Teste de suscetibilidade a antimicrobianos

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Teste de suscetibilidade a 
antimicrobianos (TSA) 
 
Introdução 
As amostras resistentes são o principal obstáculos à eficácia do tratamento. A 
sensibilidade e resistência são baseadas na concentração mínima inibitória (CMI) e 
na dosagem sérica da droga em seu estado ativo. 
 
• Quando executar o TSA 
 Microrganismos com sensibilidade não prevista. Como exemplo de 
sensibilidade prevista existe Streptococcus pyogenes, Treponema palladium e 
Corynebacterium diphtheriae. 
 
 Bactérias de espécies comumente resistentes como Escherichia coli, 
Acinetobacter e Pneumococcus. 
 
 Estudos epidemiológicos para analisar perfil de resistência de diferentes 
amostras. 
 
Técnicas 
 O TSA é influenciado por vários fatores, por isso, há necessidade de rígida 
padronização. 
• Testes convencionais 
 Difusão 
 Macro ou microdiluição em caldo 
 E-test 
 Diluição em ágar 
 
• Sistemas automatizados industriais 
 VITEK 2 – Tem como base a tecnologia de colorimetria avançada, fornece a 
CMI, ou seja, resultado quantitativo. 
 
• Métodos moleculares 
 PCR para MRSA 
• Testes com meios cromogênicos para MRSA, VRE (Enterococcus resistentes à 
vancomicina), ESBL – Requerem confirmação 
 Chromagar KPC – Indica se a bactéria é resistente ou não à carbapenema, sem 
especificar se por mecanismos bioquímicos ou enzimático. É necessária a 
confirmação, uma vez que se a resistência não for enzimática, não há 
necessidade de isolar o paciente. 
 
• Testes especiais 
 Bactérias fastidiosas 
 Β lactamases 
 Interação entre drogas 
 Concentração mínima bactericida (CMB) 
 Poder bactericida do soro 
 
Disco-difusão 
 É um método utilizado rotineiramente, de fácil execução e reprodutibilidade. 
Possui baixo custo, permite padronização dos resultados e flexibilidade na escolha 
do antimicrobiano. 
 A disco-difusão é um método qualitativo, ou seja, não fornece CMI. 
 Em meio de cultura (Ágar Mueller-Hinton) cultivado em placa, adiciona-se disco 
com antimicrobiano. Essa droga começa a se difundir no meio durante a incubação. 
Quanto mais o antimicrobiano se afasta do disco, mais diluído fica, até que existe uma 
região em que a bactéria não é mais inibida. Nessa região é formado um alo com 
borda definida. Dentro do alo não há crescimento bacteriano, apenas fora. Mede-se o 
diâmetro do alo para classificar se a bactéria é sensível ou resistente. 
 
• Etapas de execução 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. Inóculo 
A partir de um inóculo obtido de uma cultura pura, coletar de 4 a 5 colônias e 
colocar em suspensão salina até atingir o padrão de turbação. 
Para padronização do inóculo se utiliza o padrão de McFarland. Uma solução em 
cloreto de bário em diferentes concentrações que correspondem à um grau de 
turbação, é a densidade bacteriana. Quando existem 108 bactérias é o momento de 
semear. 
2. Semeadura 
É utilizado o meio Ágar Mueller-Hinton, o padrão para bactérias não fastidiosas. 
Promove crescimento da maioria dos patógenos, tem boa reprodutibilidade lote a lote 
e baixo teor de inibidores para drogas como Sulfas, que são inibidas por PABA, e 
Tetraciclinas, inibidas por íons. 
Deve-se retirar o meio de cultura da geladeira 30 minutos antes do uso e fazer 
semeadura na placa inteira, de forma homogênea. Não pode haver crescimento de 
colônias, deve ser um tapete confluente. A superfície do ágar não deve ter gotículas 
e deve ter espessura entre 4 e 5 mm. É importante esperar diminuir a umidade antes 
de aplicar os discos. 
Para controle de qualidade são usadas as bactérias Sthapylococcus aureus, 
Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, uma vez que possuem diâmetro do alo 
bem padronizado. 
3. Aplicação dos discos e incubação 
Os discos devem estar em temperatura ambiente pelo menos 1 hora antes do uso. 
A distância entre os discos deve ser homogênea, em placas de 150mm cabem 
somente 12 discos e em placas de 100mm, 5 discos. 
Após alocados, os discos não podem ser movidos. A placa deve ser invertida, para 
coletar água de condensação que ocorre durante a incubação. A incubação deve ser 
feita entre 16 e 18 horas, a 35º C. 
4. Leitura e interpretação 
Deve-se observar os alos de inibição uniformes e circulares. A leitura do diâmetro 
do alo deve ser lida com paquímetro ou régua. 
 
