Biologia Molecular

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Indaial – 2020
Molecular
Prof.ª Letícia da Silva Pereira Fernandes
1a Edição
Biologia
Elaboração:
Prof.ª Letícia da Silva Pereira Fernandes
Copyright © UNIASSELVI 2020
Revisão, Diagramação e Produção:
Equipe Desenvolvimento de Conteúdos EdTech
Centro Universitário Leonardo da Vinci – UNIASSELVI
Ficha catalográfica elaborada pela equipe Conteúdos EdTech UNIASSELVI
Impresso por:
F363b
Fernandes, Letícia da Silva Pereira
 Biologia molecular. / Letícia da Silva Pereira Fernandes. – Indaial: 
UNIASSELVI, 2020
 180 p.; il.
 ISBN 978-65-5663-345-9
 ISBN Digital 978-65-5663-346-6
 1. Biologia molecular. - Brasil. II. Centro Universitário Leonardo da 
Vinci.
CDD 575.173
Olá, acadêmico! Seja bem-vindo ao Livro Didático Biologia Molecular! Este livro 
está dividido em três unidades, as quais apresentam o principal objetivo de apresentar 
conceitos básicos e um pouco da história por trás dos avanços nas técnicas de biologia 
molecular. 
Lembre-se que a biologia molecular é um campo que está constantemente 
inovando e em busca de soluções para os estudos que focam em DNA, RNA, proteínas 
e outras biomoléculas. A biologia molecular trata de componentes essenciais à vida e 
de muita importância para as áreas biológicas e da saúde, por isso a aplicação dessas 
técnicas está cada vez mais presente no dia a dia da medicina diagnóstica e da pesquisa 
básica, na busca por tratamento e cura para as mais diversas doenças e, portanto, no 
entendimento da complexidade da vida!
Na primeira unidade, nosso foco será voltado à origem e explanação de técnicas 
básicas de biologia molecular, como o isolamento, clonagem e sequenciamento de DNA 
e a reação em cadeia da polimerase (PCR), as quais serão de extrema importância para 
o entendimento das demais técnicas abordadas ao longo do livro. 
Na Unidade 2, avançaremos para uma área mais complexa da Biologia Molecular 
e aprenderemos sobre as chamadas ciências “ômicas”. Nessa unidade, trataremos de 
um dos maiores avanços científicos dos últimos anos, o Projeto Genoma Humano (PGH), 
e veremos como esse projeto contribuiu para avanços que culminaram na era “ômica”, 
com o desenvolvimento de técnicas avançadas de estudo do genoma, do proteoma, do 
mataboloma e de outros “omas”.
Por fim, com todo o conhecimento adquirido ao longo das duas primeiras 
unidades, na terceira unidade deste livro trataremos da aplicação prática das técnicas 
abordada. Você será apresentado a um dos campos de atuação do biomédico em que 
essas técnicas avançadas de biologia molecular podem ser aplicadas. Entre elas, estão 
os testes diagnósticos moleculares e a melhora da qualidade de vida de pacientes por 
meio das investigações voltadas ao desempenho esportivo e nutricional. 
De maneira geral, o conteúdo abordado neste livro é apresentado de maneira 
prática e direcionado para que você, futuro biomédico, esteja preparado para conhecer 
e atuar aplicando a biologia molecular ou desenvolvendo novas metodologias nesta 
fantástica área!
Bons estudos!
Prof.a Letícia da Silva Pereira Fernandes
APRESENTAÇÃO
Olá, acadêmico! Para melhorar a qualidade dos materiais ofertados a você – e 
dinamizar, ainda mais, os seus estudos –, nós disponibilizamos uma diversidade de QR Codes 
completamente gratuitos e que nunca expiram. O QR Code é um código que permite que você 
acesse um conteúdo interativo relacionado ao tema que você está estudando. Para utilizar 
essa ferramenta, acesse as lojas de aplicativos e baixe um leitor de QR Code. Depois, é só 
aproveitar essa facilidade para aprimorar os seus estudos.
GIO
QR CODE
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No livro didático, você encontrará blocos com informações 
adicionais – muitas vezes essenciais para o seu entendimento 
acadêmico como um todo. Eu ajudarei você a entender 
melhor o que são essas informações adicionais e por que você 
poderá se beneficiar ao fazer a leitura dessas informações 
durante o estudo do livro. Ela trará informações adicionais 
e outras fontes de conhecimento que complementam o 
assunto estudado em questão.
Na Educação a Distância, o livro impresso, entregue a todos 
os acadêmicos desde 2005, é o material-base da disciplina. 
A partir de 2021, além de nossos livros estarem com um 
novo visual – com um formato mais prático, que cabe na 
bolsa e facilita a leitura –, prepare-se para uma jornada 
também digital, em que você pode acompanhar os recursos 
adicionais disponibilizados através dos QR Codes ao longo 
deste livro. O conteúdo continua na íntegra, mas a estrutura 
interna foi aperfeiçoada com uma nova diagramação no 
texto, aproveitando ao máximo o espaço da página – o que 
também contribui para diminuir a extração de árvores para 
produção de folhas de papel, por exemplo.
Preocupados com o impacto de ações sobre o meio ambiente, 
apresentamos também este livro no formato digital. Portanto, 
acadêmico, agora você tem a possibilidade de estudar com 
versatilidade nas telas do celular, tablet ou computador.
Preparamos também um novo layout. Diante disso, você 
verá frequentemente o novo visual adquirido. Todos esses 
ajustes foram pensados a partir de relatos que recebemos 
nas pesquisas institucionais sobre os materiais impressos, 
para que você, nossa maior prioridade, possa continuar os 
seus estudos com um material atualizado e de qualidade.
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disciplina e com ela um novo conhecimento. 
Com o objetivo de enriquecer seu conheci-
mento, construímos, além do livro que está em 
suas mãos, uma rica trilha de aprendizagem, 
por meio dela você terá contato com o vídeo 
da disciplina, o objeto de aprendizagem, materiais complementa-
res, entre outros, todos pensados e construídos na intenção de 
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dos meios avaliativos dos cursos superiores no sistema federal de 
educação superior. Todos os estudantes estão habilitados a participar 
do ENADE (ingressantes e concluintes das áreas e cursos a serem 
avaliados). Diante disso, preparamos um conteúdo simples e objetivo 
para complementar a sua compreensão acerca do ENADE. Confi ra, 
acessando o QR Code a seguir. Boa leitura!
SUMÁRIO
UNIDADE 1 - O MATERIAL GENÉTICO E AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DE 
ISOLAMENTO E SEQUENCIAMENTO ..................................................................................... 1
TÓPICO 1 - ISOLAMENTO E CLONAGEM ...............................................................................3
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................................3
2 ISOLAMENTO DE DNA OU RNA ...........................................................................................5
2.1 ELETROFORESE EM GEL ...................................................................................................................... 6
2.2 ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO ...................................................................................................7
2.3 HIBRIDIZAÇÃO ....................................................................................................................................... 9
3 CLONAGEM DE DNA .......................................................................................................... 13
RESUMO DO TÓPICO 1 ......................................................................................................... 16
AUTOATIVIDADE .................................................................................................................. 17
TÓPICO 2 - REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) ................................................. 19
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 19
2 PCR PASSO A PASSO ........................................................................................................21
3 TRANSCRIÇÃO REVERSA ................................................................................................ 23
4 PCR QUALITATIVO VS. PCR QUANTITATIVO .................................................................. 25
RESUMO DO TÓPICO 2 ........................................................................................................ 28
AUTOATIVIDADE ................................................................................................................. 29
TÓPICO 3 - BIBLIOTECAS DE DNA E CDNA ........................................................................ 31
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 31
2 BIBLIOTECA DE DNA OU GENÔMICA .............................................................................. 32
3 BIBLIOTECA DE CDNA ..................................................................................................... 34
RESUMO DO TÓPICO 3 ........................................................................................................ 36
AUTOATIVIDADE ..................................................................................................................37
TÓPICO 4 - SEQUENCIAMENTO DE DNA ........................................................................... 39
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 39
2 MÉTODOS DE SANGER E SANGER AUTOMATIZADO ..................................................... 40
3 SEQUENCIAMENTO SHOTGUN ....................................................................................... 45
4 SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO (NEXT GENERATION SEQUENCING - NGS) ...... 46
5 SEQUENCIAMENTO DE TERCEIRA GERAÇÃO ................................................................ 52
6 SEQUENCIAMENTO PORTÁTIL ........................................................................................ 53
LEITURA COMPLEMENTAR ................................................................................................ 54
RESUMO DO TÓPICO 4 .........................................................................................................57
AUTOATIVIDADE ................................................................................................................. 58
REFERÊNCIAS ......................................................................................................................59
UNIDADE 2 — GENÔMICA E AS DEMAIS “ÔMICAS” ............................................................ 61
TÓPICO 1 — GENÔMICA ....................................................................................................... 63
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 63
2 GENÔMICA ESTRUTURAL ............................................................................................... 64
3 MAPAS CROMOSSÔMICOS DE ALTA RESOLUÇÃO ..........................................................67
4 MAPAS CROMOSSÔMICOS FÍSICOS ................................................................................70
5 GENÔMICA FUNCIONAL ....................................................................................................72
6 POLIMORFISMO GENÉTICO ..............................................................................................81
RESUMO DO TÓPICO 1 ........................................................................................................ 86
AUTOATIVIDADE ..................................................................................................................87
TÓPICO 2 - PROJETO GENOMA HUMANO ......................................................................... 89
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 89
2 PGH ................................................................................................................................... 90
RESUMO DO TÓPICO 2 .........................................................................................................95
