4-Dissertacao-Deiziane-Gomes

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UFRJ

Aprendendo na Universidade

28/12/2022

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Copaifera reticulata: ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E ATIVIDADE
ANTIBACTERIANA DOS DITERPENOS ÁCIDOS

Deiziane Gomes dos Santos

2018

Copaifera reticulata: ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E ATIVIDADE
ANTIBACTERIANA DOS DITERPENOS ÁCIDOS

Deiziane Gomes dos Santos

Rio de Janeiro
Dezembro/2018

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de
Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como parte dos requisitos necessários à obtenção do
título de Mestre em Ciências (Alimentos).

Orientadora: Drª. Claudia Moraes de Rezende
Co-orientadora: Drª. Thais Matsue Uekane

Deiziane Gomes dos Santos
Copaifera reticulata: isolamento, caracterização e atividade antibacteriana dos
diterpenos ácidos
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências de Alimentos,
Instituto de Química, da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Mestre em
Ciências (Alimentos).

Aprovada por:
______________________________________________
Prof Dra. Claudia Moraes de Rezende (IQ/UFRJ)
(Presidente da banca/orientador)

_______________________________________________
Prof Dra. Thais Matsue Uekane (UFF)
(Co-orientadora)
_________________________________________________
Prof Dr. Carlos Adam Conte Junior (UFRJ)
(Membro)
__________________________________________________
Prof Dra. Rosane Nora Castro (UFRRJ)
(Membro)

Agradecimentos
Encerro essa etapa da minha vida grata a Deus pela força e por toda misericórdia que me foi
concedida para que eu pudesse chegar até aqui.
Agradeço a toda a minha família, em especial aos meus pais, Maria (in memoriam) e no meu
coração e Damião pelo apoio e carinho, que me deram forças para lutar pelo meu sonho.
À minha amiga Aline Silvestre por todo o apoio e companherismo nos momentos difícies.
À minha amiga Allien que juntas lutamos pela realização desse sonho. Foram várias noites sem
dormir, várias disciplinas juntas, além das trilhas para relaxar depois das avaliações.
À minha amiga Calionara que mesmo em pouco tempo já somos quase irmãs.
À minha amiga Ana Carolina por toda paciência em me ensinar grande parte do que sei sobre
cromatografia gasosa.
À minha amiga Fernanda por ter me ensinado a fazer cromatografia em coluna de gel de sílica e
interpretar os espectros de RMN.
À prof Claudia Rezende, pelo apoio e por ter acreditado em mim mesmo sem me conhecer. A sua
ajuda foi fundamental para a realização desse sonho.
A co-orientadora Thais Uekane, por todo aprendizado e paciência no início dessa etapa.
Aos queridos amigos do LAROMA Natália, Ana Laura, Anna Tsukui, Rodrigo, Filipe, Fábio,
José, sem vocês tudo seria mais difícil.
Ao prof Carlos Conte e seu aluno de doutorado Vinícius por todo o aprendizado e por ter aberto as
portas do seu laboratório e ter me permitido entrar no mundo da microbiologia.
À prof Daniela Alviano pelos materiais cedidos por seu laboratório.
Ao prof Alexandre, coordenador do PPGCAL eu agradeço por todo o auxílio prestado nesses
anos.
À todos os professores e funcionários do IQ.
E por fim, a CAPES pelo auxílio financeiro concedido nestes dois anos.

Resumo
O óleo-resina da espécie Copaifera é considerado um dos mais importantes remédios naturais
para os povos indígenas da região amazônica e seu uso é amplamente difundido devido às
diversas propriedades farmacológicas. O intuito desse trabalho foi realizar o isolamento, a
caracterização e a avaliação da atividade antibacteriana dos constituintes do óleo-resina de
Copaifera reticulata com ênfase nos diterpenos ácidos. O óleo-resina de C. reticulata foi
fracionado por cromatografia em coluna de gel de sílica impregnada com KOH para obtenção
das três classes de substâncias, sendo elas hidrocarbonetos sesquiterpênicos, sesquiterpenos
oxigenados e diterpenos ácidos. Para avaliação da atividade antibacteriana do óleo-resina
bruto de C. reticulata e das três classes de substâncias foram utilizados grupos de bactérias
gram-negativas (Salmonella Typhimurium e Escherichia coli) e gram-positivas (Listeria
monocytogenes e Staphylococcus aureus), normalmente encontradas em surtos de
enfermidades causadas pela ingestão de alimentos contaminados. Na avaliação da atividade
antibacteriana pelo teste de antibiograma foi observada maior atividade dos diterpenos ácidos,
onde foi obtido um halo de inibição de 10 mm para a bactéria S. aureus, sendo assim, também
foi realizada para essa classe a avaliação da concentração inibitória mínina (CIM), obtendo
um valor de CIM de 20 g/mL para L. monocytogenes e 6.250 g/mL para S. aureus. O
isolamento dos diterpenos ácidos foi realizado por CLAE-UV semipreparativa para posterior
avaliação da atividade antibacteriana dessas substâncias isoladamente. Na avaliação da CIM
para os diterpenos ácidos isolados foram testadas somente as bactérias gram-positivas, pois as
gram-negativas foram resistentes aos diterpenos ácidos nos testes preliminares. Para L.
monocytogenes o melhor resultado foi para o ácido copálico com CIM de 4 g/mL, seguido
do ácido agático com 15 g/mL. Já para S. aureus a substância mais ativa foi o ácido copálico
com CIM de 15 g/mL. Com base nesses dados podemos concluir que, dentre as classes de
substâncias avaliadas, os diterpenos ácidos foram os que mais apresentaram inibição para as
bactérias gram-positivas quando comparado às outras classes. Dentre as substâncias isoladas a
mais ativa, ou seja, a que apresentou os menores valores de CIM para as bactérias gram-
positivas L. monocytogenes e S. aureus foi o ácido copálico, confirmando assim a resistência
das bactérias gram-negativas aos óleos-resinas da espécie Copaifera devido à composição
química complexa da sua parede celular.
Palavra chave: Copaifera, ácido copálico, bactérias gram-positivas, alimentos contaminados.

Abstract
Copaifera oil-resin is considered one of the most important renewable natural remedies for
the indigenous peoples of the Amazon region and its use is widely diffused due to its diverse
pharmacological properties. The objective of this work was to isolate, characterize and
evaluate the antibacterial activity of the oil-resin constituents of Copaifera reticulata with
emphasis on acid diterpenes and investigate its chemical composition by gas chromatography.
The oil-resin of C. reticulata was fractionated by column chromatography on a silica gel
impregnated with KOH to obtain the three classes of substances, being sesquiterpene
hydrocarbons, oxygenated sesquiterpenes and acidic diterpenes. In order to evaluate the
antibacterial activity of the crude oil-resin of C. reticulata and of the three classes were used
groups of gram-negative (Salmonella Typhimurium and Escherichia coli O157:H7) and gram-
positive bacteria (Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus), usually found in
outbreaks of diseases caused by the ingestion of contaminated food. In the evaluation of the
antibacterial activity by the antibiogram test it was observed a higher activity of the acid
diterpenes, where a halo of inhibition of 10 mm was obtained for the S. aureus. In this way, it
was also performed for this class the evaluation of the minimum inhibitory concentration
(MIC), obtaining a MIC of 20 μg/mL for L. monocytogenes and 6,250 μg/mL for S. aureus.
The isolation of acid diterpenes was performed by semipreparative HPLC-UV for subsequent
evaluation of the antibacterial activity of these substances alone. In the evaluation of CIM for
acidic diterpenes alone, only gram-positivebacteria were tested, since gram-negative bacteria
were resistant to acid diterpenes in the preliminary tests. For L. monocytogenes, the best result
was for the copalic acid with a MIC of 4 μg/mL, followed by agathic acid with 15 g/mL. For
S. aureus, the most active substance was copalic acid with MIC of 15 μg/mL MIC. Based on
these data, it can be concluded that, among the classes of substances evaluated, acid
diterpenes presented the most inhibition for gram-positive bacteria when compared to other
classes. Among the most active isolates, that is, the one with the lowest MIC values for the
gram-positive bacteria L. monocytogenes and S. aureus was the copalic acid, thus confirming
the resistance of gram-negative bacteria to the resin-resins of the Copaifera species due to the
complex chemical composition of its cell wall.
Keyword: Copaifera, copalic acid, gram-positive bacteria, contaminated food.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Exsicata das folhas da espécie Copaifera.................................................................19
Figura 2. Método utilizado para coleta do óleo-resina de troncos de Copaifera. (A) Abertura
de um orifício no tronco usando uma broca de madeira; (B) Introdução de uma calha de aço
inoxidável para captura de óleo-resina; (C) Fechamento do orifício do tronco com tubo de
PVC e tampa de rosca; (D) Abertura da tampa do tubo de PVC para coleta do óleo-resina após
a primeira coleta........................................................................................................................21
Figura 3. Árvore da espécie C. reticulata................................................................................22
Figura 4. Mapa ilustrativo com as regiões de ocorrência confirmada para a espécie C.
reticulata...................................................................................................................................23
Figura 5. Principais sesquiterpenos encontrados em óleo-resina de copaíba..........................28
Figura 6. Esqueletos diterpênicos encontrados no óleo-resina de copaíba..............................29
Figura 7. Principais diterpenos encontrados em óleo-resina de copaíba.................................29
Figura 8. Biossíntese de terpenos para a formação da unidade do isopreno (IPP) pela via do
mevalonato................................................................................................................................31
Figura 9. Biossíntese de terpenos pela via do metileritritol fosfato.........................................32
Figura 10. Formação das diferentes classes de terpenos a partir do IPP e DMAPP................33
Figura 11. Ciclização do GGPP e formação do esqueleto do labdano e ent-labdano..............34
Figura 12. Mecanismo de formação do esqueleto ent-caurano, por meio de reações de
formação de carbocátions..........................................................................................................35
Figura 13. Representação da parede celular das bactérias gram-negativas e gram-
positivas....................................................................................................................................42
Figura 14. Placa de ágar contendo discos de papel-filtro para o teste de antibiograma..........44
Figura 15. Placa de plástico estéril com 96 poços para o teste da CIM...................................45
Figura 16. Redução da resazurina para resorufina na presença de células vivas.....................45

