TESTES-SOROLÓGICOS-E-TRICOGRAMA

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TESTES SOROLÓGICOS E TRICOGRAMA 
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Sumário 
 
NOSSA HISTÓRIA ...................................................................................................... 2 
Tricograma ................................................................................................................... 3 
TRICOGRAMA ........................................................................................................... 8 
DEFINIÇÃO ................................................................................................................. 8 
TÉCNICA ..................................................................................................................... 8 
RESULTADOS GERAIS ............................................................................................. 9 
Métodos de diagnóstico sorológico ............................................................................. 13 
A MICROPLACA ELISA EUROIMMUN ................................................................. 21 
PRINCÍPIO DO TESTE ............................................................................................. 21 
VANTAGENS ............................................................................................................ 23 
BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................ 25 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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NOSSA HISTÓRIA 
 
A nossa história inicia com a realização do sonho de um grupo de 
empresários, em atender à crescente demanda de alunos para cursos de 
Graduação e Pós-Graduação. Com isso foi criado a nossa instituição, como 
entidade oferecendo serviços educacionais em nível superior. 
A instituição tem por objetivo formar diplomados nas diferentes áreas de 
conhecimento, aptos para a inserção em setores profissionais e para a 
participação no desenvolvimento da sociedade brasileira, e colaborar na sua 
formação contínua. Além de promover a divulgação de conhecimentos culturais, 
científicos e técnicos que constituem patrimônio da humanidade e comunicar o 
saber através do ensino, de publicação ou outras normas de comunicação. 
A nossa missão é oferecer qualidade em conhecimento e cultura de forma 
confiável e eficiente para que o aluno tenha oportunidade de construir uma base 
profissional e ética. Dessa forma, conquistando o espaço de uma das instituições 
modelo no país na oferta de cursos, primando sempre pela inovação tecnológica, 
excelência no atendimento e valor do serviço oferecido. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Tricograma 
 
 
 
O tricograma consiste numa observação ao microscópio de um pelo previamente 
extraído (Campbell, 2004). Utiliza-se uma pinça simples ou uma pinça 
hemostática para remover os pelos, na direção em que estes saem da pele, 
evitando assim traumas no pelo (Wilkinson & Harvey, 1996; Miller et al., 2013). 
 
São colocados cerca de vinte a trinta pelos numa lâmina de microscópio, 
orientados na mesma direção e mantendo-se estabilizados através de fita-cola 
ou óleo mineral Representação do ciclo do crescimento do pelo. Legenda: A- 
Anagénese, Fase de crescimento, Mitose das células epiteliais; B- Catagénese 
precoce, Fase transitória, Constrição no bulbo piloso; CCatagénese, Folículo 
distal enrugado empurra o pelo; D- Telógenese, Fase de descanso, Papila 
Folicular separa-se e um filamento epitelial forma o germe secundário; E- 
Anagénese precoce, Crescimento do germe secundário ao encontro da papila e 
formação de um novo bulbo; F- Exogénese, Perda do pelo antigo; GAnagénese, 
Pelo alonga-se durante o crescimento (Adaptado de McGavin & Zachary, 2007). 
Prélaud, 1999; Hnilica, 2011). As amostras são observadas microscopicamente, 
com uma intensidade de luz média e ampliação de 40x, 100x e 250x (Guagère 
& Prélaud, 1999). Cada porção do pelo permite-nos retirar informações sobre 
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afeções distintas: a observação da haste pilosa permite distinguir entre a 
presença de prurido e causas não traumáticas de queda de pelo, o pelo em si 
fornece-nos dados acerca da presença de fungos ou ectoparasitas e as raízes 
da regularidade do ciclo folicular (Hnilica, 2011). 
 
 
 
As distintas apresentações do pelo no tricograma, quer na ausência de patologia, 
quer em doenças específicas, estão representadas na tabela 1 e figura 4. 
Através deste exame é possível então avaliar se a alopécia do animal se deve a 
excesso de lambedura ou contacto com superfícies, devido a prurido ou a devido 
a uma causa não pruriginosa como displasia folicular ou doença endócrina 
(Mueller, 2008; Frank, 2014). No primeiro caso as hastes encontram-se 
quebradas, tornando-se muito útil no diagnóstico, especialmente de gatos em 
que os donos não identificam o prurido (Frank, 2014). A observação do pelo 
também possibilita a identificação de esporos de Dermatophyte ectothrix spp., 
apresentando-se como pequenas estruturas esféricas em fila ao longo deste 
(Paterson, 2008). Podem ser visíveis ovos de ectoparasitas nos casos de 
pediculoses ou infestação por Cheyletiella spp. (Hnilica, 2011). 
 
