Avaliação de Nasturtium officinale contra Leishmania amazonensis

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UNIVERSIDADE DO RIO DE JANEIRO 
FACULDADE DE FARMÁCIA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM 
CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 
 
 
 
 
 
Avaliação do Perfil Fitoquímico e 
Atividade Anti-Leishmania amazonensis de 
Nasturtium officinale W.T. Aiton (Brassicaceae) 
 
 
 
 
IASMIM CASTRO DE LIMA SANTIAGO 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2018 
ii 
 
 
 
IASMIM CASTRO DE LIMA SANTIAGO 
 
 
 
Avaliação do Perfil Fitoquímico e 
Atividade Anti-Leishmania amazonensis de 
Nasturtium officinale W.T. Aiton (Brassicaceae) 
 
 
 
 
Dissertação de Mestrado apresentada ao 
Curso de Pós-Graduação em Ciências 
Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da 
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como 
requisito parcial à obtenção do título de Mestre 
em Ciências Farmacêuticas. 
 
Orientador: Dr. Igor de Almeida Rodrigues 
Coorientadora: Drª. Ana Claudia F. Amaral 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2018 
iii 
 
 
 
IASMIM CASTRO DE LIMA SANTIAGO 
 
Avaliação do Perfil Fitoquímico e Atividade Anti-Leishmania amazonensis de 
Nasturtium officinale W.T. Aiton (Brassicaceae) 
 
 
Dissertação de Mestrado apresentada ao 
Curso de Pós-Graduação em Ciências 
Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da 
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como 
requisito parcial à obtenção do título de Mestre 
em Ciências Farmacêuticas. 
 
Aprovada em _________________ 
 
Orientador: 
 
___________________________________________________________________ 
Prof. Dr. Igor de Almeida Rodrigues, FF, UFRJ. 
Coorientadora: 
 
___________________________________________________________________ 
Profª. Drª. Ana Claudia F. Amaral, Farmanguinhos, FIOCRUZ. 
 
Banca examinadora: 
 
___________________________________________________________________ 
Profª. Drª. Carla Holandino Quaresma, FF, UFRJ. 
 
___________________________________________________________________ 
Prof. Dr. Leopoldo Barrato, FF, UFRJ. 
 
___________________________________________________________________ 
Profª. Drª. Danielle Pereira Vieira, IMPG, UFRJ. 
 
iv 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Agradeço primeiramente a Deus que me guiou e me capacitou para essa conquista. 
Agradeço à minha família. Minha mãe Eliane, meu pai Alfredo e minha avó Gentilina 
que me criaram e se preocuparam sempre com a minha educação, me permitindo 
chegar até aqui. Ao meu irmão Matheus, à minha tia Elisione e minha prima Roberta, 
muito obrigada pelo carinho e pelo apoio de todas as horas. Em especial agradeço 
ao meu marido Mateus Santiago por sempre estar ao meu lado, por todo apoio e 
compreensão. Eu amo vocês. 
Aos meus orientadores, Igor e Ana Claudia por me dedicarem seu tempo e sua 
confiança. Obrigada pela compreensão, pelo ensinamento e por todos os esforços 
para concretização deste trabalho. 
Aos companheiros de laboratório, do LABAN e do PN1: Flávia, Michele, Elis, Geisa, 
Viviane, Aline, José Luiz, em especial à Andreza, Mariana, Maria Athana e 
Jerfferson, obrigada por todo auxílio que vocês me deram, pela paciência e pelos 
bons momentos vividos que tornaram o trabalho mais agradável. 
À Profª. Drª Suzana Côrte-Real pelo auxílio e por abrir as portas de seu laboratório. 
À Profª. Drª Alane Vermelho pela colaboração. 
Ao Prof. Dr. Alexandre Pyrho pela doação de animais para os experimentos. 
Ao Prof. Dr. Eduardo Ricci pelo método de obtenção das nanoemulsões. 
Ao professor Leopoldo Baratto pela excelente experiência proporcionada a mim com 
o estágio à docência. 
Aos professores Suzana Leitão, Carla Holandino, Danielle Vieira, Leopoldo Baratto e 
Alexandre Pyhro por aceitarem participar desta banca examinadora, como titular ou 
suplente. 
Também a todos que de alguma forma participaram da minha trajetória, 
amigos, familiares, líderes, professores. 
E aos órgãos de fomento CNPq, CAPES e FAPERJ pelo apoio financeiro. 
v 
 
 
 
RESUMO 
 
 
LIMA, Iasmim Castro Santiago. Avaliação do perfil fitoquímico e atividade anti-
Leishmania amazonensis e Nasturtium officinale W.T. Aiton (Brassicaceae). Rio de 
Janeiro, 2018. Dissertação (mestrado) – Programa de Pós-graduação em Ciências 
Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Rural do Rio de 
Janeiro, Rio de Janeiro, 2018. 
 
A leishmaniose é uma doença causada por protozoários intracelulares do gênero 
Leishmania. Os medicamentos disponíveis apresentam eficácia limitada e muitos 
efeitos adversos. Neste contexto, os produtos naturais surgem como fonte 
promissora de substâncias bioativas e potenciais candidatas a novos 
antileishmaniais. Nasturtium officinale (Brassicaceae) é uma espécie vegetal rica em 
substâncias ativas, com diversas ações farmacológicas descritas na literatura, como 
atividade anticâncer, antioxidante, anti-inflamatória e antimicrobiana. Desta forma, o 
objetivo deste estudo foi avaliar o perfil fitoquímico e a atividade anti-Leishmania 
amazonensis dos extratos, frações e subfrações de N. officinale, bem como da 
principal substância bioativa, o 2-feniletil-isotiocianato (PEITC), na forma livre e 
nanoemulsionada. Para isto, foram obtidos macerados da planta inteira seca (NOFS) 
e fresca (NOFF) em diclorometano, e em etanol absoluto (fresca - NOEE). NOEE 
seco foi submetido a partições sólido-líquido em diclorometano (NODIC) e metanol 
(NOMET). NODIC e NOMET foram submetidas à cromatografia de coluna aberta 
com Sephadex® LH20, gerando 20 (ND1 a 20) e 16 (NM1 a 16) subfrações, 
respectivamente. Todos os derivados de N. officinale foram analisados por 
cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas (CG-EM). Ainda, foi 
preparada uma nanoemulsão contendo PEITC (Nano-PEITC), utilizando Pluronic® 
127 como tensoativo. A atividade antileishmanial e citotóxica (magrafagos murinos) 
foram avaliadas utilizando o sal de tetrazólio (MTT) como indicador. NODIC, NOFF e 
ND11 apresentaram atividade anti-L. amazonensis sob as formas promastigotas 
(IC50 = 110, 8,2 e 1,02 µg/mL, respectivamente). A atividade observada pode ser 
atrelada à concentração de PEITC das amostras. PEITC apresentou IC50 igual a 0,9 
µg/mL. As principais alterações na ultraestrutura de parasitos tratados com PEITC 
foram dilatação mitocondrial, formação de vesículas no citoplasma e na bolsa 
flagelar. NOFF e PEITC apresentaram citotoxicidade para macrófagos (CC50 = 3,02 
e 1,25 µg/mL, respectivamente); e células VERO (CC50 = 45,9 e 15,7 µg/mL, 
respectivamente). Nano-PEITC aumentou a atividade antileishmanial (IC50 = 0,18 
µg/mL), além de melhorar o perfil citotóxico frente a macrófagos e células VERO 
(CC50 = 0,9 e 6,1 µg/mL, respectivamente). Somados, os resultados apresentados 
mostram o potencial dos extratos, subfrações de N. officinale, de PEITC e sua 
nanoemulsão como agentes antileishmaniais. 
 
Palavras-Chave: Nasturtium officinale; 2-feniletil-isotiocianato; Leishmania 
amazonensis; leishmaniose; atividade antileishmanial; nanoemulsão. 
vi 
 
 
 
ABSTRACT 
 
 
LIMA, Iasmim Castro Santiago. Evaluation of phytochemical profile and 
anti-Leishmania amazonensis activity of Nasturtium officinale W.T. Aiton 
(Brassicaceae). Rio de Janeiro, 2018. Dissertação (mestrado) – Programa de Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia, Universidade 
Federal Rural do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2018. 
 
Leishmaniasis is a disease caused by intracellular protozoa from Leishmania genus. 
The current drugs have limited efficacy and many adverse effects. In this context, 
natural products emerge as a promising source of bioactive substances and potential 
drug candidates leishmaniasis treatment. Nasturtium officinale (Brassicaceae) is a 
plant species rich in active substances, with several pharmacological properties 
previously described as anticancer activity, antioxidant, anti-inflammatory and 
antimicrobial activity. Thus, the objective of this study was to evaluate the 
phytochemical profile and anti-Leishmania amazonensis activity of extracts, fractions 
and subfractions of N. officinale, as well as its major component2-phenylethyl-
isothiocyanate (PEITC) in the free and nanoemulsion forms. For this, macerates of 
dried (NOFS) and fresh (NOFF) plants were obtained in dichloromethane, and in 
absolute ethanol (fresh plant - NOEE). The dry extract of NOEE was subjected to 
solid-liquid partitions in dichloromethane (NODIC) and methanol (NOMET). NODIC 
and NOMET were subjected to open-column chromatography with Sephadex® LH20, 
generating 20 (ND1-20) and 16 (NM1-16) subfractions, respectively. All N. officinale 
derivatives were analyzed by gas chromatography coupled to the mass spectrometer 
(GC-MS). Further, a nanoemulsion containing PEITC (Nano-PEITC) was prepared 
using Pluronic® 127 as surfactant. The antileishmanial and cytotoxic (murine 
macrophages) activities were determined by tetrazolium salt method (MTT). NODIC, 
NOFF and ND11 showed anti-L. amazonensis activity against promastigote forms 
(IC50 = 110, 8.2 and 1.02 μg/mL, respectively). The activity was shown to be linked to 
the PEITC concentration of the samples. PEITC showed IC50 equal to 0.9 μg/mL. 
Changes in the ultrastructure of parasites treated with PEITC such as mitochondrial 
dilatation, formation of vesicles in the cytoplasm and in the flagellar pocket were 
observed. NOFF and PEITC presented cytotoxicity against macrophages (CC50 = 
3.02 and 1.25 μg/mL, respectively); and VERO cells (CC50 = 45.9 and 15.7 μg/mL, 
respectively). Nano-PEITC showed higher antileishmanial activity (IC50 = 0.18 
μg/mL), and a better cytotoxic profile against macrophages and VERO cells (CC50 = 
0.9 and 6.1 μg/mL, respectively). Finally, the results presented show the potential of 
N. officinale, PEITC and its nanoemulsion as antileishmanial agents. 
 
