EstudoQuAmicoBiolAgico-Alves-2014

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ESTUDO QUÍMICO E BIOLÓGICO DE Genipa americana L. (JENIPAPO) 
 
 
 
 
 
 
 
AUTOR DISCENTE: Jovelina Samara Ferreira Alves 
ORIENTADORA: Profª. Dra. Silvana Maria Zucolotto Langassner 
CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Renata Mendonça Araújo 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL-RN 
2014 
http://www.sigaa.ufrn.br/sigaa/public/docente/portal.jsf?siape=1490222
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ESTUDO QUÍMICO E BIOLÓGICO DE Genipa americana L. (JENIPAPO) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL-RN 
2014 
Dissertação submetida ao 
Programa de Pós-graduação em 
Ciências Farmacêuticas da 
Universidade Federal do Rio 
Grande do Norte para a 
obtenção do Grau de Mestre em 
Ciências Farmacêuticas. 
 
Orientadora: Prof. Dra. Silvana 
Maria Zucolotto Langassner. 
Coorientadora: Prof. Dra. Renata 
Mendonça Araújo. 
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Aos meus pais, pela torcida de 
sempre. Obrigada pela educação que 
me deram: maior riqueza que ganhei 
nessa vida. 
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AGRADECIMENTOS 
 
À minha orientadora, Profa. Dra. Silvana Maria Zucolotto Langassner, que me 
acolheu em seu laboratório, fazendo desse metrado um primeiro passo nos sonhos da 
minha vida profissional. Por ter me confiado um projeto tão gratificante. Sua confiança 
me fez crescer bastante, sem ela não teria adquirido o conhecimento que obtive nessa 
jornada. Liberdade é tudo na pesquisa científica. Obrigada por compartilhar os 
ensinamentos, como professora e pesquisadora. Por insistir no meu aprendizado ao 
direcioná-lo para área de interesse. Por confiar em minha capacidade e por entender os 
atropelos. Sua dedicação, confiança, paciência foram essenciais ao longo desses quase 
“dois” anos. Muito obrigada. 
A minha co-orientadora Profa. Renata Mendonça Araújo, por ter me apoiado na 
disciplina de espectroscopia, inicialmente, são de professores assim que precisamos. 
Obrigada por ter me auxiliado nos experimentos de isolamento, os quais me ajudaram a 
fazer o que mais queria: colocar em prática a espectroscopia. Obrigada pelos espectros 
de ressonância magnética nuclear. Obrigada pelo apoio, principalmente àqueles nas 
horas mais inapropriadas, nos auxílios em dúvidas, etc. 
Em especial agradeço à Profa. Dra. Raquel Giordani Brandt pelas opiniões na 
bancada de laboratório, pela esperança sempre estimada e pelos ensinamentos na 
docência. Obrigada por ser um exemplo. 
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da 
UFRN, com os quais tive o prazer de ver um lado melhor do curso de Farmácia, e ver 
que realmente fiz a escolha certa. Obrigada pela convivência. 
Em especial ao Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa, pela parceria 
firmada nos experimentos de atividade anti-inflamatória e por sua atenção. 
Ao Prof. Dr. Túlio Flávio Accioly de Lima e Moura, por ter me confiado o seu 
cromatógrafo líquido de alta eficiência. Muito obrigada! 
Ao Prof. Flávio Reginatto, por ter me recebido em seu laboratório de 
Farmacognosia da USFC por dois meses, por ter passado ensinamentos preciosos de 
cromatografia e colaborado com os testes de atividade antimicrobiana. 
Obrigada às doutorandas Maíra, Mariana e Tatyane na realização dos 
experimentos de atividade biológica. 
Aos técnicos de laboratório Walteçá e Rafael, que me auxiliaram com paciência. 
Agradeço imensamente a todos os amigos que ganhei em Natal: 
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Àqueles que via quase todos os dias, Bárbara, Gisely, Júlia, Rayllan, Gustavo e 
Érika, os quais acompanharam a minha empreitada na fitoquímica, com os quais sempre 
dividimos algum conhecimento, como também nos divertimos nas saídas pela cidade, e 
no caso de Bárbara, pelas cidades, com nossa estadia em Florianópolis. Agradeço a todos 
os colegas que convivi no Laboratório de Farmacognosia da UFRN. 
Aos colegas de Laboratório de Farmacognosia da UFSC: Obrigada pelo 
acolhimento tão especial, adorei conhecer vocês! 
Aos alunos de iniciação científica, que facilitaram meu trabalho de bancada: 
Alexandre, Jorge e Layane. Espero que tenha contribuído um pouco na formação de 
vocês, pois vocês ajudaram na minha, sem dúvidas. 
A todos os amigos que me ajudaram nesses últimos anos longe da família, seja 
com um telefonema, uma risada. Aos que me deram seu ombro em momentos ruins da 
vida também. Obrigada a Fernando e Neidinha. 
À minha família, que sempre me apoiou nessas loucuras de ir atrás dos sonhos. 
Obrigada por nunca terem me criticado quanto a isso. Aos meus irmãos Soraia, Júnior e 
Gutemberg. Em especial ao meu pai, “Seu Baiô”, e a minha mãe, “Dona Toinha”, que 
sempre fizeram o melhor por mim. Obrigada pela dedicação. Obrigada pela educação 
que me deram. Ao meu pai: o exemplo de persistência e perfeccionismo. À minha mãe: 
tempo dedicado a mim quase todos os dias desde que nasci, estando perto ou longe. Eu 
amo vocês. 
A Deus por não me desamparar e se fazer presente nos meus projetos sempre. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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RESUMO 
Genipa americana L. (Rubiaceae), conhecida popularmente como “jenipapo”, 
ocorre amplamente na região Nordeste e em outras regiões do Brasil, como 
também em outros países. Sob o ponto de vista medicinal, a espécie é usada 
pela população para diferentes fins como: catártico, antidiarréico, 
antigonorréico, antiulceroso, analgésico, em casos de sífilis, anemia, icterícia, 
asma, dentre outros. Devido ao reconhecido uso popular e a escassez de 
estudos químicos e farmacológicos, o principal objetivo deste estudo foi 
caracterizar os marcadores e/ou compostos ativos e avaliar atividades 
farmacológicas das folhas e frutos da espécie. O estudo iniciou-se com a coleta 
de folhas, frutos maduros e verdes nas mediações da Praia de Barreta (Nísia 
Floresta-RN), dos quais as folhas foram submetidas à secagem e moagem. 
Posteriormente, foram preparados os extratos hidroetanólicos das folhas, 
pericarpo e endocarpo dos frutos e fracionados com solventes orgânicos com 
ordem de polaridade crescente (éter de petróleo, diclorometano, acetato de 
etila, e n-butanol). Para análise qualitativa do extrato das folhas e frutos foram 
utilizadas as técnicas de Cromatografia em Camada Delgada e Cromatografia 
Líquida de Alta Eficiência. Diversos procedimentos cromatográficos 
(Cromatografia Líquida a Vácuo, Cromatografia em Coluna Clássica e 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Semi-preparativa) foram utilizados 
para o isolamento de compostos. Adicionalmente, realizaram-se ensaios de 
atividade anti-inflamatória do extrato das folhas, no modelo de peritonite aguda 
em camundongos e o ensaio de atividade antimicrobiana, pelo método de 
difusão em disco, com extrato do endocarpo e das folhas de G. americana. Foi 
observada por Cromatografia em Camada Delgada e Cromatografia Líquida de 
Alta Eficiência a presença de flavonoides e iridoides no extrato das folhas e 
iridoides nos extratos dos do pericarpo e endocarpo dos frutos. A partir do 
extrato da folha foram isolados e caracterizados dois iridoides, o tetrahidro-7-
(hidroximetil)1-metoxiciclo-pentapiran-4-carbaldeído, inédito para a espécie e o 
GF2, provavelmente inédito na literatura, os carboidratos manitol e GF7 e cinco 
flavonoides GF4, GF5, GF6, GF8 e GF9. Os seis últimos compostos estão em 
fase de elucidação estrutural. A partir do extrato do endocarpo foram isolados 
os compostos GE1, GE2, GE3, GE4 e GE5, os quais estão em fase de 
elucidação estrutural. O extrato das folhas e do endocarpo de G. americana 
não apresentaram atividade antimicrobianapromissora frente às cepas 
testadas pelo método de difusão em disco. O extrato das folhas apresentou 
atividade anti-inflamatória nas doses 50, 100, 200 e 300 mg/kg, observada por 
meio da inibição da migração de leucócitos para o local da inflamação. Análises 
espectroscópicas estão sendo realizadas para elucidação de todos os 
compostos isolados de G. americana. O estudo fitoquímico e de atividades 
farmacológicas desenvolvidos com as folhas da espécie são resultados 
inovadores, pois até o momento era registrada a presença de iridoides, 
monoterpenos, ácidos carboxílicos apenas nos frutos da G. americana. Para as 
folhas da espécie não há relatos na literatura sobre a presença flavonoides. 
 
