Tecnologia do DNA recombinante - resumo

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Biologia Molecular 16.10.2022 
 - permite identificar, isolar e clonar um gene de interesse 
 específico 
 - usado para investigar a estrutura e função dos genes - 
 cria produtos comerciais, auxilia no diagnóstico e tratamento 
 de doenças 
 - usado para analisar, alterar e recombinar sequências 
 de DNA de qualquer fonte 
 - une genomas de duas ou mais fontes/espécies 
 (genomas diferentes) 
 Primeira etapa 
 Isolar o segmento de DNA/gene e fazer várias cópias dele » clonagem 
 - por meio de clivagem de fragmentos usando enzimas de restrição e DNA ligase 
 Segunda etapa 
 Clonar o fragmento de DNA de interesse 
 - liga o fragmento a uma molécula de DNA vetor capaz de replicar dentro de uma 
 célula hospedeira 
 - a célula hospedeira pode ser uma bactéria/leveduras ou células eucarióticas 
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 Enzimas de restrição (endonucleases) 
 ● reconhecem e fazem cortes bifilamentares no DNA de sequências específicas de 
 nucleotídeos 
 ● são produzidas naturalmente pelas bactérias com o intuito de proteção própria 
 ● a clivagem do vetor e do fragmento deve ser feita com a mesma enzima de restrição 
 para garantir extremidades coesivas 
 ● Tipo I: cliva sítios com mais de 1000 pares de bases 
 ● Tipo II: cliva sítios de 4 a 6 pares de bases - sequências palindrômicas (possuem os 
 mesmos pb lendo da direita ou esquerda) ATCCTA 
 ● Tipo III: cliva sítios com cerca de 25 pares de bases 
 Clonagem gênica: produção de cópias idênticas do pedaço original de DNA - usada para 
 amplificar um trecho específico de DNA que será usada nos métodos de DNA recombinante 
 Vetores de clonagem 
 - molécula de DNA replicante e estável onde o fragmento de DNA exógeno se liga 
 - para um vetor de clonagem ser efetivo é importante que tenha 
 a) uma origem de replicação que garanta que o vetor seja replicado dentro da célula 
 b) marcadores selecionáveis que permitem que qualquer célula tenha o vetor 
 c) um ou mais sítios únicos de restrição nos quais os fragmentos de DNA podem ser 
 inseridos. 
 VETORES 
 - quanto maior e mais complexo é o gene, maior e mais complexo o vetor deve ser 
 Plasmídeos 
 - molécula de DNA circular extragenômico 
 - 5.000 a 400.000 pb 
 - geralmente carrega genes que possuem resistência à antibióticos 
 - é introduzido na célula por transformação (choque térmico 0°C - 37°C - 43°C - CaCl 
 para tirar a eletronegatividade da membrana) ou por eletroporação (pulso elétrico 
 que deixa os poros da membrana temporariamente permeáveis) 
 - realizam duplicação independente do DNA cromossômico 
 - possuem origem de replicação mas dependem da maquinaria hospedeira para se 
 replicar (as enzimas usadas são fornecidas pelo hospedeiro) 
 Bacteriófagos 
 - usados para clonar fragmentos de DNA de 10.000 a 23.000 pb 
 - transfere DNA para bactérias com alta eficiência 
 - vírus 
 Cosmídeos 
 - vetor híbrido com características de plasmídeos e bacteriófagos 
 - possui genes repórteres (permitem sua monitoração/marcação) 
 - permitem a clonagem de fragmentos maiores de DNA (~40.000 pb) 
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 Cromossomos Arti�ciais de Levedura (YAC’s) 
 - vetor usado para clonar fragmentos de DNA em torno de 400.000 pb 
 - maior complexidade 
 - construído com 3 tipos de sequências de DNA específico do cromossomo da 
 levedura (telômero, ori, centrômero) 
 Cromossomos Bacterianos Arti�ciais (BAC’s) 
 - plasmídeo usado para clonar fragmento de DNA entre 100.000 e 300.000 pb 
 - geralmente incluem um marcador de seleção com resistência ao Cloranfenicol 
 Vetores de expressão 
 ● permitem a obtenção da proteína de interesse 
 ● possuem sinais de transcrição e de tradução 
 ● plasmídeo com 2 sequências de origem e replicação » vetor “shuttle” 
 CLONAGEM 
 1. corte do DNA em locais precisos por enzimas de restrição 
 2. seleção de uma pequena molécula de DNA capaz de fazer autorreplicação (vetor de 
 clonagem) 
 3. ligação de dois fragmentos (vetor + fragmento) pela DNA ligase 
 4. deslocamento ou transfecção do DNA recombinante no hospedeiro (inserção por 
 eletroporação ou transformação) 
 5. replicação e seleção de células hospedeiras que contêm o DNA recombinante 
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