Difusão em ÁGAR (Método de Kirby-Bauer) 
O antibiograma é um teste que permite a verificação “in vivo” da sensibilidade de 
uma bactéria aos antibióticos. Esta sensibilidade é demonstrada pela zona ou halo de 
inibição de crescimento que se forma em volta do disco de antibiótico. De acordo com o 
DIÂMETRO do halo de inibição diz-se que a bactéria é sensível ou resistente ao 
antimicrobiano testado. 
 
Material: 
• Cultura bacteriana crescida por 18 horas (105 células por mL); 
• Placas com meio de cultura Müller-Hinton; 
• Discos de antibióticos; 
• Cotonetes e pinças esterilizados. 
 
Procedimento: 
1. Agitar bem a cultura bacteriana (Escherichia coli ou Staphylococcus aureus); 
2. Umedecer o cotonete na suspensão bacteriana, retirando o excesso ao apertar o 
cotonete contra a parede interna do tubo; 
3. Espalhar a suspensão bacteriana em toda a superfície do meio de cultura, de modo 
homogêneo, inclusive nas bordas; 
4. Colocar os discos de antibióticos com auxílio da pinça sobre a superfície do meio e 
de modo equidistante; 
5. Incubar as placas a 370C por 18 horas. 
 
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6. Utilizando um “Swab” aplicar por toda a superfície da placa de Petri a cultura 
bacteriana crescida; 
7. Aplicar os discos de antibióticos na superfície da placa utilizando a pinça. 
 
Resultados 
Leitura e interpretação: Verificar a presença ou ausência de halo de inibição ao redor dos 
discos. Medir o DIÂMETRO dos halos, vide figura a seguir, e verificar se o 
microorganismo é resistente, parcialmente resistente ou sensível. A seguir tem uma 
tabela que mostra alguns halos de inibição de crescimento para alguns antibióticos 
testados em aula. 
 
Tabela de Kirbe & Bauer de sensibilidade aos antibióticos (em mm) 
 
Antibiótico Conc. Sigla Resistente Intermediário Sensível 
Gentamicina 10ug GEN 12 ou - 13 a 14 15 ou + 
Ceftazidima 30ug CAZ 14 ou - 15 a 17 18 ou + 
Amicacina 30ug AMI 14 ou - 15 a 16 17 ou + 
Ciprofloxacin 5ug CIP 15 ou - 16 a 20 21 ou + 
Cefepime 30ug CPM 14 ou - 15 a 17 18 ou + 
Sulfazotrim 25ug SUT 10 ou - 11 a 15 16 ou + 
Cloranfenicol 30ug CLO 12 ou - 13 a 17 18 ou + 
Rifampicina 5ug RIF 11 ou - 12 a 18 19 ou + 
Tetraciclina 30ug TET 14 ou - 15 a 18 19 ou + 
Perguntas a serem respondidas no relatório 
1 – Que procedimentos deveriam ser tomados para a determinação da concentração inibitória mínima (MIC) 
dos antibióticos testados? 
2 - Que fatores podem interferir no perfil de sensibilidade a antibióticos em uma linhagem bacteriana? 
3 – A resistência a antibióticos expresso por uma linhagem bacteriana pode ser considerada um fator de 
virulência? Justifique. 
4- Quais são os halos para os demais antibióticos (Resistente, Intermediário e Sensível), que não estão 
descritos na Tabela de Kirbe & Bauer acima. 
 
 
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Completar de acordo com os resultados obtidos na prática 
Grupo Bact. AMO AMP ATM CEP CIP Cf CLO CTX ERI GEN IPM KET NAX PEN POL Rif SUL TET VAN 
Esperado E. coli 
Esperado S. 
aureus 
 
