Beatriz-Nascimento-Correa

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UFRJ

Aprendendo na Universidade

05/01/2023

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

BEATRIZ DO NASCIMENTO CORRÊA DOS SANTOS

DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADES ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICA DA BIOMASSA DE
Arthrospira platensis PRODUZIDA EM DIFERENTES CONDIÇÕES DE CULTIVO

RIO DE JANEIRO
2015

1
Beatriz do Nascimento Corrêa dos Santos

DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADES ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICA DA BIOMASSA DE
Arthrospira platensis PRODUZIDA EM DIFERENTES CONDIÇÕES DE CULTIVO

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de
Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em
Ciência de Alimentos.

Orientadores: Profª. Drª. Selma Gomes Ferreira Leite (Escola de Química – UFRJ)
Profª. Drª. Kátia Gomes de Lima Araújo (Faculdade de Farmácia – UFF)

RIO DE JANEIRO
2015

2
3
AGRADECIMENTOS

É com grande reconhecimento que expresso os meus sinceros agradecimentos a todos
aqueles que, de forma direta ou indireta, contribuíram decisivamente para a realização deste
trabalho. Em especial:
A Deus, meu Senhor, pai e amigo, por me permitir chegar até aqui e proporcionar a
conclusão de mais uma etapa em minha vida.
Aos meus pais maravilhosos, Regina Lucia do Nascimento Corrêa dos Santos e Gilberto
Corrêa dos Santos, pelo amor, carinho, confiança e apoio em todos os momentos, incentivo
e encorajamento em meus estudos e trabalhos.
Ao meu namorado e amigo, Fabio Macedo da Costa, por estar sempre ao meu lado nos
momentos bons e ruins, pelo amor, força, apoio e incentivo. Obrigada por me fazer
companhia no laboratório aos fins de semana e feriados, por virar comigo as madrugadas de
estudo e escrita, por estar sempre disposto a me ajudar em tudo. Obrigada por sempre me
incentivar sempre e, por ser um companheiro excepcional.
A meus familiares pela torcida, em especial, a minha irmã Bianca do Nascimento Corrêa dos
Santos e meus avós, Iracema Corrêa, Ione Coelho e Geraldo Costa, por estarem sempre
por perto, prontos a me apoiar com carinho.
À Professora Selma Gomes Ferreira Leite, pela oportunidade de ser sua orientada e pela
confiança depositada. Obrigada pelo apoio, incentivo e disponibilidade demonstrada em
todas as fases que levaram à concretização deste trabalho.
À minha querida co-orientadora, mãe e amiga, Kátia Gomes de Lima Araújo, por me instruir
desde a graduação. Obrigada pelo carinho, apoio, por todos os ensinamentos passados, por
me dar força e ajudar a superar os momentos difícieis, por não me deixar desaminar, pelo
incentivo, confiança e amizade em todos os momentos, por ser exemplo de profissional, que
sempre fará parte da minha vida.
À Universidade Federal do Rio de Janeiro e ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de
Alimentos do IQ/UFRJ, pela oportunidade de realização do curso.
À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES, pela
bolsa de doutorado.
Ao Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias pelo suporte na execução
de etapas preliminares do projeto referente a toxicologia de Cianobactérias.