• Possíveis resultados 
A exposição depende do como a via de administração, dose, intervalo entre as 
doses, tempo de infusão, distribuição, metabolismo e excreção do antimicrobiano, 
influenciam o microrganismo no local da infecção. 
 
 Sensível, dosagem padrão 
Ocorre quando há alta probabilidade de sucesso terapêutico utilizando o regime 
de dosagem padrão do agente. 
 
 Sensível, aumentando exposição 
Ocorre quando há alta probabilidade de sucesso terapêutico porque a exposição 
foi aumentada ajustando-se o regime de dosagem ou sua concentração no local de 
infecção. 
 
 Resistente 
Ocorre quando há alta probabilidade de falha terapêutica mesmo quando há 
aumento da exposição. 
 
• Observações 
 Deve-se considerar que a resistência intrínseca ocorre para várias bactérias 
e drogas, como Escherechia coli e penicilina G. 
 
 Considerar o sítio de ação da droga, que deve ser o mesmo da bactéria. 
 
 Em MRSA deve-se relatar resistência para todos os β lactâmicos, mesmo 
quando existe sensibilidade a alguns desses in vitro. 
❖ Discos de Oxacilina (1µg) e Cefoxitica (30µg) – Indica a presença de mecA, 
um gene que codifica a proteína PBP2A, que não possui afinidade com os 
fármacos β lactâmicos; 
❖ PCR para mecA; 
❖ Screening em meio Mueller-Hinton com NaCl (4%) junto com Oxacilina 
(6µg/mL) – A resistência não é homogênea, somente algumas células da 
população vão ter. Quando tem NaCl a resistência é induzida 
homogeneamente; 
❖ Aglutinação pelo látex para PBP2A. 
 
• Resultados atípicos 
 
Ocorre em bactérias móveis. A borda interna deve ser desconsiderada. 
 
Mutantes resistentes na população ou contaminação. Caso seja Escherichia coli 
com Fosfomicina, utilizado em infecções urinárias, deve-se ignorar as colônias 
dentro do alo e ler a borda externa. 
 
 
Mal posicionamento dos discos. 
 
 
Não formou tapete. 
 
 
Em A o alo tem borda bem delimitada e diâmetro menor que 12 mm, a bactéria é 
sensível. Em B, C e D, os alos possui bordas irregulares ou possuem colônias dentro 
do alo. São consideradas resistentes, independente do diâmetro do alo. 
• Bactérias com exigências nutricionais 
 Haemophilus e Streptococcus – Utiliza meio Ágar Mueller Hinton com 5% de 
sangue difibrinado de cavalo e NAD, com 5 a 7% de CO2. 
 
 Neisseria gonorrhoeae – Ainda não há critério definido. 
 
Teste epsilométrico – E-teste 
É utilizada fita plástica com gradiente do antimicrobiano. Tem por vantagem 
fornecer a concentração mínima inibitória (CMI), logo, é quantitativo. A leitura é dada 
a partir da observação do ponto em que a elipse se fecha. Existem fitas que detectam 
β-lactamases. 
 
 
Testes para detecção de β lactamases 
• Método rápido de triagem 
 Cefalosporina cromogênica 
Amostra é colocada em disco ou fita com o antimicrobiano. Quando há resistência 
ocorre mudança de cor em poucos segundos. 
 
• Detecção de ESBL (β lactamases de espectro estendido) 
Ocorre principalmente com E. coli e Klebsiella pneumoniae. 
Amostras resistentes podem apresentar aparente sensibilidade no TSA. Os ESBL 
só não degradam as Carbapenemas e Cefoxina, porém são inibidos por β lactâmicos 
inibidores de β lactamases. 
A base do teste é a reversão da resistência da bactéria na presença de β lactâmico 
+ inibidor de β lactamase. 
 