 
 
 
8 
 
 
 
ABSTRACT 
Genipa americana Linnaeus (Rubiaceae) occurs largely Northeast region and 
others Brazillian regions, as well as in others countries. In the folk medicine, it is 
used for different purposes as: cathartic, antidiarrheal, antigonorréico, antiulcer, 
analgesic, in cases of syphilis, anemia, jaundice, asthma, among others. Due to 
the recognized tradicional use and the few reports about the chemical and 
pharmacologic studies, the aim of this study was characterized the chemical 
markers and/or active compounds and evaluated the pharmacological activities 
of this species. Leaves and fruits were collected in Barreta Beach (Nísia 
Floresta/RN). Leaves was dried and crushed. After, hidroetanolic extracts from 
leaves, pericarp and endocarp were obtained and fractionated with organics 
solvents in order increasing polarity (petroleum ether, dichloromethane, etil 
acetate and n-butanol). For the qualitative analysis, leaves and fruits extracts 
was analysed by Thin Layer Chromatography (TLC) and High Performance 
Liquid Chromatography (HPLC). Several chromatography procedures (Vacuum 
Liquid Chromatography, Classic Column Chromatography and Semi-
Preparative Liquid Chromatography were used to isolation of the chemical 
compounds. Regarding the pharmacological studies, was evaluated the 
antiinflammatory activity of leaves extract , in acute peritonitis in mice and the 
antimicrobial activity assay by the disc diffusion method, of the endocarp and 
leaves extract of G. americana. It was observed by TLC and HPLC the 
presence of flavonoids and iridoids in leaves extract and iridoids in the pericarp 
and endocarp extracts. From the leaves extract were isolated and characterized 
two iridoids, named tetrahydro-7-(hydroxymethyl)-1-methoxycyclohexyl 
pentapiran- 4-carbaldehyde, described for the first time for this species and the 
compound named GF2, probably inedited in the literature, manitol and GF7 
carbohydrates and five flavonoids GF4, FG5, GF6, GF8 and GF9. The last six 
compounds until this moment are not characterized. From the endocarp extract 
were isolated the compounds GE1, GE2, GE3, GE4 and GE5, until this moment 
not identified. The leaves and endocarp extracts of G. americana did not show 
promising antimicrobial activity. In relation to anti-inflammatory activity, leaves 
extract at doses of 50, 100, 200 and 300 mg/kg showed significant activity 
observed by inhibition of leukocytes to site of inflammation. Structural 
elucidation techniques are being performed to elucidate all compounds isolated 
from G. americana. The phytochemical study and pharmacological activity 
developed with the leaves of the species is so important because it was so far 
recorded the presence of iridoids, monoterpenes, carboxylic acids in the fruits 
of G. americana, but no chemical reports about leaves of this species were 
found. 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1- Genipa americana L........................................................ 24 
Figura 2- Iridoides de G. americana................................................... 28 
Figura 3- Núcleo Iridano................................................................... 29 
Figura 4- Núcleo fundamental dos flavonoides................................. 30 
Figura 5 - Análise por CCD do extrato e frações das folhas de 
Genipa americana L.......................................................... 61 
Figura 6 - Cromatograma do EHF de G. americana/ UV 340 nm...... 62 
Figura 7 - Cromatograma do EHF de G. americana/ UV 340 nm...... 63 
Figura 8 - Análise por CCD das frações da CLV da fração BuOH do 
EHF de G. americana...................................................... 65 
Figura 9 - Análise por CCD das frações da coluna cromatográfica 
da fração FLD4.................................................................. 65 
Figura 10 - Análise por CCD das frações da coluna FLD4-
E2.................................................................................... 66 
Figura 11 - Cromatograma obtido por CLAE da fração semipurificada 
FLD4-E2b do EHF de G. americana/ UV 340 nm............... 66 
Figura 12 - Cromatograma obtido por CLAE semi-preprarativa da 
fração FL4-E2..................................................................... 67 
Figura 13 - Espectro de 1H RMN do carboidrato GF1: manitol 
(DMSO; 300 MHz).............................................................. 69 
Figura 14 - Espectro de HSQC do carboidrato GF1: manitol (DMSO; 
300 MHz)............................................................................ 
 
70 
Figura 15 - Análise por CCD das frações da CLV da fração AcOEt do 
EHF de G. americana........................................................ 71 
Figura 16 - Análise por CCD das frações da coluna cromatográfica 
da fração FLD3................................................................... 72 
Figura 17 - Cromatograma obtido por CLAE semi-preparativa da 
fração FLC3-F..................................................................... 73 
Figura 18 - Cromatograma obtido por CLAE semi-preparativa da 
fração FLC7-E..................................................................... 74 
Figura 19 - Espectro de RMN de 1H do iridoide GF2 (DMSO; 300 
MHz)................................................................................... 76 
10 
 
 
 
Figura 20 - Espectro de RMN de 13C do iridoide GF2 (DMSO; 75 
MHz).................................................................................. 
 
77 
Figura 21 - Espectro de HSQC do iridoide GF2 (DMSO; 300 MHz).... 79 
Figura 22 - Correlações H-H observadas no espectro de correlação 
COSY para o iridoide GF-2................................................. 80 
Figura 23 - Estrutura proposta para o iridoide GF2: (1R,4aS,7aS)-1-
hidroxi-7-(hidroximetil)-1H,4aH,5H,7aH-
cyclopenta[c]pyran-4-carbaldeido...................................... 80 
Figura 24 - Espectro de COSY do iridoide GF2 (DMSO; 300 MHz)..... 81 
Figura 25 - Espectro de 1H RMN do iridoide GF3 (DMSO; 500 MHz).. 83 
Figura 26 - Fórmulas estruturais de dos iridoides GF3, 1-β-metoxi-
gardendiol, artselaenin-A.................................................... 85 
Figura 27 - Iridoide GF3: tetrahidro-7-(hidroximetil)1-metoxiciclo-
pentapiran-4-carbaldeído.................................................... 85 
Figura 28 - Espectro de RMN de 13C do iridoide GF3 (DMSO; 125 
MHz).................................................................................. 86 
Figura 29 - Análise por CCD do extratos e frações do endocarpo e 
do pericarpo de Genipa americana..................................... 88 
Figura 30 - Análise por CCD das frações da coluna da fração 
clorofórmio do EHE de Genipa americana L...................... 90 
 
Figura 31 - 
Efeito do EHF de G. americana (50, 100, 200, 300 e 500 
mg/kg i.p.) administrado 30 minutos antes da carragenina 
(Cg 1%/cav.), no modelo de peritonite aguda, sobre 
níveis de leucócitos totais. Dexa = Animais tratados com 
dexametasona (0,5 mg/kg, i.p., 0,5 h)................................ 92 
Figura 32 - Efeito anti-inflamatório das frações do EHF de G. 
americana (50 mg/kg i.p.) administradas 30 minutos 
antes da carragenina (Cg 1%/cav.), no modelo de 
peritoniteaguda, sobre níveis de leucócitos totais............. 95 
 
 
 
 
 
11 
 
 
 
LISTA DE FLUXOGRAMAS 
Fluxograma 1- Esquema de partição líquido-líquido do EHF............... 43 
Fluxograma 2- Esquema de isolamento dos compostos GF1, GF7, 
GF8 e GF9 das folhas de G. americana...................... 49 
Fluxograma 3- Esquema de isolamento dos compostos GF2, GF3, 
GF4, GF5 e GF6 das folhas de G. americana............. 52 
Fluxograma 4- Esquema de partição líquido-líquido do EHP e EHE 
de G. americana........................................................... 53 
Fluxograma 5- : Esquema de isolamento dos compostos GE1, GF2, 
GF3, GF4 e GF5 do endocarpo de G. americana L.... 55 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 
 
 
 
LISTA DE QUADROS 
Quadro 1- Substâncias isoladas de G. americana............................... 27 
Quadro 2- Sistemas cromatográficos empregados em CCD.............. 44 
Quadro 3- Condições cromatográficas de isolamento de compostos 
do EHF por CLAE semi-preparativa................................. 46 
Quadro 4- Gradientes de fase móvel da CLV realizada com a fração 
n-BuOH do EHF (250 mL para cada gradiente)................ 47 
Quadro 5- Gradientes de fase móvel da CLV realizada com a fração 
AcOEt do EHF (150 mL para cada gradiente).................. 50 
Quadro 6- Sistemas cromatográficos empregados para análises 
dos extratos e frações dos frutos de G. americana por 
CCD................................................................................ 55 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
Tabela 1- Rendimento das frações da partição líquido-líquido do 
EHF, EHP e EHE.............................................................. 60 
Tabela 2- Rendimento das frações da CLV da fração AcOEt e 
BuOH do EHF.................................................................. 
64 
Tabela 3- Valores de deslocamento químico observados nos 
espectros de 1H e 13C RMN (300 MHz / 75 MHz) para o 
carboidrato GF1 em DMSO............................................... 68 
Tabela 4- Valores de deslocamento químico observados nos 
espectros de RMN de 1H e 13C (300 MHz / 75 MHz) para 
o iridoide GF2 em DMSO................................................... 78 
Tabela 5- Valores de deslocamento químico observados nos 
espectros de RMN de 1H e 13C (500 MHz / 75 MHz) 
para o iridoide GF3 e comparação com os valores de 
RMN de 13C (100 MHz) para o garadenal-1, ambos em 
DMSO e CDCl3, respectivamente..................................... 84 
Tabela 6- Valores de deslocamento químico observados nos 
espectros de RMN 1H e 13C (500 MHz / 125 MHz) para 
o iridoide GF3 em DMSO e comparação com os valores 
de 1H e 13C RMN (500 MHz /100 MHz) para o 1-β-
metoxi-gardendiol e artselaenin-A, ambos em CDCl3....... 87 
Tabela 7- Resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana de 
G. americana..................................................................... 91 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
 INTRODUÇÃO................................................................................. 17 
1 REVISÃO DE LITERATURA............................................................ 19 
1.1 Plantas Medicinais............................................................................ 19 
1.2 A família Rubiaceae Juss. .............................................................. 21 
1.3 O Gênero Genipa L. ........................................................................ 23 
1.4 Espécie Genipa americana L .......................................................... 23 
1.5 Etnofarmacologia............................................................................. 23 
1.6 Constituição química......................................................................... 25 
1.7 Dados farmacológicos...................................................................... 31 
1.8 Técnicas cromatográficas para isolamento de compostos bioativos 
de produtos naturais..................................... .................................. 33 
1.9 Ressonância Magnética Nuclear .................................................... 36 
2.0 Atividade anti-inflamatória..................................... ........................... 37 
2.1 Atividade antibacteriana..................................... .............................. 38 
3 OBJETIVOS..................................................................................... 40 
3.1 Objetivo geral.................................................................................... 40 
3.2 Objetivos específicos........................................................................ 40 
4 METODOLOGIA............................................................................... 41 
4.1 Coleta, secagem e moagem do material vegetal.............................. 41 
4.2 Extração e fracionamento dos extratos............................................. 42 
4.3 Estudo fitoquímico das folhas de G. americana............................... 
42 
4.3.1 Análises cromatográficas do EHF de G. americana........................ 43 
4.3.2 Isolamento dos compostos GF1, GF7, GF8 e GF9 a partir da 
fração BuOH do EHF de G. americana............................................. 47 
4.3.3 Isolamento dos compostos GF2, GF3, GF4, GF5 e GF6 a partir da 
fração AcOEt do EHF de G. americana............................................ 50 
4.4 Estudo fitoquímico dos frutos de G.americana................................ 53 
4.4.1 Análises cromatográficas dos extratos e frações do EHE e EHP de 
G. americana por CCD..................................... .............................. 
 