Figura 17. Fluxograma da cromatografia em coluna de gel de sílica impregnada com KOH do
óleo-resina de C. reticulata.......................................................................................................50
Figura 18. Fluxograma da extração dos diterpenos ácidos, após cromatografia em coluna de
gel de sílica impregnada com KOH do óleo-resina de C. reticulata........................................51
Figura 19. Metodologia aplicada para derivatização do óleo-resina de C. reticulata com
BF3/MeOH, conforme proposto por Metcalf et al. 1966.........................................................52
Figura 20. Fluxograma para avaliação da sensibilidade das bactérias testadas frente ao óleo-
resina bruto de C. reticulata e as frações obtidas após cromatografia em coluna de gel de
sílica impregnada com KOH.....................................................................................................58
Figura 21. Esquema da técnica para determinação da concentração mínima inibitória para
avaliação da atividade antibacteriana das frações e do óleo-resina de C. reticulata. As cores
diferentes nas duplas de linhas de A a F indicam inóculos diferentes.....................................59
Figura 22. Cromatograma do óleo-resina bruto de C. reticulata obtido por CG-EM com
coluna do tipo HP-17HT...........................................................................................................61
Figura 23. Cromatograma do óleo-resina bruto de C. reticulata derivatizado com BF3/MeOH
obtido por CG-EM com coluna do tipo HP-17HT....................................................................61
Figura 24. Reação de derivatização do ácido copálico com trifluoreto de boro em metanol
(BF3/MeOH).............................................................................................................................61
Figura 25. Cromatogramas das frações contendo os hidrocarbonetos sesquiterpênicos (A) e
sesquiterpenos oxigenados (B) obtido por CG-EM com coluna do tipo HP-5MS, referente ao
fracionamento por cromatografia em coluna de gel de sílica impregnada com KOH..............62
Figura 26. Cromatograma da fração contendo os diterpenos ácidos derivatizados com
BF3/MeOH obtido por CG-EM com coluna do tipo HP-17HT................................................66
Figura 27. Cromatograma normal (A) e expandido (B) da fração contendo os diterpenos
ácidos derivatizados com BF3/MeOH obtido por CG-EM com coluna do tipo HP-5MS,
referente ao fracionamento por cromatografia em coluna de gel de sílica impregnada com
KOH do óleo-resina de C. reticulata........................................................................................67
Figura 28. Cromatograma normal (C) e expandido (D) da fração contendo os diterpenos
ácidos derivatizados com diazometano obtido por CG-EM com coluna do tipo HP-5MS......68

Figura 29. CCF (Fase estacionária: cromatoplacas revestidas com gel de sílica; Fase móvel:
hexano e acetato de etila 7:3 (v/v); Revelador químico: ácido sulfúrico 10% e vanilina 1% em
etanol) das frações do óleo-resina de C. reticulata obtidas por cromatografia em coluna de gel
de sílica impregnada com KOH. FH: Fração em Hexano; FD: Fração em Diclorometano; FM:
Fração em Metanol....................................................................................................................70
Figura 30. Cromatograma do perfil geral da fração contendo os diterpenos ácidos obtido por
CLAE-UV semipreparativa com coluna preparativa Phenomenex 5 μm C18 e metanol 100 %
como fase móvel.......................................................................................................................71
Figura 31. Cromatograma referente ao reciclo de solvente para o isolamento dos diterpenos
ácidos obtido por CLAE-UV semipreparativa com coluna preparativa Phenomenex 5 μm C18
e metanol 100 % como fase móvel...........................................................................................72
Figura 32. Cromatograma e espectro de massa obtido por CG-EM com coluna do tipo HP-
17HT, referente ao pico 1 (ácido agático) isolado da fração contendo os diterpenos ácidos por
CLAE-UV semipreparativa ......................................................................................................73
Figura 33. Proposta de fragmentação do ácido agático conforme proposto por Pereira(2011)........................................................................................................................................74
Figura 34. Cromatograma e espectro de massa obtido por CG-EM com coluna do tipo HP-
17HT, referente ao pico 2 (ácido poliáltico) isolado da fração contendo os diterpenos ácidos
por CLAE-UV semipreparativa ...............................................................................................75
Figura 35. Proposta de fragmentação do ácido poliáltico........................................................76
Figura 36. Cromatograma referente a coeluição do ácido copálico e do ácido labdan-7, 13-
dien-15-óico e espectro de massa do ácido labdan-7, 13-dien-15-óico obtido por CG-EM com
coluna do tipo HP-17HT, referente ao pico 3 isolado da fração contendo os diterpenos ácidos
por CLAE-UV semipreparativa ...............................................................................................77
Figura 37. Proposta de fragmentação do ácido labdan-7, 13-dien-15-óico conforme proposto
por Pereira (2011).....................................................................................................................78
Figura 38. Cromatograma e espectro de massas obtido por CG-EM com coluna do tipo HP-
17HT referente ao ácido copálico presente na fração dos diterpenos ácidos isolados por
CLAE-UV semipreparativa.......................................................................................................79

Figura 39. Cromatograma e espectro de massa obtido por CG-EM com coluna do tipo HP-
17HT, referente ao pico 4 (ácido 3-hidróxi copálico) isolado da fração contendo os diterpenos
ácidos por CLAE-UV semipreparativa.....................................................................................80
Figura 40. Proposta de fragmentação do ácido 3- hidróxi copálico conforme proposto por
Pereira (2011)............................................................................................................................81
Figura 41. Espectro de RMN de 1H (DMSO-d6, 500,00 MHz) do ácido copálico.................84
Figura 42. Espectro de RMN de 13C (DMSO-d6, 500,00 MHz) do ácido copálico................84
Figura 43. Espectro de RMN de 1H (DMSO-d6, 500,00 MHz) do ácido agático...................86
Figura 44. Espectro de RMN de 13C (DMSO-d6, 500,00 MHz) do ácido agático..................87
Figura 45. Espectros de massas referentes ao cromatograma da fração contendo os diterpenos
ácidos (Figura 27) derivatizados com BF3/MeOH..................................................................110
Figura 46. Espectros de massas referentes ao cromatograma da fração contendo os diterpenos
ácidos (Figura 28) derivatizados com diazometano................................................................113
Figura 47. Espectros de RMN ampliados de 1H e 13C do ácido copálico..............................116
Figura 48. (A) Espectro COSY-H1 do ácido copálico total e (B e C) ampliação..................122
Figura 49. (A) Espectro HSQC do ácido copálico total e (B) ampliação..............................123
Figura 50. (A) Espectro HMBC do ácido copálico total e (B e C) ampliação......................124
Figura 51. Espectros de RMN ampliados de 1H e 13C do ácido ent-agático..........................126
Figura 52. (A) Espectro COSY-H1 do ácido ent-agático total e (B) ampliação....................131
Figura 53. (A) Espectro HSQC do ácido ent-agático total e (B e C) ampliação...................132
Figura 54. (A) Espectro HMBC do ácido ent-agático total e (B, C e D) ampliação.............133
Figura 55. Halos de inibição obtidos a partir do teste de antibiograma utilizando o óleo-resina
bruto, frações do óleo-resina, solvente DMSO e antibiótico de controle. D: DMSO; B: Óleo-
resina bruto; M: Fração em Metanol; H: Fração em Hexano; AMP: Ampicilina...................135

LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição e percentual das substâncias presentes na fração volátil do óleo-resina
de C. reticulata..........................................................................................................................24
Tabela 2. Distribuição da produção do óleo-resina de Copaifera no Brasil em 2016.............27
Tabela 3. Atividades biológicas descritas para o óleo-resina Copaifera................................40
Tabela 4. Composição química das frações contendo os hidrocarbonetos sesquiterpênicos e
os sesquiterpenos oxigenados obtidas a partir do fracionamento do óleo-resina de C.
reticulata...................................................................................................................................63
Tabela 5. Percentual dos constituintes majoritários da fração volátil do óleo-resina de C.
reticulata...................................................................................................................................64
Tabela 6. Composição química da fração contendo os diterpenos ácidos derivatizados com
BF3/MeOH................................................................................................................................67
Tabela 7. Composição química da fração contendo os diterpenos ácidos derivatizados com
diazometano..............................................................................................................................68
Tabela 8. Valores dos deslocamentos químicos de RMN de 1H (500,0 MHz) e 13C (500,0
MHz) do ácido copálico ( em ppm, relativos ao TMS; solvente DMSO-d6) e a comparação
com a literatura..........................................................................................................................82
Tabela 9. Valores dos deslocamentos químicos de RMN de 1H (500,0 MHz) e 13C (500,0
MHz) do ácido ent-agático ( em ppm, relativos ao TMS; solvente DMSO-d6) e a
comparação com a literatura.....................................................................................................85
Tabela 10. Halos de inibição do crescimento (mm) para as bactérias testadas frente ao óleo-
resina bruto e as frações de C. reticulata..................................................................................88
Tabela 11. Resultado da CIM (g/mL) para o óleo-resina bruto de C. reticulata, para a fração
os sesquiterpenos oxigenados, os diterpenos ácidos e a comparação com a literatura.............90
Tabela 12. Resultado da CIM (g/mL) para os diterpenos isolados por CLAE-UV
semipreparativa frente as bactérias testadas..............................................................................91
Tabela 13. Valores dos deslocamentos químicos de RMN de 1H (500,0 MHz) e 13C (500,0
MHz) do ácido copálico ( em ppm, relativos ao TMS; solvente DMSO-d6).......................119