4
Ao Laboratório de Fisiologia e Cultivo de Algas do Instituto de Biologia da Universidade
Federal Fluminense (UFF) pela cessão da cianobactéria utilizada para desenvolvimento
deste trabalho.
A todos do Laboratório de Cultura de Células do Núcleo de Bioquímica Nutricional da
Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO) pela cessão da linhagem
celular, pelo suporte para execução de todas as análises biólogicas e pela paciência em
passar os ensinamentos sobre cultura de células, fundamentais para a realização deste
trabalho. Em especial ao professor Anderson Junger e aos alunos: Clara Machado, Camila
Berniz, Crsitiane Silva, Debora Bauer, Joel Pimentel, Lana Rosa, Natália Soares, Mariana
Gonçalves e Danielle Bonfim.
Às dedicadas bolsistas de iniciação científica, Mariana Borges, Garla Guidone, Dayane
Meireles, Natália Ferme, Daiana Dias e Hevelyn Dantas, pela grande contribuição para que
a parte experimental deste trabalho se concretizasse.
À Professora Josiane Roberto Domingues pela grande amizade, carinho, apoio e
ensinamentos passados. Obrigada por ser minha companheira de todas as horas.
À Doutora Thaís Souza Passos, amiga e sócia, pelo carinho, ensinamentos e dedicação a
nossa amizade.
À Família Labiotec - Laboratório de Biotecnologia de Alimentos da Faculdade de Fármácia
da UFF (Roberta Rizzo, Gabriela Pepe, Carla Guidone, Dayane Meireles, Daiana Dias,
Hevelyn Dantas, Fabiana Santos, Francine Albernaz, Nicolly Petito, Manuela Nascimento,
Jorge Pinho, Lidiane Mendes, Vanessa Naciuk, Daniele Bastos, Juliana Furtado, Alice
Gonzalez e Luciana Esper) pela amizade, carinho, apoio e pelos momentos de
descontração.
Aos companheiros do Curso de Ciência de Alimentos pela amizade, troca de conhecimentos
e experiências adquiridas, em especial à Andresa Ramos, Carlos Eduardo Conceição,
Valéria Saldanha, Manoela Pessanha e Talita Nascimento.
Aos professores, funcionários e técnicos da Faculdade de Farmácia da UFF, por serem
sempre tão prestativos, especialmente aqueles que fazem parte dos Laboratórios de
Bromatologia e Tecnologia de Cosméticos e da Central Analítica.
A todos os meus queridos amigos pelo grande incentivo e compreensão em minhas
ausências.
À banca examinadora por aceitar o convite e se disponibilizar a avaliar e contribuir com este
trabalho.

"Comece fazendo o que é necessário,
depois o que é possível, e de repente
você estará fazendo o impossível."

São Francisco de Assis

RESUMO

SANTOS, Beatriz do Nascimento Corrêa dos. Determinação de atividades antioxidante e
citotóxica da biomassa de Arthrospira platensis produzida em diferentes condições de
cultivo. Rio de Janeiro, 2015. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos) - Instituto de
Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2015.

Este trabalho objetivou estudar a influência de condições de cultivo sobre a produção de
biomassa de Arthrospira platensis e avaliar as atividades antioxidante e citotóxica de seus
extratos, visando à produção de biomassa rica em compostos bioativos com potencial
aplicação no desenvolvimento de alimentos funcionais. O cultivo foi conduzido em diferentes
concentrações de NaHCO3 (9 a 18 g.L
-1) e NaNO3 (1,25 a 2,5 g.L
-1) sob diferentes
irradiâncias (50 a 150 µMol fótons.m-2.s-1), de acordo com planejamento experimental. A
partir da biomassa obtida nas distintas condições de cultivo, produziram-se extratos aquosos
e metanólicos. A avaliação de crescimento e produção de biomassa foi realizada por
medidas de densidade óptica e a capacidade antioxidante dos extratos foi determinada
pelos ensaios TEAC e TRAP. Utilizou-se delineamento do tipo composto central rotacional
para avaliar a influência das condições de cultivo sobre produção de biomassa e capacidade
antioxidante dos extratos. Com extratos referentes à condição de maior produção de
biomassa e capacidade antioxidante e à condição padrão de cultivo (P) (NaHCO3:18 g.L
-1;
NaNO3: 2,50 g.L
-1; 50 µMol fótons.m-2.s-1), avaliou-se a atividade citotóxica em células de
adenocarcinoma de cólon humano (HT-29) por meio de ensaios de viabilidade celular com
MTT, de ciclo e apoptose celular por citometria de fluxo. Os resultados mostraram que luz foi
a variável que mais influenciou os parâmetros de crescimento e produção de biomassa. A
concentração de NaHCO3 foi o segundo fator mais importante e apresentou, assim como a
luz, correlação positiva com estas variáveis de resposta.Consequentemente, o aumento na
concentração de NaHCO3 e na irradiância levou ao aumento destas respostas. A
concentração de NaNO3 tem efeito oposto sobre os parâmetros estudados, indicando que
estes diminuem com o aumento da concentração de NaNO3. As variáveis independentes
não apresentaram efeito significativo sobre a capacidade antioxidante dos extratos
metanólicos, enquanto que, para os extratos aquosos a luz também foi fator de maior
influência de forma direta. A corrida experimental de cultivo 6 (NaHCO3: 16,18 g.L
-1; NaNO3:
1,50 g.L-1; 129,8 µMol fótons.m-2.s-1) apresentou melhores resultados associados de
produção de biomassa e capacidade antioxidante. Os extratos 6 e P apresentaram efeito
semelhante sobre células HT-29. Comparativamente ao controle, os extratos aquosos
mostraram capacidade de redução na viabilidade celular assim como os extratos