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O tricograma é muito útil aquando da presença de ácaros de Demodex spp., 
especialmente em regiões onde se torna difícil a execução de raspagens, como 
as áreas interdigitais (Lewis, 2011). Um estudo conduzido por Saridomichelakis 
et al. (2007), refere a sensibilidade do tricograma na demodicose, tendo sido 
encontrado em 85,1% destes pelo menos um parasita. Outras anomalias na 
estrutura do pelo, como trichorrhexis nodosa ou pili torti, podem ser analisadas 
ao microscópio. 
 
 
 
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Ao analisar as raízes pilosas é possível avaliar se este se encontra normal, já 
que a maioria dos pelos deverá estar em telogénese, identificando-se apenas 
alguns pelos na fase de crescimento de anagénese (Frank, 2014). A presença 
de grânulos de melanina, de dimensões anormais e escassamente estendidos é 
sugestivo de displasia folicular por diluição de cor ou alopécia por diluição de cor 
(Wilkinson & Harvey, 1996; Campbell, 2004). Este fenómeno não é comum, 
sendo uma doença dermatológica hereditária observada predominantemente em 
cães, no entanto já foi reportada em gatos com pelagem azul e creme (Gross et 
al., 2005). 
 
 
Tabela 1: Características do pelo e bulbo piloso no tricograma normal e em 
doenças dermatológicas (Adaptado de Campbell, 2004). 
 
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TRICOGRAMA 
 
DEFINIÇÃO 
 
O tricograma constitui-se como um método rápido e pouco dispendioso de 
diagnóstico em dermatologia veterinária, cujo procedimento consiste em recolher 
amostras de pêlo através da sua tração da pele e posterior exame microscópico 
(Scott et al., 2002). 
Este método fornece informações sobre a raiz, haste e extermidade distal dos 
pelos, revelando-se de grande utilidade no auxílio ao diagnóstico de patologias 
como alopécia psicogénica, alopécia por diluição de cor, dermatofitose, 
tricorrexis nodosa, displasias foliculares nutritivas ou congénitas, tricomalácia, 
tricoptilose, defluxo telogéneo, defluxo anagéneo, pili torti, alopécia endócrina e 
transtornos pigmentares do desenvolvimento piloso (Scott et al., 2002). 
 
TÉCNICA 
 
Embora o conceito simplificado de tricograma seja a recolha de amostas de pêlo 
para posterior visualização ao microscópio, poderão utilizar-se diversas técnicas 
quer na obtenção das amostras, quer no processamento das mesmas. Assim 
sendo, essa recolha pode ser realizada com o auxílio de uma pinça, com a ponta 
dos dedos (Scott et al., 2002), com uma tira de fita-cola, ou até mesmo através 
do método de escovagem (Dhurat & Saraogi, 2009). Quando se utiliza a pinça 
hemostática, esta poderá ter a sua extremidade distal revestida a borracha, 
sendo igualmente importante tracionar os pêlos seguindo a direção sobre a qual 
estes emergem da pele,de modo a reduzir ao mínimo os artefactos traumáticos 
(Scott et al., 2002). Deverá repetir-se este procedimento até se obter, pelo 
menos, vinte pêlos (Nesbitt & Ackerman, 1998). 
 
Os pêlos serão tracionados completamente pela raiz e posteriormente colocados 
numa lâmina de microscópico com uma gota de óleo mineral e uma lamela sobre 
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si, orientados na mesma direção. A visualização ao microscópio será feita com 
uma objetiva de baixa ampliação (10x) (Scott et al., 2002). Realiza-se o mesmo 
procedimento de recolha e posterior processamento da amostra quando se 
utiliza a ponta dos dedos para tracionar os pêlos, em substituição à pinça 
hemostática (Scott et al., 2002). 
 