Tabela 14. Valores dos deslocamentos químicos de RMN de 1H (500,0 MHz) e 13C (500,0
MHz) do ácido ent-agático ( em ppm, relativos ao TMS; solvente DMSO-
d6)...........................................................................................................................................128

ABREVIATURAS
AMP Ampicilina
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC American Type Culture Collection (Coleção de cultura americana)
BF3 Trifluoreto de boro
BF3/MeOH Trifluoreto de boro em metanol
BHI Brain Heart Infusion (Infusão de coração e cérebro)
BLEE Betalactamases de Espectro Estendido
CBM Concentração Bactericida Mínima
CCF Cromatografia em Camada Fina
CG-DIC Cromatografia Gasosa acoplada ao Detector de Ionização em Chama
CG-EM Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas
CIM Concentração Inibitória Mínima
CLAE-UV Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de Ultravioleta
CLAE-EM/EM Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de
Massas Sequencial
DAP Diâmetroà altura do peito
DMSO Dimetilsulfóxido
D.O Densidade Ótica
D.O.U Diário Oficial da União
eV Elétron-volt
FDA Food and Drug Administration
FD Fração em Diclorometano
FH Fração em Hexano

FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
FM Fração em Metanol
IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
INCQS Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
IRL Índice de Retenção Linear
mg Miligrama
mL Mililitro
mm Milímetro
NAD Nicotinamide adenine dinucleotide (Nicotinamida adenina dinucleotideo)
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards (Comitê Nacional para
Padrões de Laboratório Clínico)
NIST National Institute of Standards and Technology (Instituto Nacional de Padrões
e Tecnologia)
OMS Organização Mundial da Saúde
P.A Padrão Analítico
PLA poly (lactic acid) (poliácido lático)
PVC Policloreto de polivinila
RMN Ressonância Magnética Nuclear
UFC/mL Unidade Formadora de Colônia por mililitro

SUMÁRIO
1. Introdução...................................................................................................................18
2. Revisão bibliográfica....................................................................................................19
2.1. Gênero Copaifera........................................................................................................19
2.1.1. A espécie Copaifera reticulata Ducke......................................................................22
2.1.2. Óleo-resina...............................................................................................................24
2.1.3. Composição química do óleo-resina do gênero Copaifera...................................27
2.1.4. Fracionamento do óleo-resina................................................................................30
2.2. Biossíntese dos terpenos.............................................................................................31
2.2.1. Produtos naturais com atividade antibacteriana.................................................35
2.2.2. Atividade biológica do óleo-resina de Copaifera................................................. 37
2.3. Bactérias patogênicas de origem alimentar.............................................................41
2.3.1. Bactérias gram-positivas e gram-negativas..........................................................42
2.3.2. Resistência antimicrobiana....................................................................................43
2.4. Técnicas para avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos.............................43
2.4.1. Antibiograma...........................................................................................................43
2.4.2. Concentração Inibitória Mínima (CIM)...............................................................44
3.0. Objetivo.......................................................................................................................46
3.1. Objetivo geral.............................................................................................................46
3.2. Objetivos específicos..................................................................................................46
4.0. Materiais e equipamentos..........................................................................................47
5.0. Métodos.......................................................................................................................49
5.1. Dados da coleta do óleo-resina de C. reticulata........................................................49
5.2. Fracionamento do Óleo-resina de C. reticulata........................................................49
5.2.1. Cromatografia em coluna de gel de sílica impregnada com hidróxido de
potássio (KOH)..................................................................................................................49
5.2.2. Extração dos diterpenos ácidos..............................................................................50
5.3. Derivatização com trifluoreto de boro (BF3) e diazometano..................................51
5.4. Condições de Análise Cromatográfica do Óleo-resina de C. reticulata.................53
5.4.1. Cromatografia em Camada Fina (CCF)...............................................................53
5.4.2. Cromatografia Gasosa com Detector por Ionização em Chama (CG-DIC)......53
5.4.3. Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM).........53

5.4.4. Cromatografia Líquida semipreparativa de Alta Eficiência (CLAE)................54
5.4.5. Ressonância Magnética Nuclear (RMN)...............................................................54
5.4.6. Identificação dos compostos por CG.....................................................................56
5.5. Avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos.....................................................57
5.5.1. Materiais e local de análise.....................................................................................57
5.5.2. Antibiograma...........................................................................................................57
5.5.3. Concentração Inibitória Mínima (CIM)...............................................................58
6.0. Resultados e discussão...............................................................................................60
6.1. Análise da composição química do óleo-resina de C. reticulata por CG-EM e
cromatografia em coluna de gel de sílica impregnada com KOH...............................60
6.2. Cromatografia em Camada Fina (CCF)..................................................................70
6.3. Isolamento dos diterpenos ácidos por CLAE-UV semipreparativa......................71
6.4. Ressonância Magnética Nuclear de 1H e de 13C......................................................81
6.5. Atividade antibacteriana do óleo-resina de C. reticulata........................................87
6.5.1. Antibiograma...........................................................................................................87
6.5.2. Concentração Inibitória Mínima (CIM)...............................................................89
7.0. Conclusão....................................................................................................................93
8.0. Referências bibliográficas.........................................................................................94
9.0. Apêndice A. Espectros de massas referentes ao cromatograma da Fig. 27........110
10.0. Apêndice B. Espectros de massas referentes ao cromatograma da Figura
28.......................................................................................................................................113
11.0. Apêndice C. Espectros de RMN 1H e 13C ampliados e tabela com os
deslocamentos químicos do ácido copálico e ent-agático.............................................116
12.0. Apêndice D. Halos de inibição referentes ao teste de antibiograma..................135

1 Introdução
A Floresta Amazônica é amplamente reconhecida por sua riqueza em produtos florestais
não madeireiros e um grande número de espécies de plantas desse bioma tropical único são
utilizadas como fonte de óleos. Entre elas, a copaíba (Copaifera spp.) que fornece um óleo-
resina a partir de seus troncos, sendo este bastante comercializado na região amazônica
(MEDEIROS et al. 2018).
A coleta do óleo-resina de copaíba é uma importante fonte de renda para uma variedade
de povos tradicionais da Amazônia, com a atividade sendo regulamentada pela legislação
local, uma vez que as espécies de Copaifera são protegidas por lei (Decreto-Lei nº
25044/2005, estado do Amazonas, Brasil). Váriosestudos mostraram grandes variações na
quantidade de óleo-resina produzida entre espécies do gênero Copaifera, bem como entre
indivíduos da mesma espécie e população natural, variando de indivíduos altamente
produtivos àqueles que não produzem quantidades detectáveis de óleo-resina (MEDEIROS et
al. 2018).
Cardim e Cunha (1998) relatam que as propriedades medicinais do óleo da copaíba eram
bastante difundidas entre os índios latinos americanos na época em que os primeiros
exploradores europeus chegaram ao Brasil no século XVI. Ressalta ainda que o conhecimento
a respeito dessas propriedades surgiu provavelmente da observação do comportamento de
certos animais que, quando feridos, esfregavam-se nos troncos das copaibeiras para
cicatrizarem suas feridas.
Os produtos naturais são fontes de compostos que podem servir como agentes
antimicrobianos, podendo ser empregados na tentativa de superar a resistência a
antimicrobianos usados atualmente na terapia clínica. Assim, atenção tem sido dada para
plantas ricas em compostos bioativos conhecidos por suas propriedades antimicrobianas
(SIMÕES et al. 2010).

2 Revisão bibliográfica
2.1 Gênero Copaifera
A família Leguminosae Juss. é a terceira maior família de angiospermas, compreendendo
cerca de 727 gêneros e 19.325 espécies (LEWIS, 2005). Copaifera é um gênero pantropical
distribuído amplamente nas Américas, estendendo-se do México ao norte da Argentina, na
África Ocidental e na Ásia (ROSA e DA SILVA, 2009). Segundo disponível no International
Plant Names Index (2018), o gênero Copaifera possui registro de 90 espécies catalogadas.
Costa (2018) relata que o gênero Copaifera possui ocorrência confirmada no Brasil nas
regiões Norte (Acre, Amazonas, Amapá, Pará, Rondônia, Roraima, Tocantins), Nordeste
(Bahia, Ceará, Maranhão, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio Grande do Norte), Centro-Oeste
(Distrito Federal, Goiás, Mato Grosso do Sul, Mato Grosso), Sudeste (Espírito Santo, Minas
Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo) e Sul (Paraná, Rio Grande do Sul, Santa Catarina).
As copaibeiras são árvores de crescimento lento, alcançam de 25 a 40 metros de altura,
podendo viver até 400 anos (ARAÚJO JÚNIOR et al. 2005). O tronco é áspero, de coloração
escura, medindo de 0,4 a 4 metros de diâmetro. As folhas são alternadas, pecioladas e
penuladas (Figura 1). Os frutos contêm uma semente ovóide envolvida por um arilo e as
flores são pequenas, apétalas e hermafroditas (LORENZI, 1992).