7
metanólicos, que apresentaram efeito inibitório mais acentuado. Houve aumento no
percentual de células HT-29 na fase Sub G1 para extratos metanólicos e na fase G0/G1
para extratos aquosos, seguido por diminuição no percentual de células nas fases S e G2/M
do ciclo celular. O extrato metanólico P conduziu ao aumento significativo no processo de
apoptose celular. Os resultados sugerem que a biomassa de Arthrospira platensis cultivada
com concentrações intermediárias de NaHCO3 e reduzidas de NaNO3 e em alta irradiância
pode desempenhar importante papel na eliminação de radicais livres, na redução da
viabilidade celular, na modulação e progressão do ciclo celular de adenocarcinoma de cólon
humano. Esta biomassa é rica em compostos bioativos tais como ficobiliproteínas e
compostos fenólicos, apresentando potencial aplicação como suplemento e no
desenvolvimento de alimentos funcionais.

Palavras-chave: Arthrospira platensis, bicarbonato de sódio, nitrato de sódio, luz, biomassa,
capacidade antioxidante, atividade citotóxica.

8
ABSTRACT

This study investigated the influence of culture conditions on the biomass production of
Arthrospira platensis and evaluated cytotoxic and antioxidant activities of its extracts, aimed
to produce rich biomass in bioactive compounds for potential application in functional foods.
The cultivation was performed with different concentrations of NaHCO3 (9 to 18 g.L
-1) and
NaNO3 (1.25 to 2.5 gL
-1) under different light irradiances (50 to 150 µMol photons.m-2.s-1),
according to experimental design. From the obtained biomass under different conditions,
aqueous and methanol extracts were produced. Evaluation of growth and biomass
production was performed by optical density measurements and the antioxidant capacity of
the extracts was determined by TEAC and TRAP assays. A central composite rotatable
design was employed to evaluate the influence of culture conditions on biomass production
and antioxidant capacity of the extracts. Extracts obtained from the optimal condition of
biomass production and antioxidant capacity and from standard cultivation condition (P)
(NaHCO3: 18 g.L
-1; NaNO3: 2.50 g.L
-1; 50 µMol photons.m-2.s-1) were used to evaluate the
cytotoxic activity in human colon adenocarcinoma cells (HT-29) through assays of cell
viability with MTT, cell cycle and apoptosis by flow cytometry. The results showed that light
was the variable that most influenced the growth parameters and biomass production. The
NaHCO3 concentration was the second most important factor, as well as light, presented
positive correlation with these response variables, consequently, increase in the NaHCO3
concentration and irradiance led to increase in these responses. The NaNO3 concentration
has inverse effect on the studied parameters, indicating that these responses decreased in
higher NaNO3 levels. The independent variables had no significant effect on the antioxidant
capacity of the methanol extracts, while for the aqueous extracts the light was also the most
influential factor directly. The better results related to biomass production and antioxidant
capacity were observed in experimental run cultivation 6 (NaHCO3: 16.18 g.L
-1; NaNO3: 1.50
g.L-1; 129.8 µMol photons.m-2.s-1). Extracts 6 and P had similar effect on HT-29 cells.
Compared to the control, the aqueous extracts showed capacity of reduction on cell viability
as well as the methanol extracts, which showed stronger inhibitory effect. An increase in the
percentage of HT-29 cells in sub G1 phase for methanol extracts and in G0/G1 phase for
aqueous extracts were observed, followed by a decrease in the percentage of cells in S and
G2/M phases of cell cycle. The methanol extract P resulted in a significant increase in cell

9
apoptosis. The results suggest that Arthrospira platensis biomass cultivated with
intermediate NaHCO3 concentration, reduced NaNO3 concentration and high irradiance can
play an important role in scavenging free radicals, reducing cell viability, in modulation and
progression of cell cycle of human colon adenocarcinoma. This biomass is rich in bioactive
compounds such as phycobiliproteins and phenolic compounds, with potential application as
a supplement and in the development of functional foods.