Key words: Nasturtium officinale; 2-phenylethyl-isothiocyanate; Leishmania 
amazonensis; leishmaniasis; antileishmanial activity; nanoemulsion. 
vii 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
5’-GDP - Guanosina 5’-difosfato-D-manose 
AKT - Proteína quinase B 
C5-C9 – Elementos do sistema complemento 
CC50 - Concentração tóxica de 50% (do inglês half maximal citotoxicity 
concentration) 
CC90 - Concentração inibitória de 90% (do inglês maximal citotoxicity concentration) 
CCD – Cromatografia de camada delgada 
CG-MS – Gas chromatography–mass spectrometry (CG – EM - Cromatografia 
gasosa acoplada espectrometria de massas) 
CMI - Concentração mínima inibitória 
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium 
DMSO - Dimetilssulfóxido 
DR4 e DR5 - Receptores de morte celular 
EGFR - Receptor do fator de crescimento epidérmico 
HER2 - Receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 
i.p.- Intraperitoneal 
IC50 – Concentração inibitória de 50% (do inglês half maximal inhibitory 
concentration) 
IC90 - Concentração inibitória de 90% (do inglês maximal inhibitory concentration) 
IDRM - Intradermorreação de Montenegro 
LCD – Leishmaniose cutânea disseminada 
LCL – Leishmaniose cutânea localizada 
LD – Leishmaniose difusa 
LMC -Leishmaniose mucocutânea 
LT – Leishmaniose cutânea 
LV – Leishmaniose visceral 
MDA - Malondialdeído hepática 
MTT - Sal de tetrazólio 
NNK - 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona 
NODIC – Partição em diclorometano do extrato etanol de N. officinale 
NOEE – Extrato etanólico de Nasturtium officinale 
viii 
 
 
 
NOMET – Partição em metanol extrato etanol de N. officinale 
ND11 – Subfração de NODIC 
NOFF – Extrato em diclorometano da planta fresca 
NOFS – Extrato em diclorometano da planta seca 
Nano-PEITC – Nanoemulsão de 2-feniletil-isotiocianato 
PBS - Tampão fosfato-salino 
PCR – Reação de cadeia da polimerase 
PDI - Índice de polidispersão 
PEITC - 2-feniletil-isotiocianato 
PKDL - leishmaniose pós-calazar 
R2 – Coeficiente de determinação 
Sb – Antimônio 
SFB – Soro fetal bovino 
SOD - Superóxido desmutase 
subCMI - Concentração subinibitória inibitória 
ROS – Espécies reativas de oxigênio 
Th1 – T cell helper 1 
Th2 – T cell helper 2 
TRAIL - Vias apoptóticas mediadas pelo ligante indutor de apoptose relacionado 
com TNF 
v.o. – Via oral 
UV - Ultravioleta 
ix 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1. Formas clínicas da leishmaniose Cutânea............................................................2 
Figura 2. Principais formas evolutivas de Leishmania durante o ciclo de vida....................5 
Figura 3. Ciclo biológico da Leishmania..............................................................................7 
Figura 4. Status epidemiológico de leishmaniose cutânea endêmica no mundo 
em 2015................................................................................................................................9 
Figura 5. Fármacos utilizados no tratamento da leishmaniose.........................................11 
Figura 6. Nasturtium officinale............................................................................................17 
Figura 7: Produtos da hidrólise enzimática dos glucosinolatos..........................................20 
Figura 8. Estrutura de uma nanoemulsão O/A ou A/O.......................................................23 
Figura 9: Configuração e funcionamento do microfluidizador, homogeneizador 
e ultrassonicador.................................................................................................................26 
Figura 10. Fluxograma de fracionamento do extrato bruto em etanol da 
espécie vegetal...................................................................................................................32 
Figura 11. Fluxograma de fracionamento dos extratos em diclorometano........................33 
Figura 12: CCD de algumas das subfrações (ND) obtidas de NODIC antes 
da reunião de semelhantes.................................................................................................44 
Figura 13. Efeito inibitório de NODIC (A), ND11 (B), NOFF (C) e 
anfotericina B (D) sobre formas promastigotas de L. amazonensis....................................47 
Figura 14. Efeito inibitório de PEITC sobre formas promastigotas de 
L. amazonensis...................................................................................................................48 
Figura 15. Curva de inibição das amostras ND11, NOFF e PEITC...................................49 
Figura 16. Efeito citotóxico das subfrações sobre macrófagos peritoneais.......................51 
Figura 17. Efeito inibitório sobre formas promastigotas de L. amazonensis (A) 
e efeito citotóxico em macrófagos peritoneais (B) da forma nanoemulsionada 
x 
 
 
 
de PEITC (nano-PEITC).....................................................................................................53 
Figura 18. Efeito citotóxico das NOFF, PEITC e nano-PEITC sobre células 
VERO..................................................................................................................................55 
Figura 19. Atividade hemolítica das amostras NOFF, PEITC e nano-PEITC....................56 
Figura 20. Alterações na ultraestrutura de L. amazonensis...............................................58 
 
xi 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1: Massa das frações obtidas das colunas cromatográficas NODIC e 
NOMET.................................................................................................................................35 
Tabela 2: Substâncias detectadas pela análise de CG-EM.................................................45 
Tabela 3: Caracterização da nanoemulsão: diâmetro, PDI e características 
organolépticas......................................................................................................................52 
Tabela 4. Índice de Seletividade..........................................................................................54 
Tabela 5. Relação dos valores de CC50 em macrófagos peritoneais e em 
 células de linhagem VERO das amostras NOFF, PEITC e nano-PEITC...........................56 
xii 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1. INTRODUÇÃO......................................................................................... 1 
1.1 Leishmaniose e suas classificações ........................................................... 1 
1.2 Ciclo biológico e formas evolutivas da Leishmania ..................................... 3 
1.3 Epidemiologia ............................................................................................. 8 
1.4 Diagnóstico e tratamentos medicamentosos convencionais ..................... 10 
1.5 Os produtos naturais ................................................................................. 14 
1.6 A espécie Nasturtium officinale ................................................................. 17 
1.7 Propriedades químicas, nutricionais e farmacológicas de N. officinale..... 18 
1.8 Nanoemulsões .......................................................................................... 22 
2. OBJETIVOS........................................................................................... 29 
2.1 Objetivo geral ............................................................................................ 29 
2.2 Objetivos específicos ................................................................................ 29 
3. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................... 30 
3.1 Material vegetal ........................................................................................ 30 
3.1.1 Aquisição e autenticação da espécie N. officinale ................................. 30 
3.1.2 Extração e fracionamento do extrato em etanol de N. officinale ............ 30 
3.1.3 Subfracionamento e análise por cromatografia em camada delgada 
(CCD).........................................................................................................................33 
3.1.4 Análises dos extratos e frações de N. officinale por CG-EM ................. 36 
3.1.5 Obtenção e caracterização das nanoemulsões ..................................... 36 
3.2 Atividade antileishmanial .......................................................................... 37 
3.2.1 Cultura de parasitas ............................................................................... 37 
3.2.2 Animais .................................................................................................. 37 
3.2.3 Cultura de macrófagos peritoneais murinos .......................................... 38 
3.2.4 Cultura de células VERO ....................................................................... 38 
xiii 
 
 
 
3.2.5 Avaliação da atividade antileishmanial .................................................. 38 
3.2.6 Perfil de inibição do crescimento de L. amazonensis ............................ 39 
3.2.7 Ensaio de citotoxidade ........................................................................... 40 
3.2.8 Índice de Seletividade ............................................................................ 41 
3.2.9 Potencial hemolítico ............................................................................... 41 
3.2.10 Avaliação de alterações na ultraestrutura celular ................................ 41 
4. RESULTADOS ...................................................................................... 43 
4.1 Obtenção das subfrações ativas ............................................................... 43 
4.2 Análises dos cromatogramas obtidos por CG-EM .................................... 44 
4.3 Avaliação da atividade antileishmanial ..................................................... 46 
4.4 Efeito de ND11, NOFF e PEITC no crescimento de L. amazonensis ....... 48 
4.5 Citotoxidade em macrófagos peritoneais murinos .................................... 50 
4.6 Caracterização da nanoemulsão de PEITC .............................................. 50 
4.7 Atividade antileishmanial e citotóxica de nano-PEITC .............................. 52 
4.8 Índice de seletividade ............................................................................... 53 
4.8 Citotoxidade em células VERO ................................................................. 54 
4.9 Potencial hemolítico .................................................................................. 56 
4.10 Avaliação de ultraestruturas do parasita – microscopia eletrônica ......... 57 
5. DISCUSSÃO.......................................................................................... 59 
6. CONCLUSÃO ......................................................................................... 69 
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................ 70 
8. APÊNDICES ........................................................................................... 86 
 
 
 
 
1 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
 
1.1 Leishmaniose e suas classificações 
 
Leishmaniose é um termo genérico para diversas manifestações clínicas 
causadas por espécies de parasitas pertencentes ao gênero Leishmania 
(Trypanosomatidae). É uma doença tropical causada por protozoário intracelular que 
acomete células do sistema imunitário. Sua transmissão ocorre através da picada de 
insetos flebotomíneos. Trata-se de uma doença zoonótica, ou seja, acomete outras 
espécies vertebradas além de humanos, como cães e ratos. A leishmaniose pode 
ser classificada de acordo com a localização geográfica e as diferentes espécies do 
parasita. A leishmaniose do Velho Mundo ocorre no oriente, continente Asiático, 
continente Africano e sul da Europa. Já a leishmaniose do Novo Mundo está 
relacionada ao Ocidente, sendo endêmica na América Central e na maioria dos 
países da América do Sul (KEVRIC et al., 2015). 
Quando classificadas em função das manifestações clínicas, as 
leishmanioses são divididas inicialmente como leishmaniose visceral (LV) e 
leishmaniose tegumentar (LT). A primeira envolve a infecção de órgãos internos 
vitais, como fígado, baço e medula óssea. Já a leishmaniose tegumentar é 
caracterizada por lesões ulcerosas na pele que podem retroceder espontaneamente, 
mas deixam cicatrizes que levam ao estigma social dos indivíduos acometidos 
(ALVAR & ARANA, 2017). Na LV normalmente estão envolvidas as espécies 
Leishmania donovani e Leishmania infantum. No caso da LT e suas variações, as 
espécies mais frequentes em humanos incluem: Leishmania major, Leishmania 
tropica e Leishmania aethiopica no Velho Mundo; e Leishmania mexicana, 
Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania panamensis e 
Leishmania guyanensis no Novo Mundo (BARRETT & CROFT, 2012). 
 A LT é ainda subdivida em leishmaniose cutânea localizada (LCL), 
mucocutânea (LMC), cutânea disseminada (LD) e cutânea difusa (LCD) (Figura 1). 
Esta diferenciação decorre das apresentações clínicas diversas que são geralmente 
associadas à resposta imunológica variada do hospedeiro e às diferentes espécies 
 
 
2 
 
infectantes do parasita (MARTINS et al., 2014; VRIES et al., 2015). Outra 
manifestação cutânea, conhecida como leishmaniose pós-calazar (PKDL), pode 
surgir após o tratamento da LV. Esta manifestação clínica é caracterizada pelo 
surgimento de lesões maculares, papulares ou nodulares na pele. No entanto, os 
mecanismos pelos quais a PKDL surge ainda não são bem compreendidos (ALVAR 
& ARANA, 2017). 
 