Figura 1. Exsicata das folhas da espécie Copaifera.
Fonte: Herbario Virtual Austral Americano. Disponível em:
https://herbariovaa.org/imglib/neotrop/misc/201406/index_1403769568_web.jpg. Acesso em: 20 de jun. 2018.

Em relação ao grupo ecológico, as copaíbas são classificadas como espécies de vida
longa, exigindo luz, mas tolerante à sombra (CARVALHO, 2003). São consideradas
generalistas porque estão adaptadas a uma ampla variedade de ambientes, podendo ocorrer em
várzeas, matas ciliares, córregos da bacia amazônica e florestas do Cerrado no centro do
Brasil (SHANLEY et al. 2005). As espécies de Copaifera possuem grande flexibilidade em
relação às condições edáficas, pois ocorrem em áreas com solo fértil e bem drenado e em
áreas com solos ácidos muito pobres, como os campos do Cerrado, podendo também ter bom
crescimento em solos arenosos, argilosos e geralmente ocupam o dossel da floresta
(CARVALHO, 1994; RIGAMONTE AZEVEDO et al. 2004).
Embora o gênero Copaifera tenha sido extensivamente estudado taxonomicamente, ainda
existem dificuldades na identificação de algumas espécies, principalmente devido a sua
complexa morfologia floral e ausência de estruturas reprodutivas nas amostras estudadas.
Com relação às espécies amazônicas, a escassez de informações de campo compõe a principal
limitação para descrições botânicas do grupo. Esses problemas taxonômicos restringiram o
avanço das pesquisas químicas e farmacológicas, limitaram o uso industrial e racional do
óleo-resina e também dificultaram o desenvolvimento de projetos, planos de manejo
sustentável e conservação de espécies comercialmente visadas (MARTINS DA SILVA et al.
2008; SOARES et al. 2015).
As copaíbas são geralmente polinizadas por abelhas Apis mellifera e Trigona spp.
(CARVALHO, 1994). A dispersão das sementes de copaíba ocorre principalmente em formas
zoocórica, ou seja, quando as sementes são dispersas pelos animais, normalmente por aves e
roedores, ou barocórica quando os frutos caem por ação da gravidade (ALENCAR, 1982;
MUNIZ, 2008).
A produção de óleo-resina por espécie é bastante variável e pode ser influenciada por
diferenças genéticas entre espécies, habitat, solo e intensidade de exploração (PINTO et al.
2010).
Na literatura existem vários métodos relatados para a retirada do óleo-resina de copaíba,
porém a maioria não é recomendada, pois ocasiona a morte da árvore, como por exemplo,
através de cortes a machado no tronco. A única prática de coleta não agressiva é a realizada
através da incisão com um trado a cerca de 1 metro de altura do tronco (Figura 2), onde após a
coleta, o orifício é vedado para evitar a infestação da árvore por fungos ou cupins, podendo a
vedação ser facilmente retirada para futuras coletas no mesmo local (ALENCAR, 1982).

Figura 2. Método utilizado para coleta do óleo-resina de troncos de Copaifera. (A) Abertura de um orifício no
tronco usando uma broca de madeira; (B) Introdução de uma calha de aço inoxidável para captura de óleo-resina;
(C) Fechamento do orifício do tronco com tubo de PVC e tampa de rosca. Fonte: Adaptado de Medeiros et al.
2018.

A prática de extração do óleo-resina possui alguns obstáculos, pois o produto de várias
árvores é frequentemente misturado, dificultando assim a identificação botânica do óleo-
resina das copaíbas. Além disso, a falta de parâmetros botânicos para caracterizar o óleo-
resina e realizar o seu controle de qualidade constitui um obstáculo para o registro e
exportação de produtos fitoterápicos contendo copaíba (PIERI et al. 2009).
O volume médio de óleo-resina obtido por cada árvore pode variar de 0,3 a 3 litros,
dependendo da espécie e condições às quais está submetida e referente a coletas consecutivas.
Não há estudos definitivos sobre o tempo necessário para uma copaibeira recompor o óleo-
resina extraído. Em algumas árvores da espécie Copaifera não é possível retirar o óleo-resina,
porém não existem estudos precisos da média de árvores efetivamente fornecedoras de óleo-
resina, o que pode variar de acordo com as características do solo, clima e espécie
(RIGAMONTE AZEVEDO et al. 2004).
O perfil químico do óleo-resina pode variar de acordo com as espécies, características
sazonais e climáticas do ambiente, tipo e composição do solo e índice pluviométrico entre
outros. Pressões bióticas, como predação de insetos e infecção por patógenos, também causam
diferenças na composição do óleo-resina (BARBOSA et al. 2012).
As características químicas do óleo-resina, tais como baixa viscosidade e acidez são
importantes para o processamento farmacêutico, pois contribuem para a consistência das
formulações. Em contraste, a elevada viscosidade e acidez são importantes para a indústria de
cosmético, como na produção de sabonetes, xampus e condicionadores (VEIGA JUNIOR &
PINTO, 2002; CASCON, 2004).

2.1.1 A espécie Copaifera reticulata Ducke
Copaifera reticulata é uma árvore nativa das regiões tropicais da América do Sul e
considerada uma árvore de porte médio, sendo conhecida popularmente como copaibeira e
pau d'óleo (CORREA, 1984).
A espécie C. reticulata Ducke (Figura 3) é encontrada ao norte da Amazônia ocidental na
região que se estende até a Venezuela. Produz um óleo-resina de aspecto líquido, fino, odor
fraco e de coloração amarelo-dourada (73,3% das plantas), mas com variações (amarelo-
média, 16,7%; amarelo-clara,10%) (BARBOSA et al. 2009; SILVA et al. 2012a).

Figura 3. Árvore da espécie C. reticulata.
Fonte: Flickr. Disponível em: https://www.flickr.com/photos/mauroguanandi/1375091702. Acesso em: 05 de
abr. 2018.

No Brasil, a espécie C. reticulata possui ocorrência confirmada nas regiões Norte
(Amapá, Pará, Roraima) e Centro-Oeste (Mato Grosso), conforme o mapa ilustrado na Figura
4 (COSTA, 2018).

Figura 4. Mapa ilustrativo com as regiões de ocorrência confirmada para a espécie C. reticulata.
Fonte: Copaifera in Flora do Brasil 2020 em construção. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Disponível
em: <http://reflora.jbrj.gov.br/reflora/floradobrasil/FB22899>. Acesso em: 09 de Junho de 2018.

Herrero-Jáuregui et al. (2011) analisaram a composição química do óleo-resina de C.
reticulata e sua variabilidade relacionada à sazonalidade (estações seca e chuvosa), às
sucessivas extrações e a vários fatores associados à morfometria, doenças e à estrutura da
vegetação circundante. Para cada árvore, variáveis morfométricas como a presença de cupins,
vinhas e buracos, bem como o tipo de solo e a estrutura da vegetação circundante, foram
registrados. Os resultados mostraram alta variabilidade intrapopulacional na composição e
concentração dos hidrocarbonetos sesquiterpênicos, sendo esta comparável à variabilidade
interespecífica. Ressalta ainda que não foi possível determinar uma clara influência de fatores
ambientais, morfométricos e estruturais na composição do óleo-resina, embora alguns
compostos variassem de acordo com o tipo de solo, volume do óleo-resina extraído e a
superfície da coroa.
Bardají et al. (2016) relataram que o rendimento da fração volátil obtido por
hidrodestilação para o óleo-resina bruto de C. reticulata foi de 59% em peso, ressaltaram
ainda que a fração volátil foi analisada pela técnica de cromatografia gasosa acoplada a
espectrometria de massas onde foi identificado um total de 18 compostos, cujos principais
constituintes foram -bisaboleno (24,9%), trans--bergamoteno (21,9%), -selineno (12,1%)
e -selineno (11,4%). Já Ziech et al. (2013) relataram que foi possível detectar 24 compostos
voláteis no óleo-resina de C. reticulata utilizando somente a técnica de cromatografia gasosa
acoplada a espectrometria de massas, onde os principais constituintes foram os sesquiterpenos
β-cariofileno (37,6%), β-bisaboleno (14%) e (E)--bergamoteno (9,3%) (Tabela 1).

Tabela 1. Composição e percentual das substâncias presentes na fração volátil do óleo-resina de C. reticulata.

Referência: a Bardají et al. 2016; b Ziech et al. 2013.
a, b: Calculado a partir da área do pico em relação à área total do pico.

