Replicação de DNA e suas Enzimas

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS – UNIMONTES
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
DEPARAMENTO DE BIOLOGIA GERAL
BIOLOGIA MOLECULAR
II- Replicação
1). Combine as propriedades ou funções na coluna à direita com a DNA polimerase na coluna da esquerda.
(a) DNA polimerase I (1,2,5) (1) Envolvida na replicação.
(b) DNA polimerase II (2,3) (2) Requer um iniciador e um molde.
(c) DNA polimerase III (1,2,4) (3) Papel fisiológico desconhecido.
 (4) Sintetiza a maior parte do DNA na replicação.
 (5) Remove o iniciador e preenche as lacunas durante a replicação.
2) O fragmento de DNA no esquema é de fita dupla em ambas as extremidades, porém de fita simples no meio. A polaridade da fita superior está indicada:
5’_____________________________3’
____________P HO_________
a) O fosfato (P) indicado na fita inferior está na extremidade 5’ ou 3’ do fragmento do qual ele pertence? (Indique no esquema)
Na extremidade 5’ 
b) Como você esperaria que a lacuna fosse preenchida pelos processos de reparo do DNA “in vivo”?
A DNA polimerase I ou II faria a extensão do fragmento que possui OH na extremidade 3’ até o fragmento que possui P na extremidade 5’ e enzima ligase uniria os fragmentos, tornando a fita inferior contínua.
c) Quantos fragmentos você esperaria encontrar na fita inferior se o experimento fosse realizado “in vitro”, na presença de todos os desoxiribonucleotídeos-trifosfato e DNA polimerase?
Dois fragmentos, pois faltaria a enzima ligase para a ligação dos fragmentos.
3) Explique por que variedades mutantes da DNA polimerase I podem apresentar atividades de DNA polimerase ausente, mas podem ter atividade de exonuclease 5’ → 3’ praticamente normal?
Porque como a DNA polimerase I é formada por dois fragmentos independentes: o menor, responsável pela atividade da exonuclease 5’-3’, e o maior, responsável pela atividade da polimerase e da exonuclease 3’-5’. Havendo mutação no fragmento maior, a atividade da polimerase e da exonuclease 3’-5’ são prejudicadas, mas não haverá interferência na atividade da exonuclease 5’-3’, pois as atividades dos fragmentos são independentes.
4) Qual a atividade de DNA polimerase III que é responsável pela editoração durante a replicação?
Atividade da exonuclease 3’-5’.
5). A DNA polimerase I de E. coli está envolvida principalmente em reparos de DNA enquanto a DNA polimerase III é a enzima responsável pela síntese de DNA. Quais são as enzimas correspondentes que possuem estas funções em eucariotos?
As Dna polimerases III e I.
6) Defina os seguintes termos: primer, ori, DNA primase, fragmento de Okasaki, síntese descontínua de DNA, DNA ligase, girase e fita líder.
- primer: oligonucleotídeo necessário para a iniciação da síntese de DNA.
- ori: região de origem de replicação 
- DNA primase: enzima que sintetiza primer na síntese de DNA
- fragmento de Okazaki: fragmento de DNA gerado nos processos de síntese de DNA.
- síntese descontínua de DNA: quando o DNA é sintetizado no sentido oposto ao da progressão da forquilha, tendo que ser paralisado para a adição de mais primers, gerando vários fragmentos de Okazaki.
- DNA ligase: enzima que faz a ligação dos fragmentos de Okazaki, usando como fonte de energia o ATP ou NAD.
- DNA girase: topoisomerase do tipo II da E. coli.
- fita líder: fita que é sintetizada na mesma direção do movimento da forquilha de replicação.
7) Que propriedades do DNA e da DNA polimerase sugerem que as duas fitas não podem ser replicadas pelo crescimento no mesmo sentido (como mostra a figura abaixo)? Como a célula supera o problema?
As duas fitas que compõem a molécula de DNA são antiparalelas e a DNA polimerase só adiciona nucleotídeos no sentido 5’ -> 3’, porque precisa da extremidade 3’-OH livre para que ocorra a ligação fosfodiéster. Desta forma, uma das fitas é sintetizada continuamente e a outra descontinuamente.