AUTOATIVIDADE ..................................................................................................................96
TÓPICO 3 - AS DEMAIS “ÔMICAS” ......................................................................................97
1 INTRODUÇÃO .....................................................................................................................97
2 TRANSCRIPTÔMICA......................................................................................................... 98
3 PROTEÔMICA ..................................................................................................................103
4 METABOLÔMICA ............................................................................................................. 113
LEITURA COMPLEMENTAR ............................................................................................... 116
RESUMO DO TÓPICO 3 .......................................................................................................122
AUTOATIVIDADE ................................................................................................................123
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................124
UNIDADE 3 — DIAGNÓSTICO E OUTRAS APLICAÇÕES DAS DIVERSAS 
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR: POTENCIAIS ÁREAS DE 
ATUAÇÃO DO BIOMÉDICO .................................................................................................125
TÓPICO 1 — TESTES PRÉ-NATAIS, NEONATAIS E EM PRODUTOS DA CONCEPÇÃO ........ 127
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 127
2 TRIAGEM PRÉ-NATAL NÃO INVASIVA (NIPT) ...............................................................128
3 TESTE DO PEZINHO (TRIAGEM NEONATAL) .................................................................129
3.1 DOENÇA DA URINA DE XAROPE DE BORDO OU LEUCINOSE (MSUD) .................................... 132
4 PERFIL METABÓLICO ASSOCIADO AOS ERROS INATOS DO METABOLISMO .............133
4.1 ÁCIDOS ORGÂNICOS URINÁRIOS .................................................................................................. 133
4.2 ACILCARNITINAS E AMINOÁCIDOS .............................................................................................. 134
5 SURDEZ GENÉTICA OU SURDEZ HEREDITÁRIA ...........................................................134
6 SEQUENCIAMENTO DE PRODUTO DE CONCEPÇÃO .....................................................135
RESUMO DO TÓPICO 1 ....................................................................................................... 137
AUTOATIVIDADE ................................................................................................................138
TÓPICO 2 - TESTES ONCOLÓGICOS .................................................................................139
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................139
2 CÂNCER DE MAMA E DE OVÁRIO .................................................................................. 140
3 POLIPOSE ADENOMATOSA FAMILIAR ........................................................................... 141
4 CÂNCER COLORRETAL ...................................................................................................142
5 PESQUISA DE CÂNCER HEREDITÁRIO ..........................................................................142
6 BIÓPSIA LÍQUIDA ........................................................................................................... 144
RESUMO DO TÓPICO 2 .......................................................................................................145AUTOATIVIDADE ................................................................................................................146
TÓPICO 3 - DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS E OUTROS TESTES ......................................... 147
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 147
2 DOENÇAS MITOCONDRIAIS ........................................................................................... 147
3 PERFIL GENÉTICO PARA DOENÇAS CARDIOVASCULARES ........................................148
4 ANÁLISE CROMOSSÔMICA POR MICROARRANJO .......................................................149
5 INTOLERÂNCIA À LACTOSE ...........................................................................................150
6 SEQUENCIAMENTO DO EXOMA ...................................................................................... 151
6.1 EXOMA DO RECÉM-NASCIDO ......................................................................................................... 153
7 TESTE DE DNA OU TESTE DE PATERNIDADE ................................................................153
8 SAÚDE ENDOMETRIAL – ENDOMETRITE CRÔNICA .....................................................156
8.1 ALICE – ANÁLISE DE ENDOMETRITE CRÔNICA INFECCIOSA ................................................. 157
8.2 EMMA – ANÁLISE METAGENÔMICA DO MICROBIOMA ENDOMETRIAL ................................158
9 PLANEJAMENTO DE GRAVIDEZ – ACONSELHAMENTO GENÉTICO ............................160
10 ANCESTRALIDADE JUDAICA ASHKENAZI ..................................................................162
11 TRIMETILAMINÚRIA – TMAU1 .......................................................................................163
12 HIV E HEPATITES ..........................................................................................................164
13 INFECÇÕES RESPIRATÓRIAS .......................................................................................164
14 TROMBOFILIA ................................................................................................................166
15 INFECÇÕES SEXUALMENTE TRANSMISSÍVEIS (IST) .................................................166
15.1 PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) .................................................................................................167
16 FARMACOGENÉTICA ..................................................................................................... 167
17 AVALIAÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL ..................................................................169
18 NUTRIGENÉTICA ...........................................................................................................170
19 PERFIL GENÉTICO DESEMPENHO ESPORTIVO ...........................................................170
20 SEQUENCIAMENTO COMPLETO DO GENOMA (WGS) ..................................................171
LEITURA COMPLEMENTAR ............................................................................................... 173
RESUMO DO TÓPICO 3 ....................................................................................................... 177
AUTOATIVIDADE ................................................................................................................178
REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 179
1
UNIDADE 1 -
O MATERIAL GENÉTICO E 
AS PRINCIPAIS TÉCNICAS 
DE ISOLAMENTO E 
SEQUENCIAMENTO
OBJETIVOS DE APRENDIZAGEM
PLANO DE ESTUDOS
A partir do estudo desta unidade, você deverá ser capaz de:
• investigar a origem do desenvolvimento de diversas técnicas de biologia molecular;
• identifi car técnicas de isolamento e clonagem de fragmentos de DNA;
• ilustrar o funcionamento da técnica de PCR e suas principais aplicações;
• apontar como são formadas as bibliotecas de DNA e cDNA e seus diferentes objetivos;
• examinar as principais técnicas de sequenciamento de DNA.
Esta unidade está dividida em quatro tópicos. No decorrer dela, você encontrará 
autoatividades com o objetivo de reforçar o conteúdo apresentado.
TÓPICO 1 – ISOLAMENTO E CLONAGEM 
TÓPICO 2 – REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
TÓPICO 3 – BIBLIOTECAS DE DNA E CDNA
TÓPICO 4 – SEQUENCIAMENTO DE DNA
Preparado para ampliar seus conhecimentos? Respire e vamos em frente! Procure 
um ambiente que facilite a concentração, assim absorverá melhor as informações.
CHAMADA
2
CONFIRA 
A TRILHA DA 
UNIDADE 1!
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3
ISOLAMENTO E CLONAGEM
1 INTRODUÇÃO
Caros acadêmicos, antes de adentrarmos no universo das técnicas avançadas de 
biologia molecular, é preciso relembrar a origem e alguns conceitos básicos sobre a molécula 
de ácido desoxirribonucleico, o DNA, pois, a partir desses conhecimentos, que as técnicas 
conhecidas, atualmente, como técnicas de biologia molecular, foram desenvolvidas.
Embora, atualmente, seja comum o conhecimento de que o DNA é a molécula 
que possui as informações genéticas, até meados do século XX, sabia-se apenas da 
importância dessas informações – já denominadas de genes – para a manutenção da 
vida. No entanto, não havia clareza de qual molécula biológica poderia ser responsável 
por tão importante e complexa função. 
Com a descoberta, na década de 1950, por James Watson, Francis Crick, Maurice 
Wilkins e Rosalind Franklin, da estrutura de dupla hélice complementar do DNA (Figura 
1), foi possível entender como a complexidade das informações contidas nos genes 
poderia ser replicada ou transmitida para outras células.
FIGURA 1 – ESTRUTURA EM DUPLA HÉLICE DO DNA - DR=DESOXIRRIBOSE; A=ADENINA; T=TIMINA; 
C=CITOSINA; G=GUANINA; P=FOSFATO
FONTE: Junqueira e Carneiro (2012, p. 57).
TÓPICO 1 - UNIDADE 1
4
Assim, após o conhecimento de que a estrutura de dupla hélice do DNA é formada 
por duas fitas lineares, compostas por uma sequência complementar formada por quatro 
nucleotídeos (adenina, citosina, guanina e timina ou A, C, G e T, respectivamente) (Figura 
1), foi possível entender como a sequência de nucleotídeos de um determinado gene, 
presente no DNA, é responsável pela codificação da sequência complexa de aminoácidos 
que deverão ser sintetizados para formar uma determinada proteína.
Por fim, embora fosse conhecido que os genes presentes no DNA codificassem 
para a síntese de proteínas, observou-se que a síntese ocorria essencialmente onde o 
DNA não estava presente: no citosol. Dessa forma, veio à tona a descoberta do RNA, 
uma molécula semelhante ao DNA que também é formada por nucleotídeos, porém em 
uma única fita, na qual, em vez de timina, é encontrado o nucleotídeo uracila (Figura 2). 
Essa é molécula capaz de carregar as informações contidas no DNA para fora do núcleo 
(transcrição), servindo de molde para a síntese de proteínas (tradução) (Figura 3).
FIGURA 2 – ESTRUTURA DO RNA - C= CITOSINA; A= ADENINA; U=URACILA; G=GUANINA
FONTE: Adaptado de Alberts et al. (2008).
5
FIGURA 3 – ESQUEMA DNA RNA PROTEÍNA
FONTE: Adaptado de Alberts et al. (2008).
Em posse do conhecimento sobre estas importantes macromoléculas: o DNA, 
o RNA e as proteínas, e da sua íntima relação umas com as outras, iniciaram-se os 
estudos relativos aos processos intracelulares de manutenção, reparo e síntese desses 
componentes e das demais moléculas envolvidas nestes processos. Esses estudos 
estão englobados em áreas conhecidas como genética molecular ou biologia molecular 
e incluem a aplicação de técnicas e modelos baseados no entendimento de como os 
processos intracelulares ocorrem. Tais técnicas incluem o isolamento de moléculas, 
como um gene, a clonagem, a amplificação e o sequenciamento de um fragmento de 
DNA, metodologias que serão abordadas com mais detalhes nesta unidade. 
2 ISOLAMENTO DE DNA OU RNA
Para que seja possível investigar uma molécula, um fragmento de DNA ou mesmo 
um gene específico, é preciso isolá-la dos demais componentes celulares e das demais 
moléculas deDNA ou dos demais genes, pois, mesmo que seja feita a extração do DNA 
de uma determinada amostra celular ou tecidual, todo o DNA presente na amostra será 
extraído em conjunto e, assim, será necessário que alguma técnica de isolamento seja 
aplicada para que apenas o fragmento de DNA de interesse seja isolado dos demais. 
