A tecnologia do DNA recombinante

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A RECOMBINAÇÃO DO DNA NAS ESPÉCIES
Indivíduos de mesma espécie são passiveis de cruzamento
Gerar descentes 
A RECOMBINAÇÃO DO DNA NAS ESPÉCIES
A meiose gera gametas recombinantes através do crossing-over
A RECOMBINAÇÃO DO DNA NAS ESPÉCIES
A SEGREGAÇÃO INDEPENDENTE DOS GENES GERA GAMETAS E INDIVIDUOS COM CARACTERÍSTICAS DIFERENTES DAS PARENTAIS, OU SEJA,
RECOMBINANTES
A RECOMBINAÇÃO DO DNA NAS ESPÉCIES
A recombinação na meiose e a combinação dos alelos na fecundação gera diversidade de fenótipos
A RECOMBINAÇÃO DO DNA NAS ESPÉCIES
Conjugação
Transferência de DNA de uma bactéria para outra. Envolve o contato entre as duas células
Transformação
Incorporação de DNA livre, geralmente decorrente de lise celular
Transdução 
Transferência de material genético mediada por bacteriófago
A RECOMBINAÇÃO DO DNA NAS ESPÉCIES
Tecnologia do DNA recombinante
 Também chamada de engenharia genética, é um conjunto de técnicas que permite aos cientistas identificar, isolar e multiplicar e expressar genes de quaisquer organismos.
DNA recombinante é uma molécula de DNA que incorpora fragmentos de DNA ou genes vindos de duas ou mais espécies, geralmente diferentes.
Ex: Milho Bt
APLICAÇÕES DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
Obtenção de transgênicos:
	Vegetais ou animais resistentes a doenças ou pragas
	Vegetais ou animais mais produtivos
	Vegetais ou animais que produzem medicamentos ou vacinas
Produção de produtos Biotecnológicos:
 medicamentos / enzimas / alimentos / vacinas / kits diagnóstico
Estudo do produto final do gene: RNA/Proteína.
Produção de proteínas em larga escala para estudos de sua estrutura, função e fins industriais
Estudo dos genes de um organismo = Estudos genômicos.
COMO SE FAZ UM ORGANISMO COM DNA RECOMBINANTE ?
Organismo geneticamente modificado (OGM)
Transgênico
Recombinante
Expressar as características do gene exógeno inserido nele
v
COMO SE FAZ UM ORGANISMO COM DNA RECOMBINANTE ?
DEFINICÃO DE ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO
De acordo com a legislação brasileira, independentemente da origem do material genético, todo o organismo que tiver seu DNA modificado por meio de qualquer técnica de Engenharia Genética é considerado um organismo geneticamente modificado (OGM). 
Dessa maneira, um OGM pode: 
ter a adição de um gene proveniente de uma espécie não sexualmente compatível (transgênico)
ter a adição de um gene de uma espécie com a qual poderia haver um cruzamento (cisgênico) 
ter um ou mais de seus genes deletados.
Transgênicos são organismos que tiveram seu código genético modificado por meio da biotecnologia. Essa alteração inseriu no genoma desse organismo o DNA de espécies que não são compatíveis sexualmente.
Dessa forma, todo o transgênico é OGM, mas nem todo OGM é transgênico.
ETAPAS PARA PRODUZIR UM ORGANISMO RECOBINANTE
Definir o objetivo. O que eu quero com este organismo?
 Planejamento. Perguntas que podem ajudar:
O gene a ser clonado é de procarioto ou eucarioto? 
Em qual organismo vai ser inserido?
Busca pela sequência nucleotídica do gene em bancos de dados
Qual vetor de clonagem utilizar? Quais enzimas de restrição utilizar?
Verificar a presença de sítios de restrição no fragmento a ser clonado
Projetar os primers e as condições da amplificação.
Qual vai ser organismo que vou utilizar para propagação da minha construção plasmidial.
3. Montar os protocolos.
O QUE VOU PRECISAR PARA FAZER UM ORGANISMO COM DNA RECOMBINANTE ?
ORGANISMO QUE VAI RECEBER O GENE
O DNA A SER CLONADO
De quem é o gene? Que tipo de célula que é?
Quem vai receber? Que tipo de célula que é?
Procariotos não tem intron
Não fazem modificações pós- traducionais
O DNA A SER CLONADO
Procarioto
Procarioto
Eucarioto
Eucarioto
Eucarioto
Procarioto
Observar se a proteína precisa de modificações pós-traducionais
No banco de dados há sequencia do mRNA ou cDNA deste gene
O DNA A SER CLONADO
Clonagem da Harmoniasin peptide em E. coli
Sequencia de nucletotideos - cDNA ou mRNA - modificações pós-traducionais
O DNA A SER CLONADO
Escolher o vetor de clonagem e expressão
Enzimas de restrição
Desenhar os oligonucleotídeos iniciadores da amplificação
O DNA A SER CLONADO
Análise de possíveis sítios de restrição no gene a ser clonado para escola da melhor enzima de restrição
O DNA A SER CLONADO
Análise de possíveis sítios de restrição no gene a ser clonado para escola da melhor enzima de restrição
 
O QUE SÃO ENZIMAS DE RESTRIÇÃO ? POR QUE UTILIZAR ? 
São endonucleases que reconhecem sequencias especificas de nucleotídeos e cortam o DNA nesta sequencia
QUAIS SÃO AS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO E COMO ELAS FUNCIONAM ?
QUAIS SÃO AS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO E COMO ELAS FUNCIONAM ?
O VETOR DE CLONAGEM
É uma molécula de DNA circular sintética, semelhante à plasmídeos em bactérias. É nele que será inserido o “inserto” que é o fragmento de DNA ser clonado. Multiplicam a molécula de DNA recombinante gerando muitos clones.
CARACTERISTICAS QUE UM VETOR DE CLONAGEM DEVE TER
Ter a capacidade de se autorreplicar de forma autônoma no hospedeiro. Ou seja, ter uma origem de replicação.
Possuir sítios de restrição únicos para clonagem, ou sítios de clonagem.
Ter pelo menos uma marca de seleção. Resistencia a antibióticos. E recomendável o uso de vetores de expressão com mais de uma marca de seleção.
Operons para seleção do clone recombinante.
EXISTEM VÁRIOS VETORES DE CLONAGENS DISPONÍVEIS COMERCIALMENTE
CARACTERISTICAS QUE UM VETOR DE CLONAGEM DEVE TER
VOLTEMOS AO EXEMPLO
Clonagem da Harmoniasin peptide em E. coli
VOLTEMOS AO EXEMPLO
Clonagem da Harmoniasin peptide em E. coli
Achar a região codificadora do gene. Entre o Start e o Stop códon.
região codificadora do gene.
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Amplificação 
PCR
Digestão de ambos com as enzimas de restrição EcoRI e SacI
Transformação química ou eletroporação
Meio de cultura com ampicilina 
Células transformadas
resistentes
não transformadas
controle
VERIFICANDO A PRESENÇA DO VETOR COM O INSERTO.
Meio seletivo contendo X-gal + Antibiótico.
Colônias azuis, clones negativos.
Colônias Brancas, clones positivos.
SEQUENCIAMENTO
Sequência confirmada?
Sequência não bate?
MUITO OBRIGADO !!!!