2.1.2 Óleo-resina
A designação correta para o óleo da copaíba é a de óleo-resina, por ser um exsudato
constituído por compostos voláteis e ácidos resinosos. Também é chamado, erroneamente, de
bálsamo de copaíba, apesar de não ser um bálsamo verdadeiro, pois não contêm derivados do
ácido benzóico ou cinâmico (BRUNETON, 1991).
Em 1972, o óleo-resina foi aprovado como agente flavorizante pelo Food and Drug
Administration (FDA) e pelo Food Chemicals Codex (FCC) após avaliação de sua segurança
(FCC, 1972).
Composto Conteúdo (%)
a Conteúdo (%)b
cicloisosativeno 0,3 -
-copaeno 0,3 0,5
epi-sesquitujeno 0,5 -
-elemeno 2,5 3,3
-gurjuneno 1,3 0,4
-santaleno 0,3 -
trans--cariofileno 7,7 37,6
trans--bergamoteno 21,9 9,3
aristoleno 1,0 -
epi--santaleno 0,1 0,1
-fameseno 3,9 -
-chamigreno 1,5 0,9
-selineno 12,1 4,9
-selineno 11,4 3,1
-bisaboleno 24,9 13,9
-sesquifelandreno 2,7 1,1
óxido de cariofileno 0,2 0,2
-bisabolol 0,1 -
-humuleno + (E)--farneseno - 5,3
-bulneseno - 2,1
(Z)--bisaboleno - 1,8
(E)--bisaboleno - 1,3
aromadendreno - 0,9
ciclosativeno - 0,9
-curcumeno - 0,6
−gurjuneno - 0,6
−curcumeno - 0,4
−bisabolol - 0,2
−elemeno - 0,2
epi−−bisabolol - 0,1

Burdock (2010) relata que as espécies comercialmente mais importantes de Copaifera são
a C. reticulata Ducke, C. guayanensis Benth, C. multijuga Hayne, C. officinalis L., C. martii
var. rigida e C. coriacea. Todas estas espécies consistem em árvores altamente ramificadas
que crescem nas regiões do norte da América do Sul (Brasil, Venezuela e Colômbia). As
árvores produzem um óleo-resina que se acumula nos bolsos da mesma e são coletados
fazendo furos no tronco. Este óleo-resina possui um odor aromático característico, sendo
ligeiramente amargo e com um sabor picante.
O óleo-resina contribui ativamente para a saúde das árvores, portanto, um regime regular
de coleta pode reduzir o tempo de vida das árvores envolvidas. No entanto, não é possível
confirmar que a mortalidade é causada exclusivamente pela coleta dos óleos-resinas, pois em
determinados locais é comum encontrar árvores caídas devido a fortes ventos e/ou fortes
chuvas (PLOWDEN, 2003). As coletas sucessivas do óleo-resina durante curtos períodos
podem enfraquecer os troncos, tornando-os mais suscetíveis à ação de ventos e fortes chuvas,
já que a extração conduzida de forma inadequada é frequentemente responsável por fornecer
pontos de entrada para patógenos (WIEDENHOEFT, 2005).
Lindenmayer et al. (2000) e Plowden (2003) relatam que ainda não foi comprovado se a
formação de cavidades nos troncos de Copaifera ocorre pela redução da produção e do
armazenamento do óleo-resina em árvores muito antigas, porém ressaltam que esse fato pode
ocorrer porque os óleos-resinas impedem a deterioração causada por cupins e fungos que
podem ser responsáveis pela decomposição do núcleo e pela conseqüente formação de
cavidades no interior do tronco.
O processo de renovação do óleo-resina leva muitos anos, de modo que o tempo
necessário para produzir um novo volume próximo ao obtido na primeira coleta pode exigir
um longo prazo, além disso, a grande diversidade de árvores em diferentes idades, estágios
fisiológicos e diversidade genética dificultam a definição de um intervalo de tempo específico
entre as coletas (MARTINS et al. 2013). Entretanto, é possível estimar um intervalo mínimo
entre as coletas sucessivas que forneceriam uma quantidade comercialmente satisfatória de
óleo-resina. Embora Newton et al. (2011) sugeriram que a produção de óleo-resina deveria ser
um processo anual, Klauberg et al. (2014), estudando diferentes ciclos de produção
envolvendo diferentes espécies de copaíba, concluíram que um intervalo de três anos é viável
em termos de produção de óleo-resina.

De acordo com o conhecimento tradicional de seringueiros de diferentes localidades do
estado do Amazonas, o óleo-resina de copaíba não é coletado durante a estação seca porque
relatam que “estão secos” (ou seja, não produtivos), isso ocorre porque algum mecanismo
fisiológico interno permite a retenção do óleo-resina pela árvore durante a estação seca,
podendo influenciar diretamente na redução do volume do óleo-resina no momento da coleta
(MEDEIROS et al. 2018). Acredita-se que a cessação da produção do óleo-resina pode
ocorrer quando uma árvore torna-se senescente, fase freqüentemente associada ao declínio
fisiológico (ROQUETTE, 2014; THOMAS, 2013).
Embora seja difícil distinguir os efeitos da idade dos efeitos de tamanho e variações
ambientais associados à senescência, ou separar as interações entre eles, o tamanho individual
pode ter influência significativa na função fisiológica das árvores mais antigas. Porém, além
da idade da árvore outros fatores como o estresse competitivo pode influenciar a cessação da
produção do óleo-resina, como por exemplo, quando plantas vicinais utilizam a mesma
quantidade de luz, íons de nutrientes minerais e moléculas de aguá, podendo esse fator alterar
a fisiologia das árvores, levando em consideração que a produção do óleo-resina depende de
substâncias que são produzidas fotossinteticamente(BOND, 2000; THOMAS, 2013).
Boas práticas de manejo podem ser adotadas para garantir um sistema de produção de
óleo-resina duradouro, associando a viabilidade econômica e ecológica. Isso incluiria
características como o uso de um diâmetro mínimo do tronco da árvore DAP (Diâmetro à
Altura do Peito) ≥ 45 cm para a coleta do óleo-resina inicial, restringir a coleta até o final da
estação chuvosa e o uso de técnicas de coleta de baixo impacto para a árvore. Respeitando
essas condições, é possível aproveitar ao máximo a vida produtiva de uma determinada
árvore, até que ela entre na fase de senescência (MEDEIROS et al. 2018).
Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) em 2016, foram
produzidas 166 toneladas de óleo-resina de copaíba, sendo essa produção concentrada
principalmente na região Norte do Brasil, em destaque para o estado do Amazonas com a
produção de 142 toneladas do óleo-resina conforme Tabela 2 (IBGE, 2016).

Tabela 2. Distribuição da produção do óleo-resina de Copaifera no Brasil em 2016.

Fonte: IBGE, 2016.

2.1.3 Composição química do óleo-resina do gênero Copaifera
Quimicamente, o óleo-resina é composto por sesquiterpenos e por uma parte sólida
resinosa não volátil formada por ácidos diterpênicos, sendo os sesquiterpenos
majoritariamente responsáveis pelo aroma e pela atividade anti-inflamatória (BARRETO
JUNIOR et al. 2005; RIGAMONTE AZEVEDO et al. 2004) e os ácidos diterpênicos pela
atividade antitumoral (OHSAKI, 1994) e ação anti-inflamatória e cicatrizante (BARDAJÍ et
al. 2016).
Conforme Leandro et al. (2012), muitos estudos demonstraram que os sesquiterpenos são
usualmente as principais substâncias presentes nos óleos-resinas de copaíba, podendo ser
responsáveis por até 90% de sua composição. Seu efeito farmacológico não pode ser atribuído
a apenas um constituinte, pois os constituintes presentes no óleo-resina podem interagir
sinergicamente na promoção da atividade observada.
Os principais sesquiterpenos encontrados nos óleos-resinas de copaíba são: β-cariofileno,
óxido de cariofileno, α-humuleno, δ-cadineno, α-cadinol, α-cubebeno, α e β-selineno, β-
elemeno, trans-α-bergamoteno e β-bisaboleno (Figura 5) (LEANDRO et al. 2012; PINTO et
al. 2000).

Estado Óleo-resina (toneladas)
Rondônia 8
Amazonas 142
Pará 15
Mato Grosso 1

Figura 5. Principais sesquiterpenos encontrados em óleo-resina de copaíba.
Fonte: Leandro et al. 2012.

De acordo com Pinto et al. (2000), os óleos-resinas de Copaifera são compostos por uma
grande quantidade de sesquiterpenos hidrocarbonetos, sendo o principal constituinte o β-
cariofileno, encontrado como um dos mais abundantes sesquiterpenos nesse gênero.
O β-cariofileno possui uma variedade de atividades biológicas, incluindo antioxidante
devido a presença das duas ligações duplas trans e anti-inflamatória. Além disso, devido ao
seu odor amadeirado e picante, é comumente usado como um agente aromatizante (SKOLD et
al. 2006; YOUNG et al. 2007).
Os diterpenos encontrados nos óleos-resinas de copaíba apresentam estrutura de
esqueletos caurano, labdano e clerodano (Figura 6). Em estudo realizado com diversos óleos-
resinas de copaíba provenientes de várias regiões do Brasil, o ácido copálico foi o único
encontrado em todos os óleos-resinas analisados (VEIGA JUNIOR et al. 1997), sendo
-cariofileno óxido de cariofileno -humuleno -cadineno
-cadinol -elemeno
-selineno
-cubebeno
trans--bergamoteno -selineno
-bisaboleno

considerado um biomarcador para o gênero Copaifera e alguns estudos foram realizados para
avaliar a atividade antibacteriana desta substância (TINCUSI et al. 2002).

Figura 6. Esqueletos diterpênicos encontrados nos óleos-resinas de copaíba.
Fonte: Veiga Junior et al. 1997.

Os diterpenos ácidos ou ácidos diterpênicos mais comumente encontrados nos óleos-
resinas de copaíba são os ácidos copálico, poliáltico, hardwíckiico, caurenóico, 3-hidróxi-
copálico, 3-acetóxi-copálico e ent-agático (Figura 7) (TINCUSI et al. 2002).