Figura 1. Formas clínicas da leishmaniose cutânea. (A) Leishmaniose cutânea localizada. A 
formação de lesão caracterizada por úlcera com bordas elevadas, infiltrada, fundo profundo e 
granuloso, drenado e com secreção esbranquiçada pode ser observada; (B) Leishmaniose cutânea 
difusa. Caracterizada pela formação de placas infiltradas; (C) Leishmaniose cutânea disseminada. 
Nesta forma da doença, há formação de polimorfismo lesional e lesões distribuídas em diversos 
segmentos do corpo; (D) Leishmaniose mucocutânea. Edema nasal com comprometimento da parte 
superior do lábio (TEIXEIRA et al., 2013). 
 
A forma mais comum de leishmaniose é a LCLcom 0,7 a 1.3 milhão de novos 
casos ocorrendo anualmente em todo o mundo. É caracterizada por uma ou mais 
lesões formadas no local da picada que podem se desenvolver em meses ou 
semanas após o inóculo. Úlceras surgem no local da picada, apresentando bordas 
rígidas e erosão central que pode ser coberta por crosta. As lesões podem 
 
 
3 
 
apresentar infecções secundárias, mas em geral, apresentam boa resposta ao 
tratamento, podendo ocorrer inclusive sua regressão espontânea. (KEVRIC et al., 
2015). 
É estimado que de 3% a 5% dos casos de LT desenvolvam lesões em 
mucosas, levando ao quadro de LMC. Esta pode evoluir após a cura clínica da LCL, 
com início insidioso e pouca sintomatologia. Os parasitas migram das lesões na pele 
até as mucosas da boca, nariz, palato, faringe e laringe, através da corrente 
sanguínea ou linfática. A LMC se expressa por lesões destrutivas localizadas nas 
mucosas das vias aéreas superiores, formando úlceras que causam destruição do 
septo nasal, lábios e palato, podendo acarretar em desfiguração facial (DAVID & 
CRAFT, 2009). 
As características clínicas da LD incluem múltiplas lesões em mais de uma 
parte do corpo, podendo ser acneiformes, nodulares ou ulceradas, em um quadro 
que sugere disseminação hematogênica. Alguns estudos prévios confundiam a LD 
com a LCD, mas na forma disseminada, do ponto de vista histopatológico, são 
observados nas lesões infiltrados mononucleares com presença de linfócitos, 
macrófagos e poucos parasitos. Outro aspecto a ser destacado nesta forma clínica é 
o acometimento mucoso concomitante que tem sido observado em até 30% dos 
pacientes (BRASIL, 2007; CARVALHO et al., 2008). 
A LCD constitui uma forma clínica rara, porém grave, que ocorre em 
pacientes com anergia e deficiência específica na resposta imune celular a 
antígenos de Leishmania. Tem início com lesão única que não cicatriza 
espontaneamente. A lesão tende a regredir após tratamento, mas recidivas podem 
ocorrer. Estas evoluem de forma lenta com formação de placas e múltiplas lesões 
nodulares não ulceradas recobrindo grandes extensões cutâneas (BRASIL, 2007; 
SUNDAR & RAI, 2009; KEVRIC et al., 2015). 
 
 
1.2 Ciclo biológico e formas evolutivas da Leishmania 
 
Os vetores responsáveis pela transmissão dos parasitas são conhecidos 
popularmente como mosquitos-palha (sandflies no inglês) e integram os gêneros 
Phlebotomus (velho mundo) e Lutzomyia (novo mundo) da família Psychodidae e 
 
 
4 
 
subfamília Phlebotominae. O primeiro ocorre no Velho Mundo, e o segundo é 
responsável pela disseminação da doença no Novo Mundo (KEVRIC et al., 2015). O 
ciclo biológico da Leishmania é heteroxênico, ocorrendo parte no hospedeiro 
vertebrado e a outra parte no inseto. Desta maneira, o parasita apresenta dois 
estágios de desenvolvimento: a forma promastigotas, encontrada no interior do 
inseto vetor; e a forma amastigota, que ocorre mediante a diferenciação de 
promastigotas após a infecção de células do sistema fagocítico mononuclear do 
hospedeiro mamífero (SÉGUIN & DESCOTEAUX, 2016). 
As diferentes formas evolutivas do parasita dependem das mudanças nas 
condições ambientais encontradas no hospedeiro vertebrado e no vetor 
flebotomíneo, como a disponibilidade e tipos de nutrientes, pH, temperatura e 
disponibilidade de oxigênio. Desta forma, os parasitas são capazes de regular sua 
taxa de crescimento e divisão celular, expressão de moléculas de superfície e 
morfologia, entre outros fatores. No flebotomíneo, a Leishmania se reproduz como 
células flageladas extracelulares e ativamente móveis, conhecidas como 
promastigotas, que residem principalmente no trato alimentar do inseto. Entre várias 
formas intermediárias detectadas, é possível descrever duas formas principais: 
promastigotas procíclicas, presentes no intestino médio do inseto; e promastigotas 
metacíclicas, presentes no intestino médio toráxico e probóscide do flebotomíneo. 
As formas promastigotas se diferenciam em amastigotas que por sua vez 
multiplicam dentro do vacúolo parasitóforo de células fagocíticas (por exemplo, 
macrófagos). As amastigotas são parasitas intracelulares obrigatórios e adaptados 
ao ambiente hostil do vacúolo. Nesta forma evolutiva, os parasitas apresentam 
tamanho reduzido, flagelo menor internalizado na bolsa flagelar e não possuem 
motilidade. As amastigotas são acidófilos, adaptados ao baixo pH, e possuem um 
metabolismo energético diferenciado (BESTEIRO et al., 2007). 
A célula promastigota (Figura 2) apresenta forma alongada e elíptica, cujo 
corpo celular mede entre 6 a 8 μm de comprimento, e flagelo alongado emitido da 
bolsa flagelar. Apresenta organelas e estruturas típicas dos eucariotos, tais como 
núcleo, mitocôndria, retículo endoplasmático, complexo de Golgi e citoesqueleto. 
Também são encontradas organelas exclusivas da Família Trypanosomatidae como 
o cinetoplasto, estrutura paraflagelar, acidocalcissomo, glicossomo e microtúbulos 
subpeliculares. As amastigotas (Figura 2) são arredondadas e ovaladas, medem 
 
 
5 
 
aproximadamente 3 μm de largura e 6 μm de comprimento, com flagelo reduzido e 
internalizado. O cinetoplasto possui forma de bastão e fica entre o núcleo e a base 
do flagelo. As amastigotas possuem todas as organelas e estruturas semelhantes às 
promastigotas, exceto pela presença adicional dos megassomos e ausência da 
estrutura paraflagelar (TEIXEIRA et al., 2013; SUNTER & GULL, 2017). 
 
Figura 2. Principais formas evolutivas de Leishmania durante o ciclo de vida. Representação 
esquemática das principais organelas intracelulares das formas promastigota (esquerda) e 
amastigota (direita). A porção anterior da célula é marcada pela presença da bolsa flagelar (adaptado 
de BESTEIRO et al., 2007). 
 
Os membros da família Trypanosomatidae como a Leishmania apresentam 
uma única mitocôndria que possui DNA próprio que pode chegar a 30% do DNA 
total. Nestes protozoários, o DNA mitocondrial se organiza na forma de círculos 
pequenos e grandes que formam cadeias. Concentram-se em uma determinada 
região da mitocôndria, localizada logo abaixo do corpúsculo basal, dando origem a 
uma estrutura denominada cinetoplasto, este apresenta-se em forma de bastão 
levemente curvado. O corpúsculo basal está associado ao flagelo e pode ser 
 
 
6 
 
definido com um local de crescimento de microtúbulos. A estrutura paraflagelar é 
formada por um arranjo de estruturas proteicas associadas ao axonema e se 
prolonga na extensão do flagelo da promastigota. Os acidocalcissomos são 
organelas ácidas ricas em cálcio, polifosfatos e outros íons, além de apresentarem 
canais de transporte passivos e ativos, e trocadores iônicos. São estruturas 
pequenas (600 nm) distribuídas em toda célula e estão envolvidas na manutenção 
da homeostase intracelular, pH e osmorregulação. Os glicossomos são estruturas 
esféricas e distribuídos nas células como os acidossomos, mas tratam-se de um tipo 
de peroxissomos carreando um conjunto de enzimas que compõem a via glicolítica e 
outros processos celulares como β-oxidação de ácidos graxos, gliconeogênese, 
biossíntese de lipídeos, pirimidinas, aminoácidos, dentre outros. Os túbulos 
multivesiculares são estruturas revestidas por membrana e que se encontram ao 
longo do corpo celular de formas promastigotas, é sustentado por dois microtúbulos 
citoplasmáticos que o envolvem. Também estão presentes os megassomos que são 
grandes estruturas eletrondensas encontradas em amastigotas que possuem 
atividade lisossomal, atuam como destino de macromoléculas capturadas no meio 
extracelular por endocitose. Por fim, a Leishmania apresenta estruturas esféricas 
denominadas inclusões lipídicas que são envoltas por uma monocamada de 
fosfolipídios, algumas eletronlucentes e outras eletrondensas (TEIXEIRA et al., 
2013). 
O ciclo biológico (Figura 3) tem início durante o repasto sanguíneo de fêmeas 
hematófagas dos flebotomíneos quandoingerem macrófagos infectados com formas 
amastigotas junto com o sangue. As diferenças no ambiente dentro do inseto em 
relação às células do hospedeiro mamífero, como temperatura e pH, fazem com que 
o parasita sofra modificações morfológicas. As amastigotas se diferenciam em 
promastigotas procíclicas no intestino médio posterior do inseto. Para não serem 
excretados, as promastigotas expressam moléculas que se ligam ao epitélio 
intestinal do inseto. Cerca de 48 a 72 h depois, os parasitas iniciam a replicação e 
melhoram a mobilidade, migrando para o intestino médio anterior, onde secretam um 
tipo de gel feito de proteofosfoglicanos que obstruem fisicamente o intestino. 
Posteriormente, elas migram mais uma vez e alcançam a válvula estomodeal 
(cardíaca), diferenciando-se em promastigotas metacíclicas infectantes e causando 
danos ao epitélio destas células, o que facilita o refluxo dos parasitas através da 
 