6
2.1 ELETROFORESE EM GEL
A técnica mais simplificada de separação, aplicável a moléculas de DNA, RNA 
ou até mesmo a proteínas, é pelo tamanho da molécula e se dá por meio de uma 
eletroforese em gel, o qual pode ser composto por poliacrilamida ou agarose. Nessa 
técnica de isolamento, uma corrente elétrica é transmitida através do gel, o qual se 
encontra imerso em solução tampão, do polo negativo (cátodo) para o polo positivo 
(ânodo) e, por meio das cargas negativas presentes nas moléculas de DNA, elas são 
carreadas por afinidade para o polo positivo do gel (Figura 4). 
Esse carreamento acontece porque o gel utilizado na técnica possui a 
porosidade necessária para que as moléculas se movimentem por ele. Dessa forma, 
moléculas maiores tendem a apresentar maior dificuldade de migrar pelo gel, enquanto 
moléculas menores apresentam maior facilidade para essa movimentação. Assim, as 
moléculas são separadas em populações contendo moléculas de tamanho semelhante, 
o que posteriormente será visualizado em um formato que chamamos de bandas no gel, 
formando um gradiente, sendo as menores encontradas mais próximas ao polo positivo 
e as maiores permanecendo próximas ao polo negativo.
FIGURA 4 – ELETROFORESE EM GEL - A – APARATO PARA ELETROFORESE VERTICAL; B – APARATO PARA 
ELETROFORESE HORIZONTAL
FONTE: A – Adaptado de Alberts et al. (2008); B – Adaptado de Watson et al. (2015).
Após a separação no gel, ele deve ser corado com corantes fluorescentes, que 
se ligam ao DNA, possibilitando a visualização das bandas formadas pelas populações 
da molécula. O corante fluorescente mais conhecido e aplicado em géis de eletroforese 
de DNA e RNA é o brometo de etídio, que, após a coloração, permite que as bandas 
sejam visualizadas sob luz ultravioleta (UV).
7
Um detalhe dessa técnica é a escolha de agarose ou poliacrilamida como matriz 
do gel. Embora ambas sejam aplicáveis para o isolamento de moléculas de acordo com 
seu tamanho, é importante ressaltar que a escolha depende do tamanho da molécula a 
ser isolada e do objetivo do isolamento. 
A poliacrilamida forma um gel de maior resolução, ou seja, fragmentos de DNA com 
até mesmo uma única base nitrogenada de diferença podem ser separados. No entanto, 
uma menor faixa de tamanho das moléculas pode se movimentar nesse tipo de matriz. 
A agarose, por sua vez, apresenta menor resolução, o que signifi ca que cada banda 
presente no gel representa um agrupamento de moléculas de tamanho semelhantes. No 
entanto, fragmentos maiores de DNA podem facilmente migrar por essa matriz. 
Ainda assim, vale lembrar que uma única molécula de DNA íntegra pode conter 
milhares de genes e, portanto, apresentar centenas de milhares de pares de bases 
nitrogenadas, o que inviabiliza seu carreamento adequado em uma eletroforese, mesmo 
em um gel de matriz de agarose. Além disso, o maior interesse nos estudos relacionados 
ao DNA se dá por fragmentos ou genes específi cos que possam ser facilmente 
manipulados e, por conta disso, ferramentas mais precisas, como as endonucleases de 
restrição, têm sido utilizadas com o objetivo de fragmentar e manipular o DNA e seus 
fragmentos para a aplicação em estudos específi cos.
2.2 ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Diversas bactérias produzem, naturalmente, endonucleases como mecanismo 
de proteção contra infecções virais, já que essas enzimas quebram o DNA viral, impedindo 
o vírus de agredir a bactéria. Foi a partir da observação e estudo desse mecanismo 
de defesa que as endonucleases foram descobertas e, desde então, essas enzimas 
passaram a ser isoladas e purifi cadas a partir de colônias de diferentes bactérias, 
sendo aplicadas como enzimas de restrição na manipulação do DNA. São diversas as 
endonucleases isoladas, pois cada bactéria apresenta uma específi ca.
Assista a um esquema exemplifi cando uma eletroforese em gel de agarose 
em https://www.youtube.com/watch?v=B2KLuzD_suQ. Você também pode 
assistir a uma prática demonstrativa através do link https://www.youtube.com/
watch?v=08wqFHbFMtg.
DICA
8
De maneira simplificada, a utilização de endonucleases de restrição permite a 
manipulação do DNA para que ele seja fragmentado em regiões específicas, viabilizando 
que um determinado fragmento seja isolado dos demais fragmentos do DNA. Essas 
enzimas clivam a molécula de DNA em regiões predeterminadas, compostas por uma 
sequência específica de 4 a 8 nucleotídeos, chamados de sequência de reconhecimento. 
Um exemplo desse caso é a enzima de restrição chamada EcoRI, a qual é amplamente 
utilizada e cuja sequência de reconhecimento é composta por apenas quatro 
nucleotídeos (5’-AATT-3’) (Figura 5). Cada endonuclease de restrição apresenta uma 
região de clivagem conhecida e específica, permitindo o controle dos sítios de clivagem 
e a previsão do tamanho dos fragmentos que serão originados. 
 
FIGURA 5 – EXEMPLO DE RESTRIÇÃO REALIZADO COM A ENDOCNUCLEASE DE RESTRIÇÃO ECORI E A 
SEPARAÇÃO, POR ELETROFORESE EM GEL, DOS FRAGMENTOS OBTIDOS
FONTE: Watson et al. (2015, p. 150).
Após o tratamento das amostras de DNA com uma ou mais endonucleases de 
restrição, é possível submeter a amostra a uma separação por eletroforese em gel, como 
previamente descrito, promovendo a identificação mais precisa pela quantidade de bases 
nitrogenadas, e o isolamento do fragmento de interesse a ser avaliado (Figura 5).
9
2.3 HIBRIDIZAÇÃO
Antes de discutirmos sobre o que é a hibridização e como ela é aplicada no 
isolamento de fragmentos de DNA, é preciso que mais alguns conceitos básicos relativos 
a essa tão importante molécula sejam relembrados.
Como já discutimos anteriormente, o DNA é composto por duas fitas que, quando 
ligadas, formam uma estrutura em dupla hélice. Cada uma dessas fitas é complementar 
a outra e é formada por uma sequência composta pelos quatro nucleotídeos (A, T, C 
e G). O que ainda não discutimos neste livro é que essas duas fitas, embora sejam 
complementares e ligadas, formando a dupla hélice, podem ter suas ligações entre os 
nucleotídeos, também chamados de pares de bases, rompidas quando em condições 
adequadas de salinidade, temperatura e pH, disponibilizando duas fitas simples. Esse 
processo é chamado de desnaturação. No entanto, as bases nitrogenadas, mesmo após 
a desnaturação, tendem a se ligar novamente com suas bases complementares, ou 
seja, A se liga com T, e C se liga com G, em um processo chamado de anelamento, o qual 
promove a renaturação do DNA, restaurando a dupla fita.
Essa possibilidade de desnaturação e reanelamento dos pares de bases de 
um fragmento de DNA permitiu que algumas manipulações, em prol do isolamento e 
identificação desses fragmentos, fossem desenvolvidas. Assim, foi elaborada a técnica 
de hibridização, a qual se resume à promoção do anelamento entre duas fitas simples de 
origem distintas, sejam elas fitas de DNA ou RNA, inclusive podendo ser a hibridização 
entre uma fita de RNA com uma de DNA.
Mas, você pode se perguntar: “como o processo de hibridização poderia promover 
o isolamento e identificação de algum fragmento específico?”. Pois bem, para esse 
propósito são utilizadas as chamadas sondas, que são fitas de DNA com uma sequência 
de nucleotídeos complementar ao gene ou fragmento de interesse, mas que carregam 
em sua estrutura um marcador que pode ser radioativo ou químico. Desta forma, em 
condições adequadas, a sonda é capaz de detectar a região da fita desnaturada do DNA 
da amostra, que é complementar à sua sequência e, então, anelar-se a ela, permitindo 
que por meio do marcador seja visualizada a presença do fragmento de interesse (Figura 
6). As principais aplicações da técnica de hibridização são chamadas de hibridização insitu, Northern e Southern-blotting. 
10
FIGURA 6 – ESQUEMA DO PROCESSO DE LIGAÇÃO DA SONDA DE HIBRIDIZAÇÃO COM UMA FITA SIMPLES 
DE DNA
FONTE: Adaptado de Alberts et al. (2008)
Na hibridização in situ, as sondas de ácidos nucleicos, quimicamente marcadas, 
são aplicadas, como o próprio nome diz, no local em que a molécula de interesse deve 
ser encontrada. Assim, é possível determinar a presença de uma determinada sequência 
de DNA ainda nos cromossomos ou verificar a existência de um RNA específico dentro de 
uma célula, sem que, para isso, a amostra seja homogeneizada e o material de interesse 
extraído, evitando, assim, a perda ou degradação das fitas de nucleotídeos durante esses 
processos (Figura 7). Nesse caso específico, a amostra é submetida a uma elevação de 
pH que permite a separação da fita dupla de DNA e, consequentemente, o pareamento da 
sonda de ácidos nucleicos que foi aplicada. A hibridização in situ pode, ainda, ser aplicada 
para determinar a localização de um RNA específico em um tecido, célula ou até mesmo 
em pequenos organismos, ou seja, os padrões de expressão diferencial do gene. Para 
esse objetivo, no entanto, o tecido de interesse deve ser fixado de uma forma específica, 
que envolve, por exemplo, o tratamento com proteinases e detergentes para a quebra de 
estruturas celulares que possam impedir a penetração das sondas de hibridização.