Keywords: Arthrospira platensis, sodium bicarbonate, sodium nitrate, light, biomass,
antioxidant capacity, cytotoxic activity.

10
LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Principais complexos fotossintéticos da membrana tilacóide de
cianobactérias.
25
Figura 2. Filamentos helicoidais ou espirais da Arthrospira platensis. 28
Figura 3. Redução do oxigênio. 41
Figura 4. Estrutura química de alguns antioxidantes endógenos e exógenos. 49
Figura 5. Esquemas dos principais mecanismos de reação dos ensaios de
capacidade antioxidante total.
57
Figura 6. Organograma experimental. 59
Figura 7. Fotomicrografia da cepa de Arthrospira platensis utilizada no presente
trabalho.
61
Figura 8. Frascos de cultivo de Arthrospira platensis. 62
Figura 9. Curva-padrão para avaliação do crescimento de Arthrospira platensis,
relacionando DO (absorbância) versus concentração de biomassa seca.
64
Figura 10. Recuperação da biomassa de Arthrospira platensis. 65
Figura 11. Curva-padrão de Trolox para teste de regeneração do ânion ABTS-2
pelos extratos de Arthrospira platensis, relacionando absorbância versus
concentração (μmoles.L-1).
67
Figura 12. Comportamento do Trolox, em diferentes concentrações (μM),
durante teste de Total radical-trapping antioxidant parameter (TRAP),
correlação de absorbância versus tempo (em minutos).
68
Figura 13. Curva-padrão de trolox para Total radical-trapping antioxidant
parameter (TRAP) dos extratos de Arthrospira platensis, relacionando tempo de
fase lag (em minutos) versus concentração (μmoles.L-1).
69
Figura 14. Imagem microscópica de células de adenocarcinoma de cólon
humano da linhagem HT-29 em alta densidade.
71
Figura 15. Incubadora para cultivo de células de adenocarcinoma de cólon
humano da linhagem HT-29 com atmosfera controlada.
72

11
Figura 16. Células de adenocarcinoma de cólon humano da linhagem HT-29
tratadas com extrato de Arthrospira platensis para realização de ensaios
biológicos.
74
Figura 17. Curva-padrão de ácido gálico para determinação de compostos
fenólicos totais dos extratos de Arthrospira platensis, relacionando absorbância
versus concentração (μg.mL-1).
77
Figura 18. Produção de biomassa por Arthrospira platensis durante 21 dias de
cultivo.
79
Figura 19. Histograma de Pareto para resposta de produção de biomassa de
(mg.L-1).82
Figura 20. Superfície de resposta (A) e curvas de nível (B) para NaNO3 e
NaHCO3 referente a produção de biomassa de Arthrospira platensis.
84
Figura 21. Superfície de resposta (A) e curvas de nível (B) para Luz e NaHCO3
referente à produção de biomassa de Arthrospira platensis.
84
Figura 22. Superfície de resposta (A) e curvas de nível (B) para Luz e NaNO3
referente a produção de biomassa de Arthrospira platensis.
85
Figura 23. Histograma de Pareto para resposta de produtividade de Arthrospira
platensis – P18 (mg.L
-1.dia-1).
86
Figura 24. Histograma de Pareto para capacidade antioxidante de extrato
aquoso de Arthrospira platensis pelo teste TEAC - ABTS.
95
Figura 25. Histograma de Pareto para capacidade antioxidante de extrato
aquoso de Arthrospira platensis segundo o percentual de extinção do radical
ABTS•-.
96
Figura 26. Histograma de Pareto para capacidade antioxidante de extrato
aquoso de Arthrospira platensis pelo teste TRAP.
98
Figura 27. Histograma de Pareto para capacidade antioxidante de extrato
metanólico de Arthrospira platensis pelo teste TEAC - ABTS.
100
Figura 28. Histograma de Pareto para capacidade antioxidante de extrato
metanólico de Arthrospira platensis segundo o percentual de extinção do radical
ABTS•-.
101
Figura 29. Histograma de Pareto para resposta de capacidade antioxidante de
extrato metanólico de Arthrospira platensis pelo teste TRAP.
102