 
7 
 
probóscide até alcançarem o hospedeiro. Desta forma, o inseto necessitará 
regurgitar este gel junto com as formas metacíclicas infectantes no hospedeiro para 
conseguir se alimentar novamente, dando início à segunda etapa do ciclo (BATES, 
2007; DOSTÁLOVÁ & VOLF, 2012). 
 
 
Figura 3. Ciclo biológico da Leishmania. A leishmaniose é transmitida pela picada do flebotomíneo 
fêmea infectado. Os insetos injetam formas promastigotas (estágio infectivo) a partir da probóscide 
durante o repasto sanguíneo (1). As formas promastigotas que atingem a região da picada são 
fagocitadas por macrófagos e outros tipos de células do sistema mononuclear fagocítico (2). Os 
promastigotas transformam-se em amastigotas dentro das células do hospedeiro vertebrado (3), que 
se multiplicam por divisão binária simples e passam a infectar outras células do sistema mononuclear 
fagocítico (4). Neste estágio, a infecção apresenta sintomas e os insetos flebotomíneos tornam-se 
carreadores pela ingestão de células infectadas durante o repasto sanguíneo (5, 6). No vetor, formas 
amastigotas são diferenciadas em promastigotas, desenvolvem-se no intestino (7) e migram para a 
probóscide (8) (Adaptado de CDC, 2013). 
 
 
 
8 
 
As formas promastigotas metacíclicas são inoculadas no hospedeiro 
mamífero e logo ocorre uma infiltração de neutrófilos, seguida de recrutamento de 
macrófagos, devido à lesão causada pela picada. Então, os parasitas são 
fagocitados por células do sistema fagocítico mononuclear, principalmente 
macrófagos. Estes internalizam a Leishmania em vacúolos parasitóforos. Desta 
forma, tem início um processo de diferenciação em formas amastigotas e replicação 
por divisão binária. Quando esta multiplicação alcança um ápice, ocorre o 
rompimento do fagócito e formas amastigotas são liberadas, alcançando outras 
células e disseminando a infecção. O ciclo é completado com o repasto sanguíneo 
do flebotomíneo que internaliza células infectadas com Leishmania e servirá de vetor 
para disseminar a doença (KEVRIC et al., 2015). 
Os parasitas do gênero Leishmania são capazes de sobreviver aos 
mecanismos imunes do hospedeiro. Promastigotas metacíclicas infecciosas são 
resistentes à lise mediada pelo sistema complemento, impedindo a inserção do 
complexo de ataque à membrana C5-C9. Para sobreviver dentro do macrófago, o 
parasita precisa resistir ao pH ácido, alta temperatura e ao estresse oxidativo e 
nitrosativo. No vacúolo parasitóforo, eles são capazes de atrasar a fusão dos 
lisossomas e neutralizar parcialmente o meio ácido. Também produzem enzimas 
antioxidantes e proteínas que inibem espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, 
como peróxido de hidrogênio, peroxinitrito, hipoclorito e óxido nítrico, sendo capaz 
de permanecer neste fagolisossomo e proliferar. Além disso, os parasitas alteram a 
sinalização celular, modulam a produção de citocinas e estudos mostram que são 
capazes de modificar o perfil de reposta imune celular Th1 efetora para um fenótipo 
Th2 suscetível (GUPTA et al., 2014). 
 
 
1.3 Epidemiologia 
 
A LT é classificada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como uma 
doença negligenciada de ocorrência em países pobres ou em desenvolvimento. 
Apesar de não ser considerada fatal, as lesões podem causar desfiguração, 
mutilação e trazerem forte estigma social aos indivíduos acometidos. É considerada 
endêmica em 98 países (Figura 4), onde cerca de 350 milhões de pessoas estão 
 
 
9 
 
expostas. Todavia, 75% dos casos são relatados em apenas dez países: 
Afeganistão, Argélia, Brasil, Colômbia, Costa Rica, Etiópia, Irã, Sudão, Peru e Síria. 
Estima-se que ocorram de 0,6 a 1.2 milhão de novos casos todo ano, ou seja, um 
novo caso a cada 30 segundos. No entanto, estes números podem ser maiores 
tendo em vista possíveis falhas de diagnóstico e de notificação de os novos casos. 
O índice tende a aumentar cada vez mais devido à falta de profilaxia correta, como a 
carência de vacinação adequada e o fato de a maior parte da população não realizar 
o controle dos vetores e seus reservatórios corretamente (KARIMKHANI, C. et al. 
2016; ALVAR & ARANA, 2017). No Brasil, entre 2007 a 2013, a LT foi verificada e 
praticamente todos os Estados, com maior registro na Bahia (22.255), Pará (19.930) 
e no Mato Grosso (15.144). Neste mesmo período no Acre foram notificados 5.689 
casos, sendo responsável pela maior taxa de incidência do país (11,1 casos / 10.000 
habitantes/ano) (MELCHIOR et al., 2017). 
 
 
Figura 4. Status epidemiológico de leishmaniose cutânea endêmica no mundo em 2015. Estes 
dados apontam para o Brasil como sendo um dos países com o maior índice da doença no mundo. 
(Adaptado de OMS, 2015). 
 
 
 
 
 
10 
 
1.4 Diagnóstico e tratamentos medicamentosos convencionais 
 
Além do diagnóstico clínico obtido a partir da observação das características 
das lesões, o diagnóstico laboratorial é fundamental. Este consiste em exames 
imunológico, parasitológico e histopatológico. A intradermorreação de Montenegro 
(IDRM) ou da Leishmania é um teste intradérmico que se baseia na resposta de 
hipersensibilidade celular retardada. Deve ser feito de quatro a seis semanas após 
surgimento da lesão. É feita uma aplicação de antígenos de Leishmania no 
antebraço e observada a reação que será considerada positiva quando maior que 5 
mm (GOTO & LINDOSO, 2012). Também são realizados exames de demonstração 
direta ou indireta do parasita. Para a pesquisa direta são utilizadas as seguintes 
técnicas: escarificação da borda da lesão, biópsia ou punção aspirativa. O material 
coletado é fixado e corado com Giemsa, seguida da observação no microscópio 
ótico para pesquisa de formas amastigotas. Também é possível inocular in vitro e in 
vivo o material da lesão obtido por biópsia. O método mais sensível usado é a 
reação em cadeia da polimerase (PCR) que amplifica várias vezes regiões 
específicas do DNA da Leishmania, obtidos de amostras como pele e mucosa. No 
entanto, esta metodologia de análise possui um custo elevado (KEVRIC et al., 2015; 
BRASIL, 2017). 
A terapêutica para os tipos de LT inclui a limpeza das lesões através do uso 
de antissépticos e tratamento das possíveis infecções secundárias com uso de 
antibióticos por via oral ou tópica. Além disto, o paciente deve ser tratado com o 
quimioterápico adequado, em associação ou não, para controle e morte dos 
parasitas (PONTE-SUCRE, 2013). Os fármacos mais utilizados estão demonstrados 
na figura 5. 
Os medicamentos de primeira escolha pertencem à classe dos antimoniais 
pentavalentes: estibogluconato de sódio (Pentostam®) e antimoniato de meglumina 
(Glucantime®). A aplicação do medicamento pode ser intralesional ou sistêmica. 
Nesta última, as injeções devem ser feitas por via intramuscular ou intravenosa, com 
repouso após a aplicação. A via intravenosa é mais recomendada, pois permite a 
aplicação de grandes volumes sem o inconveniente da dor local (BRASIL, 2017). O 
mecanismo de ação desta classe aindanão é bem elucidado, mas são descritas 
quatro hipóteses: (i) antimônio (Sb)(V) sofre redução à Sb(III) no organismo, sendo 
 
 
11 
 
tóxico ao parasita; (ii) formação de complexos entre o Sb(V) e nucleotídeos, 
interferindo no metabolismo através da inibição da topoisomerase do parasita; (iii) 
formação de complexos entre o Sb(V) com alguns glicoconjugados ricos em manose 
e guanosina 5’-difosfato-D-manose (5’-GDP), interferindo na virulência do parasita; 
(iv) inibição da enzima superóxido dismutase (SOD), ocasionando o aumento do 
nível de radicais superóxido, com a consequente morte do parasita. Os efeitos 
adversos incluem artralgia, mialgia, anorexia, náuseas, vômitos, epigastralgia, 
pirose, dor abdominal, pancreatite, prurido, febre, fraqueza, cefaleia, tontura, 
palpitação, insônia, nervosismo, choque pirogênico, edema e insuficiência renal 
aguda e ainda pode causar efeito sobre o sistema cardiovascular (arritmia) 
(OLIVEIRA et al., 2011; BASTOS et al., 2016). 
 
 
Figura 5. Fármacos utilizados no tratamento da leishmaniose. 
 