11
FIGURA 7 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU REALIZADA EM UM CROMOSSOMO
FONTE: Alberts et al. (2008, p. 537).
Para a aplicação da técnica de hibridização northern-blotting, assim como para 
a southern-blotting, um fracionamento prévio por meio de eletroforese em gel deve 
ser aplicado para a separação, em bandas, dos RNAs - no caso da northern; ou dos 
fragmentos de DNA, para a aplicação da southern. Na northern-blotting, a população de 
RNA mensageiros (mRNAs) extraída da amostra de interesse é submetida à eletroforese 
em gel e, na sequência, as bandas formadas são transferidas para uma membrana, 
normalmente de nitrocelulose, permitindo que o padrão de bandas formado no gel gere 
uma impressão na membrana e disponibilizando as moléculas de mRNA para a ligação 
com as sondas de hibridização. Esse processo de “impressão” é chamado de blotting. 
Assim, após o blotting na membrana, ela é incubada com a sonda de DNA marcada, 
formada pela sequência molde do gene de interesse a ser avaliado, promovendo, assim, 
a hibridização. Nesse processo, após incubação, se a sequência complementar à sonda 
aplicada estiver presente na amostra, ela será marcada e sua presença será identificada 
por meios químicos ou de autorradiografia (dependendo da marcação presente na sonda 
utilizada) (Figura 8). Além disso, é possível determinar o tamanho da sequência, uma vez 
que, durante o processo, podem ser aplicadas no gel e transferidas para a membrana 
amostras que contenham RNAs de tamanhos conhecidos, os chamados padrões de RNA. 
Essa técnica normalmente é aplicada quando se busca comparar situações distintas, por 
exemplo, utilizando amostras controle que sirvam como padrão para a expressão do gene 
de interesse. Assim, após o processo de hibridização, pode ser avaliado, por exemplo, 
se o gene de interesse se encontra expresso em ambas as amostras, bem como se a 
quantidade e o tamanho das moléculas de mRNA são diferentes entre elas, elucidando, 
por vezes, a participação de tal gene em uma determinada condição patológica.
12
FIGURA 8 – REPRESENTAÇÃO DA IDENTIFICAÇÃO DE UM FRAGMENTO DE DNA ALVO POR MEIO DE 
HIBRIDIZAÇÃO EM MEMBRANA (BLOTTING)
FONTE: Watson et al. (2015, p. 152). 
Similarmente ao northern-blotting, o southern-blotting utiliza sondas de DNA 
molde, as quais são marcadas quimicamente ou com radiação. No entanto, nessa técnica 
são avaliados os padrões das sequências de nucleotídeos de genes no DNA, ou seja, ela 
identifica o tamanho do fragmento de um gene, e não o seu padrão de expressão, como 
no northern-blotting. Como dito anteriormente, o DNA é uma fita dupla, polinucleotídica 
e bastante extensa, que contém a informação dos genes. Assim, para que seja 
possível a sua movimentação em gel por meio da eletroforese, ela deve ser clivada em 
fragmentos menores, portanto, as endonucleases de restrição são as ferramentas mais 
adequadas a serem utilizadas. Após a clivagem, o DNA é submetido à eletroforese em 
gel e, assim, os fragmentos obtidos serão fracionados de acordo com seu tamanho. 
Antes do processo de transferência para a membrana ou blotting, os fragmentos de 
DNA presentes no gel devem ser submetidos ao processo de desnaturação, o qual se 
dá normalmente pela imersão do gel em solução alcalina. Dessa forma os fragmentos 
de DNA estarão prontos para a transferência para a membrana de nitrocelulose, onde 
serão incubados com as sondas de hibridização e posteriormente identificados quanto 
à sua presença e tamanho, como previamente descrito para o northern-blotting. Com a 
aplicação da técnica southern-blotting, é possível caracterizar a estrutura de um gene 
por meio da comparação dos fragmentos obtidos e marcados na amostra de interesse 
com mapas de restrição previamente determinados para o mesmo gene, ou seja, é 
possível identificar a ocorrência de alguns tipos de alterações na sequência do gene 
dos organismos que estão sendo testados, como, por exemplo, a inserção ou deleção 
de pequenas sequências de nucleotídeos, as quais podem estar associadas a condições 
deletérias ou doenças.
13
3 CLONAGEM DE DNA
Como já observamos, as técnicas de biologia molecular permitem a manipulação 
e a investigação das moléculas de DNA, dos genes, da expressão desses genes, 
entre outras tantas aplicações. No entanto, o isolamento de fragmentos de DNA de 
interesse presentes em uma amostra fornece apenas pequenas quantidades – muitas 
vezes ínfimas, quando se trata de amostras raras – de material para as manipulações 
subsequentes. Nesse sentido, o desenvolvimento de técnicas de clonagem permitiu que, 
rapidamente, fossem obtidas cópias idênticas do fragmento de interesse, fornecendo a 
quantidade de material adequado para a aplicação em outras análises.
Conceitualmente, a clonagem de DNA se refere à produção, dentro de uma célula, 
de diversas cópias de uma sequência específica de um fragmento de DNA. A clonagem 
de DNA depende da utilização de um vetor, do fragmento de DNA e, posteriormente, de 
um organismo hospedeiro. Para iniciar o processo de clonagem, o fragmento de DNA 
de interesse deve ser inserido em uma molécula de DNA genômico com capacidade de 
autorreplicação, ou seja, o DNA do vetor. A nova molécula de DNA, formada pela junção 
do fragmento de interesse com o DNA do vetor, é chamada de DNA recombinante. Para 
a formação do DNA recombinante, é necessária a atuação de enzimas de restrição e de 
enzimas de ligação.
A partir da clivagem de uma molécula de DNA por uma enzima de restrição, cuja 
sequência de clivagem é conhecida, formam-se os fragmentos de DNA que podem ser 
selecionados e ligados ao DNA do vetor, em que, pela ação da enzima DNA ligase, ficarão 
inseridos e formarão o DNA recombinante.
Os vetores mais comumente utilizados são os vetores plasmidiais, pequenas 
moléculas de DNA circular capazes de se autorreplicar que contêm sítios conhecidos de 
ligação a determinadas enzimas de restrição, o que permite manipulações específicas 
na fita de DNA. Esses pequenos DNA circulares, atualmente utilizados como vetores, 
foram desenvolvidos a partir de moléculas maiores de DNA circular, que podem estar 
naturalmente presentes em bactérias, inclusive conferindo a elas a resistência a 
antibióticos, além de apresentarem capacidade de replicação de forma independente 
da replicação da bactéria, estando muitas vezes presentes em várias cópias dentro de 
uma única bactéria. Outro tipo de vetor, por vezes também utilizado para a clonagem 
de DNA, são os fagos ou vírus bacterianos que, devido à sua capacidade de infectar 
bactérias, inserindo seu material genético nelas, foram manipulados, modificados e 
adaptadospara a aplicação na biologia molecular.
Para a inserção do fragmento de interesse do DNA clivado por uma enzima de 
restrição em um vetor, o DNA circular do vetor deve ser clivado, com a mesma enzima 
de restrição, formando uma fita linear em que o fragmento de interesse possa se ligar 
às extremidades. Dessa forma, por meio da atividade da enzima DNA ligase, o DNA 
14
vetorial e o fragmento inserido são ligados covalentemente, formando novamente uma 
molécula de DNA circular, mas, desta vez, recombinante. No entanto, como já falamos, a 
clonagem deve acontecer dentro de uma célula, ou seja, em um organismo hospedeiro.
O processo de inserção do vetor no organismo hospedeiro é chamado de 
transformação e ocorre naturalmente em diversas bactérias que apresentam competência 
genética, ou seja, que apresentam a capacidade de incorporar fragmentos ou moléculas 
de DNA presentes no meio externo, chamadas de bactérias competentes. No entanto, o 
organismo hospedeiro mais comumente utilizado no processo de clonagem é a bactéria 
Escherichia coli, a qual, diferentemente da maioria das outras bactérias, não apresenta 
essa capacidade, ou seja, não é uma bactéria naturalmente competente. Porém, mesmo 
não apresentando naturalmente a habilidade de internalização de material genético 
externo, a E. coli pode ser manipulada para que o vetor plasmidial seja internalizado por ela.
Após a transformação, devido à capacidade de autorreplicação do vetor, 
associada às elevadas taxas de replicação bacteriana, o fragmento de DNA inserido no 
vetor será rapidamente multiplicado durante o processo de crescimento bacteriano em 
meio de cultivo, produzindo, assim, os clones do fragmento de DNA (Figura 9).
FIGURA 9 – PROCEDIMENTO PARA CLONAGEM DE UM FRAGMENTO DE DNA
FONTE: Adaptado de Alberts et al. (2008)
15
Outros detalhes da técnica de clonagem podem ser encontrados em 
https://kasvi.com.br/clonagem-molecular-dna-recombinante/.
DICA
Embora a taxa de clonagem e multiplicação celular seja elevada, o processo 
de transformação, no entanto, não apresenta elevada efi ciência, portanto, apenas 
algumas das células bacterianas internalizarão o vetor plasmidial. Dessa forma, após 
a multiplicação celular inicial, é necessário que seja feito um processo de seleção das 
bactérias que contêm o vetor plasmidial. Para tanto, as bactérias são transferidas para 
um meio de cultivo na presença de antibiótico e, neste caso, aquelas que internalizaram 
o vetor apresentarão resistência ao antibiótico e permanecerão se multiplicando, 
enquanto aquelas que não internalizaram o vetor não se propagarão.