8) Kornberg e colaboradores incubaram extratos solúveis de células de E. coli com uma mistura de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, todos marcados com 32P no grupo fosfato da posição α. Após um intervalo de tempo, a mistura da incubação foi tratada com ácido tricloroacético e o precipitado coletado. A quantidade de incorporação dos nucleotídeos no DNA foi determinada a partir da quantidade de radioatividade no precipitado.
a) Qual a base química deste procedimento?
Durante a síntese, os nucleotídeos radioativos vão sendo incorporados e o P α permanece na molécula.
b) Quando um dos quatro nucleotídeos era omitido da mistura de reação, praticamente nenhuma radioatividade era encontrada no precipitado. Explique.
A DNA polimerase só funciona na presença dos 4 nucleotídeos na mesma quantidade.
c) 32P seria incorporado no DNA se somente o dTTP estivesse marcado?
Sim, desde que houvesse adenina para parear com timina.
d) Haveria radioatividade no precipitado se o 32P estivesse no fosfato de posição β ou ϒ dos nucleotídeos?
Não, pois os fosfatos ϒ e β não são incorporados na molécula.
09. Descreva os principais experimentos que indicam que o DNA é o material genético. 
Experimento de Griffith: O experimento de Griffith foi o primeiro experimento sugerindo que bactérias são capazes de transferir informação genética através de um processo conhecido como Transformação. Em seus estudos sobre pneumococos, na tentativa da criação de uma vacina, acabou percebendo a existência de dois ou mais tipos dessa bactéria em uma amostra de secreção coletada de um paciente. Buscando comprovar sua observação realizou diversos experimentos envolvendo a introdução da Streptococcus pneumonie em ratos. Os experimentos utilizaram duas variantes, uma virulenta (Cepa S) e outra avirulenta (Cepa R). Foi inoculada, primeiramente, uma cepa S morta por aquecimento e, como esperado, não ocorreu o desenvolvimento da doença. Em outra análise, injetou-se no roedor a cepa S inativada pelo calor combinada a cepa R. O rato desenvolveu a pneumonia e foram encontradas células da variante S em seus tecidos. Griffth, portanto, chegou à conclusão de que as bactérias R teriam se "transformado" na variante S, pois adquiriram o que Frederick denominou de substância S. E para ele, era uma proteína. Em trabalhos posteriores a substância responsável pela "transformação" foi isolada e identificada como DNA.
Experimentos de Hershey-Chase: Em seus experimentos, Hershey e Chase estudaram bacteriófagos, ou vírus que atacam bactérias. Para estabelecer se o fago injetava DNA ou proteína no interior da bactéria hospedeira, Hershey e Chase prepararam dois diferentes lotes de fagos. Em cada lote, os fagos eram produzidos na presença de elemento radiativo específico, que era incorporado nas macromoléculas (DNA e proteínas) sintetizadas pelos fagos. Uma amostra foi produzida na presença um isótopo radioativo do enxofre, encontrado em muitas proteínas mas ausente no DNA e outra amostra foi produzida na presença de um isótopo radioativo de fósforo, encontrado no DNA mas não em proteínas. Cada lote de fagos era usado para infectar uma cultura diferente de bactérias. Após a infecção, cada cultura era turbilhonada em um liquidificador, removendo qualquer fago remanescente e partes de fagos externas às células bacterianas. Finalmente, as culturas eram centrifugadas a alta velocidade, para separar as bactérias dos resíduos de fagos. Quando Hershey e Chase mediram a radioatividade no sedimentado e no sobrenadante para ambos os experimentos, eles encontraram que uma grande quantidade de 32P apareceu no material sedimentado, enquanto quase todo o 35S apareceu no sobrenadante. Com base neste e em experimentos similares, Hershey e Chase concluíram que o DNA, não a proteína, era injetado nas células hospedeiras e compunham o material genético dos fagos.