 
 
12 
 
A segunda escolha terapêutica é a anfotericina B, também administrada via 
intravenosa e comercializada na forma de suspensão coloidal ou na forma 
lipossomal (AmBisome®). Trata-se de um antifúngico que também possui ação 
contra Leishmania. Interage com o ergosterol na membrana celular do 
microrganismo causando desorganização na membrana com formação de poros e 
agregados (PURKAIT et al., 2012). Os efeitos adversos mais frequentes incluem 
febre, cefaleia, tremores, cianose, hipotensão, hipomagnesemia, distúrbio de 
comportamento, calafrios, náuseas, vômitos, hipopotassemia e flebite no local da 
infusão. É contraindicado na gravidez e os pacientes em terapia devem ser 
monitorados quanto a função renal, hepática, eletrólitos séricos e dos componentes 
sanguíneos, além de outros cuidados. Ao realizar a troca do antimonial Glucantime® 
para anfotericina B, deve-se esperar 14 dias para evitar toxicidade cardíaca grave. 
Apesar do AmBisome® possuir melhores resultados devido ao tratamento mais curto 
e diminuição dos efeitos colaterais, possui alto custo, sendo inacessível em lugares 
do mundo onde ocorre alta taxa da doença (KEVRIC et al., 2015; BRASIL, 2017). 
Outra alternativa terapêutica de tratamento para indivíduos resistentes ou 
intolerantes aos antimoniais é a pentamidina. Sendo o medicamento utilizado como 
primeira escolha para tratar infecções pela espécie L. guyanensis, também pode ser 
administrado via intramuscular ou intravenosa (KEVRIC et al., 2015). Seu 
mecanismo de ação ainda não foi totalmente elucidado, mas um importante alvo 
parece ser a mitocôndria. O fármaco interfere na síntese de DNA, acarretando em 
alterações morfológicas no cinetoplasto e causando a fragmentação da membrana 
mitocondrial, o que leva à morte do parasita (MAES et al., 2013). Os efeitos 
adversos descritos incluem hiperglicemia resistente após uso prolongado de 
pentamidina, elevação de creatina quinase, apontando efeito cardiotóxico, além de 
hipotensão, nefrotoxicidade e hepatotoxicidade. O medicamento é contraindicado na 
gestação e lactação, diabetes mellitus, intolerância à glicose, insuficiência renal e 
hepática, além de doenças cardíacas (KEVRIC et al., 2015; BASTOS et al., 2016). 
A miltefosina é um agente terapêutico usado para o tratamento da 
leishmaniose de administração oral. Atua no parasita por meio de diferentes 
mecanismos, tais como interferência com lipídios (fosfatidilcolina), alterações nas 
atividades das fosfolipases C, A2 ou D e na sinalização da transdução de lipídeos, 
inibe a atividade da citocromo c oxidase, e causa despolarização mitocondrial e 
 
 
13 
 
morte semelhante à apoptose (GAMARRO et al., 2013). Efeitos adversos comuns 
incluem náusea, vômito, diarreia, distúrbios gastrointestinais e nefrotoxicidade. É um 
medicamento teratogênico, ou seja, deve ser usado com cautela em mulheres na 
idade fértil e pode causar rápido desenvolvimento de resistência devido ao seu longo 
tempo de meia-vida (BASTOS et al., 2016; BRASIL, 2017). A miltefosina demostrou 
ser muito eficaz para LV, com uma taxa de cura de 95%, enquanto que para LCL 
apresentou taxa bem menor de eficácia: 53% (L. mexicana) e 21% (L. brasiliensis); 
apenas para L. panamensis a taxa de cura foi mais significativa, ficando em 91%. 
Para LMC os percentuais de cura são de 60% a 80% (KEVRIC et al., 2015). 
Outros fármacos que podem ser utilizados incluem a paromomicina - um 
aminoglicosídeo de uso tópico ou oral que possui baixo custo, mas que apresenta 
eficácia variável e efeitos adversos como nefrotoxicidade, ototoxidade e disfunção 
hepática (NASSIF et al., 2017) - azitromicina, cetoconazol e fluconazol, imiquimode, 
entre outros. Há ainda os imunomoduladores usados como adjuvantes no 
tratamento como alopurinol e pentoxifilina que aceleram o processo de cura, mas 
não tem indicação isoladamente. No entanto, estes fármacos de uso secundário 
apresentaram eficácia relativa e necessitam de mais estudos que justifiquem seu 
uso (KEVRIC et al., 2015; BRASIL, 2017). 
Outro recurso terapêutico para o tratamento da leishmaniose é o uso 
combinado de medicamentos, visando diminuir o tempo de tratamento e atenuar os 
efeitos adversos. Estudos realizados com a associação de estibogluconato de sódio 
e paromomicina apresentaram eficácia de 93%. Também foi realizado um estudo de 
fase III na Índia, utilizando anfotericina lipossomal, miltefosina e paromomicina 
(ZULFIQAR et al., 2017). No entanto, mesmo com o recurso das diferentes terapias 
combinadas ainda ocorrem as reações adversas e há outra problemática: o 
surgimento de cepas resistes a muitos destes fármacos (MOHAPATRA, 2014). 
Existem vários mecanismos bioquímicos que conferem resistência 
medicamentosa aos parasitas do gênero Leishmania. Entre eles estão: 
retroalimentação negativa de sistemas de captação de fármacos; inativação ou 
modificação do fármaco; alterações estruturais da molécula-alvo da droga ou em sua 
produção; sequestro intracelular; reparação mais eficaz dos danos causados pela 
ação do fármaco; e ainda contornando um alvo bloqueado através da ativação de 
outros recursos. A compreensão destes mecanismos é importante na intervenção 
 
 
14 
 
inicial do tratamento, utilizando outros recursos terapêuticos como a mudança do 
fármaco ou utilizando a associação de medicamentos, e ainda na busca por novas 
moléculas mais eficazes na morte do parasita (MANDAL et al., 2017). 
Em suma, a terapia usada atualmente é considerada antiga e não há 
inovação neste mercado há algum tempo. Os medicamentos disponíveis 
apresentam efeitos colaterais significativos e alguns destes possuem taxas de 
eficácia relativa, além da identificação de cepas resistentes de espécies de 
Leishmania. Desta forma, torna-se necessária a busca por novos antileishmaniais 
que apresentem maior eficácia e segurança, que exijam um tempo de tratamento 
menor e que sejam administrados por via mais confortável ao paciente (via oral ou 
tópica). 
 
 
1.5 Os produtos naturais 
 
Os produtos naturais possuem grande importância na história da humanidade 
sendo os principais recursos terapêuticos antes da evolução da medicina alopática 
em meados do século XX, quando houve diminuição do interesse do uso de plantas 
medicinais que foram sendo substituídas por medicamentos sintéticos nos centros 
urbanos (FIGUEIREDO et al., 2014). Todavia, nas últimas décadas tem sido 
reconhecida e resgatada a importância do uso desses recursos. Os produtos 
naturais são relevantes na pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos, tanto de 
uso direto quanto servindo como precursores na síntese de compostos ativos. É 
estimado que cerca de 40% dos medicamentos disponíveis foram desenvolvidos a 
partir de produtos naturais, de forma direta ou indireta. O Brasil possui uma grande 
parcela da biodiversidade global, cerca de 15 a 20%, com destaquepara as plantas 
superiores com 24% da biodiversidade. Tendo em vista seu amplo patrimônio 
genético e sua diversidade cultural, o país deve investir na exploração sustentável 
desses recursos, visto as potencialidades do uso de plantas medicinais gerando 
inovação, riquezas e inclusão social (BRASIL, 2006; LIMA-SARAIVA et al., 2015). 
Os vegetais sintetizam metabólitos primários e secundários. Os primários, 
proteínas, carboidratos e lipídeos, são essenciais para a sobrevivência, promovendo 
energia e constituição morfológica. Já os metabólitos secundários promovem 
 
 
15 
 
vantagens adaptativas como proteção contra o ataque de predadores e 
microrganismos, atração de polinizadores, entre outras que favorecem a 
perpetuação de espécies. Estes metabólitos secundários são conhecidos por 
apresentarem atividades biológicas, benéfica ou tóxica, o que proporciona o uso de 
plantas como remédios e como fonte de novos bioativos (POSER, 2016). 
As plantas medicinais podem ser definidas como vegetais que possuem 
moléculas ativas usadas para fins terapêuticos ou como precursoras na síntese de 
fármacos. Enquanto o fitoterápico consiste no uso da planta medicinal para elaborar 
uma formulação específica com finalidade terapêutica. O fitoterápico possui 
parâmetros de eficácia e segurança, o que proporciona a reprodutibilidade do 
produto e garante a qualidade. Diferente dos fitofármacos, os fitoterápicos não 
podem apresentar sustâncias isoladas ou altamente purificadas em sua composição 
(VEIGA et al., 2005; BRASIL, 2006). O uso de plantas medicinais e fitoterápicos é 
uma importante alternativa terapêutica, tornando o acesso à saúde mais inclusivo e 
eficaz, em alguns casos apresenta-se como uma opção menos danosa frente aos 
efeitos colaterais dos medicamentos sintéticos (SANTOS et al., 2011). 
As doenças tropicais negligenciadas são um conjunto de doenças infecciosas, 
no qual a leishmaniose está inserida, que inclui uma série de patógenos e vetores 
que acometem predominantemente as populações mais carentes de países em 
desenvolvimento. Os recursos financeiros globais para pesquisa e desenvolvimento 
de doenças tropicais negligenciadas são menos que 10%, em contraste com outras 
patologias não transmissíveis como câncer, diabetes, cardiopatias que recebem o 
maior apoio das multinacionais farmacêuticas e centros de pesquisa. Há falta de 
interesse pelas grandes indústrias farmacêuticas em investir na busca por novos 
fármacos ou no desenvolvimento de vacinas para tratamento e profilaxia destas 
enfermidades devido ao menor lucro obtido na exploração deste mercado (FEASEY 
et al., 2010; HOTEZ, 2017). Desta forma, os recursos encontrados na natureza têm 
sido reconhecidos como ótima fonte de inovação e alternativa à população mais 
pobre que não têm acesso aos tratamentos convencionais (FUNARI e FERRO, 
2005). 
Foram descritos na literatura diversos extratos de plantas e moléculas 
isoladas derivadas de produtos naturais que se apresentaram como candidatas a 
novos antileishmaniais. Por exemplo, a luteolina e a quercetina, dois flavonoides 
 