Uma importante aplicação da clonagem de DNA é a formação das bibliotecas 
de DNA, as quais serão discutidas com mais detalhes ainda nesta unidade. Além das 
bibliotecas de DNA, a clonagem precede diversas análises de biologia molecular, pois, 
após a execução de todas as etapas descritas anteriormente, as moléculas de DNA 
recombinante podem ser extraídas. Esse processo fornece grande quantidade de 
material, do qual os clones do fragmento de DNA de interesse podem ser isolados e, 
na sequência, aplicados em outras análises, como, por exemplo, a caracterização do 
fragmento inserido por meio do sequenciamento dos nucleotídeos presentes nele. 
16
Neste tópico, você adquiriu certos aprendizados, como:
• A partir dos estudos sobre a molécula de DNA, sua estrutura em dupla hélice e 
dos mecanismos celulares envolvidos nos processos de replicação do DNA e 
expressão gênica, as técnicas avançadas de biologia molecular começaram a ser 
desenvolvidas.
• Para o estudo do DNA, devido à complexidade, diversas manipulações podem ser 
empregadas, como o isolamento, a clonagem e o sequenciamento. 
• O isolamento de fragmentos de DNA pode ser realizado por eletroforese em gel 
de agarose ou poliacrilamida. Ainda, podem ser usadas técnicas mais complexas, 
como a hibridização para a identificação de um fragmento ou gene específico.
• A clonagem de DNA envolve a utilização de enzimas de restrição, vetores e um 
organismo hospedeiro, como a bactéria Escherichia coli. Através dessa técnica, 
rapidamente, podem ser obtidas muitas cópias ou clones de um mesmo fragmento 
de DNA.
RESUMO DO TÓPICO 1
17
1 Quais são os princípios físicos que permitem que a eletroforese em gel seja aplicada 
no isolamento de fragmentos de DNA?
a) ( ) Cargas negativas dos fragmentos de DNA, corrente elétrica e polaridade do gel. 
b) ( ) Cargas positivas dos fragmentos de DNA, corrente elétrica e porosidade da 
matriz do gel.
c) ( ) Cargas negativas dos fragmentos de DNA, corrente elétrica e porosidade da 
matriz do gel.
d) ( ) Cargas negativas do gel, elevação de temperatura e corrente elétrica.
2 Com relação à clonagem, explique como é formado o DNA recombinante e descreva 
as principais etapas do processo de formação dos clones.
 
3 Descreva, brevemente, as principais diferenças das técnicas de hibridização in situ, 
southern e northern-blotting.
4 Quais as principais características que um vetor e uma célula hospedeira devem 
conter para que possam ser utilizadas no processo de clonagem?
AUTOATIVIDADE
18
19
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
1 INTRODUÇÃO
Para entendermos com clareza como a técnica de reação em cadeia da 
polimerase – a chamada PCR – acontece, é preciso antes relembrar como a fita de DNA 
se replica in vivo, pois foi a partir desse entendimento que enzimas e moléculas foram 
manipuladas permitindo que um processo bastante similar de replicação fosse realizado 
dentro de um tubo de ensaio (in vitro).
O primeiro conceito a ser relembrado é que a replicação do DNA é semiconservativa, 
ou seja, cada nova cadeia dupla de DNA é formada por uma fita da cadeia original, a fita 
conservada, e uma fita nova, que foi sintetizada utilizando a fita conservada como molde 
(Figura 10). Esse processo é relativamente simples de entender, no entanto, existem 
diversas outras moléculas, além dos nucleotídeos, que são importantes e requisitados 
para que a replicação do DNA ocorra.
FIGURA 10 – DUPLICAÇÃO SEMICONSERVATIVA DA FITA DUPLA DE DNA
FONTE: Junqueira e Carneiro (2012, p. 182).
UNIDADE 1 TÓPICO 2 - 
20
A principal molécula envolvida no processo de replicação do DNA é uma 
enzima chamada DNA polimerase, que, como o próprio nome indica, é responsável pela 
polimerização da nova fita de DNA, sendo a enzima que alinha os novos nucleotídeos 
de acordo com a sequência obtida a partir da fita molde, formando, assim, uma nova fita 
de DNA. Aqui, vale ressaltar que o sentido de síntese da fita de DNA se dá sempre de 5’ 
para 3’, ou seja, o novo nucleotídeo sempre será inserido na terminação 3’ da fita que 
está sendo moldada por meio da ligação covalente promovida por moléculas de fosfato 
entre o carbono 3’ da desoxirribose que já está na fita e o carbono 5’ da desoxirribose do 
próximo nucleotídeo a ser inserido na fita.
Outra informação importante é que a DNA polimerase necessita de uma 
extremidade 3’ disponível para a inserção do novo nucleotídeo, o que nos leva ao conceito 
de primer, ou iniciador. No processo de replicação realizado in vivo, existem enzimas que são 
capazes de formar pequenas sequências de nucleotídeos, conhecidas como sequências 
iniciadoras, utilizando a fita molde de DNA sem a necessidade de uma extremidade 3’ para 
isso. Essas enzimas, denominadas primases, são de extrema importância no processo de 
replicação, pois são responsáveis por fornecer um sítio de ação para a DNA polimerase 
iniciar o processo de replicação do restante da fita. Entendido esse conceito, as técnicas 
de biologia molecular lançaram mão de primers artificialmente sintetizados, também 
chamados de oligonucleotídeos sintéticos, que podem ser facilmente sintetizados e 
utilizados como iniciadores no processo de amplificação in vitro.
 
Além dos componentes citados (fita molde de DNA, desoxirribonucleotídeos, 
enzimas sintetizadoras de primers e DNA polimerase), o processo de replicação ainda 
depende de outras enzimas e cofatores,como, por exemplo, as enzimas que farão a 
abertura da cadeia dupla e o desenrolamento da dupla hélice, como a DNA helicase e a 
topoisomerase. 
Com o entendimento de que o processo de replicação do DNA acontecia 
naturalmente e o conhecimento da estrutura química da molécula de DNA, foi possível 
aplicar os mesmos conceitos utilizando, por exemplo, DNA polimerases isoladas de 
bactérias, primers sintetizados e manipulações de pH, salinidade e temperatura para 
promover a replicação do DNA em ciclos sucessivos, com uma ou poucas moléculas 
de DNA sendo utilizadas como molde, dando origem, assim, ao que hoje conhecemos 
como a técnica de PCR. 
PCR é uma sigla que vem do inglês Polymerase Chain Reaction, que significa 
reação em cadeia da polimerase. O termo se refere à técnica base para a rápida replicação, 
também chamada de amplificação, de um fragmento de DNA. Essa técnica permitiu 
que fragmentos específicos de uma molécula de DNA fossem amplificados com grande 
eficácia e rapidez dentro de um tubo de ensaio em poucas horas. Um processo similar 
apenas era possível com a utilização da técnica de clonagem, no entanto, embora a 
clonagem seja eficiente, ela requer no mínimo um vetor e um organismo hospedeiro 
para a replicação, além de alguns dias para que o crescimento do hospedeiro produza 
quantidade suficiente de material replicado.
21
Com a utilização da PCR, em apenas alguns minutos é possível multiplicar de 
maneira expressiva a quantidade do fragmento de DNA que se deseja estudar, tornando 
a amostra repleta desse fragmento e possibilitando uma série de análises subsequentes, 
como, por exemplo, a quantificação da expressão de um gene em diferentes indivíduos 
ou tecidos, o sequenciamento dos nucleotídeos que compõem a molécula de interesse 
ou a comparação entre a expressão de um determinado gene em amostras provenientes 
de diferentes condições.
2 PCR PASSO A PASSO
Para que seja realizada uma PCR de um fragmento específico de DNA, por 
exemplo um gene, o primeiro passo é conhecer a sequência de nucleotídeos desse 
gene ou parte da sequência, pois, como dito anteriormente, para que o processo de 
replicação aconteça, é necessário que seja utilizado um primer ou oligonucleotídeo 
sintético. Esse primer deve ser uma sequência curta, com cerca de 18 a 22 nucleotídeos, 
que seja complementar ao gene de interesse. Para a aplicação em PCR, é utilizado um 
par de primers, cada um para uma das duas fitas de DNA, sempre em sentido 5’-3’. 
Obter um par de primers específico para o gene de interesse assegura que, nas etapas 
seguintes do processo, o material correto seja amplificado, promovendo uma purificação 
da amostra para a fragmento de interesse. 
Após a síntese dos primers e a extração do material genético da amostra de 
interesse, é iniciada a PCR em si. Nessa reação, são adicionados os primers, um coquetel 
contendo os quatro desoxinucleotídeos (dNTPs; A, T, G e C), a enzima DNA polimerase, 
cofatores enzimáticos (como o magnésio – Mg), e o material extraído, dando início ao 
processo de amplificação.
Devido à afinidade entre os nucleotídeos A e T, e C e G, os primers tendem a 
se ligar à sua sequência complementar no fragmento de DNA. No entanto, para que 
isso ocorra, é necessário que haja a abertura da dupla fita, liberando os nucleotídeos 
de cada uma das fitas simples que serão originadas a se ligarem aos seus primers 
correspondentes. Para que esse processo ocorra, o DNA é desnaturado sendo 
submetido, por um curto período, a uma alta temperatura, o que permite a separação 
das fitas e a ligação dos primers em suas sequências complementares em cada uma 
das fitas, processo chamado de anelamento de primers.
Após a ligação dos primers a cada uma das fitas simples de DNA, é formada 
uma pequena região de fita dupla composta pela fita molde do DNA desnaturado e do 
pequeno fragmento do primer. Assim, uma extremidade 3’ do primer fica disponível para 
que a DNA polimerase possa iniciar o processo de inserção dos dNTPs correspondentes 
à fita molde ou, como comumente chamado, o processo de extensão, formando uma 
nova fita dupla ao fim, composta pela fita molde e uma nova fita recém polimerizada e 
complementar ao molde.