12
Figura 30. Efeito dos extratos aquoso (A) e metanólico (B), referentes à
biomassa de Arthrospira platensis obtida na condição de cultivo da corrida
experimental 6 sobre a viabilidade de células HT-29, 24 e 48 horas após a
incubação.
110
Figura 31. Efeito dos extratos aquoso (A) e metanólico (B), referentes à
biomassa de Arthrospira platensis obtida na condição de cultivo da corrida
experimental P sobre a viabilidade de células HT-29, 24 e 48 horas após a
incubação.
111
Figura 32. Efeito do Extrato 6 sobre a progressão do ciclo celular em células
HT-29, 48 horas após a incubação.
116
Figura 33. Efeito do Extrato P sobre a progressão do ciclo celular em células
HT-29, 48 horas após a incubação.
117
Figura 34. Efeito do Extrato 6 sobre o processo de morte programada
(apoptose) em células HT-29 48 horas após a incubação.
120
Figura 35. Efeito do Extrato P sobre o processo de morte programada
(apoptose) em células HT-29 48 horas após a incubação.
121
Figura 36. Compostos fenólicos totais determinados em extrato aquoso (H2O) e
metanólico (MeOH) obitdos a partir da biomassa de Arthrospira platensis
referentes as corridas experimentais de cultivo 6 e P.
124
Figura 37. Espectros de varredura no UV-visível dos extratos aquosos (6 - em
azul e P - em verde) ricos em ficobiliproteínas obtido da Arthrospira platensis,
em destaque o pico característico da ficocianina (PC) e o ombro da
aloficocianina (APC).
127

13
LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadro 1. Papel de radicais livres em várias doenças. 44
Tabela 1. Composição do meio Zarrouk utilizado para o cultivo de Arthrospira
platensis.
61
Tabela 2. Valores utilizados no delineamento experimental para produção de
biomassa e atividade antioxidante de Arthrospira platensis.
63
Tabela 3. Matriz de delineamento das corridas experimentais de cultivo de
Arthrospira platensis.
63
Tabela 4. Matriz de planejamento experimental com duas variáveis de resposta,
produção de biomassa seca e produtividade de Arthrospira platensis aos 18
dias de cultivo.
81
Tabela 5. Matriz de planejamento experimental com três variáveis de resposta
referentes a capacidade antioxidante do extrato aquoso de Arthrospira platensis
pelos testes TEAC - ABTS, percentual de extinção do radical ABTS•- e TRAP.
94
Tabela 6. Matriz de planejamento experimental com três variáveis de resposta
referentes a capacidade antioxidante do extrato metanólico de Arthrospira
platensis pelos testes TEAC - ABTS, percentual de extinção do radical ABTS•- e
TRAP.
99
Tabela 7. Faixa de capacidade antioxidante de extratos aquoso e metanólico,
obtidos de biomassa de Arthrospira platensis produzida nas diferentes
condições experimentais de cultivo, avaliada pelos testes TEAC - ABTS,
extinção do radical ABTS•- e TRAP.
103
Tabela 8. Concentração de ficobiliproteínas determinada em extrato aquoso
obitdo a partir da biomassa de Arthrospira platensis referentes às corridas
experimentais de cultivo 6 e P e, expressa em mg% em biomassa seca.
126

14
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AAPH 2,2’- azinobis-2-amidinopropano
ABTS 2,2’-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico
ADP Adenosine diphosphate
AIDS Acquired immune deficiency syndrome
ANOVA Análise de variância
Anvisa Agência Nacional de Vigilância Sanitária
Atm Atmosfera
ATP Adenosine triphosphate
BHT Butil hidroxitolueno
°C Grau(s) Celsius
CAT Catalase
CCRD Central composite rotatable design
CPIR Cell proliferation inhibition rate
DBN dibutil nitrosamina
d.C. Depois de Cristo
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Deoxyribonucleic acid
DO Densidade óptica
DPPH 2,2-di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl assay
ERN Espécie(s) reativa(s) de nitrogênio
ERO Espécie(s) reativa(s) de oxigênio
ET Electron transfer based assays
FAO Food and Agriculture Organization
FDA Food and Drug Administration
FITC Fluorescein isothiocyanate
G Grama(s)
G0 Estado de quiescência das células durante o ciclo celular
G1 Primeira fase do ciclo celular
G2 Segunda fase do ciclo celular
GR Glutationa redutase
GRAS Generally Recognized as Safe
GSH-Px Glutationa peroxidase
HAT Hydrogen atom transfer based assays