Figura 7. Principais diterpenos encontrados em óleo-resina de copaíba.
Fonte: Tincusi et al. 2002.

Ácido copálico Ácido ent-agático
Ácido caurenóico Ácido poliáltico Ácido hardwickiico
Ácido 3-hidróxi-copálico
Ácido 3-acetóxi copálico
Caurano Clerodano Labdano

Gelmini et al. (2013) estudaram os compostos não voláteis presentes na fração resinosa
do óleo-resina de C. langsdorffii Desf., onde após análise por cromatografia gasosa acoplada a
espectrometria de massas evidenciaram a presença de 44,7% de ácidos diterpênicos, 31,7% de
sesquiterpenos, 1,2% de fitohormônios, 3,8% de ácidos graxos e 5,6% de diterpenos. Dos
ácidos diterpênicos identificados, destacaram-se os ácidos copálico, abiético, daniélico,
lambertiano, labd-7-en-15-óico, pimárico, isopimárico e kaur-16-en-18-óico.
2.1.4 Fracionamento do óleo-resina
O processo de separação de produtos naturais corresponde, no geral, a três fases
principais: extração a partir da matéria vegetal, fracionamento do extrato ou óleo e purificação
do(s) princípio(s) ativo(s). Em escala de laboratório, a cromatografia em gel de sílica é a
técnica mais utilizada para a separação de compostos, porém variações desta técnica têm sido
apresentadas na literatura, como a adaptação realizada por Pinto e colaboradores (1997) da
metodologia originalmente desenvolvida por McCarthy e Duthie (1962), utilizando
cromatografia com sílica impregnada em hidróxido de potássio (KOH) (BARRETO Jr et al.
2005).
Quando as moléculas que se deseja isolar são substâncias ácidas ou básicas, a utilização
de resinas de troca iônica pode ser uma excelente alternativa. Vários inconvenientes das
extrações líquido-líquido e ácido-base podem ser minimizados usando a cromatografia de
troca iônica, como por exemplo, a formação de emulsões de difícil separação, que
comprometem a eficiência do processo de partição e limitação no uso do solvente de extração,
já que os dois líquidos devem ser imiscíveis (BARRETO Jr et al. 2005).
Pinto et al. (2000) analisaram uma fração contendo diterpenos ácidos isolados a partir do
óleo-resina bruto de C. cearensis por cromatografia flash em gel de sílica impregnada com
hidróxido de potássio (KOH), onde os componentes desta fração foram identificados por
cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas e posterior fracionamento por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) semipreparativa de fase reversa para
identificar os constituintes ácidos. Ressaltaram ainda que após análise da sílica impregnada
com KOH pela técnica de infravermelho, os resultados demostraram que o efeito geral da
lavagem da sílica com KOH foi diminuir a área de superfície com deposição de KOH na
superfície da sílica, além da formação de Si-OK devido a um processo de troca de cátions.

2.2 Biossíntese dos terpenos
Os terpenos abrangem uma ampla variedade de substâncias de origem vegetal, que
apresentam grande importância ecológica como defensores de plantas, pois podem ser
fabricados em resposta a herbívoros ou a fatores de estresse (ZWENGER e BASU, 2008).
De acordo com Dewick (2002), os terpenos são formados através de unidades de
isopreno, que por sua vez, originam-se da condensação de isopentenil difosfato (IPP) e do
dimetilalil difosfato (DMAPP). A síntese do IPP e do DMAPP pode ocorrer pela via
mevalonato (Figura 8), na qual três moléculas de acetil-CoA são usadas para formar o ácido
mevalônico e pela via do metileritritol fosfato (2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato), que tem início
com a tiamina difosfato e ácido pirúvico, conforme Figuras 9.

Figura 8. Biossíntese de terpenos para a formação daunidade do isopreno (IPP) pela via do mevalonato.
Fonte: Dewick (2002).

Figura 9. Biossíntese de terpenos pela via do metileritritol fosfato.
Fonte: Dewick (2002).

As unidades isoprênicas DMAPP (dimetilalil difosfato) e IPP (isopentenil difosfato) são
consideradas básicas para a formação dos terpenos, a reação “cabeça-calda” dessas unidades

produz o geranil difosfato (GPP), precursor dos monoterpenos (C10). Novas ligações entre a
molécula de IPP e o precursor GPP resultam na formação do farnesil difosfato (FPP),
precursor dos sesquiterpenos (C15) e diterpenos (C20). O FPP, por sua vez, dá origem ao
esqualeno que é o precursor dos triterpenos (C30) e esteroides (C27), através da ligação
“cabeça-cabeça” conforme Figura 10 (DEWICK, 2002).

Figura 10. Formação das diferentes classes de terpenos a partir do IPP e DMAPP.
Fonte: Dewick (2002).

O principal modo de ciclização do GGPP (geranilgeranil difosfato) inicia-se com a
protonação da ligação dupla isopropilideno terminal, conduzindo à formação de compostos
bicíclicos. Este tipo de ciclização conduz a duas séries enantioméricas, dependendo da
configuração dos carbonos 5, 9 e 10, onde após a fusão dos anéis A e B ocorre a formação do
esqueleto labdano e quando essa fusão ocorre de uma forma inversa é formado o esqueleto
ent-labdano conforme Figura 11 (BRUNETON, 1993).

Figura 11. Ciclização do GGPP e formação do esqueleto do labdano e ent-labdano.
Fonte: Bruneton (1993).

Para a formação de diterpenos do tipo caurano é proposto o mecanismo de reação
conforme a Figura 12, onde inicialmente ocorre a perda de uma molécula de pirofosfato pelo
ent-CPP, seguido de ciclização, dando origem ao carbocátion pimarenila (A). Este por sua
vez, passa pela ciclização cátion-alceno, levando à formação de um carbocátion secundário, o
cátion beieranila (B), o qual é o precursor dos beieranos e também é um ponto de ramificação
fundamental nas etapas que levam aos cauranos. Um deslocamento alquila (C12 migrando de
C16 a C13) em (B) leva ao cátion cauranila (C), que é o precursor dos cauranos (HONG e
TANTILLO, 2014).

Figura 12. Mecanismo de formação do esqueleto ent-caurano, por meio de reações de formação de carbocátions.
Fonte: Hong e Tantillo (2014).
2.2.1. Produtos naturais com atividade antibacteriana
Os fitoquímicos são componentes vegetais não nutritivos que conferem propriedades
organolépticas e que podem ser utilizados como agentes antimicrobianos. A concentração,
composição, estrutura e os grupos funcionais desses fitoquímicos desempenham um papel
importante na determinação da atividade antimicrobiana. (HOLLEY e PATEL, 2005). Os
compostos fenólicos são geralmente os mais eficazes e com base em suas estruturas químicas
podem ser divididos em diferentes categorias, incluindo compostos fenólicos simples,
flavonóides, quinonas, taninos e cumarinas. Os fitoquímicos mais importantes usados como
conservantes de alimentos são os óleos essenciais, que têm sido utilizados pelos seres
humanos nos continentes desde os tempos antigos (NEGI, 2012).

Os alcalóides, que são considerados uma importante classe de produtos naturais possuem
propriedades antimicrobianas potentes, como exemplo desta classe, a morfina isolada de
Papaver somniferum, que provavelmente foi o primeiro alcalóide relatado com importância
medicinal, assim como outros alcalóides provenientes de fontes naturais podem, portanto, ser
um bom substituto para os medicamentos já existentes (OMULOKOLI et al. 1997).
As propriedades antifúngicas e antimicrobianas dos ácidos graxos são conhecidas há
séculos. Em comparação com ácidos graxos saturados, os ácidos graxos insaturados com
ligações duplas e/ou triplas são, em geral, mais potentes contra patógenos fúngicos
(GERSHON e SHANKS, 1978). Embora o modo de ação desses compostos ainda não tenha
sido totalmente elucidado, Kenny et al. 2009 analisaram o modo de ação dos ácidos graxos
insaturados de cadeia longa em S. aureus, onde afirmaram que a atividade dessa classe está
relacionada ao rompimento da membrana celular, levando à interferência na produção de
energia dentro da célula bacteriana.
Outra classe importante de produtos naturais são as cumarinas, que são amplamente
distribuídas em membros da família Rutaceae. A 7-amino-4-metilcumarina isolado da espécie
Ginkgo biloba possui atividades antibacterianas de largo espectro contra Staphylococcus
aureus, Escherichia coli (CIM ambos de 10 g/mL), Salmonella Typhimurium (CIM 15
g/mL), Salmonella enteritidis (CIM 8,5 g/mL) (LIU et al. 2008).
Os flavonóides são uma das maiores classes de metabólitos secundários e estão
distribuídos em várias espécies de plantas, sendo considerados agentes antimicrobianos
potentes. A apigenina, um fitoquímico comum, foi identificado a partir de Scutellaria barbata
(Lamiaceae) e exibiu uma atividade potente com um valor de CIM entre 3,9 - 15,6 g/ml)
contra 20 cepas de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (SATO et al. 2000).
A atividade antimicrobiana de compostos fenólicos de plantas tem sido intensamente
estudada e, além de controlar a invasão e o crescimento de fitopatógenos, sua atividade contra
patógenos humanos tem sido investigada para caracterizar e desenvolver novos produtos
farmacêuticos (PUUPPONEN-PIMIA et al. 2005).
Os terpenóides contêm elementos adicionais, como o oxigênio, e conferem atividade
contra bactérias, fungos, protozoários e vírus (COWAN, 1999). Como exemplo desta classe,
temos os óleos essenciais que possuem efeitos antiinflamatórios, bactericidas, antivirais e
anticancerígenos (ABURJAI e NATSHEH, 2003). Delaquis et al. 2002 determinaram que o