53 
4.4.2 Isolamento dos compostos GE1, GE2, GE3, GE4 e GE5 do 
endocarpo de G. americana a partir da fração CH2Cl2 do EHE..... 54 
15 
 
 
 
4.5 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de 
Hidrogênio-1 (RMN 1H) e Carbono-13 (RMN 13C)............................ 
 
56 
4.6 Estudo biológico das folhas e dos frutos de G. americana.............. 55 
4.6.1 Avaliação da atividade antimicrobiana.............................................. 57 
4.6.2 Avaliação da atividade anti-inflamatória............................................ 58 
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES..................................................... 60 
5.1 Estudo fitoquímico das folhas de G. americana............................... 60 
5.1.1 Comparação do perfil cromatográfico das frações do EHF de G. 
americana por CCD.............................................................................. 60 
5.1.2 Análises cromatográficas por CLAE do EHF de G. americana......... 62 
5.1.4 Isolamento dos compostos GF1, GF7, GF8 e GF9 a partir da 
fração BuOH do EHF de G. americana............................................. 64 
5.1.4 Isolamento dos compostos GF2, GF3, GF4, GF5 e GF6 a partir da 
fração AcOEt do EHF de G. americana............................................ 75 
5.2 Estudo fitoquímico dos frutos de G.americana................................ 88 
5.2.1 Análises cromatográficas dos extratos e frações do EHE e EHP de 
G. americana por CCD..................................... ............................... 88 
5.2.2 Isolamento dos compostos GE1, GE2, GE3, GE4 e GE5 do 
endocarpo de G. americana a partir da fração CH2Cl2 do EHE....... 89 
5.3 Estudo biológico das folhas e dos frutos de G. americana............... 90 
5.3.1 Avaliação da atividade antimicrobiana.............................................. 90 
5.3.2 Avaliação da atividade anti-inflamatória............................................ 91 
6 CONCLUSÕES..................................... .......................................... 96 
 REFERÊNCIAS 
 ANEXO A – Solicitação de Depósito de Patente: Processo para 
obtenção de “extratos, frações, compostos isolados e composição 
farmacêutica de Genipa americana L. no tratamento da 
inflamação”.16 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
13C RMN = Ressonância Magnética Nuclear de carbono 
1H RMN = Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio 
ACN = Acetonitrila 
AcOEt = Acetato de etila 
BuOH = Butanol 
CCD = Cromatografia em Camada Delgada 
CCC = Cromatografia em Coluna Clássica 
CLAE = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
COSY= “Correlated Spectroscopy” 
DAD = Detecção por arranjo de diodos 
EM = Espectrometria de Massas 
EtOH = Etanol 
HSQC = “Heteronuclear Single Quantum Coherence” 
MeOH = Metanol RMN = Ressonância Magnética Nuclear 
UV = Ultravioleta 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
A sociedade carrega consigo várias informações sobre o ambiente em 
que vive, desde a antiguidade. Assim, muitas dessas crenças sobreviveram às 
passagens de gerações e a partir delas pôde-se trocar informações 
diretamente com o meio, a fim de buscar a sobrevivência. Neste acervo 
encontra-se o conhecimento sobre o mundo vegetal, com o qual as sociedades 
estão em contato. Deste modo, a busca e o uso de plantas com propriedades 
terapêuticas é uma atividade que vem de geração em geração e são descritos 
com a intenção de preservar esta tradição milenar, a qual é atestada em vários 
tratados de fitoterapia. Cerca de 2/3 da população do planeta utilizam as 
plantas como único recurso terapêutico (NEWALL, 2002; ARGENTA et al., 
2011). 
 As grandes fontes de biodiversidade são as florestas tropicais 
localizadas em países em desenvolvimento como o Brasil, o qual detém 
aproximadamente um terço da flora mundial, no entanto esse país perde para 
outros no que concerne à manufatura e comercialização de produtos naturais, 
devido ao custo dessa produção (AGRA et al., 2008; KLEIN et al., 2009; 
MARINHO et al., 2011). 
 Dentro desse cenário da flora brasileira, destaca-se a espécie Genipa 
americana Linnaeus de ocorrência em todas as regiões do país, como também 
em outros países. Do ponto de vista comercial, essa espécie fornece madeira 
de boa qualidade para a construção civil, móveis e produtos artesanais e os 
frutos comestíveis são usados para produção de sucos, doces e licores, entre 
outros (LORENZI, 2008). 
Sob o ponto de vista medicinal, todas as partes da planta são 
empregadas popularmente e em muitas regiões do país como: catártico, 
antidiarréico, antigonorréico, antiulceroso, analgésico, em casos de sífilis, 
anemia, icterícia, asma, hidropsia, problemas de fígado e baço (LORENZI, 
2008). 
Do ponto de vista químico e farmacológico, os estudos realizados com 
esta espécie mostraram que o primeiro composto isolado de seus frutos no 
Brasil foi genipina em 1960 (DJERASSI, 1960), em seguida foram encontrados 
mais dois compostos: os ácidos genípicos e genipínico (TALENT, 1964). 
18 
 
 
 
Posteriormente, surgiram outros estudos que permitiram o isolamento de 
outros compostos, porém até o presente momento não foram caracterizados os 
possíveis marcadores e/ou compostos ativos da espécie. 
Conforme a RDC n° 14 de 31 de março de 2010 da Agência Nacional de 
Vigilância Sanitária (ANVISA) é importante caracterizar os marcadores da 
espécie vegetal, para a obtenção do registro de um medicamento fitoterápico. 
A caracterização dos marcadores auxilia na padronização da matéria-prima 
vegetal até o produto final, garantindo a qualidade dos medicamentos 
fitoterápicos que são comercializados. Este controle contribui para garantir a 
eficácia, segurança e qualidade e a concentração dos princípios ativos no 
extrato (BRASIL, 2010). 
Devido ao reconhecido uso popular da espécie G. americana e a 
escassez de estudos químicos e farmacológicos, faz-se necessário conduzi-los 
para caracterização dos marcadores e/ou compostos ativos e comprovação de 
atividades farmacológicas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
19 
 
 
 
1. REVISÃO DE LITERATURA 
1.1 Plantas Medicinais 
O uso de plantas para tratamento, cura e prevenção e doenças é uma 
das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade (VEIGA JÚNIOR; 
PINTO, 2005). O Brasil possui um grande potencial de bioprospecção devido à 
biodiversidade e à riqueza do conhecimento tradicional acumulado pelos 
habitantes locais, o qual é de grande valor, pois essas pessoas possuem 
acesso direto com a natureza e os produtos da sua biodiversidade. O 
conhecimento tradicional de plantas medicinais é a base da medicina popular 
no país, o qual é derivado de uma mistura de culturas indígenas brasileiras e 
influências europeias e africanas desde o período colonizador (CARTAXO, 
2010). 
O uso de produtos naturais tem se mostrado como uma estratégia de 
sucesso em inovação tecnológica de medicamentos. Metabólitos secundários 
de organismos terrestres e marinhos estão sendo usados para o tratamento de 
várias doenças, considerando que algumas moléculas são utilizadas também 
como modelos para uso em química medicinal (VALLI et al., 2012). Até o 
momento, a investigação dos materiais de origem vegetal contribuiu 
grandiosamente tanto na descoberta de novos fármacos, quanto no 
delineamento de medicamentos de fitoterápicos (PERKS, 2011). 
As espécies vegetais produzem uma grande variedade de metabólitos 
secundários que desempenham um papel fundamental na sobrevivência da 
própria espécie, como também na manutenção do equilíbrio ecológico, 
desempenham ainda funções muito importantes na interação da planta com 
insetos, resistência contra pragas e doenças, atração de polinizadores e 
interação com microrganismos simbiontes, além de representar uma importante 
fonte de produtos naturais bioativos (PERKS, 2011). 
Apesar dos avanços recentes na química combinatória, que permitem a 
síntese de compostos a partir de uma biblioteca, a qual compreende uma vasta 
gama de produtos químicos, com propriedades diferentes, a alta diversidade 
estrutural e complexidade típica de produtos naturais são únicas, colocando-os 
em posição de superior. No entanto, alguns destes compostos ocorrem em 
quantidades pequenas, o que torna a sua comercialização inviável. Mesmo 
quando produtos naturais bioativos identificados não possuem rendimento 
20 
 
 
 
significativo, potência ideal ou propriedades farmacológicas para o 
desenvolvimento de novos medicamentos, as suas estruturas químicas podem 
ser utilizadas como modelos para a concepção de novos análogos com 
propriedades biológicas otimizadas (CORBET et al., 2006; KENNEDY et al., 
2008). 
Dentro desse contexto, o medicamento fitoterápico consiste em outra 
área derivada do estudo com produtos naturais, consistindo assim em um 
produto tecnicamente elaborado com emprego exclusivo de matérias-primas 
ativas vegetais, cuja eficácia, segurança, conhecimento dos riscos de seu uso, 
assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade são 
validadas. Não se considera medicamento fitoterápico aquele que inclui na sua 
composição substâncias ativas isoladas, sintéticas ou naturais, nem as 
associações dessas com extratos vegetais (BRASIL, 2010). 
 O produto fitoterápico registrado tem se inserido no contexto da 
inovação farmacêutica, devido à importância do uso popular de algumas 
espécies, ou a partir da descoberta de novas aplicações para extratos de 
plantas, ou ainda por possuir atividade mais elevada que substâncias isoladas, 
devido ao efeito sinérgico que pode ser apresentado pelas várias substâncias 
presentes em uma matriz biológica, que pode atuar em mais de um alvo 
terapêutico potencializando a atividade farmacológica (WAGNER; ULRICH-
MERZENICH, 2009). 
A popularidade de medicamentos fitoterápicos está aumentando 
progressivamente em todo o mundo, o que gera preocupação com a qualidade 
desses produtos, pois muitos dos eventos adversos de medicamentos à base 
de plantas podem ser atribuídos à má qualidade de matérias-primas ou 
produtos acabados. Dentre os fatores que ocasionam esses problemas têm-se 
os externos: a adulteração,identificação incorreta e contaminação do material 
vegetal, com metais tóxicos, agrotóxicos e microorganismos; e fatores internos, 
como a complexidade e não-uniformidade da matriz biológica vegetal. Os 
fatores externos podem ser controlados. Através da utilização de métodos 
analíticos o fator qualidade da matriz biológica tornou-se solucionável. Esses 
parâmetros refletem na qualidade total do produto, com a garantia de qualidade 
da matéria-prima vegetal até o produto acabado (ZHANG et al., 2012). 
21 
 
 
 