15
HepG2 Linhagem de carcinoma hepatocelular humano
HT-29 Linhagem celular de adenocarcinoma de cólon humano
IARC International Agency for Research on Cancer
Kg Quilograma
L Litro(s)
LDL Low-density lipoprotein
m Metro(s)
M Mitose
min Minuto(s)
mg Miligrama(s)
mL Mililitro(s)
mM Milimol(es)
MTT brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio
g Micrograma(s)
m Micrometros(s)
Mol Micromol(es)
NADP(H) Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (reduzido)
NASA National Aeronautics and Space Administration
NK Natural killer
nm Nanômetro(s)
OMS Organização Mundial da Saúde
pH Potencial de hidrogênio
PBS Phycobilisome
PSI (II) Photosystem I (II)
RNA Ribonucleic acid
s Segundo(s)
Se-PC Ficocianina purificada contendo selênio
SFB Soro fetal bovino
SOD Superóxido dismutase
Sub-G1 Sub-fase G1 (células hipodiploides)
TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity
TRAP Total radical-trapping antioxidant paramenter
UV Ultravioleta
vvm volume de ar por volume de meio

16
SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 19
2 OBJETIVOS 21
2.1 OBJETIVO GERAL 21
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 21
3 REVISÃO DA LITERATURA 22
3.1 CIANOBACTÉRIAS 22
3.1.1 Aspectos gerais de cianobactérias e microalgas 22
3.1.2 Principais características de cianobactérias 24
3.1.3 Produção de substâncias/compostos de interesse por cianobactérias 26
3.1.4 Gênero Athrospira 27
3.1.5 Utilização e consumo de cianobactérias 30
3.1.6 Sustâncias/compostos produzidos por cianobactérias com atividade
biológica
32
3.1.7 Modulação das condições de cultivos 36
3.2 ESTRESSE OXIDATIVO EM ORGANISMOS VIVOS 39
3.2.1 Radicais livres 39
3.2.2 Doenças associadas ao estresse oxidativo 42
3.2.3 Prevenção e tratamento do estresse oxidativo 46
3.3 ANTIOXIDANTES 48
3.3.1 Busca por novas substâncias antioxidantes 52
3.3.2 Antioxidantes de organismos fotossintetizantes 53
3.3.3 Determinação da capacidade antioxidante 54

17
4 MATERIAL E MÉTODOS 59
4.1 ORGANOGRAMA EXPERIMENTAL 59
4.2 REAGENTES 59
4.3 MICRO-ORGANISMO 60
4.4 CONDIÇÕES E MODALIDADES DE CULTIVO 61
4.5 AVALIAÇÃO DE CRESCIMENTO E PRODUÇÃODE BIOMASSA 64
4.6 OBTENÇÃO DE EXTRATOS DAS BIOMASSAS 66
4.7 DETERMINAÇÃO DE CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS 66
4.8 ENSAIOS DE CITOTOXIDADE 69
4.8.1 Cultura de células de adenocarcinoma de cólon humano 70
4.8.2 Ensaio de viabilidade celular 73
4.8.3 Ensaio de ciclo celular 74
4.8.4 Ensaio de apoptose celular 75
4.9 DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS E
FICOBILIPROTEÍNAS
76
4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA 78
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 79
5.1 CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE BIOMASSA DE ARTHROSPITA
PLATENSIS
79
5.1.1 Produção de biomassa 80
5.1.2 Produtividade 86
5.2 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS DE ARTHROSPIRA
PLATENSIS EM FUNÇÃO DAS CONIÇÕES DE CULTIVO
93
5.2.1 Extrato Aquoso 93
5.2.1.1 Capacidade antioxidante de extrato aquoso pelo teste TEAC – ABTS 93
5.2.1.2 Capacidade antioxidante de extrato aquoso segundo percentual de
extinção do radical ABTS•-
95
5.2.1.3 Capacidade antioxidante de extrato aquoso pelo teste TRAP 97