22
Esse simples processo de desnaturação, anelamento e extensão, em apenas 
alguns minutos, duplica a quantidade de DNA disponível na amostra, pois, de acordo 
com o princípio semiconservativo, cada uma das duas fitas formadoras da cadeia dupla 
do DNA, após o processo de replicação, dará origem a uma nova fita dupla, composta 
pela fita conservada e uma nova fita. Ou seja, a cada ciclo da PCR, a amplificação duplica 
o material disponibilizado pelo ciclo anterior, sendo normalmente necessário cerca de 
20 a 40 ciclos de amplificação para a obtenção de uma grande quantidade de cópias 
provenientes de apenas um fragmento de DNA. Fazendo um simples cálculo, partindo 
de um único fragmento, ao final do primeiro ciclo de amplificação seriam obtidos dois 
fragmentos idênticos, após o segundo ciclo seriam obtidos quatro fragmentos, no 
terceiro ciclo estariam disponíveis oito fragmentos e assim sucessivamente (Figura 11).
FIGURA 11 – ESQUEMA DA RÁPIDA AMPLIFICAÇÃO DE UMA FRAGMENTO DE DNA DURANTE A PCR
FONTE: Watson et al. (2015, p. 159).
23
Um detalhe interessante é que, como falamos, o método de desnaturação do 
DNA se dá por meio da elevação da temperatura, chegando a cerca de 95 ºC. Por vezes, 
esse processo pode inviabilizar a ação de enzimas como a DNA polimerase, sendo 
necessária a utilização de uma DNA polimerase que seja termoestável e termoresistente. 
Nesse sentido, os avanços na biologia e biotecnologia proporcionaram, já nos anos 80, 
a obtenção da DNA polimerase presente na bactéria Thermus aquaticus, um organismo 
que vive em temperaturas elevadas e com sua DNA polimerase adaptada para resistir 
a essas temperaturas. A DNA polimerase obtida desse organismo é a chamada Taq 
polimerase e é uma das DNA polimerases mais utilizadas nas reações de PCR.
Outra informação interessante é que, embora a PCR pareça um processo simples 
e rápido, em sua origem ela era executada por meio de mudanças de temperatura 
promovidas em banho-maria, sendo necessário que o pesquisador cronometrasse o 
tempo de elevação e retomada de temperatura em cada ciclo e mudasse os tubos de 
ensaio entre os banho-maria com as diferentes temperaturas necessárias, por volta 
de 95 ºC para desnaturação, 60-65 ºC para anelamento e 72 ºC para extensão. Porém, 
atualmente, todo esse processo foi automatizado e é realizado em um equipamento 
chamado termociclador, que, como o próprio nome indica, é um equipamento capaz 
de mudar rapidamente de temperatura, elevando ou diminuindo a temperatura em 
segundos, além de apresentar opções de programação para que os ciclos sejam 
repetidos pela quantidade de vezes necessária.
Então, resumidamente, o conceito básico da técnica de PCR é baseado na 
desnaturação do fragmento de DNA, seguido do anelamento dos primers nas fitas 
desnaturadas e da extensão da nova fita pela DNA polimerase, sendo todo o processo 
realizado em ciclos repetidos (uma reação em cadeia) que proporcionam a amplificação 
da quantidade de fragmentos iguais ao fragmento de interesse para o estudo (Figura 11). 
Diante disso, você pode se perguntar: “como essa quantidade de material 
genético amplificado pode ser analisada?”, “em quais aplicações a técnica de PCR pode 
ser aplicada?”, “que tipo de informações a amplificação de um fragmento de DNA pode 
fornecer?”, entre outras tantas questões que tentaremos discutir ao longo deste tópico.
3 TRANSCRIÇÃO REVERSA
Uma das técnicas de biologia molecular bastante utilizada na pesquisa de 
expressão diferencial de genes é uma adaptação da PCR chamada de RT-PCR, que, na 
verdade, é simplesmente uma reação de transcrição reversa seguida de uma PCR. 
Ainda não falamos sobre a transcrição reversa, mas não vai ser tão difícil entender 
como ela funciona se lembrarmos que, para que um gene seja expresso, ele deve ser 
transcrito emmRNA, o qual, por sua vez, carregará a informação contida no gene para 
que seja traduzida no citoplasma, proporcionado a síntese proteica. Esta é a chave da 
24
questão: se desejamos avaliar a expressão diferencial de um gene, por exemplo, em 
diferentes tecidos de um mesmo organismo, é preciso que se avalie o mRNA contido 
nesse tecido (pois é ele que será traduzido em proteínas) – e não o DNA genômico, já 
que o DNA genômico carrega a informação de todos os genes de um organismo e em 
todas as suas células, não sendo representativo da expressão de algum gene específico.
Para a avaliação da expressão diferencial, é preciso avaliar o mRNA. Pode-se 
pensar que basta proceder com a extração do mRNA de interesse e prosseguir com 
sua amplificação na PCR, mas precisamos entender e relembrar que a DNA polimerase 
utilizada na PCR não consegue atuar em uma molécula de fita simples, como a de um 
RNA, para executar a extensão. Sendo assim, para que ocorra a síntese de uma fita 
dupla que possa servir de molde para a DNA polimerase, deve ser executada a reação 
de transcrição reversa. Portanto, a transcrição reversa é um passo essencial quando 
se objetiva amplificar na PCR um fragmento de polinucleotídeos oriundo de uma fita 
simples de RNA.
A transcrição reversa é uma reação que ocorre pela ação da enzima transcriptase 
reversa ou RT. Essa enzima é uma DNA polimerase dependente de RNA, ou seja, ela é 
capaz de sintetizar uma fita de DNA utilizando como molde a fita simples de RNA. Sua 
descoberta se deu a partir da observação de que, quando os retrovírus, cujo material 
genético é um RNA, infectam um hospedeiro, o RNA viral é convertido em DNA. 
A reação de transcrição reversa é bastante similar àquela descrita na PCR, sendo 
necessário, para tanto, a adição de oligonucleotídeos sintéticos, da enzima transcriptase 
reversa, do coquetel contendo os quatro dNTPs, da amostra de RNA e de cofatores 
enzimáticos. 
Para a reação de RT (Figura 12), todo o conteúdo de RNA deve ser extraído da 
amostra de interesse. Para que o gene de interesse seja estudado, todo o conteúdo de 
RNAs deve ser retrotranscrito em DNA, formando o chamado DNA complementar ou cDNA. 
Ou seja, toda a população de RNAs expressa naquela amostra, naquele momento, será 
convertida em cDNA. Para tanto, os oligonucleotídeos adicionados, ou primers, devem 
apresentar a capacidade de se anelar à maior parte das moléculas de RNA disponíveis 
na amostra, permitindo, assim, que a transcriptase reversa forme a dupla fita baseada no 
molde desses RNAs. Um exemplo desses oligonucleotídeos são os chamados oligodT, 
que são fitas polinucleotídicas curtas, formadas pelo nucleotídeo T, capazes de se anelar 
à cauda poli A presente na maioria dos mRNAs. A transcrição reversa, assim como a PCR, 
depende da submissão das amostras à temperatura ideal para o anelamento dos primers 
e extensão das fitas. No entanto, ela não é realizada em ciclos, pois é necessário que 
apenas uma fita de cDNA correspondente a cada mRNA seja polimerizada. Assim, a partir 
do momento em que o RNA está convertido em cDNA, ele já pode ser utilizado na PCR e, 
nessa etapa, com a utilização dos primers específicos para o gene de interesse, apenas 
o cDNA formado a partir do mRNA desse gene será amplificado.
25
FIGURA 12 – TRANSCRIÇÃO REVERSA
FONTE: Adaptado de Alberts et al. (2008).
4 PCR QUALITATIVO VS. PCR QUANTITATIVO
Agora que você já sabe que a técnica de PCR produz uma série de cópias de um 
determinado fragmento de DNA ou cDNA de uma maneira bastante rápida e eficiente, 
vamos discutir um pouco sobre como essa reação pode fornecer dados que serão 
avaliados em uma pesquisa. Nesse sentido, a primeira pergunta a se fazer é: qual o 
objetivo da pesquisa. Por exemplo, se você estiver estudando a expressão de um gene, 
é importante saber se ele apenas está sendo expresso em determinado tecido ou tipo 
celular, ou se é necessário que se obtenha a informação do quanto esse gene está 
expresso diferente nessas amostras? Respondendo a essa pergunta, é possível definir 
se a PCR que melhor se aplica ao seu objetivo é qualitativa ou quantitativa.
Uma PCR qualitativa é aquela que vai indicar a presença de um fragmento 
específico de DNA ou cDNA em uma amostra, sem fornecer dados numéricos relativos ao 
quanto o gene estava expresso. Essa técnica é bastante simples e basicamente se resume 
à execução dos ciclos de desnaturação, anelamento e extensão, já descritos em maiores 
detalhes, e, posteriormente, a visualização do produto resultante da amplificação. Para a 
visualização das cópias obtidas, é necessário submeter as amostras a uma eletroforese 
em gel e corá-las para a visualização, por exemplo, utilizando o brometo de etídio. Dessa 
forma, é possível observar se as amostras em estudo apresentam o gene que se buscou 
amplificar. Ainda, de maneira indireta, é possível, de certa forma, comparar a expressão 
de um gene em diferentes condições ou amostras por meio da visualização das bandas 
no gel. Existem programas computacionais capazes de mensurar a área que cada uma 
26
das amostras ocupa no gel e, assim, compará-las, indicando possíveis aumentos ou 
diminuições na expressão do gene. No entanto, para uma avaliação mais confiável da 
diferença nos níveis de expressão de um gene, utilizamos uma técnica mais eficiente e 
tão simples quanto a PCR qualitativa, a PCR quantitativa, também conhecida como PCR 
em tempo real, cuja sigla correta é qPCR.