No Brasil as exigências para garantia de qualidade do medicamento 
fitoterápico estão fixadas na Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) da 
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) nº 14 de 31 de março de 
2010, a qual define que a padronização do extrato utilizado na produção do 
medicamento fitoterápico é uns dos requisitos requeridos no processo de 
registro, para validar o método é necessário que a espécie vegetal tenha um 
marcador químico, que é definido como um composto ou classe de compostos 
químicos presentes na matéria prima vegetal, preferencialmente tendo 
correlação com o efeito terapêutico, que é utilizado como referência no controle 
da qualidade da matéria-prima vegetal e do medicamento fitoterápico (BRASIL, 
2010). 
 Atualmente, a cromatografia tem sido o método mais utilizado para 
padronização de extratos, pois oferece adequada capacidade de separação de 
extratos, especialmente quando combinada com métodos espectroscópicos, o 
que tornou-se uma prática recente. Os instrumentos acoplados melhoraram o 
desempenho em termos de diminuição na instrumentação, eficiência na 
separação, correção de desvio nos tempos de retenção, seletividade e precisão 
(GAD et al., 2013). Estes parâmetros cromatográficos garantem a 
conformidade de extratos e produtos acabados, o que influencia na segurança 
e eficácia do medicamento fitoterápico. 
O nosso país possui um grande potencial de bioprospecção, devido à 
enorme biodiversidade da flora brasileira e apesar das dificuldades 
encontradas no desenvolvimento de fitoterápicos o governo tem investido 
nesse setor com a implantação do Programa Nacional de Plantas Medicinais e 
Fitoterápicos, que visa garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso 
racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável 
da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria 
(BRASIL, 2013). 
 
1.2 A família Rubiaceae Juss. 
Rubiaceae apresenta-se como a quarta maior família das angiospermas, 
com distribuição de 650 gêneros e 13.000 espécies em todo mundo 
(DELPRETE, 1999; MOBOT, 2011). Encontra-se distribuída em sua maioria 
nas regiões mais quentes, principalmente dos trópicos. A América do Sul 
22 
 
 
 
comporta o maior número de espécies dessa família no planeta, englobando 
30% do total, muitas endêmicas no Brasil, onde atualmente ocorrem cerca de 
124 gêneros e 1.396 espécies, correspondendo a uma das principais famílias 
da flora brasileira, distribuídas por diversas formações vegetacionais (BOLZANI 
et al., 2001; CHIQUIERI et al., 2004, FLORA DO BRASIL, 2013). Essas 
espécies são empregadas com finalidades ornamentais, complemento 
alimentar, na medicina popular e em pesquisas de desenvolvimento de 
medicamentos fitoterápicos (ERBANO; DUARTE, 2010). 
Conforme a classificação botânica essa família encontra-se dividida em 
quatro subfamílias: Ixoroideae, Cinchonoideae, Antirheoideae e Rubioideae, na 
qual cada subfamília apresenta um perfil fitoquímico típico, que são 
marcadores quimiotaxonômicos, para iridoides (Ixoroideae), alcalóides 
indólicos (Cinchonoideae) e antraquinonas (Rubioideae) (BOLZANI et al., 
2001). 
A família Rubiaceae apresenta várias espécies de interesse 
farmacológico e econômico como, por exemplo, a espécie Coffea arabica L., 
utilizada como uma das bebidas mais famosas em todo mundo, o “café”, essa 
espécie é utilizada também para extração da cafeína, a qual é bastante 
empregada em formulações farmacêuticas (Andreeva et al., 2012). Outra 
espécie importante, Cephaelis ipecacuanha Rich., conhecida como “ipeca” e 
“ipecacuanha”, possui grande uso na medicina popular, suas raízes contêm o 
alcaloide emetina, que apresenta efeitos anti-helmíntico e expectorante (MORS 
et al., 1995). A espécie Psychotria viridis Ruiz et Pavón, conhecida 
popularmente como “chacrona” tem sua importância por ser usada em 
cerimônias e rituais religiosos, em conjunto com o cipó de Banisteriopsis caapi 
(Spruce) Morton (“caapi”), uma Malpighiaceae, na elaboração de uma bebida 
com propriedades alucinógenas, a “ayahuasca”, que significa “vinho das 
almas”. A mistura é utilizada em várias regiões da floresta Amazônica pelas 
comunidades do “Santo Daime” e “União do Vegetal” (CALLAWAY et al., 1996; 
GROB et al., 1996). Ainda, a espécie Uncaria tomentosa (Willd) DC., conhecida 
popularmente como “unha-de-gato”, possui várias propriedades medicinais 
tradicionalmente descritas, as quais já foram validadas por diversos estudos 
experimentais (LEMAIRE et al., 1999; PERAZZO, 2004; GONÇALVES et al., 
2005). 
23 
 
 
 
No ano de 1977, mais de 50 produtos à base desta planta foram 
introduzidos no mercado farmacêutico nos Estados Unidos, com diversas 
indicações farmacológicas, dentre as principais a imunoestimulante e anti-
inflamatória (PERAZZO, 2004; GONÇALVES et al., 2005). 
 
1.3 O gênero Genipa L. 
O gênero Genipa L. apresenta-se distribuído em G. americana L. e G. 
infundibuliformis Zappi & Semir, a primeira espécie possui ampla distribuição, 
porém a segunda espécie é encontrada apenas no Brasil centro-meridional. 
Esse gênero apresenta uso diversificado, o fruto é comestível e utilizado na 
produção de sucos, geleias e licores. Tribos indígenas da América do Sul 
utilizam o fruto verde no tingimento de tecidos, redes, objetos de madeira e 
pele de humanos. A madeira é empregada na fabricação de móveis e a casca, 
rica em taninos, é usada em curtumes no tratamento de couro. O uso medicinal 
é amplo, dentre esses, as principais indicações são como diurética, antifebril, 
para o tratamento de feridas externas e faringites (ERBANO, 2010; FLORA DO 
BRASIL, 2013). 
 
1.4 A Espécie Genipa americana L. 
 
 A espécie Genipa americana L. é popularmente conhecida como 
“jenipapo” ou “jenipapeiro”, e apresenta-se como uma árvore de copa estreita, 
de 8 a 14 m de altura, com tronco liso de 40 a 60 cm de diâmetro, nativa de 
várzeas úmidas ou encharcadas em todo território brasileiro. As folhas são 
simples, subcoriáceas e glabras de 15-35 cm de comprimento. As flores são 
grandes, inicialmente brancas. Os frutos são bagas globosas tomentosas, de 8 
a 10 cm de diâmetro, com polpa adocicada e sementes achatadas de cor 
creme (LORENZI, 2008) (Figura 1). 
 
1.5 Etnofarmacologia 
Segundo Lorenzi (2008), G. americana fornece madeira de boa 
qualidade para construção civil, confecção de móveis e peças artesanais. 
Conforme Hansen et al. (2008) dentre as inúmeras espécies frutíferas 
utilizadas pela população nordestina, destaca-se o “jenipapeiro” (G. 
americana), cuja comercialização como fruta fresca tem-se mostrado 
24 
 
 
 
promissora nas feiras livres, nos mercados atacadistas e supermercados. A 
industrialização, sob as mais diferentes formas, tem estimulado bastante o 
crescimento da demanda dos frutos pelo mercado nordestino, com 
possibilidade de expansão para outras regiões brasileiras ou mercado 
internacional. Os frutos quando ainda verdes fornecem um suco de cor 
inicialmente azulada, e posteriormente, preta, muito consumido e utilizado 
pelos indígenas como corante do corpo. Quando maduros sua polpa é 
consumida in natura ou transformada em doces, geléias e licor, seu suco 
fermentado também é usado para fabricação de vinho e licor (LORENZI, 2008). 
 
 
Todas as partes desta planta são empregadas na medicina popular em 
todas as regiões do país. O chá das raízesé considerado purgativo e 
antigonorréico. A casca do tronco é catártica e antidiarréica e também 
empregada externamente como emplastro contra úlceras, dores de várias 
origens, torção injúria, luxação, hematomas e nos casos de faringite. As folhas 
na forma de decocto são indicadas contra diarréia e sífilis, a poupa dos frutos 
verdes também é utilizada contra sífilis e para tratamento de ruptura de umbigo 
em recém-nascidos. Os frutos maduros são aromáticos, diuréticos e 
estomáquicos, indicados contra anemia, icterícia, asma, hidropsia, e problemas 
do fígado e baço, com base no conhecimento tradicional (DE ALBUQUERQUE, 
2007; AGRA et al., 2008; LORENZI, 2008.; ERBANO; DUARTE, 2010; 
BREITBACH, 2013). O suco do fruto e o decocto da raiz e da casca possui 
Figura 1 – Genipa americana (Fonte: TROPICOS, 2011). 
25 
 
 
 
efeito adaptógeno tônico, fortificante e afrodisíaco (MENDES;CARLINI, 2007). 
 Em uma pesquisa realizada entre 43 ervanatários do município de 
Campina Grande-PB constatou-se que G. americana foi citada por 69,8% 
deles, como planta comercializada e indicada para uso medicinal. O estudo não 
mostrou quais as indicações estas pessoas fazem no comércio (DANTAS & 
GUIMARÃES, 2007). 
1.6 Constituição química 
A espécie Genipa americana L. é quimicamente caracterizada pela 
presença de iridoides (LORENZI, 2008). O primeiro composto isolado dos 
frutos dessa espécie no Brasil foi a genipina (1) em 1960 (DJERASSI, 1960), a 
partir de frutos frescos, com os quais foi feito um extrato etanólico e o 
isolamento se deu por métodos cromatográficos. 
Em uma amostra de G. americana coletada em Porto Rico foram 
encontrados mais dois compostos da mesma classe, os ácidos genípico (2) e 
genipínico (3), oriundos de extratos de frutos frescos (TALLENT, 1964). 
 Guarnaccia et al. (1972), a partir das folhas de G. americana, coletada 
no Panamá, isolaram um iridoide glicosilado, o ácido geniposídico (4), por meio 
do extrato metanólico das folhas, esse foi o único iridoide isolado nessa parte 
da planta até o momento. Posteriormente, Ueda e Iwahashi (1991), obtiveram a 
partir do extrato metanólico das frutas frescas de G. americana, um iridoide 
glicosilado inédito, o geniposídeo (5) e por meio de formação de calos e 
culturas de células suspensas obtiveram o tarenosídeo (6), o gardenosídeo (7) 
e o ácido geniposídico (4). 
Conforme Yang et al. (1999), foi isolado o primeiro alcaloide listado para 
espécie: criptolepina. Em frutos de jenipapo coletados no Brasil, a partir da 
fração volátil foi detectado alto teor de ácidos carboxílicos (butírico, 2-
metilbutírico e hexanóico), os quais são os compostos majoritários desta 
fração, e 2- e 3-butanoato de metila, são as substâncias que aparentam estar 
relacionadas ao odor forte e primário do jenipapo (BORGES; REZENDE, 2000). 
Em 2003 foi isolado o triterpeno genipatriol, por Hossain et al., a partir do 
extrato metanólico das folhas. 
A partir de frutos, folhas e calos de G. americana L. coletada no Peru, 
Ono et al. (2005) isolaram mais quatro iridoides glicosilados inéditos 
denominados genamesídeos A-D (8, 9, 10 e 11), juntamente com outros quatro 
26 
 