18
5.2.2 Extrato Metanólico 98
5.2.2.1 Capacidade antioxidante de extrato metanólico pelo teste TEAC - ABTS 99
5.2.2.2 Capacidade antioxidante de extrato metanólico segundo percentual de
extinção do radical ABTS•-
100
5.2.2.3 Capacidade antioxidante de extrato metanólico pelo teste TRAP 101
5.3 ENSAIOS BIOLÓGICOS 109
5.3.1 Efeito dos extratos de Arthrospira platensis sobre a viabilidade
celular de adenocarcinoma de cólon humano (HT-29)
109
5.3.2 Efeito dos extratos de Arthrospira platensis sobre a progressão do
ciclo celular de adenocarcinoma de cólon humano (HT-29)
115
5.3.3 Efeito dos extratos de Arthrospira platensis sobre a taxa de apoptose
em células de adenocarcinoma de cólon humano (HT-29)
119
5.4 DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS E
FICOBILIPROTEÍNAS
123
5.4.1 Compostos fenólicos totais 124
5.4.2 Ficobiliproteínas totais 126
6 CONCLUSÃO 130
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS 132
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 133

19
1 INTRODUÇÃO

A transferência de elétrons é um dos processos químicos mais fundamentais para a
sobrevivência das células. Entretanto, um efeito associado a este evento é a produção de
radicais livres e outras espécies reativas de oxigênio que podem causar dano oxidativo
(BAE et al, 1999). Quando a produção de radicais livres supera a capacidade antioxidante
em um sistema vivo, espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio podem reagir com
lipídios, proteínas e com o ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês deoxyribonucleic acid)
conduzindo a dano estrutural e/ou funcional nas células, enzimas e material genético
(BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).
Danos aos componentes celulares podem resultar em disfunção de crescimento,
diferenciação e morte celular, conduzindo ao desenvolvimento de inflamação e câncer. Os
radicais livres são conhecidos por desempenhar um papel significativo na promoção da
carcinogênese. O câncer está prestes a se tornar a principal causa de morbidade e
mortalidade nas próximas décadas em todas as regiões do mundo (KANG et al, 2011).
Em virtude de várias publicações terem mostrado a alta associação entre a geração
de radicais livres e as doenças crônicas não transmissíveis, tem havido grande interesse por
alimentos funcionais antioxidantes (GUARIENTI; BERTOLIN; COSTA, 2010). Estudos
realizados com substâncias antioxidantes presentes na dieta demonstraram que é possível
diminuir o risco de diversas doenças crônicas não transmissíveis (BRESSAN et al, 2009;
SILVA et al, 2010).
Organismos fotossintetizantes como plantas, macroalgas, microalgas e
cianobactérias, são expostos a uma combinação de luz e altas concentrações de oxigênio
durante a atividade fotossintética, o que leva à formação de radicais livres e outras espécies
oxidativas. A ausência de danos oxidativos nesses organismos, apesar da proximidade
entre o oxigênio formado na fotossíntese e os componentes do aparelho fotossintetizante,
sugere que estes organismos possuam substâncias com atividade antioxidante, além de
mecanismos próprios de proteção contra a oxidação (WANG et al, 2008).
Dentre os organismos fotossintetizantes, as cianobactérias têm sido identificadas
como um dos mais promissores grupos de organismos para descoberta e identificação de
produtos naturais biologicamente ativos, incluindo substâncias com atividade antioxidante
(SUHAIL et al, 2011; SHANAB et al, 2012).
Algumas espécies de cianobactérias são cultivadas tanto para consumo direto como
para inclusão em suplementos dietéticos. São utilizadas na alimentação humana devido às
suas propriedades nutricionais como alto conteúdo proteico, presença de ácidos graxos
essenciais e de vitaminas, e o seu consumo pode acarretar efeitos benéficos à saúde pela
produção de metabólitos bioativos. A produção de suplementos alimentares contendo
20
cianobactérias e uso de seus compostos extraídos vêm crescendo na indústria em todo o
mundo (RELLÁN et al, 2009; JOHNSON et al, 2008).
As condições ambientais que influenciam a síntese de substâncias em cultivos de
microalgas e cianobactérias têm sido estudadas. Fatores como luz incidente, composição do
meio de cultivo, temperatura, bem como os tipos de cultivo têm sido caracterizados (YU; JIA;
DAÍ, 2009), a fim de melhorar a produção dos compostos de interesse por meio da
manipulação das condições de cultivo.
Considerando o que foi exposto anteriormente e, em vista do aproveitamento do
potencial biotecnológico de cianobactérias como fonte de moléculas de interesse para uso
em alimentos e/ou como medicamento, este trabalho teve por objetivo estudar a influência
de condições de cultivo sobre a produção de biomassa da cianobactéria Arthrospira
platensis e avaliar as atividades antioxidante e citotóxica, visando à produção de uma
biomassa rica em compostos bioativos com potencial aplicação no desenvolvimento de
alimentos funcionais.
21
2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a influência de condições de cultivo sobre a produção de biomassa da
cianobactéria Arthrospira platensis e as atividades antioxidante e citotóxica, visando à
produção de uma biomassa rica em compostos bioativos com potencial para aplicação em
alimentos.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Cultivar Arthrospira platensis em condições fotoautotróficas com diferentes
concentrações de bicarbonato de sódio e nitrato de sódio sob diferentes irradiâncias e
avaliar o crescimento e a produção de biomassa nas diferentes condições experimentais de
cultivo.