 
16 
 
isolados de espécies vegetais, apresentaram IC50 contra amastigotas intracelulares 
de L. donovani de 12,5 e 45,5 μM, além de reduzirem a carga parasitária em 
roedores em 80% (3,5 mg/kg) e 90% (14 mg/kg), respectivamente. O mecanismo de 
ação dos compostos está relacionado com a indução da topoisomerase II que 
promove clivagem no DNA do cinetoplasto do parasita. Outra classe interessante é 
das chalconas. A licochalcona, por exemplo, isolada de espécies de alcaçuz 
(Glycyrrhiza spp.) apresentou forte atividade antileishmanial, contra L. donovani, o 
valor de IC50 em amastigotas intracelulares foi de 0,9 μg/mL (2,7 μM) e 7,2 μg/mL 
(21 μM) para formas promastigotas de L. major. Outra classe interessante é a dos 
alcaloides quinolínicos. Quinolinas 2–substituídas isoladas de Galipea longiflora 
(Rutaceae) apresentaram atividade contra a espécie L. amazonensis. Em 
experimentos in vivo, houve redução no tamanho da lesão em 74% e redução de 
mais de 90% da carga parasitária total em camundongos BALB/c infectados sob 
regime de dosagem de 50 mg/kg em 5 injeções com intervalos de 4 dias. Também 
foram encontrados iridoides, alcaloides quinolínicos, saponinas, terpenos e outras 
classes de metabólitos secundários ativos contra diferentes espécies do gênero 
Leishmania (POLONIO & EFFERTH, 2008). 
Kalanchoe pinnata (Crassulaceae) é uma espécie vegetal cuja composição 
química compreende triterpenos, esterois, flavonoides (quercetina e kaempferol). 
Seu extrato aquoso apresentou efeito leishmanicida em tratamento de camundongos 
BALB/c infectados com L. amazonensis após 30 dias de uso de forma comparável 
ao efeito do antimoniato de meglumina. A atividade do extrato está associada ao 
aumento na produção de óxido nítrico por macrófagos, o que também pode 
aumentar ainda mais o óxido nítrico induzido por INF-γ. A quercetina é a principal 
substância ativa do extrato e apresentou isoladamente um IC50 de 1,0 μg/mL sob 
formas amastigotas intracelulares de L. amazonensis, sendo mais ativa que o 
medicamento de referência Pentostan®. O extrato aquoso de K. pinnata foi testado 
clinicamente em um paciente brasileiro no Estado do Amazonas. O paciente recebeu 
21 mg do extrato liofilizado duas vezes por dia no decorrer de 14 dias. Os resultados 
mostraram uma redução significativa no tamanho da lesão durante o tratamento (DE 
OLIVEIRA et al., 2016). 
 
 
 
17 
 
1.6 A espécie Nasturtium officinale 
 
A espécie Nasturtium officinale R. Brown (Figura 6) (Protólogo: W.T. Aiton, 
Hortus kew. 4:111, 1812) pertence à família Brassicaceae (Cruciferae) que é 
composta por cerca de 37 gêneros 4.060 espécies (The Plant List, 2010). Também 
conhecida como família da mostarda, a família Brassicaceae é cultivada no mundo 
inteiro e teria surgido na costa norte do Mediterrâneo e da Ásia, expandindo-se para 
outras regiões, particularmente no hemisfério norte, onde é bastante abundante. Os 
membros desta família são vegetais importantes na horticultura, sendo hortaliças 
muito consumidas na dieta devido aos seus altos valores nutricionais (ISERI et al., 
2014). 
 
 
Figura 6. Nasturtium officinale (agrião). Planta com inflorescência e exposição dos caules com 
raízes saindo dos nós. (Fonte: Davidse, Gerrit – 39668 Disponível em: 
<http://www.tropicos.org/Image/100234643>). 
 
O gênero Nasturtium reúne 14 espécies vegetais, sendo que destas se 
destacam o N. officinale (agrião) seguido do N. microphyllum, encontrada 
comumente na Europa. A espécie N. officinale (sinonímia: Rorippa nasturtium-
aquaticum (L.) Hayek, 1905) é uma erva verde, suculenta, rizomatosa e perene 
(ISERI et al., 2014). Por se tratar de uma planta aquática ou semi-aquática, o agrião 
é muitas vezes colhido a partir de sistemas de águas naturais e dependendo das 
características destas águas, a qualidade da planta pode ser comprometida. É uma 
espécie amplamente consumida em vários países, incluindo o Brasil. Possui rápido 
 
 
18 
 
crescimento e pode ser consumida crua, como em saladas, ou cozida, como em 
sopas e outras receitas (GOUNDEN et al., 2016). 
O agrião é uma planta herbácea com caule verde e a base pode ser 
arroxeada, sendo flexível, glabro, fistuloso, semicilíndrico e possui sulcos 
longitudinais pouco profundos. Pode atingir entre 10 a 60 cm, mais comumente entre 
15 a 30 cm de comprimento, e até 1 cm de diâmetro na base. Dos nós são 
originadas finas raízes adventícias de coloração esbranquiçada. Apresenta folhas 
alternas, compostas, pecioladas, imparipinadas providas de três a onze folíolos 
membranosos, glabros, de forma variando entre oval, elíptica até orbicular. As flores 
são pequenas, medindo cerca de 5mm de comprimento, brancas e dispostas em 
espigas terminais ou opostas as folhas. A corola é actinomorfa, crucífera e o cálice é 
dialissépalo regular formado dequatro sépalas. O androceu é tetradínamo e o ovário 
apresenta-se súpero bicarpelar. O fruto é siliquo, um pouco recurvado e mais 
comprida que o pedúnculo, e produz muitas sementes. As sementes são pequenas 
e de cor marrom-avermelhadas. A espécie floresce duas vezes ao ano, de abril a 
maio e novembro a fevereiro (SCAVONE & PANIZZA, 1973; CARVALHO, 2001; 
KLIMEK-SZCZYKUTOWICZ et al., 2018). 
 
 
1.7 Propriedades químicas, nutricionais e farmacológicas de N. officinale 
 
N. officinale possui importantes propriedades nutricionais e terapêuticas. Sua 
composição em macronutrientes é de 13,4 g/100 g de proteínas, 3,1 g/100 g de 
lipídeos e 68,5 g/100 g de carboidratos. Além disto, é rico em moléculas protetoras 
como vitamina C (ácido ascórbico), vitamina E (principalmente α-tocoferol), vitamina 
A (β-caroteno), além de vitaminas do complexo B; também contêm minerais como 
cálcio, fósforo, potássio, ferro, magnésio, zinco, e traços de selênio. Apresenta alta 
concentração de ácidos graxos insaturados, principalmente ácido α-linolênico, ácido 
palmítico e ácido linoleico. Para uma boa qualidade nutricional e efeitos benéficos à 
saúde, o alimento deve possuir uma taxa de ácidos graxos poli-insaturados por 
ácidos graxos saturados maior que 4,5% e proporção de ácidos graxos n-6/n-3 
menor que 4%. Neste contexto, o agrião apresenta ótimos valores para estes 
 
 
19 
 
parâmetros, 4,9% e 0,2%, respectivamente (PEREIRA et al., 2011; 
ZAHRADNIKOVA & PETŘIKOVA, 2012). 
Como outros membros da família Brassicaceae, o agrião contém 
glucosinolatos, compostos de enxofre glucosilados, que são responsáveis pelo 
aroma e sabor picante característico inerente à família. Possuem importantes ações 
farmacológicas, atuando como anti-câncer, antioxidante e antibacteriano, entre 
outras (GIALLOUROU et al., 2016). Foram descritos oito glucosinolatos principais 
encontrados no agrião: gluconasturtina, glucobrassicina, glucohirsutina, glucoiberina, 
glucosiberina, glucotropaeolina, 4-hidroxi-glucobrassicina, 4-metoxi-glucobrassicina, 
a partir de folhas, caules, raízes, flores e também sementes. Nas flores e nas 
sementes estão as maiores concentrações destas substâncias, sendo o 
gluconasturtina (2-feniletil glucosinolato) o mais abundante na espécie vegetal. Os 
glucosinolatos são hidrolisados pela ação da enzima mirosinase (β-tioglucosidase) 
(Figura 7) que é ativada através de dano celular, como na mastigação e ao 
fragmentar a hortaliça. Quando cozida, a hidrólise dos glucosinolatos ocorre após a 
ingestão e se dá pela ação de enzimas providas pela microbiota intestinal. No 
entanto, a concentração de isotiocianatos no organismo é muito menor do que a 
fornecida pela ingestão do agrião cru. Os produtos dessa hidrólise são, entre outros, 
isotiocianatos, nitrilas e enxofre, tiocianatos, epitionitrilas, oxazolidina-2-tionas, ou 
compostos indólicos (GETAHUN & CHUNG, 1999; ISERI et al., 2014; KLIMEK-
SZCZYKUTOWICZ et al., 2018). 
Os óleos de mostarda são compostos de enxofre formados pela hidrólise 
enzimáticas dos glucosinolatos e são caracterizados pelos isotiocianatos. Os 
isotiocianatos apresentam muitos efeitos biológicos e são identificados pelo forte 
odor (voláteis). De fato, são moléculas relativamente instáveis quando armazenadas 
por algum tempo, podendo formar produtos de decomposição e oxidação (KLIMEK-
SZCZYKUTOWICZ et al., 2018). É relatada atividade antimicrobiana, inseticida, 
antifúngica e nematicida para os isotiocianatos, sendo utilizados principalmente no 
preparo e sanitização de solos na agricultura (ZAHRADNIKOVA & PETŘIKOVA 
2012; ISERI et al., 2014). 
O 2-feniletil-isotiocianato (PEITC), produto de hidrólise do gluconasturtina 
possui atividade antitumoral e quimioprotetora. É capaz de induzir apoptose e 
interromper o ciclo celular em células tumorais (CASANOVA & CARBALLO, 2011). 
 
 
20 
 
Como quimioprotetor atua inibindo enzimas do metabolismo de fase I, 
monoxigenases e citocromo P450, que estão envolvidas na bioativação de agentes 
cancerígenos; e por indução de enzimas de fase II, o que leva a formação mais 
intensa de conjugados com substâncias carcinogênicas, resultando em maior taxa 
de excreção destes componentes (ENGELEN-EIGLES et al., 2006). 
 
 
Figura 7: Produtos da hidrólise enzimática dos glucosinolatos (A) e a estrutura do 2-feniletil-
isotiocianto (B), produto da hidrólise do gluconasturtina. Na reação é liberado o grupo sulfato (HSO4-). 
Os colchetes indicam os intermediários instáveis. R = cadeia lateral (adaptado de HALKIER & 
GERSHENZON, 2006). 
 