 
 
já conhecidos: ácido geniposídico (4), geniposídeo (5), gardenosídeo (7) e 
genipina-gentiobiosideo (12). Em 2007, os mesmos pesquisadores isolaram a 
partir dos frutos da mesma espécie: genipacetal (13), genipaol (14), 
genipamida, gardeniol (15), éster metílico do ácido desacetilasperulosídico (16) 
e shanzhisídeo (17) (ONO et al.,2007). 
Estudos foram realizados com a polpa com a finalidade de descobrir os 
componentes responsáveis pelo aroma característico dos frutos da espécie. 
Pino et al. (2005) demonstrou, por análises de Cromatografia Gasosa-
Espectrômetria de Massas (CG-EM), a presença de 91 compostos voláteis 
presentes na polpa, 81 inéditos para espécie, as classes mais representativas 
foram: ácidos carboxílicos (69,6%), terpenos (10,1%), aldeídos e cetonas (1%) 
e os maiores constituintes foram ácido hexanóico (9.35 mg/kg), ácido 
octadenoóico (1.34 mg/kg), ácido tetra decanóico (1.16 mg/kg), linalol (0.91 
mg/kg) e limoneno (0.62 mg/kg). 
Pinto et al. (2006) analisou um extrato aquoso da polpa e observou a 
presença de 52 constituintes voláteis, 32 inéditos para espécie, dentre esses a 
maioria eram álcoois (24,4%, 28,2%), ésteres (21,9%, 12,8%), ácidos (17,1%, 
20,5%) e compostos aromáticos (9,7%, 23,1%), na porção superior do extrato e 
na porção aquosa do extrato, respectivamente. 
Foram identificados e quantificados por cromatografia gasosa acoplada 
ao detector por ionização de chama, a presença de campesterol (1 mg, 0 mg), 
sigmasterol (8 mg, 74 mg), β-sitosterol (150 mg, 123 mg), Δ5-avanasterol 
conjuntamente com Δ7-sigmasterol (21 mg, 33 mg) e Δ7-avanasterol (4 mg, 3 
mg), para cada 100 g de polpa e semente, respectivamente (DA COSTA et al., 
2010). 
Outro estudo com os frutos determinou o teor de umidade (93,12%), 
proteínas (0,21%), lipídios (0,34%), fibras (1,15%) carboidratos (4,43%), dentre 
esses, açúcares (3,89%). Foram quantificados em 100 g de frutos os seguintes 
componentes: 0,59 mg de fósforo, 92,5 mg de potássio, 13,23 mg de cálcio, 
8,17 mg de magnésio e 0,22 mg de ferro, ácido ascórbico (27 mg), compostos 
fenólicos (47 mg), β-caroteno (0,93 mg) e licopeno (0,63 mg) (DE SOUZA et 
al., 2012a). A Figura 2 demonstra os iridoides isolados de G. americana e no 
Quadro 01 estão apresentados de forma sumarizada os compostos já descritos 
para a espécie. 
27 
 
 
 
Quadro 1 – Substâncias isoladas de G. americana. 
Compostos Farmacógeno Autor 
Iridoides 
Genipina Frutos Djerassi, 1960 
Ácido genípico e ácido 
genipínico 
Frutos Tallent, 1964 
Ácido geniposídico Folhas Guarnaccia et. al, 1972 
Geniposídeo, tarenosídeo e 
gardenosídeo 
Frutos Ueda e Iwahashi, 1991 
Genamesídeo-A, genamesídeo-
B, genamesídeo-C e 
genamesídeo-D 
Folhas, frutos e 
calos 
Ono et al., 2005 
Gardeniol, éster metílico do 
ácido desacetilasperulosídico e 
shanzhisídeo 
Frutos Ono et al., 2007 
Flavonoides 
Quercetina Polpa, pericarpo 
e sementes 
Omena et al., 2012 
Alcaloides 
Criptolepina Não descrito Yang et al., 1999 
Ácidos carboxílicos 
Ácido butírico, metilbutírico e 
hexanóico 
Frutos Borges e Rezende, 2000 
Monoterpenos 
Genipacetal, genipaol, 
genipamida 
Frutos Ono et al., 2007 
Fitosteróis 
Campesterol, sigmasterol, β-
sitosterol, Δ5-avanasterol, Δ7-
sigmasterol e Δ7-avanasterol 
Polpa e semente Da Costa et al., 2010 
28 
 
 
 
 
 
 
Figura 2 – Iridoides de G. americana. 
29 
 
 
 
Iridoides são compostos monoterpenoídicos constituído de oito a dez 
átomos de carbono. A estrutura química dessas substâncias é baseada no 
esqueleto ciclopentano-[C]-pirano (Figura 3). Sob o aspecto biogenético, os 
iridoides são biossintetizados a partir do cátion iridodial e diversificam-se em 27 
vias diferentes. Iridoides têm sido usados como marcadores 
quimiotaxonômicos para Corniflorae, Gentianiflorae, Loasiflorae e Lamiiflorae. 
O número e a natureza dos iridoides encontrados no Reino Vegetal são 
indicativos da complexidade das vias envolvidas na sua biossíntese. Em 
quimiossistemática, os iridoides representam um marcador importante em 
classificação vegetal, filogenia e evolução (SAMPAIO-SANTOS & KAPLAN, 
2001). 
 
O
CH3
CH3
 
 
Essas substâncias podem se apresentar como sólidos ou líquidos, com 
alto ponto de fusão, reagem facilmente com ácidos por hidrólise de ligação 
glicosídica, ocasionando a formação de coloração azul. Em CCD apresentam-
se com coloração azul a cinza em câmara de UV 365nm e marrom, vermelho, 
violeta, azul ou cinza ao serem revelados com vanilina sulfúrica 
(WAKSMUNDZKA-HAJNOS et al., 2008). 
Esses compostos tiveram importância devido à presença do primeiro 
iridoide originado do veneno de formigas, contribuindo para defesa desses 
animais, como também por serem precursores de alcaloidesindolmonoterpênicos e alguns alcaloides isoquinolínicos. Os iridoides possuem 
diversas atividades farmacológicas comprovadas por estudos científicos, dentre 
elas hipotensora, espasmolítica, antiarrítimica, hepatoprotetora, 
hipoglicemiante, hipolipemiante, antitumoral, antiviral, imunomoduladora, anti-
inflamatória, entre outras. Em geral as agliconas apresentam atividade mais 
pronunciada que as formas glicosídicas, o que permite afirmar que a atividade 
Figura 3 – Núcleo Iridano 
30 
 
 
 
biológica está diretamente relacionada com as agliconas liberadas 
(GHISALBERTI, 1998). 
Outra classe relevante no estudo são os flavonoides, os quais são os 
compostos fenólicos mais importantes e diversificados de origem natural, 
constitui em uma classe largamente distribuída no reino vegetal, presente em 
frutos, vegetais, sementes, folhas, flores, talos, raízes, em produtos originados 
de vegetais, como chás e vinhos (HEIM et al, 2001). 
 Essa classe metabólica deriva dos fenilpropanoides e possui esqueleto 
estrutural básico C6-C3-C6, constituído por dois anéis aromáticos (A e B) e um 
anel heterocíclico (C) (Figura 4) (GHASEMZADEH & NEDA GHASEMZADEH, 
2011). 
 
O
O
A
B
C
2
3
10
6
7
8
5
9
2'
3'
4'
5'
6'
4
1'
 
Os flavonoides podem ser: flavonas, flavonóis, flavononas, flavan3-ols, 
isoflavonas e antocianidinas. Os flavonoides podem apresentar-se na forma de 
aglicona ou heterosídica, através de ligação O- ou C- heterosídica, com 
diversos tipos de açúcares (GHASEMZADEH & NEDA GHASEMZADEH, 
2011). 
A análise espectroscópica de Utravioleta (UV) é bastante útil na 
identificação de flavonoides, pois o sistema de π-elétrons é um dos 
absorvedores de radiação UV mais eficazes (COCKELL; KNOWLAND, 1999). 
Este tipo de análise apresenta duas bandas de absorção máximas, a banda II, 
encontra-se entre 240 e 285 nm, correspondendo à absorção do anel A. A 
banda I localiza-se na região de 300 e 400 nm, correspondente ao grupo 
cinamoil, ou seja, relacionada aos anéis B e C. O tipo de flavonoide, as 
oxigenações presentes na estrutura alteram a posição e intensidade dos 
máximos de absorção. Substituintes com grupo hidroxila não-dissociados, 
 
Figura 4 – Núcleo fundamental dos flavonoides. 
 
31 
 
 
 
metoxi e metil geralmente efetuam apenas pequenas alterações na posição da 
absorção máxima, contudo geralmente um aumento da oxigenação promove 
deslocamento das bandas para maiores comprimentos de onda (MABRY; 
MARKHAM; THOMAS,1970). 
Os estudos químicos realizados até o momento promoveram apenas 
identificação de substâncias na espécie, em sua maioria, alguns estudos com 
substâncias voláteis houve quantificação. Porém, até o momento não existem 
marcadores químicos para nenhuma das partes da planta, a qual devido ao 
largo uso tradicional poderá ser utilizada no futuro para produção de 
medicamento fitoterápico. 
 