 Disco adição – Disco de β lactâmico próximo a disco de β lactâmico + inibidor 
de β lactamase. 
 E-Teste – Fita com β lactâmico em uma extremidade e β lactâmico + inibidor 
de β lactamase na outra. 
 
 Disco-aproximação (dupla difusão) 
 
• β-lactamase AmpCs plasmidiais 
Não degradam Cefepima, Carbapenema (principalmenteImipenem) e Cloxacilina. 
São inibidas pelo ácido fenilborônico, assim como as KPCs e por Cloxacilina. Quando 
a produção de AmpC se associa a alterações nas porinas, ocorre resistência também 
para Carbapenemas. 
As Cefalosporinas inibem o crescimento dessas bactérias somente quando há 
associação com os inibidores da enzima. 
 
• β-lactamase do tipo carbapenemases 
É uma grande fonte de preocupação porque pode conferir resistência à 
praticamente todos os β-lactâmicos e frequentemente possui resistência muito 
ampla aos antimicrobianos. As amostras produtoras são associadas a altas taxas de 
mortalidade. Recomendado fazer o isolamento do paciente, programa de 
rastreamento de amostras produtoras de carbapenemase, reforço de antissepsia 
Em testes de triagem, deve ser feito TSA convencional para enterobactérias de 
pacientes hospitalizados. Devem ser testados simultaneamente todos os 
carbapenemas, como Meropenem, Imipenem e Ertapenem. Se ocorrer resistência ou 
sensibilidade diminuída em pelo menos um, sugere-se a presença de carbapenemase 
e por isso devem ser feitos testes específicos. 
 
 Classe A – Klebsiella pneumoniae carbapenemase e outras. 
A natureza da resistência é plasmidial e pode sofrer inibição pelo ácido 
fenilborônico. A inibição não é aumentada quando ocorre adição de cloxacilina. 
 
 Classe B – Metalo β lactamases, como a NDM (New Delhi metalo β lactamase) 
Essas bactérias utilizam zinco como cofator para a hidrólise do anel β lactâmico, 
são inibidas por EDTA. 
 
 
 
 
 Testes fenotípicos para detecção de carbapenemases 
❖ Inibidores de carbapenemases ou Teste do disco combinado 
Utiliza discos de carbapenema com e sem aditivos, dentre eles EDTA, ácido 
fenilborônico e cloxacilina, esse último para ocorrer diferenciação de AmpC 
associada a perda de porinas. 
 
❖ Teste de Hodge modificado 
Boa sensibilidade para KPC, mas menor que 50% para NDMs. Feito com 
Meropenem ou Ertapenem. Quando são amostras KPC ocorre crescimento de outra 
bactéria, como a E. coli. 
 
❖ Teste molecular 
É o confirmativo para carbapenemase. 
 
Provas de Efeito Terapêutico 
 Conhecido como poder/atividade bactericida do soro. Utilizado para conhecer o 
nível do antimicrobiano no soro ou outros fluídos biológicos e assim saber se ocorre 
acumulação ou se é possível reduzir a dose do fármaco. 
 Usado principalmente em paciente com endocardite ou com transtorno renal em 
uso de antimicrobiano nefrotóxico. 
 É realizado isolamento do agente e colhidas amostras de soro antes e depois da 
administração do antimicrobiano. São realizadas diluições seriadas do soro e do 
agente para avaliação do título. 
 
Teste de suscetibilidade a antimicrobianos com determinação da CMI 
 Deve-se levar em conta preparo de soluções concentradas, solventes e diluentes 
e atividade específica. 
 
• Macrodiluição 
Em um inóculo padronizado de cultura bacteriana, são utilizadas diversas 
concentrações do antimicrobiano, para verificar em qual deles não há mais turvação. 
Para verificar a concentração mínima bactericida (CMB) são utilizados tubos a partir 
da CMI em placa para verificar as colônias. 
 
 
 
• Microdiluição 
Única metodologia validada para micobactérias de crescimento rápido (MCRs). É 
utilizada placa de microtitulação com 50µL das diferentes concentrações da droga. 
Em qualquer poço que houver botão de crescimento ou turvação ocorreu resistência 
à respectiva concentração. É utilizado caldo do meio Mueller-Hinton. 
 
 
 
• Diluição em ágar 
A CMI é aquela com a menor concentração que inibe completamente o 
crescimento da bactéria. Não deve considerar qualquer colônia única ou turvação 
leve causada pelo inóculo.