A recolha com tira de fita-cola embora não seja muito usada em tricografia, 
revelase bastante rápida e eficaz, contudo, mais traumática para o pêlo. Nesta 
técnica, a face adesiva da fita-cola ficará em contacto com o pêlo, sendo 
destacada num movimento rápido na direção do crescimento do mesmo, 
repetindo-se este procedimento várias vezes. Este método não requer a fixação 
do material com óleo mineral, uma vez que a tira de fita-cola será colada 
diretamente na lâmina para visualização (Guaguère e Prélaud, 1999). Quanto ao 
processo de escovagem, este poderá realizar-se, por exemplo, com o auxílio de 
uma escova de dentes. Deste modo, em movimentos repetidos, passa-se a 
escova pelo mesmo local na pelagem, até que se obtenha a quantidade de pêlos 
necessária à realização do tricograma. O processamento da amostra é o já 
descrito nos métodos de tração com pinça e com a ponta dos dedos (Dhurat & 
Saraogi, 2009). 
 
RESULTADOS GERAIS 
 
O exame microscópico do pêlo permitirá avaliar parâmetros como a integridade 
da extremidade distal, a fase do ciclo de crescimento e a sua pigmentação, 
através da visualização das principais estruturas pilosas (raiz, haste e ponta), 
auxiliando na determinação de alguns aspetos do diagnóstico dermatológico 
(Mur, 1997; Nesbitt & Ackerman, 1998; Paterson, 2008). Assim sendo, este irá 
iniciar-se com a observação da raiz do pêlo e respetivos bulbos pilosos, 
estruturas que permitem a avaliação da fase do ciclo de crescimento de cada 
pêlo, bem como a existência de alguns parasitas (ex: Demodex) (Scott et al., 
2002; Paterson, 2008). O bulbo piloso pode encontrar-se em anagénese ou 
telogénese. Quando em anagénese, os bulbos são arredondados, lisos, 
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brilhantes, em forma de gancho, muitas vezes pigmentados e frágeis, de tal 
forma que a raiz pode mesmo dobrar-se (Nesbitt & Ackerman, 1998; Scott et al., 
2002). 
 
Por sua vez, quando em telogénese, apresentam-se em forma de lança, de 
superfície rugosa, não pigmentados e habitualmente retos. Embora presentes, 
os pêlos em catagénese são raramente visíveis e os seus bulbos têm uma 
aparência intermédia entre as duas fases anteriores (Scott et al, 2002). Em 
animais adultos saudáveis existe uma mistura de pêlos em anagénese e 
telogénese, cuja proporção varia de acordo com fatores como a raça, estação 
do ano, maneio, entre outros. Esta proporção poderá ser determinada 
classificando os bulbos de aproximadamente 100 pêlos, contudo, por não 
existirem valores normais bem estabelecidos, os autores raramente registam 
esta proporção, embora o seu cálculo possa revelar-se de extrema importância 
(Scott et al., 2002). Em casos de defluxo telogéneo, todos os pêlos se 
apresentam em telogénese (Mur, 1997). Do mesmo modo, quantidades 
inadequadas de pêlos em telogénese (ex: no Verão a maioria encontra-se em 
telogénese, quando a proporção deveria rondar os 50:50), sugerem a existência 
de uma patologia endócrina, nutricional, ou metabólica (Scott et al., 2002). A 
etapa seguinte é a avaliação da haste pilosa. Uma haste pilosa normal possui 
um diâmetro uniforme, que vai diminuindo suavemente até à ponta, uma cutícula 
facilmente visível, bem como um córtex e medula perfeitamente delimitados. 
 
Os pêlos que se apresentam inadequadamente frisados, malformados e de 
tamanho pouco comum, sugerem a existência de uma patologia subjacente, seja 
ela nutricional, metabólica, ou uma anomalia congénita hereditária (Scott et al., 
2002). Sempre que se observem pêlos quebrados de modo repentino ou partidos 
longitudinalmente, embora com hastes normais, estes representam um indicador 
de traumatismo externo, provocado por comportamentos excessivos como coçar 
ou lamber. Tais alterações podem verificar-se em patologias como a alopécia 
por diluição de cor e outros transtornos congénitos hereditários, na alopécia 
areata, na tricorrexis nodosa, na tricomalácia e na dermatofitose (Scott et al., 
2002). O diagnóstico de dermatofitose é possível após adicionar à amostra 
Hidróxido de Potássio (KOH) a 20%. 
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Após trinta minutos, procede-se ao exame microscópico, podendo visualizar-se 
desta forma as hifas e esporos (pequenas estruturas esféricas) do fungo no pêlo. 
Embora simples, este método requer uma certa experiência, uma vez que não é 
fácil distinguir elementos fúngicos provenientes de dermatófitos de outros, 
característicos de fungos contaminantes (Mur, 1997). No caso de infestação por 
piolhos, poderão ser também visualizados ovos aderidos à haste pilosa 
(Paterson, 2008). A pigmentação dos pêlos depende da raça do animal e da cor 
do manto, contudo, nas zonas em que a coloração do manto é uniforme, este 
parâmetro não deverá variar muito entre um pêlo e outro. 
 