1.7 Dados Farmacológicos 
Os ácidos genípicos e genipínico isolados dos frutos frescos de Genipa 
americana L. inibiram o crescimento in vitro de algumas bactérias gram-
positivas e gram-negativas, do fungo Trichophyton menthagrofites, da alga 
Chlorella vulgares, e do protozoário Tetrahymena gelleii (TALENT, 1964). 
No entanto, o extrato metanólico das folhas de G. americana L. não 
exibiu atividade antimicrobiana, pelo método de difusão em disco cepas de 
Escherichia coli e Staphylococcus aureus (MELÉNDEZ & CAPRILES, 2006). A 
partir do óleo essencial de G. americana constatou-se a presença de atividade 
antioxidante, como também de uma atividade extremamente forte contra todos 
os microrganismos testados no estudo de Barbosa (2008), possuindo um 
espectro de ação amplo, inclusive sobre amostras bacterianas 
reconhecidamente resistentes mesmo a antibióticos sintéticos, como é o caso 
de Staphylococcus aureus MRSA (resistente à meticilina), Eenterococcus 
faecium VRE (resistente à vancomicina), Klebsiella pneumoniae e Pseudomona 
aeruginosa. 
Outro estudo realizado por Ueda e Iwahashi (1991) testaram 
geniposídeo, tarenosídeo, gardenosídeo e o ácido geniposídico, isolados de 
G. americana L., os quais apresentaram atividade anticancerígena, com tumor 
induzido em linhagem celular Ragi por vírus Epstein-Bar. O composto genipina 
tem sido muito estudado nos últimos anos devido à suas propriedades 
farmacológicas: antiangiogênica, antiinflamatória e antioxidante, como também 
devido ao seu poder corante, este composto é encontrando também em 
32 
 
 
 
Gardenia jaminoides Ellis (ALMOG et al., 2004; KOO et al., 2004; BYUNG-
CHUL et al.,2005). 
Um trabalho realizado por Hsua et al. (1997) comparou a atividade 
antitumoral do ácido geniposídico e geniposídeo, com administração 
intraperitoneal (i.p.) de 100, 200 e 500 mg/Kg em ratos na presença e 
ausência de radiação de raios-x, verificou-se que o ácido geniposídico mostrou 
uma maior inibição do crescimento tumoral que o geniposídeo, e que utilização 
da radiação concomitantemente com as duas substâncias aumentou resposta 
ao tratamento, significativamente. 
A partir de genipina e geniposídeo, foi investigada a proteção 
neurocitogênica, evitando a toxicidade de proteína β-amiloide da Doença de 
Alzheimer em cultura de neurônios do hipocampo, observações morfológicas 
mostraram a proteção dos neurônios por genipina. Enquanto, o genoposídeo 
demonstrou menor atividade (YAMAZAKI et al., 2001). 
Estudos que buscam inibidores da tirosinase vêm sendo realizadas para 
tentar descobrir novos antagonistas, como também auxiliar nos mecanismos 
patológicos de melanomas malignos. Dentro desse contexto, foi verificado que 
um extrato hidro-propilenoglicólico das raízes de G. americana foi capaz de 
inibir, in vitro, em 23% a atividade da enzima tirosinase (BAURIN et al., 2001). 
Em contraste, extratos etanólicos e hexânicos das folhas e dos frutos, e o 
hexânico das cascas de G. americana apresentaram fraca atividade inibitória 
da tirosinase in vitro (SOUZA et al., 2012). 
Um estudo com genipina e geniposídeo, demostrou a presença de 
atividade anti-inflamatória em edema de pata induzido por carragenina em 
ratos. No entanto, genipina possui maior atividade anti-inflamatória do que o 
geniposídeo, como demonstrados pelo edema de pata induzido por 
carragenina e o conteúdo de ON no exsudato (KOO et al., 2004). 
 Um estudo in vitro sobre a atividade antiparasitária do extrato bruto 
hidroetanólico (70 Gl), com concentração de 0,0501 g/mL, da espécie em 
estudo foi e realizado e apontou que índice de inibição de desenvolvimento de 
ovos de trichostrongilídeos, na etapa de formação de larva, acima de 90% 
(FURTADO, 2006). 
 A atividade antioxidante foi testada com extratos metanólicos dos frutos 
secos e moídos de G. americana obtidos por meio de maceração, soxhlet e 
33 
 
 
 
ultrassom por Barbosa. Nesse estudo foi visto que esses extratos possuem 
atividade antioxidante semelhante ao padrão utilizado, Ginkgo biloba, com 
menor atividade para o extrato obtido por maceração (BARBOSA, 2008). 
 Outro estudo analisou a capacidade antioxidante do extrato etanólico do 
pericarpo, polpa e sementes de G. americana L. avaliada por diferentes 
ensaios, dentre eles o método de captura de radicais livres 2,2-difenil-1-picril-
hidrazila (DPPH), 2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido-sulfônico) (ABTS), 
pelo método de redução dos íons de ferro (FRAP) e íons de ferro (CUPRAC), a 
capacidade antioxidante um em sistema biomimético de membranas, e em um 
sistema biológico constituído de fígado de rato homogeneizado, os quais 
confirmaram o poder antioxidante desses extratos in vitro. O estudo 
correlacionou ainda, as atividades antioxidantes e a atividade 
anticolinesterásica exibidas pelos extratos de G. americana que foi positiva 
para polpa apenas. A atividade citotóxica foi avaliada em células de córneas de 
ovelhas, a qual revelou que nenhum dos extratos levou a inibição da viabilidade 
celular em menos de 90%(Omena et al., 2012). 
 A atividade inibitória sobre as enzimas α-amilase e α-glucosidase in vitro 
de G. americana foi avaliada com a utilização de extratos etanólicos e 
hexânicos das folhas e dos frutos, e hexânico da casca, o que confirmou uma 
alta inibição da enzima α-glucosidase em todos os extratos testados e uma 
fraca e inibição para enzima α-amilase apenas para o extrato etanólico das 
folhas, a identificação dos princípios ativos responsáveis poderão contribuir no 
controle do diabetes (DE SOUZA et al., 2012b). 
 Extratos fenólicos dos frutos produzidos com acetona 80% foram 
avaliados com relação à atividade antiproliferativa, que por meio do ensaio 
ensaio de MTT [3(4,5- dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium], do ensaio de 
MUH (4-metilumbeliferilheptanoato) e azul de metileno, sugeriram que G. 
americana L. possui esta atividade in vitro (FINCO, 2013). 
 
1.8 Técnicas cromatográficas na análise e isolamento de 
compostos bioativos 
Juntamente com os métodos convencionais de extração, numerosos 
métodos inovadores foram estabelecidos, mas até agora nenhum método é 
considerado como padrão para a extração de compostos bioativos a partir de 
34 
 
 
 
plantas. As eficiências de métodos de extração convencionais e não-
convencionais dependem principalmente compreensão da natureza da matriz 
da planta e conhecimentos sobre química de compostos bioativos (AZMIR et 
al., 2013). Após a extração, os processos de cromatografia são iniciados a fim 
de se isolar substâncias, que poderão ser futuros marcadores químicos para 
espécie. Para um melhor entendimento do trabalho estão descritas a seguir as 
técnicas utilizadas no isolamento e análise de PN de G. americana no presente 
estudo: 
1.8.1 Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 
 É uma técnica rápida, simples e de baixo custo, que pode ser aplicada a 
vários tipos de análises farmacêuticas, no monitoramento de um processo de 
reação, identificação de um composto em uma amostra, na detecção de 
impurezas de um composto, entre outras aplicações. Essa técnica pode ser 
utilizada de modo preliminar, anteriormente à análise por Cromatografia Líquida 
de Alta Eficiência (CLAE). Baseia-se na separação dos componentes de uma 
amostra através da migração diferencial sobre adsorvente numa superfície 
plana. Os fenômenos envolvidos podem ser adsorção, partição ou troca-iônica. 
Para desenvolvimento do cromatograma é necessário escolher uma Fase 
Móvel (FM), que em geral é selecionada conforme a polaridade da amostra e 
experiência do analista (POOLE, 1999; BELE & KHALE, 2010) 
A CCD com auxílio de reveladores gerais e específicos auxilia detecção 
de compostos ou classes de compostos. Amostras reveladas com vanilina 
sulfúrica que apresente coloração amarelo ou marrom podem tratar-se de 
flavonoides, cinza, roxo-escuro, vermelho ou marrom podem tratar-se de 
iridoides. O revelador difenilborato de aminoetanol, conhecido também por 
reagente Natural A, permite detecção de flavonoides ao serem expostos a luz 
ultravioleta (365 nm), pois esses compostos emitem fluorescência com 
coloração amarelo, laranja e verde por formarem um complexo derivado 
(WAGNER & BLADT, 2001). 
 
1.8.2 Cromatografia Líquida à Vácuo (CLV) e Cromatografia 
em Coluna Clássica (CCC) 
A CCC com caráter preparativo, em geral, é feita com transferência de 
técnica CCD para CCC, para otimização da escolha de fase estacionária e fase 
35 
 
 
 
móvel, assim a separação limitada por CCD é minimizada por fatores como 
comprimento da coluna e fluxo de fase móvel em CC (SCHILITT & GEISS, 
1972). Os tipos de Fases Estacionárias (FE) mais utilizadas no isolamento de 
produtos naturais são gel de sílica, gel de exclusão molecular e fase reversa, 
dependendo do tipo de FE e FM podem estar envolvidos os princípios de 
separação por adsorção, partição, exclusão molecular, troca-iônica, entre 
outros, os quais podem estar combinados ou não (SCHILITT & GEISS, 1972; 
VAILAYA & HORVATH, 1998; HATANO et al., 2003). 
A CLV pode ser realizada para isolamento e purificação de amostras, 
possui boa resolução por poder ser utilizado uma FE com tamanho de partícula 
menor que os utilizados em CC, visto que é realizada com auxílio de um 
sistema de vácuo, que impulsiona a FM (COLL & BOWDEN, 1986). Apesar dos 
avanços em CCC, dependendo da complexidade da amostra, pode não ocorrer 
separação completa dos constituintes da amostra, principalmente quando a 
semelhança entre as moléculas é grande ou quando se tratam de isômeros e 
enantiômeros, assim se faz necessário o uso de técnicas mais refinadas a fim 
de se obter a separação. 
 