óleo essencial de coentro era particularmente eficaz contra Listeria monocytogenes,
potencialmente por causa dos alcoóis de cadeia longa e aldeídos, uma vez que as propriedades
antimicrobianas dos alcoóis aumentam com o peso molecular.
Seow et al. 2014 relataram que, devido a presença de grupos altamente diversificados de
fitoquímicos em óleos essenciais, sua atividade antimicrobiana têm sido sugerida para
envolver múltiplos alvos. As características únicas de hidrofobicidade dos óleos essenciais
permitem interagir com os lipídios nas membranas das células bacterianas, aumentando a
permeabilidade da membrana e modificando a estrutura celular original (KNOBLOCH et al.
1986; SIKKEMA et al. 1994). O diterpeno labdano, óxido de 6- maloniloximanoíla, isolado
das partes aéreas de Stemodia foliosa, inibiu o crescimento de S. aureus, Bacillus cereus, B.
subtilis e Mycobacterium smegmatis com MICs de 7.0 - 15,0 g/mL. Já o ácido hardwickiico,
obtido através da casca do caule de Irvingia gabonensis, exibiu atividade potente contra cinco
bactérias gram-negativas e quatro gram-positivas, com valores de MIC de 1,22 - 4,8 g/mL
(KUETE et al. 2007; DA SILVA et al. 2008).
2.2.2. Atividade biológica do óleo-resina de Copaifera
O óleo-resina de copaíba obtido do gênero Copaifera L., é largamente utilizado na
medicina popular como antiinflamatório, antimicrobiano e antitumoral, porém, informações
sobre seu potencial tóxico são escassos na literatura. Para analisar a toxicidade oral aguda e os
possíveis efeitos neurotóxicos relacionados à ingestão do óleo-resina de C. reticulata em ratos
saudáveis, foi administrado por gavagem doses de 300 e 2000 mg/kg de peso corporal de
óleo-resina. Os resultados obtidos mostraram que nestas doses não houve sinais clínicos de
toxicidade ou neurotoxicidade, alteração no consumo de ração ou alteração no peso corpóreo,
indicando assim que existe uma relativa margem de segurançapara o uso do óleo-resina de
copaíba como agente terapêutico (SACHETTI et al. 2009).
A atividade antibacteriana do óleo-resina da espécie Copaifera parece estar relacionada à
combinação de sesquiterpenos e diterpenos ácidos, que afetam a integridade da parede celular
bacteriana (SANTOS et al. 2008a; SANTOS et al. 2013). Esta ação foi demonstrada em
muitos patógenos, incluindo gram-negativos e, principalmente, bactérias gram-positivas,
como Staphylococcus spp. (ALENCAR et al. 2015).
Ziech et al. (2013) investigaram o potencial antimicrobiano da fração volátil do óleo-
resina de C. reticulata Ducke em isolados de Staphylococcus coagulase positiva provenientes

de casos de otite externa em cães. O método de microdiluição em caldo foi utilizado para
determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima
(CBM) e a determinação da composição química do óleo-resina de copaíba foi realizada por
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas, sendo o β-cariofileno, β-
bisaboleno e (E)--bergamoteno identificados como os compostos majoritários. O óleo-resina
de copaíba demonstrou CIM90 de 0,1 mg/mL e CBM90 de 1,3 mg/mL, com isso a atividade
antimicrobiana foi evidenciada nos resultados de CIM e CBM, com eficácia demonstrada em
concentrações inferiores a 2,6 mg/mL.
Morelli et al. (2015) estudou as propriedades antibacterianas do óleo-resina de Copaifera
multijuga que foi incorporado em embalagem ativa impregnado em dois materiais
biodegradáveis: papel e filme de poliácido lático (PLA) e testado contra bactérias gram-
positivas (Bacillus subtilis). A incorporação do óleo-resina foi realizada na superfície, por um
processo de revestimento, a granel, através de impregnação (amostras de papel) ou por filme
de PLA. Os testes antibacterianos confirmaram a atividade contra B. subtilis em papel e em
filmes de PLA com um teor de óleo-resina de copaíba de aproximadamente 20% em peso,
podendo esses materiais ser utilizados como embalagens biodegradáveis com efeito
bactericida com a finalidade de melhorar a vida de prateleira de produtos alimentares.
Alguns agentes antimicrobianos naturais podem ser incorporados diretamente nos
alimentos, porém esses agentes tendem a alterar o sabor dos mesmos, o que pode ser um
problema para indústria alimentícia. As embalagens protegem os alimentos, mesmo durante o
transporte, e tendem a aumentar a vida de prateleira (CAMPOS et al. 2011; SÁNCHEZ-
GONZÁLEZ et al. 2011).
Segundo Mendonça e Onofre (2009), o óleo-resina de C.multijuga inibiu o crescimento
de Escherichia coli (ATCC 25922), S. aureus (ATCC 25923) e Pseudomonas aeruginosa
(ATCC 9027) com concentração inibitória mínima (CIM) de 1,5, 3,1 e 12,5%,
respectivamente. Além da C. multijuga, o óleo-resina de C. officinalis também demonstrou
atividade bacteriana contra S. aureus com CIM de 0,7 L/mL para o óleo-resina a 10%
(PIERI et al. 2012).
Pieri et al. (2010) avaliaram o efeito antimicrobiano de diferentes concentrações de óleo-
resina de copaíba contra o crescimento de Listeria monocytogenes originária de produtos
cárneos e analisaram as diferenças na inibição do micro-organismo com soluções do óleo-
resina autoclavadas e não autoclavadas. Os resultados mostraram sensibilidade de cinco cepas

de L. monocytogenes em relação à solução 10% de óleo-resina de copaíba autoclavada, quatro
cepas sensíveis a solução de 5% autoclavada e apenas uma cepa foi sensível à solução de
2,5% autoclavada. A solução 10% não autoclavada apresentou inibição do crescimento de
apenas duas cepas. Esses resultados apontam que a solução autoclavada de 10% do óleo-
resina de copaíba demostrou maior inibição em relação a todas as outras soluções e
concentrações testadas. Esses resultados sugerem que o óleo-resina de copaíba autoclavado
pode ser uma potencial fonte de novos agentes para o controle de infecção ou para a
conservação dos alimentos, inibindo o crescimento de bactérias de origem alimentar como L.
monocytogenes.
Abrão et al. (2015) avaliaram a ação antibacteriana do sesquiterpeno óxido de cariofileno
e dos diterpenos ácido copálico, ácido caurenóico, ácido acetóxicopálico, ácido agático e do
ácido hidróxicopálico isolados do óleo-resina de C. langsdorffii contra as bactérias
multirresistentes Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. capitis,
Enterococcus faecalis e Streptococcus pneumoniae. O ácido copálico foi o antibacteriano
mais ativo com valores de CIM variando de 15,6 a 31,2 μg/mL. Os ácidos copálico,
acetóxicopálico, agático e hidróxicopálico foram metilados com diazometano para avaliação
da atividade antibacteriana desses diterpenos metilados, porém as modificações na estrutura
molecular alteraram marcadamente a atividade antibacteriana, onde não exibiram nenhuma
ação, sendo esse fato explicado pelos autores devido às características estruturais dos
diterpenos ácidos, como por exemplo, a existência de um grupo doador de hidrogênio (COOH
grupo hidrofílico), que interage com grupos fosforilados na membrana da célula bacteriana
promovendo atividade antibacteriana. Entretanto, quando os diterpenos estão na forma de um
éster metílico a presença do grupo (OCOCH3) diminuiu a atividade antibacteriana do
composto.
Tincussi et al. (2002) avaliaram a atividade antibacteriana dos diterpenos ácidos isolados
do óleo-resina da C. paupera, uma planta medicinal peruana. A atividade antibacteriana foi
testada contra bactérias gram-positivas (S. aureus ATCC 6538, S. epidermidis CECT 232, S.
saprophyticus CECT 235, B. subtilis CECT 39) e gram-negativas (Escherichia coli CECT 99,
Pseudomonas aeruginosa AK 958). Os ácidos copálico e caurenóico mostraram atividade
antimicrobiana significativa (CIM <10 μg/mL) contra bactérias gram-positivas, comparável à
cefotaxima, antibiótico usado como controle.

Lima (2015) utilizou o óleo-resina de copaíba comercial (onde não foi identificada a
espécie) com diferentes proporções como suplemento alimentar para bovinos com o objetivo
de avaliar os efeitos sobre o consumo de ração, digestibilidade e parâmetros ruminais em
bovinos mantidos em pastos. O óleo-resina de copaíba foi adicionado ao suplemento na forma
de spray, sendo a pulverização realizada diariamente no momento do fornecimento do
suplemento. A adição do óleo-resina alterou o consumo de ração, com o fornecimento de 0,66
g/kg de matéria seca, porém não alterou os parâmetros de fermentação ruminal e a
digestibillidade de nutrientes dos animais mantidos em pasto nas condições estudadas.
Embora já tenha sido descrito na literatura várias atividades biológicas para o gênero
Copaifera, apenas alguns estudos discriminam quais espécies de Copaifera foram utilizadas,
pois na maioria dos casos utilizam óleos-resinas comerciais (LEANDRO et al. 2012). A
Tabela 3 apresenta um resumo de algumas atividades biológicas já testadas para óleos-resinas
das espécies de Copaifera.
Tabela 3. Atividades biológicas descritas para os óleos-resinas obtidos a partir de algumas espécies de
Copaifera.