Por outro lado, os pêlos dos animais com diluição de cor normal não deverão ser 
confundidos com uma entidade patológica, uma vez que anomalias de 
pigmentação associadas à alopécia por diluição de cor não se encontram ainda 
bem estudadas (Scott et al., 2002). Sempre que se observem alterações de 
pigmentação, devem considerar-se em primeiro lugar fontes externas tais como 
tingimento por saliva, exposição solar, medicações tópicas ou produtos 
químicos, bem como fatores que influenciam a transferência do pigmento até à 
haste pilosa, sejam eles provocados por fármacos, desequilíbrios nutricionais, 
transtornos endócrinos ou desordens idiopáticas (Scott et al., 2002). A última 
etapa será a avaliação da extremidade distal ou ponta do pêlo. 
 
A sua examinação é particularmente útil em casos em que este se apresente 
quebrado, terminando em forma de escova, pois constitui-se como um 
importante indicador da presença de trauma auto-induzido por excesso de 
lambedura (Mur, 1997; Paterson, 2008). Nestes casos, as extremidades do pêlo 
não só se apresentam danificadas, como se poderão observar fragmentos de 
pêlos ingeridos nas fezes (Guaguère & Prélaud, 1999). Assim sendo, este 
achado pode auxiliar no diagnóstico da alopécias com origem pruriginosa ou 
psicogénica no gato. Por outro lado, quando a extremidade do pêlo está intacta, 
indica que o animal não está a contribuir para a alopécia, ou seja, torna-se 
importante considerar as causas de alopécia espontânea (Mur, 1997). Por vezes 
também se visualizam no tricograma cilindros de queratina na porção proximal 
do pêlo. Estes indicam alteração do processo de queratinização folicular e 
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observam-se em patologias como a seborreia primária, demodecose, adenite 
sebácea, foliculite bacteriana, displasia folicular e endocrinopatias (Paterson, 
2008). No Quadro 6 apresenta-se a interpretação de um tricograma 
relativamente aos possíveis diagnósticos diferenciais, de acordo com o conjunto 
de parâmetros observados 
 
 
 
Interpretação de Tricograma (Guaguère & Prélaud, 1999) 
 
 
 
 
 
 
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Métodos de diagnóstico sorológico 
Existem vários testes que detectam anticorpos séricos específicos para N. 
caninum, principalmente em cães e bovinos (Tabela 1) (Atkinson et aI., 2000). 
Os mais utilizados são a reação de imunofluorescência indireta – IFI 
- e o teste imunoenzimático (Enzyme-/inked Immunosorbent Assay - ELlSA) 
(Pereira-Bueno et aI., 2003). 
 
 
 
 
 
 
14Os testes sorológicos de IFI e de ELlSA necessitam do conjugado (anticorpo 
secundário espécie-específico) para detectar os anticorpos de N. caninum. Os 
antígenos de N. caninum podem ser naturais ou recombinantes, e diferem de 
acordo com o teste sorológico. No método da IFI, os taquizoítas inteiros são 
fixados nas lâminas, e nos diferentes tipos de ELlSA, utilizam o extrato de 
taquizoítas (taquizoítas inteiros; antígenos de taquizoítas incorporados a um 
complexo imunoestimulante e antígenos recombinantes) . Os taquizoítas são 
obtidos de cultivo in vitro de cepas de N. caninum isoladas de bovinos e de cães, 
e não existem indicações que possíveis pequenas diferenças antigênicas entre 
os isolados afetem a eficácia dos testes (Yamane et aI., 1997). 
 