 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
9 
10 
11 
12 
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14 
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Prática 6. Características gerais de fungos 
MORFOLOGIA DE FUNGOS 
 A identificação dos fungos é baseada quase principalmente em sua morfologia 
tanto macro- como microscópica. Macroscopicamente os fungos podem apresentar vários 
tipos morfológicos com colônias filamentosas, cotonosas, pulverulentas e outras (bolores) 
e cremosas (leveduras) e com os mais diversos tipos de pigmentos. 
 A unidade estrutural dos fungos filamentosos é representada pela hifa e o conjunto 
desses elementos é denominado micélio. O micélio pode ser diferenciado em vegetativo - 
quando exerce as funções de assimilação de alimentos e fixação em substratos, e em 
reprodutivo - que serve à reprodução dos fungos. 
De acordo com a morfologia, os fungos podem apresenta 3 tipos: 
Unicelular: Células arredondadas, ovóides ou alongadas, podendo se reproduzir por 
brotamento, cissiparidade ou por outro processo. Caracteriza as leveduras. 
Filamentoso: Pode se apresentar com ou sem septos. As hifas podem se diferenciar em 
estruturas variadas, recebendo denominações diversas: rizóides, artrósporos 
anastomoses, etc. Caracteriza os bolores. 
Pseudofilamentoso: Algumas leveduras em determinadas condições formam, por 
brotamentos sucessivos, uma estrutura filamentosa conhecida com o nome de 
pseudomicélio. Caracteriza algumas leveduras do gênero Candida. 
O micélio vegetativo (em fungos filamentosos) se diferencia em estruturas de reprodução 
caracterizadas pela formação de conídios/esporos que cumprem as funções de 
disseminação da espécie. Os conídios/esporos podem ser hialinos, pigmentados, simples, 
septados, apresentando várias formas que muitas vezes definem gêneros ou espécies de 
fungos. São estruturas extremamente importantes na identificação dos fungos. 
As estruturas reprodutivas, de acordo com sua origem, podem ser assexuados (conídios) 
ou sexuados (esporos), podendo estar ou não dentro de determinadas estruturas. 
Conídios (Reprodução assexuada): 
Ectósporos: formam-se na extremidade de hifas especiais denominadas conidióforos. Ex. 
Aspergillus, Penicillium. 
Endósporos: conídios produzidos no interior de esporângios. Os conídios, nesse caso são 
chamados de esporangiósporos e caracterizam a subdivisão Zygomycotina. Ex. Rhizopus, 
Mucor, Absidia. 
Esporos (Reprodução sexuada): 
Ectósporos: esporos formados na extremidade de basídios e são denominados 
basidiósporos. Caracterizam a subdivisão Basidiomycotina. Ex. cogumelos. 
Endósporos: esporos formados no interior de células denominadas ascos. Os esporos são 
chamados de ascósporos e caracterizam a subdivisão Ascomycotina. Ex. Aspergillus 
fumigatus. 
 
MATERIAL 
Culturas de Aspergillus, Penicillium, Rhizopus e Candida 
Lâminas prontas e focalizadas de Aspergillus, Penicillium,Rhizopus e Candida. 
Placas de ágar Sabouraud 
Placas para microcultivo em lâmina. 
Lâminas, lamínulas, corante lactofenol azul-algodão, alças em L 
Tubos com solução fisiológica. 
PRÁTICA: 
 
 
Técnica da colônia gigante: Com alça de platina em L, retire um pequeno fragmento da 
colônia de fungo do tubo e coloque no centro de uma placa de Petri com ágar Sabouraud 
dextrose. Incubar à 28 ºC. Quando o desenvolvimento estiver satisfatório observar os 
aspectos morfológicos característicos. 
 
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Técnica do microcultivo de fungos: Utilizar placas de Petri contendo lâminas dispostas 
sobre um bastão de vidro. Com todo cuidado de assepsia, coloque um pequeno quadrado 
(1 cm) de ágar Sabouraud, sobre a lâmina. Com alça de platina, retire um pequeno 
fragmento de uma colônia escolhida (placa de fungo do ambiente) e semeie os lados do 
ágar. Coloque uma lamínula estéril sobre o ágar e água destilada estéril na placa para 
evitar dessecamento do meio. Feche a placa e deixe à temperatura ambiente. Quando 
houver desenvolvimento satisfatório, retire a lamínula e o fragmento do meio de cultura e 
coloque numa lâmina contendo uma gota de lactofenol azul algodão. Examinar ao 
microscópico e tentar identificar o fungo, quando possível. 
 
DEMONSTRAÇÃO 
Morfologia macro- e microscópica 
Desenhe e Descreva, através de lâminas prontas e focalizadas, os principais aspectos 
macroscópicos (tipo de colônia, verso, reverso, pigmentação, etc. Observe a diferença 
entre levedura e bolor) e microscópicos dos fungos (micélio septado x não sepatado, 
hialino x demácia, delgado x espesso, formação de ectosporos x endósporos e outras 
características). 
 
Aspergillus 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Penicillium 
Rhizopus 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Candida 
 
 
 
 
 