A atividade antimicrobiana associada ao N. officinale é atribuída 
principalmente aos isotiocianatos. Seu mecanismo de ação está relacionado à 
inativação de enzimas extracelulares por meio da clivagem oxidativa de ligações 
dissulfeto e pela formação de uma espécie reativa de tiocianato mediando esta 
atividade. Este efeito também é associado aos compostos fenólicos presentes 
 
 
21 
 
capazes de alterar a permeabilidade da célula microbiana, interferir nas funções de 
membrana (transporte de elétrons, absorção de nutrientes, entre outras) e interagir 
com proteínas de membranas, causando uma deformação estrutural e perda de 
função (TIWARI et al., 2009; NIKAN; 2014). 
Os flavonoides e ácidos fenólicos são grupos importantes de metabólitos 
secundários na espécie. Possuem atividade antioxidante, formando derivados 
radicalares que estabilizam e deslocam elétrons desemparelhados, além da 
capacidade de formar quelatos com íons metálicos (ISERI et al., 2014). Um 
experimento realizado em ratos com extratos de N. officinale (500 mg/kg/dia) 
demonstrou queda significativa da enzima malondialdeído hepática (MDA – um 
marcador de dano oxidativo em lipídeos celulares), bem como as atividades da 
glutationa peroxidase e da glutationa redutase. O tratamento com extrato 
hidroalcoólico de N. officinale (50, 100 e 200 mg/kg/dia) foi capaz de proteger contra 
o aumento de espécies reativas de oxigênio, glutationa, peroxidação lipídica e 
proteína carbonil na nefrotoxicidade induzida por gentamicina em ratos 
(YAZDANPARAST et al., 2008; KLIMEK-SZCZYKUTOWICZ et al., 2018). 
 É relatado na literatura alto teor de polifenois, dentre eles, ácido clorogênico 
e ácido cafeico, ácido p-cumárico, ácido ferúlico, ácido gálico, ácido p-
hidroxibenzoico em extratos de N. officinale. Há presença de derivados de 
quercetina, kaempferol e rutina, além de antocianinas. Também contribuem para a 
atividade antioxidante a vitamina C, vitamina E (α-tocoferol) e carotenoides como β-
caroteno, luteína e zeaxantina, abundantes na espécie (BOLIGON et al., 2013; 
ISERI et al., 2014; GIALLOUROU et al., 2016; KLIMEK-SZCZYKUTOWICZ et al., 
2018). A composição do óleo essencial inclui a presença de miristicina, α-
terpinoleno, limoneno, óxido de cariofileno e p-cimen-8-ol (AMIRI, 2010). Também 
carvacrol, 1,8-cineol, pulegona e o sesquiterpeno óxido de α-bisabolol A (KLIMEK-
SZCZYKUTOWICZ et al., 2018). Experimentos com extrato aquoso e etanólico 
mostram atividade antioxidante contra peroxidação lipídica em ácido linoleico, no 
fígado, cérebro e rins (modelo homogeneizado), além de benefícios no 
funcionamento cardiovascular e propriedades anticâncer (BOLIGON et al., 2013; 
ZEB, 2015). 
Na literatura, o extrato hidroalcóolico de agrião (500 mg/kg) apresentou 
atividade anti-inflamatória, diminuindo significativamente o edema de pata de ratos 
 
 
22 
 
induzido por carragenina e por formalina, e o edema de orelha induzido por TPA (12-
O-tetradecanoil forbol acetato), quando comparado ao controle com indometacina 
(10 mg/kg). Também houve redução da hiperplasia e do infiltrado de células 
inflamatórias no exame histológico do grupo tratado (SADEGHI et al., 2014). Outro 
trabalho demostrou a proteção de N. officinale (20, 100 e 200 mg/kg/dia) em ratos 
contra o aumento de óxido nítrico (NO) e fator de necrose tumoral (TNF-α). 
Atividades biológicastais como antialérgica, antipsoriática, antidiabética, indução do 
aumento de hormônios sexuais (testosterona, LH, FSH) e aumento da motilidade 
dos espermatozoides (melhorando parâmetros da reprodução em ratos) também 
foram descritas para extratos de N. officinale. O tratamento via oral em ratos com 
extrato hidroalcoólico de agrião durante 10 dias foi capaz de reduzir o colesterol 
total, triglicérides e colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL) em 34,2; 
30,1 e 52,9%, respectivamente. Além disso, verificou-se o aumento dos níveis de 
colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL) no sangue em 27,0% 
(YAZDANPARAST et al., 2008; KLIMEK-SZCZYKUTOWICZ et al., 2018). 
O agrião possui um longo histórico como planta medicinal sendo 
antiescorbútico, laxativo e usado para coceira da pele (SCHIPPERS, 2004). As 
folhas da planta também são amplamente utilizadas como um diurético, agente 
antidiabético e expectorante. É considerado uma planta medicinal para tratamento 
da tosse, bronquite e asma. Adicionalmente, é utilizado para tratamento de dores de 
dente, resfriados, auxiliar da digestão e cicatrização de feridas (ISERI et al., 2014). 
Também é descrito para o tratamento da hipertensão e cólicas renais (KLIMEK-
SZCZYKUTOWICZ et al., 2018). 
 
 
1.8 Nanoemulsões 
 
As formulações farmacêuticas são elaboradas de acordo com as 
propriedades físico-químicas da substância ativa e devem ser estáveis e eficazes. 
Um dos principais objetivos de um sistema de liberação de fármaco ideal é 
potencializar o efeito terapêutico e minimizar a toxicidade. As nanoemulsões são 
geralmente sistemas bifásicos simples de óleo em água (O/A) ou água em óleo 
(A/O) com gotículas da fase dispersa variando de 50 a 1000 nm de diâmetro, mas 
 
 
23 
 
geralmente de 100 a 500 nm. Mas podem existir formas mais complexas, por 
exemplo, uma gotícula de óleo revestindo uma gotícula de água pode ser suspensa 
em água para formar uma emulsão água em óleo em água (A/O/A) ou o contrário 
(O/A/O), sendo denominados emulsões múltiplas. Estas possuem interesse 
principalmente como veículos de liberação e ação retardada de fármacos. Quando 
dois líquidos imiscíveis são agitados é formada uma emulsão temporária, na qual as 
gotículas dispersas na fase contínua tendem à coalescência e separação do sistema 
em duas fases, retornando ao estado de energia livre superficial mínima. As 
emulsões são estabilizadas por um agente tensoativo que é adsorvido na interface 
óleo-água (Figura 8), garantindo o aumento da área superficial e impedindo a 
coalisão (AULTON & TAYLOR, 2016; CHIME et al., 2014). 
 
 
Figura 8. Estrutura de uma nanoemulsão O/A ou A/O. São sistemas bifásicos nos quais um 
volume otimizado de fase oleosa dispersa está contida na fase contínua aquosa ou o contrário, com a 
ajuda de um composto tensoativo. São utilizados líquidos imiscíveis e o teor de fármaco é geralmente 
solubilizado na fase dispersa (adaptado de SINGH et al., 2017). 
 
As nanoemulsões possuem vantagens em relação às emulsões mais 
grosseiras sendo mais estáveis a longo prazo devido ao tamanho das gotículas 
formadas, o que dificulta fenômenos de desestabilização como cremagem, 
sedimentação e coalescência. As nanoemulsões são capazes de dissolver fármacos 
pouco solúveis aumentando sua biodisponibilidade e protegendo-os de fatores 
 
 
24 
 
ambientais diversos como hidrólise, degradação enzimática, pH e oxidação. Alguns 
estudos demonstraram que as nanoemulsões sofrem absorção linfática direta, 
evitando assim o metabolismo de primeira passagem quando a administração é feita 
por via oral. Tal fato leva a um aumento na biodisponibilidade, além de reduzir a 
dose de drogas que sofrem transformação hepática. Ainda são capazes de mascarar 
sabor amargo ou metálico de um fármaco, o que pode causar efeito nauseante, 
levando o paciente a não aderir ao tratamento. Apesar das muitas vantagens, 
algumas considerações devem ser feitas como a incapacidade para solubilizar 
substâncias com alto ponto de fusão; o cuidado na escolha e na dose do surfactante 
usado, que deve ser atóxico para o uso humano. Além disso, sua concentração 
aumentada, requerida em métodos de formulação de baixa energia, pode causar 
fluidificação de membrana celular (SINGH et al., 2017). 
As principais vantagens das nanoemulsões como transportadores de 
liberação de drogas incluem aumento da carga de fármaco, maior solubilidade e 
biodisponibilidade, redução da variabilidade da resposta farmacológica pelo 
paciente, controle de liberação do fármaco e proteção de degradação enzimática. 
Podem ser administradas por diversas vias. Além disto, as gotículas pequenas que 
são formadas melhoram a penetração profunda em diferentes tecidos através de 
capilares finos, sendo capazes de atingir locais específicos no organismo, como o 
fígado e o encéfalo. As propriedades das nanoemulsões podem ser modificadas 
através do controle de cargas formadas no filme interfacial ou incorporando ao filme 
sinalizadores que guiam a formulação a órgãos específicos. As partículas 
carregadas negativamente são depuradas mais rapidamente do sangue do que as 
neutras ou positivamente carregadas. As emulsões catiônicas facilitam a permeação 
de fármacos antifúngicos pouco solúveis e de ceramidas através da pele, devido à 
sua interação com as células epiteliais carregadas negativamente na pele. Outro 
exemplo são as formulações água em óleo que estão sendo investigadas para 
quimioterapia, pois podem prolongar a liberação do fármaco após injeção 
intramuscular ou intratumoral ainda como forma de melhorar o transporte de agentes 
anticâncer pelo sistema linfático (AULTON & TAYLOR, 2016; CHIME et al., 2014). 
As nanoemulsões podem ser produzidas por método de alta e baixa energia. 
Os processos de baixa energia são mais simples e econômicos, no entanto, muitas 
vezes necessitam de uma maior concentração de tensoativos, o que pode tornar o 
 