 
 
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TESTE DE ELISA 
 
O teste de “ELISA” (do inglês “Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay) se 
baseia reações antígeno-anticorpo detectáveis através de reações enzimáticas. 
A enzima mais comumente utilizada nestas provas é a peroxidase, que catalisa 
a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2) em H2O mais O2. 
Existem 
 
vários modelos de testes de ELISA; em sua forma mais simples, chamada ELISA 
indireto, um antígeno aderido a um suporte sólido (placa de ELISA) é preparado; 
a seguir coloca-se sobre este os soros em teste ( ex. soro humano), na busca 
de anticorpos contra o antígeno. Se houver anticorpos no soro em teste ocorrerá 
a formação da ligação antígeno-anticorpo, que posteriormente é detectada pela 
adição de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie 
onde se busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual é ligada à 
peroxidase. 
Este anticorpo anti-IgG, ligado à enzima denomina-se conjugado. Ao adicionar-
se o substrato apropriado para a enzima (isto é, H2O2 dissolvida em uma 
substancia química que dá uma reação colorida quando H2O2 é desdobrada). 
Os orifícios onde ocorreu a reação antígeno-anticorpo apresentam uma 
coloração (variável dependendo do substrato). 
 
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Outro método é o chamado ELISA de bloqueio ou competição, em que a 
presença de anticorpos em determinado soro é revelada pela competição com 
um anticorpo específico (mono ou policlonal) dirigido contra o antígeno. 
Igualmente, o resultado é dado pela adição de um conjugado, porém a coloração 
aparecerá nos orifícios onde não havia anticorpos. A seguir, temos um modelo 
de teste de ELISA de bloqueio, desenvolvido por nós e utilizado amplamente em 
nosso laboratório para o diagnóstico de anticorpos contra herpesvírus bovinos. 
Método: 
1 – Sensibilizar as placas de ELISA com o antígeno, previamente diluído (no 
nosso exemplo, diluído a 1/200, correspondente à diluição considerada ótima em 
titulações anteriores), em tampão carbonato (vide fórmulas no final), 100 ul por 
orifício, e incubar overnight a 4 oC. Isto permitirá a ligação do antígeno à placa. 
 
2- No dia seguinte, remover a solução de antígeno e lavar a placa 3 vezes com 
líquido de lavagem de ELISA (PBS-T20), em volume de 100 ul por orifício. 
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3- A placa pode então ser armazenada para uso posterior (em sacos plásticos 
fechados a – 20 oC, ou utilizada imediatamente. 
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4- Acrescentar os soros a testar em uma diluição previamente determinada ( ½ 
em nosso exemplo), preparada em líquido de lavagem, em volumes de 100 
ul/orifício. Incubar por uma hora a 37 oC. 
 
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5- Remover a diluição dos soros e lavar três vezes com líquido de lavagem. 
6- Acrescentar 100 ml por orifício de uma diluição apropriada do anticorpo 
monoclonal (1:1000 em nosso exemplo), preparada em líquido de lavagem. 
Incubar por uma hora a 37 oC. 
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7 - Remover o anticorpo monoclonal e lavar três vezes com líquido de lavagem. 
8- Acrescentar 100 ml por orifício de uma diluição apropriada do conjugado (anti- 
IgG de camundongos; 1:1000 em nosso exemplo), preparada em líquido de 
lavagem. Incubar por uma hora a 37 oC. 
 
9- Remover a diluição de conjugado e lavar três vezes com líquido de lavagem. 
10- Acrescentar 100 ml por orifício de uma solução de OPD (ortofenilenodiamina) 
preparada em tampão citrato-fosfato acrescentado de 0,001% de H2O2. Incubar 
por 15 minutos a 37 oC. 
11- A reação é interrompida pela adição de 50 ml por orifício de uma solução de 
H2SO4 2M. 
12- Os resultados são obtidos com base na leitura da densidade ótica (D.O.) em 
espectrofotômetro com filtro de 492 nm. 
 
 
 
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A MICROPLACA ELISA EUROIMMUN 
O teste de ELISA baseia-se em reações antígeno-anticorpo detectáveis por meio 
de reações enzimáticas (teste imunoenzimático). 
A enzima mais comumente usada nesta prova á a peroxidase, responsável por 
catalisar a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2) em H2O mais 
O2. 
 
PRINCÍPIO DO TESTE 
O antígeno purificado fica aderido aos poços da microplaca de poliestireno (fase 
sólida). Em seguida, adiciona-se o soro do paciente e, caso a amostra seja 
positiva, anticorpos específicos se ligam aos antígenos da fase sólida. 
 
Na segunda etapa, inclui-se um segundo anticorpo dirigido contra as 
imunoglobulinas da espécie, que é ligado à peroxidase (conjugado). 
 
Ao adicionar-se o substrato apropriado para a enzima, ocorre a reação de cor. 
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Os orifícios onde ocorreu a reação antígeno-anticorpo apresentam uma 
coloração. A intensidade da cor produzida é proporcional à concentração de 
anticorpos na amostra de soro. 
 