1.8.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
 A CLAE é uma das técnicas de análise mais populares, utilizada em todo 
o mundo ao longo dos últimos quarenta anos em laboratórios de ciências 
farmacêuticas, química clínica, síntese química, na área alimentícia e 
ambiental, entre outras (ZOTOU, 2011). A CLAE ganhou sua popularidade 
principalmente devido à sua confiabilidade e versatilidade. É uma técnica muito 
poderosa na separação de produtos naturais em matrizes complexas, como 
extratos, para a detecção e quantificação seletiva ou visualização do perfil 
cromatográfico. O método é muito comum e foi adaptado para a análise de 
uma larga variedade de produtos naturais, em geral não há necessidade de 
uma preparação complexa da amostra (WOLFENDER, 2009). 
Com o desenvolvimento das colunas com diferentes FE, especialmente 
a fase reversa, permitiu a separação de quase qualquer tipo de produto natural. 
As últimas inovações, como a introdução de FE estáveis a mudanças de pH e 
tamanho de partícula em torno de 2 μm melhoraram consideravelmente a 
performance da CLAE, em termos de resolução, velocidade e reprodutibilidade. 
36 
 
 
 
As separações são realizadas principalmente em cromatografia de fase 
reversa octadecilsilanica (C18) material com o sistema de solvente de ACN - 
H2O ou MeOH - H2O em modo de gradiente de eluição. Dois tipos principais de 
detectores podem ser definidos: simples detectores utilizados para a análise do 
perfil cromatográfico ou fins de quantificação (UV, ELSD, ECD) e detectores de 
sistemas hifenados que geram dados multidimensionais, cromatográficos e 
espectroscópicos, para a identificação de substâncias (UV-DAD, MS, RMN) 
(WILSON & BRINKMAN, 2003; DAVID et al., 2007; WOLFENDER, 2009). 
A CLAE analítica é utilizada rotineiramente em fitoquímica para 
desenvolvimento de um método “piloto” para isolamento de produtos naturais 
em escala preparativa, com otimização das condições experimentais e 
verificação da separação dos componentes da amostra, como também para 
verificar a pureza final dos compostos isolados (MARSTON, 2007). 
Em CLAE preparativa (>20 bar) as colunas são maiores e há 
necessidade de vidraria para armazenamento das amostras. O objetivo é isolar 
ou purificar compostos, enquanto que no processo analítico o foco é obter 
informações sobre a amostra. Na CLAE analítica os parâmetros importantes 
são resolução, sensibilidade e tempo de análise rápido, enquanto que, na 
CLAE preparativa o parâmetro mais importante é o grau de pureza da 
substância isolada, a quantidade de composto que se pode conseguir em 
relação ao tempo (rendimento). No desenvolvimento de CLAE em escala 
preparativa, a transferência de método depende de parâmetros, tais como 
vazão do eluente e dimensões da coluna, a qual é frequentemente aumentada 
à custa da pureza (WELLINGS, 2006; MARSTON, 2007). 
 Na cromatografia preparativa para isolamento de compostos puros 
podem envolver muitas técnicas diferentes, como CLAE preparativa, 
cromatografia líquida de média pressão, CCC, cromatografia em contra-
corrente, entre outros. A tarefa de obtenção de compostos isolados no mais 
curto espaço de tempo possível encontra-se na concepção de uma estratégia 
adequada de separação. O isolamento de produtos naturais, que anteriormente 
eraminconcebíveis, agora é possível por CLAE (HOSTETTMAN, 1998). 
 
1.9 Ressonância Magnética Nuclear 
A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é uma 
37 
 
 
 
técnica muito importante para análise de produtos naturais. Nesta técnica um 
campo eletromagnético é aplicado ao átomo, em seguida o núcleo entra em 
movimento de precessão em baixa frequência, 60 MHz, por exemplo, assim é 
possível que absorva energia de baixa frequência e seja liberada e expressa na 
forma de sinais no espectro de RMN de hidrogênio ou carbono, entre outros 
núcleos (SILVERSTAIN, WEBSTER & KIEMLE, 2012). Rotineiramente técnicas 
de RMN monodimensionais (1D) e bidimensionais (2D) são utilizadas para 
análise de estruturas complexas. Há quase três décadas, para realização 
dessas análises era necessária um quantidade entre 20-50 mg de amostra, 
para identificar e caracterizar os produtos naturais. Atualmente esta análise é 
possível com menos de 1 mg de amostra. Isto ocorreu devido à modernização 
no equipamento de ressonância. Apesar de tantas adequações nessa técnica a 
sua sensibilidade é inferior à espectrometria de massas, com a qual é possível 
fazer a identificação de uma substância com quantidades bem inferiores 
(FUKUSHI, 2006; BRETON & REYNOLDS, 2013). 
 
2.0 Atividade anti-inflamatória 
2.0.1 O processo inflamatório 
A reação inflamatória é um processo caracterizado por uma cascata de 
reações celulares e vasculares, o qual ocorre como resposta a diversas 
injúrias: traumas no tecido, invasão de bactérias, vírus ou parasitos, presença 
de complexos imunes, entre outros. O objetivo deste mecanismo é o reparo 
tecidual ou a geração de novos tecidos (CUNHA et al., 2003; SCHMID-
SCHÖBEIN, 2006). Estas respostas são iniciadas e reguladas por diferentes 
mediadores químicos endógenos liberados por diferentes tipos celulares, que 
são responsáveis pelos sinais clínicos da inflamação: dor, calor, rubor e tumor 
(HOFSETH, 2008). 
Para que ocorra a reação inflamatória, o organismo sintetiza e armazena 
os mediadores químicos endógenos, dentre esses: histamina, serotonina, 
leucotrienos, prostaglandinas, quimiocinas, fatores ativadores de plaquetas, 
bradicidinas e óxido nítrico (RYAN & MAJNO, 1997). 
Os neutrófilos são células que fagocitam o agente estranho, nessas 
células é encontrada a mieloperoxidase, que é uma enzima responsável pela 
atividade microbicida no interior dos fagossomas dos neutrófilos. Os monócitos 
38 
 
 
 
liberam citocinas e espécies reativas de oxigênio, quando se transformam em 
macrófagos destroem antígenos inespecíficos e ativam linfócitos. O óxido 
nítrico (NO) é um mediador importante liberado por monócitos, mastócitos, 
neutrófilos, macrófagos, células endoteliais musculatura lisa vascular e 
fibroblastos (PERANZONI, et al. 2008). O NO atua como agente tóxico para o 
organismo infecioso, regula linfócitos, induz adesão a neutrófilos, síntese de 
citocinas por leucócitos e apoptose por neutrófilos (TRIPATHI et al., 2007). As 
citocinas podem ter função pró ou anti-inflmatória, dentre as principais 
secretadas pelas células fagocíticas ativadas está a interleucina-1 beta (IL-1β) 
(KIM & MOUDGIL, 2008). 
 
2.0.1 Modelo de peritonite aguda 
Para a avaliação do mecanismo de ação anti-inflamatória de diferentes 
fármacos e/ou plantas, vários modelos de inflamação já foram descritos, como 
a pleurisia, a bolsa de ar, o edema de pata, a artrite e o implante de esponjas 
embebidas em agentes irritantes (SEDGWICK; LEES, 1986). No entanto, o 
modelo escolhido neste trabalho foi da peritonite aguda induzida por 
carragenina em camundongos. Esta técnica caracteriza-se pelo tratamento 
com do extrato, fração ou substância isolada, inoculação intraperitoneal de 
carragenina, sacrifício e contagem de células presentes no lavado peritoneal, 
esta contagem é realizada em câmara de “Neubauer” (FERRÁNDIZ; 
ALCARAZ, 1991). 
 
 2.1 Atividade antibacteriana 
O uso inadequado de alguns antimicrobianos fez com que alguns 
estejam perdendo muito rapidamente sua eficácia, o que torna necessária 
pesquisa por novas opções terapêuticas. Assim devem ser tomadas atitudes 
que possam conter este problema, como o uso racional desses medicamentos 
(VARGAS et al., 2004). Nos últimos anos, interesse científico em química e 
estudos farmacológicos das propriedades biológicas de plantas medicinais tem 
crescido na tentativa desenvolver novos fármacos que atuem em cepas 
resistentes a antibióticos que estão no mercado (COUTINHO et al., 2008). 
Deste modo, é importante avaliar a capacidade de materiais vegetais em 
inibir o crescimento de microorganismos. A utilização de extratos pode ter uma 
39 
 
 
 
atividade maior que substâncias isoladas, devido ao efeito sinérgico 
apresentado pelas várias substâncias presentes em uma matriz biológica, que 
pode atuar não apenas um alvo único, mas vários alvos, onde os diferentes 
componentes terapêuticos colaboram de uma forma sinergética. Estas 
combinações podem ser feitas com extratos, frações, substâncias ativas 
isoladas e fármacos (WAGNER & ULRICH-MERZENICH, 2009). 
Na busca por produtos naturais com atividade antimicrobiana devem ser 
utilizados microrganismos padronizados que podem ser adquiridos da 
American Type Culture Collection (ATCC), European Culture Collections 
Organisation (ECCO), entre outras (VANDEN BERGHE; VLIETINCK, 1991). Os 
métodos para detecção de atividade antimicrobiana de produtos naturais 
podem ser qualitativos (difusão em disco e bioautografia), e o método 
quantitativo ou semi-quantitativo (microdiluição em caldo) (COS et al., 2006). 
No presente estudo foi utilizada a técnica de difusão em disco, visto que para 
dar continuidade ao estudo quantitativo é preciso que o resultado qualitativo 
seja promissor anteriormente. 
 Conforme a revisão de literatura abordada, o presente estudo foi 
realizado com intuito de isolar substâncias presentes nas folhas e frutos de G. 
americana, a fim de esclarecer o uso popular da espécie, o que poderá trazer 
novas perspectivas no desenvolvimento de medicamentos. Em paralelo, foram 
realizados ensaios de atividade anti-inflamatória do extrato das folhas, como 
também ensaios de atividade antimicrobiana do extrato das folhas e do 
endocarpo dos frutos de G. americana. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
40 
 
 
 
3 OBJETIVOS 
 
3.1 Objetivo Geral 
 
Caracterizar os marcadores químicos do extrato das folhas e dos frutos 
de Genipa americana L. e avaliar atividade antimicrobiana e anti-inflamatória da 
espécie. 
 