 
25 
 
produto tóxico. O ponto de inversão de fase é um método de emulsificação 
espontânea de baixa energia, que consiste em diluição progressiva com água ou 
óleo, para criar nanoemulsões diretas ou inversas termodinamicamente instáveis, 
mas cineticamente estáveis. No método de temperatura de inversão de fase, a 
temperatura do sistema é aumentada para alterar a solubilidade do surfactante 
(lipofílico ou hidrofílico) o qual forma microemulsões bicontínuas seguida por 
inversão da emulsão. Métodos de nanoemulsificação de baixa energia dependem do 
comportamento de fase e das propriedades dos constituintes, os mesmos utilizam a 
energia armazenada do sistema para formar gotículas em escala nanométrica. A 
nanoemulsificação pode ser realizada alterando parâmetros como a temperatura e a 
composição, o que afetaria o equilíbrio lipofílico-hidrofílico do sistema 
(SUTRADHAR, & AMIN, 2013; CHIME et al., 2014). 
Os procedimentos de formação de nanoemulsões de alta energia consistem 
na utilização de dispositivos mecânicos que geram forças de cisalhamento 
acentuadas capazes de fragmentar, a partir de uma emulsão mais grosseira, 
partículas micrométricas em nanométricas. A obtenção e tamanho das gotículas 
dependem de aspectos relacionados ao equipamento como força, fluxo, intensidade 
de energia, além de outros fatores como a temperatura, tensão superficial e 
viscosidade do sistema, características da amostra e do surfactante escolhido. Os 
aparelhos empregados na obtenção de nanoemulsões pelo método de alta energia 
são: microfluidizadores, homogeneizadores e ultrassonicadores, estão 
esquematizados na figura 9 (MCCLEMENTS & RAO, 2011). 
Nos microfluidizadores é utilizada uma bomba de alta pressão que desloca a 
emulsão em direção a uma câmara de interação, na qual ocorre uma divisão do 
fluxo. Posteriormente, estes dois fluxos gerados retornam ao mesmo ponto gerando 
colisão entre as partículas. Este impacto entre os fluxos gera força de cisalhamento 
constituindopartículas menores. O processo de homogeneização por alta pressão 
utiliza um homogeneizador no qual as micropartículas da emulsão fluem através da 
válvula e do assento da válvula em alta velocidade, através de pressão gerada por 
uma bomba de deslocamento positivo que fornece um fluxo constante ao sistema. A 
mistura contendo as micropartículas flui através da válvula e do assento da válvula 
em alta velocidade. Desta forma, o fluido é descarregado homogeneizado e é 
formada a nanoemulsão. O método empregando sonicador utiliza a aplicação de 
 
 
26 
 
energia para agitar as partículas da amostra através de uma sonda que emite ondas 
ultrassônicas que desintegram a macroemulsão por meio de forças de cavitação. 
Ocorre um colapso entre as microbolhas formadas o que provoca uma turbulência 
altamente localizada. Estas pequenas implosões atuam fragmentando as partículas 
iniciais em gotículas nanométricas (SUTRADHAR, & AMIN, 2013; CHIME et al., 
2014). 
Figura 9: Configuração e funcionamento do microfluidizador, homogeneizador e 
ultrassonicador. (A) No microfluidificador, a nanoemulsão grosseira é passada através de 
microcanais da câmara de interação sob intensa pressão. Diferentes forças atuam conjuntamente 
para efetuar a redução de tamanho das partículas a partir da interação entre elas como o atrito, 
cisalhamento, cavitação, entre outros. A nanoemulsão é submetida a várias passagens através do 
instrumento para garantir uniformidade de tamanho. (B) O processo de homogeneização por alta 
pressão utiliza um homogeneizador ou pistão no qual as micropartículas entram na válvula a uma 
velocidade relativamente baixa. Então, a pressão é gerada por uma bomba de deslocamento positivo 
 
 
27 
 
que fornece um fluxo constante ao sistema. A mistura contendo as micropartículas flui através da 
válvula e do assento da válvula em alta velocidade. Desta forma, o fluido é descarregado 
homogeneizado e é formada a nanoemulsão. (C) No processo de ultrassonicação, a eletricidade 
fornecida é convertida em ondas de ultrassom pela sonda piezoelétrica. Estas ondas intensas criam 
bolhas de cavitação que crescem em uma forma instável e, finalmente, implodem para gerar uma 
corrente de líquido circulante que fragmenta as gotículas (adaptado de SINGH et al., 2017). 
 
Ao formular uma nanoemulsão, deve-se realizar a escolha do tipo de emulsão 
(O/A, A/O ou emulsão múltipla), tipo de óleo, surfactante, podendo-se utilizar co-
surfactante ou não, de acordo com as características do fármaco e com a via de 
administração desejada para o uso clínico final. Além disto, são utilizados 
conservantes e antioxidantes para evitar o crescimento microbiano e alterações 
físico-químicas do produto, bem como a deterioração oxidativa do óleo utilizado 
(AULTON & TAYLOR, 2016). 
O óleo utilizado na formulação, geralmente entre 5% e 20% nas 
nanoemulsões O/A, pode ser o próprio fármaco ou funcionar como carreadores de 
moléculas lipossolúveis. Alguns exemplos de óleos utilizados incluem miristato de 
isopropilo, monocaprilato de propileno glicol, triacetina, óleo de coco, óleo de cravo, 
triglicerídeos (preferencialmente os de cadeia média). Os surfactantes usados para 
estabilizar nanoemulsões podem ser aniônicos (ex. laurilsulfato de sódio), catiônicos 
(ex. cetrimida), não iônicos (ex. tween 80 e span 80), poliméricos (ex. Pluronic F-
127®), anfifílicos graxos para emulsões A/O (ex. alcool cetílico e ácido esteárico) e 
emulsificantes naturais para administração por via oral (ex. metilcelulose e lecitinas). 
Para selecionar o tensoativo ideal para formulação, ele deve ser menos tóxico e 
usado na menor concentração possível, além de apresentar valor adequado do 
balanço hidrofilia-lipofilia (HBL). Os surfactantes não iônicos são considerados 
menos tóxicos e irritantes que os iônicos. Desta forma, os agentes iônicos são mais 
utilizados em preparações para via tópica. Ocasionalmente, os co-surfactantes são 
usados para complementar os surfactantes, já que se ajustam adequadamente entre 
áreas estruturalmente mais fracas, fortalecendo o filme interfacial. Alguns dos co-
surfactantes usados incluem propilenoglicol, polietilenoglicol, etanol, glicerina, 
etilenoglicol e propanol (AULTON & TAYLOR, 2016; SINGH, 2017). 
O Pluronic F-127® (PF127) faz parte do grupo dos poloxâmeros que 
constituem uma série de copolímeros neutros sintéticos compostos em blocos de 
 
 
28 
 
unidades de óxido de etileno e óxido de polipropileno e terminam em grupos 
hidroxila primários. O PF127 é uma molécula anfifílica que é capaz de formar 
micelas em soluções aquosas quando submetido a certa temperatura e 
concentração. As micelas formadas apresentam um núcleo hidrofóbico de polióxido 
de propileno envolvido por uma corona hidrofílica de polióxido de etileno. O PF127 é 
utilizado na preparação de nanoemulsões O/A (MARQUES et al., 2018). 
A alta incidência da leishmaniose no Brasil e no mundo associada com a 
eficácia limitada e efeitos colaterais dos medicamentos antiparasitários disponíveis 
revelam a necessidade da descoberta de novas substâncias que possam gerar 
novos medicamentos. A fitoquímica associada a ensaios biológicos pode ser uma 
interessante ferramenta para a descoberta de novos alvos terapêuticos e agentes 
antileishmaniais mais eficazes e acessíveis aos pacientes. 
Estudos prévios do Laboratório de Investigação de Susbtância Bioativas 
(LISBio) da Faculdade de Farmácia/UFRJ coordenado pelo prof. Dr. Igor de Almeida 
Rodrigues demostraram a atividade antileishmanial de algumas espécies vegetais e 
seus derivados, tais como o óleo essencial de Croton cajucara (Euphorbiaceae) 
(RODRIGUES et al., 2013), extratos fixos de Citrus sinensis (Rutaceae) (GARCIA et 
al., 2017), fração rica em alcaloides de Quassia amara L. (Simaroubaceae) 
(GABRIEL et al., 2016), e nanoemulsão do extrato rico em oleoserinas de Copaifera 
paupera (Fabaceae) (RODRIGUES et al., 2018), entre outas. Desta forma, a 
investigação da atividade antileishmanial do N. officinale torna-se relevante e 
promissora, tendo em vista os resultados obtidos anteriormente pela equipe e a 
riqueza de substâncias bioativas presentes na espécie vegetal. 
 
 
 
29 
 
2. OBJETIVOS 
 
 
2.1 Objetivo geral 
 
Avaliar o perfil fitoquímico e a atividade anti-L. amazonensis dos extratos, 
frações e subfrações de N. officinale, bem como do seu componente 2-feniletil-
isotiocianato, na forma livre e nanoemulsionada. 
 
2.2 Objetivos específicos 
 
a) Obter os extratos de N. officinale e fracionamentos; 
b) Avaliar o perfil fitoquímico dos extratos, frações e subfrações; 
c) Identificar os extratos, frações e subfrações com atividade 
antileishmanial em formas promastigotas de L. amazonensis; 
d) Identificar e obter o componente responsável pela atividade dos 
derivados de N. officinale; 
e) Obter as curvas de inibição das amostras ativas; 
f) Avaliar a citotoxidade das amostras ativas em macrófagos peritoneais, 
eritrócitos e células VERO; 
g) Formular e caracterizar a nanoemulsão do componente mais ativo; 
h) Investigar a atividade antileishmanial e a citotoxidade da nanoemulsão; 
i) Analisar por microscopia os parasitas tratados com componente mais 
ativo; 
j) Comparar a atividade antileishmanial dos extratos NOFF e NOFS. 
 
 
30 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
 
3.1 Material vegetal 
 
3.1.1 Aquisição e autenticação da espécie N. officinale 
 
Exemplares cultivados em sistema orgânico foram adquiridos no Hortifruti do 
Recreio dos Bandeirantes em julho de 2016 e em setembro de 2017. A autenticação 
da espécie foi feita pelo Dr. Marcelo Neto Galvão de Farmanguinhos/FIOCRUZ. Os 
vouchers foram depositados na Coleção Botânica de Plantas Medicinais de 
Farmanguinhos/FIOCRUZ, com o número de identificação CBPM 1082. 
 
3.1.2 Extração e fracionamento do extrato em etanol de N. officinale 
 
Folhas e caules frescos (291,0 g) de N. officinale foram triturados,