 
 
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VANTAGENS 
 ELISA monoespecífico (imunoensaio enzimático com um único antígeno) 
proporciona material in-vitro quantitativo para detecção de anticorpos. O perfil 
de ELISA proporciona um material in-vitro semiquantitativo para detecção de 
diferentes anticorpos em uma única microplaca. 
 
 A fase sólida do Pool ELISA é coberta com uma composição de antígenos 
para detecção semiquantitativa de anticorpos cuja especificidade deve ser 
investigada em sequência através de material monoespecífico. 
 
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25 
 
 
 
BIBLIOGRAFIA 
 
1.Coons AH, Creech HJ, Jones RN, Berliner E. The Demonstration of 
Pneumococcal Antigen in Tissues by the Use of Fluorescent Antibody. J 
Immunol. 1942;45:159-70. 
2. Beutner EH. The development of immunofluorescence and the 
immunopathology of the skin. Int J Dermatol. 2003;42:99-109. 
3. Aoki V. Imunofluorescência, immunoblotting e imunoprecipitação. In: Sampaio 
SA, Rivitti E, eds. Dermatologia. 3 ed. Sao Paulo: Artes Médicas; 2007. p.127-
38. 
4. Beutner EH, Jordon RE. Demonstration of Skin Antibodies in Sera of 
Pemphigus Vulgaris Patients by Indirect Immunofluorescent Staining. Proc Soc 
Exp Biol Med. 1964;117:505-10. 
5. Aoki V, Huang MH, Perigo AM, Fukumori LM, Maruta CW, Santi CG, et al. 
Endemic pemphigus foliaceus (fogo selvagem) and pemphigus vulgaris: 
immunoglobulin G heterogeneity detected by indirect immunofluorescence. Rev 
Hosp Clin Fac Med Sao Paulo. 2004;59:251-6. 
6. Jordon RE, Beutner EH, Witebsky E, Blumental G, Hale WL, Lever WF. 
Basement zone antibodies in bullous pemphigoid. JAMA. 1967;29;200:751-6. 
7. Mutasim DF, Pelc NJ, Supapannachart N. Established methods in the 
investigation of bullous diseases. Dermatol Clin. 1993;11:399-418. 
8. Santi CG, Maruta CW, Aoki V, Sotto MN, Rivitti EA, Diaz LA. Pemphigus 
herpetiformis is a rare clinical expression of nonendemic pemphigus foliaceus, 
fogo selvagem, and pemphigus vulgaris. Cooperative Group on Fogo Selvagem 
Research. J Am Acad Dermatol. 1996;34:40-6. 
9. Morrison LH. When to request immunofluorescence: practical hints. Semin 
Cutan Med Surg. 1999;18:36-42. 
10. Mihai S, Sitaru C. Immunopathology and molecular diagnosis of autoimmune 
bullous diseases. J Cell Mol Med. 2007;11:462-81. 
11. Hans-Filho G, dos Santos V, Katayama JH, Aoki V, Rivitti EA, Sampaio SA, 
et al. An active focus of high prevalence of fogo selvagem on an Amerindian26 
 
 
reservation in Brazil. Cooperative Group on Fogo Selvagem Research. J Invest 
Dermatol. 1996;107:68-75. 
12. Rivitti EA, Sanches JA, Miyauchi LM, Sampaio SA, Aoki V, Diaz LA. 
Pemphigus foliaceus autoantibodies bind both epidermis and squamous mucosal 
epithelium, but tis sue injury is detected only in the epidermis. The Cooperative 
Group on Fogo Selvagem Research. J Am Acad Dermatol. 1994;31:954-8. 
13. Warren SJ, Arteaga LA, Rivitti EA, Aoki V, Hans-Filho G, Qaqish BF, et al. 
The role of subclass switching in the pathogenesis of endemic pemphigus 
foliaceus. J Invest Dermatol. 2003;120:104-8. 
14. Ding X, Aoki V, Mascaro JM Jr., Lopez-Swiderski A, Diaz LA, Fairley JA. 
Mucosal and mucocutaneous (generalized) pemphigus vulgaris show distinct 
autoantibody profiles. J Invest Dermatol. 1997;109:592-6. 
15. Bhol K, Natarajan K, Nagarwalla N, Mohimen A, Aoki V 
 
 
 
.