3.2 Objetivos Específicos 
 
 Fracionar e isolar os marcadores e/ou compostos ativos do 
extrato das folhas e endocarpo dos frutos de G. americana; 
 Elucidar estruturalmente os marcadores e/ou compostos ativos do 
extrato das folhas e do pericarpo dos frutos de G.americana; 
 Analisar o extrato das folhas de G. americana por CCD e CLAE-
UV-DAD; 
 Avaliar a atividade anti-inflamatória e antimicrobiana dos extratos 
das folhas de G. americana L; 
 Avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos dos frutos de G. 
americana L. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
41 
 
 
 
4. METODOLOGIA 
 O estudo fitoquímico foi desenvolvido para isolamento e elucidação 
estrutural de compostos das folhas e frutos de G. americana, conforme a 
sequência a seguir: coleta, secagem, moagem do material vegetal, extração, 
fracionamento dos extratos e isolamento por diferentes modalidades de 
cromatografia (CCD, CLV, CCC e CLAE semi-preparativa) e análises 
espectroscópicas para elucidação estrutural. Em paralelo, foram realizados 
ensaios de atividade anti-inflamatória do extrato bruto e das frações das folhas 
da espécie, como também ensaios de atividade antimicrobiana do extrato bruto 
das folhas e do endocarpo dos frutos. 
 
4.1 COLETA, SECAGEM E MOAGEM DO MATERIAL VEGETAL 
No dia 05 de maio de 2012 foram coletados: folhas, frutos verdes e 
maduros e cascas de G. americananas mediações da Praia de Barreta 
pertencente ao município Nísia Floresta, situado no litoral do Rio Grande do 
Norte, com as seguintes coordenadas geográficas: longitude: - 35,1115 (oeste), 
latitude: - 6,1278 (sul) e altitude: 22 m. 
Material testemunho foi depositado no herbário da UFRN, sob exsicata 
de número 12251. O material foi identificado pelo botânico Alan Roque. Para a 
coleta do material foi obtida autorização pelo Sistema de Autorização e 
Informação em Biodiversidade (SISBio)/Ministério do Meio Ambiente, sob 
número 35017. Adicionalmente foi obtida autorização para acesso ao 
patrimônio genético com finalidade de pesquisa científica via Plataforma Carlos 
Chagas/CNPq (número do processo 010688/2012-9). 
Após a coleta e identificação, as folhas foram submetidas à secagem em 
estufa de ar circulante sob temperatura não superior a 45C e moídas com o 
auxílio de um liquidificador industrial. Os frutos foram conservados em 
congelador. Posteriormente com a separação do endocarpo e pericarpo, que 
foi feita com auxílio de uma faca, essas partes foram utilizadas in natura no 
processo extrativo, separadamente. 
 
 
42 
 
 
 
4.2 EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS 
De acordo com o uso popular foram preparados extratos com as folhas e 
com os frutos. Os extratos foram preparados utilizando-se os métodos 
descritos a seguir: 
4.2.1 Maceração das folhas 
 O material vegetal foi deixado em contato com álcool: água (70:30, v/v), 
na proporção material vegetal: líquido extrator de 2:10, p/v por 7 dias. Após 
esse período, o líquido foi filtrado, obtendo-se o Extrato Hidroetanólico das 
Folhas (EHF) de G. americana. Para obtenção desse extrato foi utilizado 1,8 kg 
de droga vegetal seca e moída. 
4.2.2 Maceração do pericarpo dos frutos maduros 
 O material vegetal fresco foi deixado em contato com álcool: água 
(70:30, v/v), durante 7 dias, na proporção material vegetal: líquido extrator de 
2:10, p/v. Após esse período, o líquido foi filtrado, obtendo-se o Extrato 
Hidroetanólico do Pericarpo (EHP) dos frutos de G. americana. Para obtenção 
desse extrato foi utilizado 800 g de pericarpo fresco e maduro. 
4.2.3 Maceração do endocarpo dos frutos maduros 
O material vegetal fresco foi deixado em contato com álcool: água 
(70:30, v/v), durante 7 dias, na proporção material vegetal: líquido extrator de 
2:10, p/v. Após esse período, o líquido foi filtrado, obtendo-se o Extrato 
Hidroetanólico do Endocarpo (EHE) de G. americana. Para obtenção desse 
extrato foi utilizado 800 g de endocarpo fresco e maduro. 
Para o melhor entendimento do trabalho, a metodologia foi dividida em 
três partes: estudo fitoquímico das folhas, estudo fitoquímico dos frutos e 
estudo biológico de extratos das folhas e frutos de G. americana. 
 
4.3 ESTUDO FITOQUÍMICO DAS FOLHAS DE G. americana 
Para a identificação dos marcadores e/ou compostos ativos das folhas 
de G. americana, o EHF foi fracionado (partição líquido-líquido) com solventes 
de polaridade crescente; éter de petróleo, diclorometano (CH2Cl2), acetato de 
43 
 
 
 
etila (AcOEt) e n-butanol (n-BuOH). Com 2700 mL desse extrato foram 
realizadas seis partições em funil de separação, cada uma foi desenvolvida 
com 450 mL do extrato e 300 mL de solvente orgânico (3 × 300 mL/cada 
solvente) (Fluxograma 1). 
 
Todas as frações obtidas do EHF foram concentradas com o auxílio de 
evaporador rotatório sob pressão reduzida e temperatura inferior a 50°C e 
foram armazenadas em dessecador de vidro, para posterior obtenção dos 
valores dos rendimentos de cada fração. 
 
4.3.1 Análises cromatográficas do EHF de G. americana 
4.3.1.1 Análises por CCD 
O EHF e as frações obtidas da partição líquido-líquido foram analisados 
preliminarmente por CCD, com uso de cromatoplacas de alumínio de sílica gel 
60 F254 e diferentes sistemas de solvente e reveladores (Quadro 2). 
 
 
 
 
 
 
Rota-evaporação 
de etanol 
9000 mL de EHF 
1,8 Kg de folhas secas e moídas: 9000 mL etanol 70% 
2700 mL EHF concentrado- 6 partições líquido-líquido 
(3x 460mL EHF: 300mL) solvente orgânico 
Fr. AcOEt Fr. CH2Cl2 Fr. Éter de 
Petróleo 
Fr. BuOH Fr. Residual 
Aquosa 
Fluxograma 1: Esquema de partição líquido-líquido do EHF. 
44 
 
 
 
Quadro 02 : Sistemas cromatográficos empregados em CCD. 
SISTEMA Fase Móvel Revelador 
I acetato de etila: ácido fórmico: água: 
metanol (8:1:1:1, v/v/v/v) 
Vanilina Sulfúrica 
II acetato de etila: ácido fórmico: água: 
metanol (10:1,6:1,5:0,6, v/v/v/v) 
Reagente Natural A -
1%. UV: 365 nm 
III acetato de etila: ácido fórmico: água: 
metanol (10:1,6:1,5:0,6, v/v/v/v) 
Vanilina Sulfúrica 
IV acetato de etila: ácido fórmico: água: 
metanol (10:0,5:0,2:0,6, v/v/v/v) 
Reagente Natural A -
1%. UV: 365 nm 
V acetato de etila: ácido fórmico: água: 
metanol (10:0,5:0,2:0,6; v/v/v/v) 
Vanilina Sulfúrica 
 
4.3.1.2 Análise do EHF de G. americana por CLAE: 
Para a análise do EHF de G. americana por CLAE, foi utilizado 
inicialmente o método 1, posteriormente, após adaptações, utilizou-se o 
método 2. 
A seguir têm-se detalhadas as condições cromatográficas de cada 
método utlizado: 
Método 1: cromatógrafo líquido de alta pressão PerkinElmer® Series 
200, equipado com detecto de arranjo diodos (DAD), bomba quaternária, 
degasser e injetor automáticos. Os dados foram processados no software 
TotalChrom® Workstation, o volume de injeção foi de 10 μL, a temperatura de 
análise:24± 2°C; coluna Phenomenex® Luna C18 (250 × 4,6 mm; 5 mm). O 
sistema de gradiente combinou o solvente A (acetonitrila) e o solvente B (ácido 
acético 1%, ajustado ao pH 3,0): gradiente 0-30min A-B (5:95 v/v) a (20:80 v/v); 
30-40 min isocrático A-B (20:80 v/v). As fases móveis foram preparadas e 
desgaseificadas com utilização de banho de ultrassom e sistema de vácuo. O 
fluxo de 1 mL/min foi mantido constante e o cromatograma extraído no 
espectro de UV com comprimento de 340 nm, e monitorados com arranjo de 
diodos de 200 a 500 nm. A amostra injetada foi preparada com concentração 
conhecida: EHF (2,5 mg̸/L). 
Método 2: cromatógrafo líquido de alta pressão Varian® Pro-star, 
equipado com detector de arranjo diodos (DAD), bomba quaternária, e injetor 
automático . Os dados foram processados no software Galaxy, o volume de 
45 
 
 
 
injeção foi de 10 μL; temperatura da análise: 24± 2°C; coluna Phenomenex® 
Luna C18 (250 × 4,6 mm; 5 mm). O sistema de gradiente combinou o solvente 
A (acetonitrila) e o solvente B (ácido acético 0,3%, ajustado ao pH 3,0): 
isocrático 0-5 min A-B (13:87 v/v); 5-40 min gradiente A-B (13:87 v/v) a A-B 
(18:82 v/v); 40-45 min gradiente de A-B (18:82 v/v) a A-B (20:80 v/v) e 45-50 
min gradiente de A-B (20:80 v/v) a A-B (21:79 v/v). As fases móveis foram 
preparadas e desgaseificadas com utilização de banho de ultrassom e sistema 
de vácuo. O fluxo de 1 mL/min foi mantido constante e o cromatograma 
extraído no espectro de UV com comprimento de 355 nm, e monitorados com 
arranjo diodos de 200 a 500 nm. A amostra do EHF injetada foi preparada com 
concentração de 2,5 mg/mL. 
Frações semi-purificadas obtidas nos processos de isolamento por 
coluna cromatográfica clássica também foram analisadas. Para essas análises 
foram utilizados cromatógrafos da UFRN (de acordo com a disponibilidade) e 
do Laboratório de Farmacognosia da USFC, sob colaboração do Prof. Dr. 
Flávio Henrique Reginatto. 
 Os solventes utilizados nas análises por CLAE foram acetonitrila, ácido 
acético (grau CLAE) e água purificada com sistema Milli-Q. As soluções 
preparadas para utilização no cromatógrafo foram filtradas com membrana 
PVDF 0,45 mm. 
 
4.3.1.3 Análises por CLAE semi-preparativa: 
Para o isolamento de substâncias por CLAE semi-preparativa 
inicialmente foi necessário o desenvolvimento de um método por meio de 
CLAE analítica para posterior