 
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Prática 7. Antifungigrama 
 
Infecções causadas por fungos têm se tornado um grande problema de saúde pública e 
vêm crescendo em número e gravidade nas últimas três décadas. Esse aumento 
progressivo está relacionado com a evolução dos procedimentos médico-hospitalares 
invasivos, aumentando o risco de infecção fúngica, principalmente, em pacientes 
internados em unidades de oncologia, hematologia e de terapia intensiva (UTIs). 
Atualmente, a terapia antifúngica está restrita aos agentes poliênicos, aos azóis, as 
alilaminas, aos derivados morfolínicos, a 5-fluorocitosina, a griseofulvina e, mais 
recentemente, as equinocandinas. No entanto, para o tratamento das micoses invasivas, 
este arsenal terapêutico é limitado por problemas de seletividade, toxicidade e perfil de 
resistência dos fungos. 
O teste de susceptibilidade “in vitro” tem o objetivo de avaliar se o fungo filamentoso ou 
levedura é sensível ou resistente a um antifúngico. Embora este não seja um teste 
rotineiramente empregado na clínica médica, alguns casos refratários ao tratamento 
podem justificar teste de susceptibilidade aos antifúngicos, a partir da cepa de fungo 
isolada. As cepas isoladas de Candida spp. são testadas utilizando técnicas padronizadas 
contra os antifúngicos mais utilizados no mercado (anfotericina B, cetoconazol, fluconazol, 
itraconazol, voriconazol, posaconazol, caspofungina, micafungina e anidulafungina). 
A padronização destes testes de susceptibilidade aos antimicrobianos é realizada por 
órgãos internacionais como o CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, USA) e o 
EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Europa). As 
técnicas mais frequentemente empregadas são: técnica de diluição em caldo [protocolos 
M27-A3 (2008) para leveduras e M38-A2 (2008) para fungo filamentoso] e disco difusão 
[protocolo M44-A(2004)] do CLSI. Esta padronização é necessária para que estudos 
epidemiológicos possam ser realizados em diferentes partes do mundo e os resultados 
comparados. Além disso, para a pesquisa de novos agentes antifúngicos, um dos 
quesitos é comparar a eficácia da nova droga com os antifúngicos padrão. Para uma boa 
execução do ensaio, é necessário realizar o controle de qualidade do teste de 
susceptibilidade, pois é essencial para assegurar os resultados obtidos. Para isso é 
recomendado que se use uma cepa padrão (geneticamente estável) para determinar 
valores aceitáveis de CIM. Em geral, os resultados obtidos com variação de CIM ± uma 
diluição podem ser aceitos. 
 
Definições 
CIM – Concentração inibitória mínima: é a menor concentração do antifúngico capaz de 
inibir o crescimento do fungo 
CFM – Concentração fungicida mínima: é a menor concentração do antifúngico capaz de 
matar o fungo 
Fungistático: é a capacidade do antifúngico em inibir o crescimento do fungo. 
Fungicida: é a capacidade do antifúngico em matar o fungo 
 
PRÁTICA: TÉCNICA DE MACRODILUIÇÃO EM CALDO 
Materiais 
Suspensão de conídios de Aspergillus sp. (1-5 x 105 conídios/mL) 
Suspensão de leveduras de Candida sp. (1-5 x 104 leveduras/mL). 
Solução estoque de Anfotericina B (160 µg/mL) 
Solução estoque de Fluconazol (160 µg/mL) 
Tubos com 9 mL de caldo Sabouraud + extrato de levedura 0,2% 
Tubos com 5 mL de caldo Sabouraud + extrato de levedura 0,2% 
 
Preparação das soluções de antifúngicos: 
 
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1. Anfotericina B ou fluconazol- concentração 1.600 µg/mL 
Pesar 1,6 mg de anfotericina B ou Cetoconazol e diluir em 1 mL de DMSO 
(dimetilsulfóxido) e água estéril, respectivamente. 
Diluir 1:10 em meio caldo Sabouraud + extrato de levedura 0,2% para obter a 
concentração de 160 µg/mL (que será utilizado para o Antifungigrama). 
 
Procedimento: 
Em série de 8 tubos de meio de cultura (1º tubo: 9 mL e os demais 5 mL) 
Proceder da seguinte maneira: 
1. colocar 1mL de antifúngico (solução estoque de 160 µg/mL) no primeiro tubo (Tubo 
16) com meio de cultura (diluição 1:10) e homogenizar. 
2. Proceder a diluição seriada de 1:2, transferindo 5mL do tubo 16 para o tubo 8 e 
homogenizá-lo. 
3. Realizar o procedimento 2 até o tubo 0,25 
4. Após homogenização do tubo 0,25, descartar os 5mL no Tubo Descarte 
 
5. O último tubo conterá somente o meio de cultura para o controle positivo de 
crescimento fúngico (C+) 
6. Após a diluição da droga, transferir 0,1 mL da suspensão de fungo em todos os 8 
tubos. 
7. Incubar a série de tubos a 35ºC por 72 h para Aspergillus spp. e 48 h para Candida 
spp. 
8. Determinar o valor de CIM para cada antifúngico por meio de Leitura Visual. 
 
RESULTADOS - Macrodiluição em caldo 
 
1. Grupo _____ 
Fungo: Antifúngico: 
Concentração do antifúngico (µg/mL) 16 8 4 2 1 0,5 0,25 C+ 
Crescimento do fungo 
(+: crescimento; -: inibição de crescimento) 
 
Valor de CIM = __________ 
 
Interpretação dos resultados 
Tabela 1. Diretrizes de interpretação dos testes de susceptibilidade “in vitro” de Candida 
albicans. Documento M27-A3 (CLSI, 2008) e Documento M27-S4 (CLSI, 2012). 
Antifúngicos S (susceptível) SDD (susceptível dose 
dependente) 
R (resistente) 
Anfotericina B ≤ 1 µg/mL -- ≥ 2 µg/mL 
Fluconazol ≤ 2 µg/mL 4 ≥ 8 µg/mL