10. Descreva o experimento de Meselson-Stahl. Qual seria o resultado deste experimento se a replicação do DNA fosse conservativa? (Pesquisar)
Meselson e Stahl cultivaram bactériasE.coli num meio com 15N (Isótopo pesado de Nitrogênio), depois centrifugaram seu DNA: todas novas cadeias originadas após a cultivação tinham apenas 15N. Também cultivaram bactérias E.coli na presença de 14N (Isótopo normal de nitrogênio), depois centrifugaram o DNA: todas as novas cadeias originadas após a cultivação tinham apenas 14N. Em seguida, bactérias E.coli foram cultivas em um meio para reprodução e após a reprodução o DNA de uma bactéria foi colhido, purificado e centrifugado para análise de densidades. Resultado: verificaram que a densidade de flutuação variava entre os valores de 15N (mais denso) e 14N (menos densas), mostrando que após a replicação cada dupla hélice de DNA continham quantidades mais o menos iguais de 15N e 14N. Analisando esse resultado, percebemos que ele se encaixa tanto na hipótese de replicação dispersiva quanto na hipótese de replicação semi-conservativa. Para a diferenciação entre replicação dispersiva e replicação semi-conservativa, bactérias foram cultivadas novamente com a intenção que elas se reproduzissem. Foram analisados 3 tempos de reprodução diferentes. Células foram removidas e seus DNA foram purificados para serem estudados. Foi centrifugada uma amostra de DNA e analisada a sua densidade. Resultado: surgiram dois lados uma hélice com densidade maior formada por 15N e outra hélice com densidade menor formada por 14N. Esse resultado se encaixa totalmente na hipótese de replicação semi-conservativa.
III- Mutação e Reparo, Plasmídeos e outros Elementos Genéticos Móveis
01. Que propriedade da DNA polimerase I leva à observação que mutantes polA 1 são mais sensíveis à luz ultravioleta?
A função de exonuclease 5’-3’ da DNA polimerase I, que caso uma bactéria sofra uma mutação pela luz UV, o mecanismo de reparo do DNA pode ser prejudicado, fazendo com que a enzima perca a capacidade de reparação.
02. Descreva brevemente as 3 etapas de reparo do DNA lesado por luz UV e as enzimas nelas envolvidas?
1) Uma exonuclease de reparo do DNA ou complexo enzimático se liga e remove a base ou nucleotídeo danificado;
2) A DNA polimerase é recrutada e preenche o espaço usando o filamento não danificado como molde
3) A DNA ligase sela as quebras deixadas.
03. Como a maquinaria de reparo de E. coli identifica uma fita de DNA que incorporou recentemente erroneamente um nucleotídeo não complementar durante a replicação?
A dna polimerase identifica que foi colocado um nucleotídeo errado por ele estar pareado de forma incorreta ou não pareado.
04.Visto que U pareia com A tão bem quanto T pareia com A, por que somente T é encontrado no DNA?
Porque a uridina (nucleotídeo composto de uracila) não é capaz de se ligar à DNA polimerase, a enzima que constrói as fitas de DNA. Os ribonucleotídeos, inclusive a uridina, possuem um grupo hidroxila (OH) na posição 2' da ribose, que não está presente nos nucleotídeos do DNA (conhecidos como desoxirribonucleotídeos). Esse grupo hidroxila a mais torna a molécula muito grande para se encaixar no sítio da DNA polimerase. Além disso, Timina, Citosina e Uracila são bases nitrogenadas do tipo pirimidina, sendo muito parecidas. Se tivesse Uracila no DNA, consequentemente teríamos vários erros durante a replicação da molécula.
05. Células de mamíferos de dois genótipos diferentes podem ser fundidas na presença do vírus Sendai, para formar células multinucleadas (heterocarions) contendo núcleos de ambos os genótipos. Quando fibroblastos de dois pacientes sofrendo de Xeroderma pigmentosum foram fundidos, os heterocarions resultantes não mostraram deficiências em reparo de DNA. Que conclusão pode ser tirada desta observação? Explique?
A doença é recessiva ou multifatorial, tendo mais de um gene envolvido.