A qPCR é similar à PCR qualitativa. No entanto, ela fornece informações precisas 
relativas à quantidade de expressão da um gene, permitindo comparações entre amostras 
provenientes de diferentes condições, como, por exemplo, associadas a doenças, 
podendo até mesmo fornecer informações quanto ao número exato de cópias de um 
determinado fragmento de DNA ou cDNA que foram replicadas. No entanto, embora a 
reação da PCR seja igual àquela previamente descrita, o equipamento necessário para a 
qPCR é um termociclador associado a um detector capaz de quantificar a amplificação 
dos fragmentos de DNA ao final de cada ciclo, ou seja, em tempo real, justificando, assim, 
o motivo dessa técnica ser conhecida como PCR em tempo real.
Para que o equipamento detecte o produto da amplificação, são adicionados 
corantes fluorescentes ou sondas específicas, capazes de emitir fluorescência quando 
se encontram ligados ou intercalados à fita de DNA no meio de reação da PCR. Dessa 
forma, a cada nova fita formada, a fluorescência emitida pela amostra é detectada, 
sendo proporcional à quantidade de material disponível para iniciar a amplificação. 
Assim, após a detecção ao longo de sucessivos ciclos, é possível visualizar, por meio 
das curvas de amplificação, e numericamente comparar a expressão do gene de 
interesse, por meio dos Cts (do inglês cycle threshold). Após a estabilização da reação, 
o equipamento é capaz de determinar em que momento a fluorescência detectada é 
apenas proveniente das amostras que estão sendo amplificadas (ignorando o ruído, 
chamado de background) e, assim, determinar a linha de corte ou threshold. Assim, 
quando (em qual ciclo de amplificação) a fluorescência emitida por uma amostra 
alcança a fluorescência determinada pela linha de corte, demonstrando o momento 
em que a fluorescência apresentada está livre de ruídos, sendo essencialmente a 
representação da amplificação da amostra teste, é determinado o Ct desta amostra. 
Dessa forma, observando as curvas de amplificação, é possível determinar em qual ciclo 
de amplificação cada uma das amostras atingiu o threshold. De maneira simplificada, 
quanto menor o Ct de uma amostra, maior a quantidade de material estava disponível 
para iniciar a amplificação do fragmento de interesse (Figura 13).
Você sabia que um dos primeiros testes diagnósticos para a detecção do 
coronavírus (COVID-19) é uma PCR, mais especificamente uma RT-qPCR? Saiba 
mais consultando https://www.youtube.com/watch?v=8ki-tVdVO1E&t=16s e 
https://www.uol.com.br/vivabem/noticias/redacao/2020/03/17/saiba-como-funciona-o-pcr-o-exame-que-detecta-o-novo-coronavirus.htm.
DICA
27
FIGURA 13 – CURVA DE AMPLIFICAÇÃO DA PCR QUANTITATIVA (QPCR) - CT = CYCLE THRESHOLD
FONTE: A autora.
Mais detalhes sobre as técnicas da PCR e qPCR podem ser facilmente 
encontrados em artigos científi cos, como: Bustin et al., 2009; Moreira, 2015; 
Pabinger et al., 2014; e Pfaffl , 2004. 
DICA
28
RESUMO DO TÓPICO 2
Neste tópico, você adquiriu certos aprendizados, como:
• O princípio que norteou o desenvolvimento da técnica da PCR foi a observação de como 
o processo de replicação ocorre in vivo, sendo considerado o princípio da replicação 
semiconservativa do DNA, e a ação de diversas enzimas, como a DNA polimerase.
• Para que ocorra a PCR, é necessário que a fita dupla de DNA seja desnaturada, que os 
primers se anelem às fitas simples e que a DNA polimerase faça a extensão da nova 
fita por meio da inclusão dos dNTPs complementares à fita molde.
• A transcrição reversa é uma reação de formação de uma fita dupla de DNA a partir do 
molde uma fita simples de RNA. o DNA formado é chamado de DNA complementar ou 
cDNA e a DNA polimerase responsável pela reação é a Transcriptase reversa.
• Existem diferentes tipos de PCR, a qualitativa ou convencional e a quantitativa ou 
qPCR. Na qualitativa, o material amplificado pode ser observado apenas ao final da 
reação por meio de eletroforese em gel, enquanto na quantitativa, a amplificação 
é detectada em tempo real por meio de fluorescência e fornece dados numéricos 
relativos à quantidade de material que está sendo amplificado na reação.
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1 Explique como ocorre cada uma das etapas da PCR e sua função para a reação como 
um todo.
2 Quais componentes são indispensáveis para a PCR?
a) ( ) Fita molde de DNA, oligodT, Transcriptase reversa e dNTPs.
b) ( ) Fita molde de RNA, oligodT, Transcriptase reversa e dNTPs.
c) ( ) Fita molde de RNA, primers, DNA polimerase e dNTPs.
d) ( ) Fita molde de DNA, primers, DNA polimerase e dNTPs.
3 Por que a reação de transcrição reversa é importante para estudos de expressão de 
um gene?
4 Explique como acontece a qPCR e qual sua principal diferença em relação à PCR 
qualitativa.
AUTOATIVIDADE
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31
TÓPICO 3 - 
BIBLIOTECAS DE DNA E CDNA
1 INTRODUÇÃO
Como você deve se lembrar, discutimos no Tópico 1 sobre o isolamento de DNA. 
É relativamente simples isolar um determinado fragmento de DNA que contenha o gene 
de interesse, simplesmente utilizando algumas das ferramentas e técnicas já abordadas, 
como a clivagem do DNA genômico com enzimas de restrição e posteriormente isolando 
e purificando o fragmento de interesse dos demais fragmentos por meio de uma 
eletroforese em gel. Realmente, esse processo é simples quando se trata do isolamento 
de um gene pertencente a um organismo com o DNA genômico pequeno, composto por 
alguns milhares de nucleotídeos, pois, nesse caso, a aplicação de enzimas de restrição 
produziria poucos fragmentos facilmente separáveis. No entanto, quando se trata de 
organismos com o genoma mais complexo, compostos por centenas de milhares de 
nucleotídeos, com sequências codificantes para uma infinidade de diferentes genes, 
a fragmentação desses DNAs genômicos com enzimas de restrição produz uma 
quantidade tão grande de fragmentos que, mesmo em um gel bastante extenso, torna-
se inviável o isolamento e a purificação de apenas um gene específico.
Você já deve estar ciente de que, atualmente, diversos organismos, incluindo 
os seres humanos, têm seus genes estudados por diversos grupos de pesquisa, o que 
inclusive tem trazido avanços significativos, por exemplo, para as áreas da biologia e da 
medicina, elucidando mecanismos e causas de diversas síndromes e doenças. Nesse 
sentido, fica fácil imaginar que o problema da fragmentação e isolamento de genes 
provenientes de um DNA genômico complexo foi resolvido. 
Isso foi possível com o advento das chamadas bibliotecas de DNA, pois, 
com essa técnica, houve a simplificação do processo de isolamento e purificação de 
um gene presente em uma população de fragmentos de DNA. O termo biblioteca se 
aplica perfeitamente ao processo, pois, com essa técnica, é produzida uma coleção 
de fragmentos facilmente identificáveis, nos quais pode-se fazer uma busca por um 
gene específico e prosseguir com a amplificação e outros estudos com uma amostra 
purificada para tal gene. Assim, pode-se dizer que a construção de uma biblioteca de 
DNA pode ser o primeiro passo para o isolamento de um gene específico.
UNIDADE 1
32
2 BIBLIOTECA DE DNA OU GENÔMICA
Para a construção de uma biblioteca de DNA, são aplicadas as técnicas de 
clivagem com enzimas de restrição e clonagem em vetor, as quais já foram discutidas no 
Tópico 1, no entanto, com uma abordagem um pouco diferenciada, como iremos descobrir.
O primeiro passo para formar uma biblioteca de DNA é extrair e isolar o DNA genômico 
de uma célula, tecido ou até mesmo de um organismo. Em seguida, o DNA extraído é 
clivado com uma enzima de restrição, formando centenas a milhares de fragmentos de 
DNA, os quais, por sua vez, são inseridos em vetores idênticos, que foram clivados com a 
mesma enzima, permitindo, assim, que as extremidades complementares dos fragmentos 
de DNA e dos vetores sejam unidas por meio da ação da enzima DNA ligase.
Nessa etapa do processo, espera-se que cada fragmento formado pela clivagem 
se ligue a um vetor, formando uma grande população de vetores, cada um contendo um 
diferente fragmento originado do DNA genômico isolado. Após a ligação com o vetor, 
a biblioteca em si é formada por meio da transformação, ou seja, da inserção desses 
vetores em células hospedeiras, como em células da bactéria E. coli, procedendo com a 
clonagem dos diferentes fragmentos (Figura 14).
FIGURA 14 – ESQUEMA DA FORMAÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE DNA
FONTE: Adaptado de Alberts et al. (2008)
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Sabe-se que, em geral, cada bactéria internaliza apenas um vetor. Assim, após a 
diluição das bactérias e sua aplicação em placas de cultivo, cada colônia formada terá apenas 
células contendo um dos fragmentos de DNA. Desse modo, por meio do rápido processo 
de multiplicação celular da E. coli, em poucas horas serão formados diversos clones dos 
fragmentos inseridos, sendo cada um encontrado em uma diferente colônia de crescimento.
Com a formação das diversas colônias bacterianas, cada uma contendo um dos 
diferentes fragmentos de DNA, a biblioteca estará formada e nela poderão ser buscados 
fragmentos específicos de DNA, utilizando, por exemplo, a técnica de hibridização.