Fonte: LEANDRO et al. 2012.
Espécie Atividade biológica Referência
C. cearensis Huber ex Ducke
Antimicrobiano
Anti-inflamatório
Leishmanicida
Santos et al., 2008a.
Veiga et al., 2007.
Santos et al., 2008b.
C. langsdorffii Desf.
Antimicrobiano
Leishmanicida
Cicatrização de feridas
Antioxidante
Anti-inflamatório
Inseticida
Pieri et al., 2010.
Santos et al., 2008b.
Paiva et al., 2002.
Maciel et al., 2007.
Paiva et al., 2004.
Mendonça et al., 2005.
C. martii Hayne
Antimicrobiano
Leishmanicida
Santos et al., 2008a.
Santos et al., 2011.
C. multijuga Hayne
Anti-inflamatório
Antimicrobiano
Antinociceptivo
Leishmanicida
Gomes et al., 2010.
Mendonça et al., 2009.
Gomes et al., 2010.
Santos et al., 2008b.
C. officinalis (Jacq.) L.
Antimicrobiano
AntisquêmicoAnti-inflamatório
Leishmanicida
Antitumoral
Pieri et al., 2011.
Araújo et al., 2005.
Baylac et al., 2003.
Santos et al., 2008b.
Brito et al., 2010.
C. reticulata Ducke
Anti-inflamatório
Antimicrobiano
Inseticida
Antinociceptivo
Leishmanicida
Cicatrização de feridas
Ansiolítico
Veiga et al., 2007.
Correia et al., 2008.
Silva et al., 2007.
Gomes et al., 2007.
Santos et al., 2011.
Brito et al., 1998.
Curio et al., 2009.

2.3. Bactérias patogênicas de origem alimentar
A doença de origem alimentar, resultante do consumo de produtos contaminados, é um
fenômeno comum e tem graves efeitos na saúde humana, juntamente com graves impactos
econômicos e sociais (ALEGBELEYE et al. 2018).
As doenças transmitidas por alimentos são comuns em muitas regiões do mundo, pelo
menos 1 em cada 10 pessoas adoecem anualmente devido ao consumo de alimentos
contaminados, segundo a Organização Mundial da Saúde (WHO, 2015). Existem vários
agentes, como produtos químicos, patógenos e parasitas, que podem alterar alimentos em
diferentes pontos do processo de produção e preparação (ALLOS et al. 2004).
As doenças de veiculação alimentar representam um problema de ordem global. No
Brasil, o patógeno mais prevalente em surtos de intoxicação alimentar é a Salmonella sp.
(14,4%), seguido pelo Staphylococcus aureus (7,7%) e Escherichia coli (6,5%) (ANVISA,
2016).
O S.aureus pertence à classe das bactérias gram-positivas, é um importante patógeno
bacteriano humano que causa uma grande variedade de manifestações clínicas, sendo seu
tratamento difícil de ser administrado devido ao surgimento de cepas resistentes a múltiplas
drogas. Essa bactéria normalmente não causa infecção na pele de indivíduos saudáveis, no
entanto, se for permitido acesso a corrente sanguínea ou tecidos internos pode causar uma
variedade de infecções potencialmente graves (TAYLOR, 2017). Segundo Alves (2012) as
principais fontes de contaminação por S. aureus são produtos lácteos, carnes (principalmente
de aves), ovos, atum, ou seja, na maioria dos casos produtos que requerem muita manipulação
no preparo, pois o S. aureus é um micro-organismo presente na pele.
Lysteria monocytogenes que também pertence ao grupo das bactérias gram-positivas é
um patógeno intracelular responsável por causar vários surtos de doenças transmitidas por
alimentos, podendo ser encontrada com maior incidência em carnes, aves e frutos do mar
(FARBER, 1991).
A E. coli O157 que pertence ao grupo das bactérias gram-negativas é encontrada
regularmente nas fezes de bovinos saudáveis e é transmitida aos seres humanos por meio de
alimentos contaminados, água e contato direto com pessoas ou animais infectados. A infecção
humana por E. coli O157 está associada a ampla gama de doenças clínicas, incluindo diarréia
não-sanguinolenta e colite hemorrágica (MEAD, 1998).

Já a Salmonella enterica serovar Typhimurium que também é um patógeno de origem
alimentar, podendo ser encontrada em carnes (bovina e suína), aves, ovos e leite, apresenta
capacidade de se adaptar e alterar o ambiente gastrointestinal, podendo utilizar múltiplos
mecanismos de defesa para resistir a estressores ambientais, como por exemplo, o pH ácido
do estômago (GART et al. 2016, FABREGA).
2.3.1. Bactérias gram-positivas e gram-negativas
A parede celular de uma célula bacteriana é uma estrutura semirrígida, complexa e
responsável pela forma da célula, além de recobrir a membrana citoplasmática protegendo o
interior da célula das alterações adversas do ambiente externo (Figura 13). Nas bactérias
gram-positivas a parede celular consite em muitas camadas de peptideoglicana, formando
uma estrutura espessa e rígida. Já nas bactérias gram-negativas, a parede celular consiste em
uma ou poucas camadas de peptideoglicana, além de uma membrana externa formada por
lipopolissacarídeos, lipoproteínas e fosfolipídeos, onde conferem uma barreira para certos
antibióticos, como por exemplo, a penicilina (TORTORA, 2012).
Segundo Abrão et al. (2015), os antimicrobianos têm mais dificuldade em penetrar na
parede celular das bactérias gram-negativas devido a composição química da membrana
externa que é formada pelos lipopolissacarídeos que determinam as propriedades superficiais
como permeabilidade e suscetibilidade a antibióticos.

Figura 13. Representação da parede celular das bactérias gram-negativas e gram-positivas. Disponível em:
http://blogcientistabiologia.blogspot.com/2017/04/reino-monera.html. Acesso em: 15 out. 2018.

Gram-negativa Gram-positiva
Membrana externa
peptidoglicano
Membrana
citoplasmática
Espaço
periplasmático
Lipoproteínas

2.3.2. Resistência antimicrobiana
Entende-se por resistência antimicrobiana, a capacidade que um organismo tem de
sobreviver e de se reproduzir na presença de um determinado antibiótico (BECEIRO et al.
2013).
A resistência antimicrobiana pode ser classificada em intrínseca ou adquirida. A
resistência intrínseca é uma característica presente no genoma de praticamente todas as
bactérias de uma mesma espécie, não é adquirida por transferência horizontal de genes, sendo
independente da existência de uma pressão seletiva por parte de um antibiótico. Já a
resistência adquirida é uma particularidade adquirida por bactérias previamente suscetíveis
através de mutações espontâneas que ocorrem em genes localizados no cromossoma e que são
posteriormente transmitidas verticalmente através da replicação ou da aquisição de elementos
genéticos móveis que possuam genes de resistência (COX e WRIGHT, 2013).
As transferências de plasmídeos são capazes de carrear mais de um gene de resistência
associados, facilitando a transmissão gênica horizontal de diferentes mecanismos de
resistência entre as bactérias, agravando ainda mais o problema da resistência múltipla a
antibióticos (DAVIES e DAVIES, 2010; CAUMO, et al. 2010).
Resistência a múltiplas drogas é uma causa preocupante no tratamento em infecções
bacterianas, pois vários antibióticos amplamente utilizados na medicina favorecem a seleção
de bactérias resistentes a múltiplos agentes antibacterianos (BLOT et al. 2007; NIKAIDO,
2009).
A expressão de genes mutados, codificando a resistência a um único fármaco (por
exemplo, mutação em um alvo) ou um mecanismo de resistência específico (por exemplo,
barreira enzimática), em associação com a modulação da bomba de efluxo de múltiplos
fármacos ou expressão de porina envolvida no transporte, são os processos mais comuns
descritos em bactérias multirresistentes (NIKAIDO, 2009; DAVIN-RÉGLI et al. 2008).
2.4. Técnicas para avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos
2.4.1. Antibiograma
O teste de antibiograma, também conhecido como teste de difusão em disco é realizado
dispensando os discos de papel-filtro contendo os antimicrobianos teste sobre a placa de ágar
(Figura 14) após a aplicação do inóculo bacteriano com aproximadamente 1 a 2 x 10
UFC/mL. Uma placa de 150 mm pode conter até 12 discos de antimicrobianos. As placas são

incubadas por 16 a 24 horas a 35 ± 2 ºC antes da determinção dos resultados (ANVISA,
2008).

Figura 14. Placa de ágar contendo discos de papel-filtro para o teste de antibiograma.
Fonte: ANVISA, 2008. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/atm_
racional/modulo2/metodos2.1.htm. Acesso em: 20 jun. 2018.

Os resultados são avaliados através dos diâmetros dos halos de inibição, relacionados à
sensibilidade da amostra bacteriana e à velocidade de difusão do antimicrobiano no ágar,
sendo esses halos de inibição de cada disco mensurados em milímetros. Estes resultados do
teste de disco-difusão são interpretados comparando o valor do halo de inibição com os
critérios publicados pelo Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais, com isso, as amostras
bacterianas são categorizadas