06. Defina o termo “transposon”. Explique como os transposons podem:
São pedaços de DNA que "saltam" de um lugar para outro.
a) Conduzir à ativação ou à inativação gênica?
Podem se inserir na região regulatória ou codificante de um gene, o que pode acarretar à perda da função do gene e gerar uma nova mutação
b) Dependendo da orientação da sequência de inserção, conduzir à inversão, deleção ou duplicação dos genes?
Devido à cópia do material genético, se houver um gene nesse fragmento copiado, esse pode ser invertido ou duplicado.
07. Descreva as condições necessárias para que duas bactérias conjuguem com sucesso. O que é uma célula Hfr? Qual a diferença entre fator F e F’?
É necessário genes nos plasmídeos que confiram a capacidade uma bactéria doar material genético e a outra receber. Uma célula Hfr é a integração de um fator F (plasmídeo conjugativo) ao cromossomo da bactéria, onde uma bactéria Hfr é capaz de ter seu cromossomo mobilizado pela ação dos genes plasmidiais. O fator F está presente no plasmídeo (transferência). Já F’ é o fator que apresenta a porção do gene para transferência.
08. Suponha que uma cepa Hfr de E. coli sensível a estreptomicina (Strs), capaz de sintetizar os aminoácidos Leu e His, é misturado em meio de cultura com uma cepa F- que é resistente à estreptomicina e incapaz de sintetizar Leu e His. Após certo tempo a conjugação é interrompida, colocando-se a mistura num liquidificador e transferindo-se amostras da cultura para placas seletivas para testar se houve ou não conjugação. Quando as bactérias são transferidas para um meio contendo estreptomicina e na ausência de Leu e His ocorre algum crescimento bacteriano? Explique este resultado? (Pesquisar)
Sim, ocorre crescimento bacteriano pois a cepa F- é resistente à estreptomicina e a cepa de F+ permanece enquanto o meterial genético de Hfr é transferido à cepa F-, conferindo a capacidade de sintetizar Leu e His, portanto só ocorrerá essas condições se a conjugação for completa. Somente uma população sobreviverá, enquanto que a população de cepa Hfr não sobreviverá e tampouco a F+ resistente à StrS, que não sintetiza Leu e His. A conjugação ocorre da bactéria que é Hfr para a F-, logo a Hfr passará os genes que são capazes de sintetizar Leu e His para a cepa F- que é resistente à estreptomicina. No final, apenas F- sobrevive (agora é F+) pois a Hfr é sensível ao antibiótico e morre.
09. Como você explica a necessidade do antibiograma antes de prescrever um antibiótico?
O antibiograma é importante pois com esse teste é possível verificar a resistência de uma bactéria a vários antibióticos e, dessa forma, concluir quais os antibióticos que estão ativos contra a bactéria. 
10. Descreva o funcionamento do Operon Lac e do Operon Trip.
- Operon lac: O operon lac é expresso somente quando na presença de lactose e ausência de glicose. O repressor lac atua como um sensor de lactose e a proteína ativadora de catabólito (CAP), atua como um sensor de glicose: essas proteínas se ligam ao DNA do operon lac e regulam sua transcrição com base no níveis de lactose e glicose. Quando a lactose está presente, o repressor lac perde a capacidade de ligar-se ao DNA, com isso a RNA polimerase se liga ao sitio promotor e transcreve o operon lac. A CAP, que está ativa quando os níveis de glicose estão baixos, se liga à região do DNA que precede o promotor do operon lac e auxilia na ligação da RNA polimerase ao promotor, conduzindo altos níveis de transcrição. 
- Operon trp: O operon trp é um conjunto de cinco genes que codificam as enzimas sintetizadoras do aminoácido triptofano, que é essencial para as bactérias. Quando os níveis de triptofano estão altos, o repressor trp se liga ao triptofano, bloqueando a expressão do operon trp para que a bactéria não gaste energia sintetizando o aminoácido. Já quando os níveis de triptofano estão baixos, o operon é ativado, os genes são transcritos e as enzimas são produzidas para a síntese do triptofano.