A identificação de uma colônia de bactérias que contenha um fragmento 
específico de DNA por meio da hibridização, aqui chamada de hibridização em colônia, 
é bastante semelhante às técnicas previamente descritas do Southern e Northern-
blot. Basicamente, após o crescimento das colônias bacterianas em placas de cultivo 
contendo meio sólido, uma membrana é utilizada para coletar uma pequena porção das 
células presentes em cada uma das colônias. Nessa etapa, a membrana é colocada em 
contato com as colônias na placa, sendo que algumas das células presentes em cada 
uma dessas colônias se aderem à membrana, formando uma espécie de impressão das 
colônias presentes na placa. Essas células aderidas à membrana sofrem um processo de 
lise celular para que o DNA seja liberado, porém permaneça ainda aderido à membrana 
em posição relativa àquela da sua colônia de origem na placa. Após a exposição do 
DNA, a membrana é incubada com sondas de hibridização marcadas, complementares 
à uma porção do gene de interesse, as quais permitirão a visualização da posição dos 
clones que contenham o fragmento de interesse na membrana e, consequentemente, 
a posição da colônia que contenha esse gene na biblioteca de DNA (Figura 15).
FIGURA 15 – HIBRIDIZAÇÃO EM COLÔNIA
FONTE: Adaptado de Watson et al. (2015).
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Com o uso da biblioteca de DNA, fragmentos de um mesmo DNA genômico 
podem ser mantidos por tempo indefinido, clonados, identificados e isolados paradiversas aplicações, como, por exemplo, o sequenciamento de todo o genoma. No 
entanto, quando o objetivo do estudo é a avaliação das sequências codificantes de um 
DNA, ou seja, dos genes, uma biblioteca de DNA pode apenas ser adequada para estudos 
em organismos cujo DNA apresente pequenas porções de DNA não codificante, pois, 
caso contrário, muitos dos fragmentos contidos na biblioteca não conterão sequências 
codificantes. Isso acontece, pois, com a clivagem do DNA genômico, são formados 
fragmentos de forma aleatória e, portanto, muitos deles apenas serão formados por 
sequências não codificantes, dificultando a identificação do gene de interesse. Assim, 
para que se obtenha uma biblioteca rica em fragmentos codificantes, ela deverá ser 
formada por cDNAs.
3 BIBLIOTECA DE CDNA
 A principal vantagem da utilização de bibliotecas de cDNA é justamente o fato 
de ela ser uma grande coleção de clones formados por genes, ou seja, todas as colônias 
de bactérias apresentam vetores com fragmentos codificantes.
FIGURA 16 – PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE UMA BIBLIOTECA DE DNA E UMA BIBLIOTECA DE CDNA
FONTE: Adaptado de Alberts et al. (2008).
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A montagem de uma biblioteca de cDNA é bastante semelhante à montagem 
da biblioteca de DNA. No entanto, em vez de iniciar o processo com o DNA genômico, 
neste caso, o material a ser clonado é o mRNA. Assim, o primeiro passo para a formação 
da biblioteca de cDNA é a extração dos mRNAs, sendo expressos em determinado 
tipo celular, tecido ou organismo. Posteriormente, essa população de mRNAs deve ser 
retrotranscrita em cDNA, como já vimos no item 3 do Tópico 2. Após a formação do 
cDNA, a amostra está pronta para seguir com o processo de inserção no vetor com a 
posterior transformação em bactéria E. coli, formando os clones de cDNA. Novamente, 
assim como nas bibliotecas de DNA, cada bactéria formará uma colônia de clones de 
um determinado cDNA, os quais podem ser também identificados e isolados.
 
Uma grande diferença da biblioteca de cDNA em relação à de DNA é que a 
biblioteca de DNA é formada por fragmentos aleatórios do DNA de um organismo, 
tecido ou célula, sendo que, via de regra, independentemente da célula ou tecido de 
um organismo, o DNA a ser fragmentado será idêntico. Por outro lado, como a biblioteca 
de cDNA é formada por mRNAs, cada tecido ou célula pode formar uma biblioteca 
diferente, pois cada um pode expressar diferentes genes de acordo com sua função. 
Assim, bibliotecas de cDNA originadas de células especializadas na produção de uma 
determinada proteína possivelmente apresentarão muitas colônias formadas pelo 
gene que codifica para ela. Por exemplo, uma biblioteca de cDNA produzida a partir de 
eritrócitos humanos será composta por muitas colônias de E. coli contendo vetores com 
o gene da hemoglobina. Essa abundância de determinado gene em uma biblioteca de 
cDNA, inclusive, torna-se uma vantagem no processo de identificação da colônia que 
contenha o cDNA que codifica para o gene de interesse.
 
Outra característica importante das bibliotecas de cDNA é que, como já 
mencionado, os clones formados por ela apenas contêm regiões codificantes do DNA, 
ou seja, apenas são formados pelas sequências nucleotídicas dos éxons dos genes que 
estão sendo expressos (Figura 16). Essa característica é bastante explorada e utilizada 
para estudos que buscam a dedução das sequências de aminoácidos das proteínas 
codificadas por esses genes. Além disso, os clones formados em uma biblioteca de cDNA 
podem fornecer material para a síntese de grandes quantidades de uma determinada 
proteína por meio da manipulação de bactérias ou leveduras com a capacidade de 
expressar o gene de interesse.
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RESUMO DO TÓPICO 3
Neste tópico, você adquiriu certos aprendizados, como:
• Bibliotecas de DNA ou cDNA são grandes coleções de material genético mantidas em 
colônias de bactérias, nas quais um fragmento específico de DNA ou um gene podem 
ser procurados.
• Uma biblioteca de DNA é formada por fragmentos originados a partir de um DNA 
genômico.
• Uma biblioteca de cDNA é formada por sequências codificantes dos genes que 
estavam expressos na forma de mRNA em uma determinada amostra.
• A formação das bibliotecas de DNA e cDNA permite que fragmentos clonados sejam 
mantidos e replicados por tempo indeterminado.
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1 Explique como o termo biblioteca se adéqua às técnicas de biblioteca de DNA e de 
cDNA.
2 Qual a principal diferença entre as bibliotecas de DNA e de cDNA?
3 Assim como no processo de clonagem descrito no Tópico 1, quais componentes são 
essenciais para a formação das bibliotecas de DNA?
a) ( ) DNA, enzimas de restrição, DNA ligase, vetores e células hospedeiras.
b) ( ) mRNA, enzimas de restrição, transcriptase reversa, termocicladores e células 
hospedeiras.
c) ( ) DNA, enzimas de restrição, DNA polimerase, vetores e primers.
d) ( ) mRNA, enzimas de restrição, DNA polimerase, vetores e células hospedeiras.
4 Como as técnicas de clonagem e de bibliotecas de DNA ou cDNA podem ser 
diferenciadas? Você consegue imaginar alguma diferença entre elas e entre suas 
aplicações?
AUTOATIVIDADE
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39
TÓPICO 4 - 
SEQUENCIAMENTO DE DNA
1 INTRODUÇÃO
A definição de sequenciamento de DNA está bastante explicita no próprio nome, 
ou seja, esse é o processo em que é determinado qual nucleotídeo ocupa cada posição 
na fita de uma molécula ou de um fragmento de DNA. De maneira mais simples, é o 
método que determina a sequência dos nucleotídeos presentes em uma fita de DNA.
As primeiras técnicas de sequenciamento de DNA começaram a ser aplicadas 
ainda na década de 70, com o advento da técnica proposta por Sanger, atualmente 
conhecida como método de Sanger. Com o passar dos anos, esse método foi aprimorado 
e automatizado, sendo chamado de método de Sanger automatizado. Assim, os 
métodos de Sanger são atualmente chamados de técnicas de sequenciamento de 
primeira geração.
Com base nos princípios desse método pioneiro, na década seguinte foram 
desenvolvidos outros métodos de sequenciamento, como o método Shotgun, ainda 
considerados de primeira geração. De maneira geral, eles aumentaram a eficiência e 
agilidade do processo para que fragmentos maiores de DNA pudessem ser sequenciados, 
especialmente com os objetivos de otimizar e acelerar o projeto genoma.
Já nos anos 2000, os métodos de sequenciamento alcançaram um novo nível 
de avanço, com o surgimento dos chamados métodos de sequenciamento de próxima 
geração (do inglês Next Generation Sequencing – NGS) ou métodos de segunda geração, 
os quais já não são mais baseados na técnica proposta por Sanger.
Atualmente, já existem também os métodos conhecidos como sequenciamento 
de terceira geração, os quais são inovadores, pois são capazes de realizar o 
sequenciamento de apenas uma molécula de DNA sem que seja necessário amplificar 
a molécula a ser analisada.
Por fim, pode-se considerar que também estamos diante das tecnologias 
de sequenciamento de quarta geração, a qual compreende o desenvolvimento de 
equipamentos portáteis e de menor custo, tornando a tecnologia do sequenciamento 
mais acessível para diversas áreas de atuação nas ciências biológicas e da saúde, 
inclusive em campo.
UNIDADE 1
40
Embora as técnicas de sequenciamento tenham rapidamente avançado 
nas últimas décadas, é importante ressaltar que todas as técnicas supracitadas são 
amplamente utilizadas, inclusive nas áreas de pesquisa e diagnóstico, pois cada uma 
delas apresenta distintos benefícios e aplicações.
Ainda, os avanços nas técnicas e estratégias de sequenciamento permitiram 
que, além do estudo dos genomas, sua utilização também fosse expandida ao campo 
das proteínas. Dessa forma, como facilmente tornou-se possível obter a sequência 
de nucleotídeos de um determinado gene, pode-se, de maneira indireta, determinar 
a sequência de aminoácidos (aa) da proteína codificada por esse gene. No entanto, é 
importante relembrar que, no DNA dos eucariotos, a sequência de nucleotídeos que 
codifica