Produzir extratos em metanol e água a partir da biomassa de Arthrospira platensis
cultivada nas diferentes condições experimentais e avaliar a capacidade antioxidante dos
extratos produzidos.

Avaliar a atividade citotóxica dos extratos metanólico e aquoso produzidos a partir da
biomassa produzida na condição que apresentar maior produção de biomassa e melhor
capacidade antioxidante, por meio da determinação da atividade dos extratos sobre a
viabilidade, o ciclo e a progressão de morte celular de adenocarcinoma de cólon humano.
22
3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 CIANOBACTÉRIAS

3.1.1 Aspectos gerais de cianobactérias e microalgas

As cianobactérias foram inicialmente classificadas como algas, em função da
similaridade entre o seu metabolismo fotossintético e o das plantas vasculares (FAY, 1983).
O termo alga não corresponde a uma única categoria taxonômica, mas a uma gama muito
ampla de organismos, abrangendo grande variabilidade morfológica, estrutural e metabólica,
incluindo grupos procarióticos e eucarióticos (OLIVEIRA, 2003). Portanto, historicamente, as
classificações precoces de cianobactérias foram construídas com critérios botânicos ao
invés da utilização de critérios microbiológicos. Por consequência de tal fato, esses sistemas
de classificação não refletiam as verdadeiras relações de evolução dentro de uma
determinada linhagem (HENSON; WATSON;BARNUM, 2002).
Na década de 60, começou a ser estabelecida uma distinção clara entre procariontes
e eucariontes, com base nas diferenças observadas em relação à organização celular. A
partir disso, o termo procariontes foi utilizado para designação dos organismos que não
possuem compartimentos celulares, e o termo eucariontes para designar aqueles que
possuem organelas definidas como núcleo, mitocôndria, lisossoma, assim como plastídios,
no caso de eucariontes fotossintetizantes. Com isso, as algas verde-azuladas, que são
desprovidas de compartimentos celulares, foram consideradas como integrantes do Reino
Protista, e foi proposta a designação destes organismos como cianobactérias. Em 1974,
esta nova designação foi aceita e considerada no Bergey’s Manual of Determinative
Bacteriology (BUCHANAN; GIBBONS, 1974). Neste sentido, os representantes eucarióticos
foram definidos como microalgas (BENEMANN, 1990).
As cianobactérias apresentam morfologia bem parecida com a das bactérias e são
mais próximas evolutivamente a estas que as microalgas eucariontes, contendo parede
celular, membrana celular lipoprotéica, material genético e ribossomos. Além desses
componentes básicos, possuem ainda membrana tilacóide, clorofila a, ficobiliproteínas e
carotenóides. São micro-organismos cosmopolitas, sendo que a maioria se desenvolve em
água doce. São também muito comuns junto aos recifes ou solo úmido, formando uma
crosta escura (LEE, 1980).
O número exato de espécies de cianobactérias e microalgas é desconhecido,
entretanto, são encontradas citações relatando que podem existir entre 200.000 até alguns
milhões de representantes destes grupos. Tal diversidade também se reflete na composição
bioquímica e, desta forma, as cianobactérias e as microalgas são fonte de uma quantidade
23
ilimitada de produtos (NORTON; ANDERSEN; MELKONIAN, 1996; PULZ; GROSS, 2004).
Cabe ressaltar que algumas espécies sintetizam substâncias que podem ser altamente
tóxicas para outras espécies de organismos, inclusive para o homem e demais animais. Os
produtos oriundos de cianobactérias têm sido explorados comercialmente e são objetos de
inúmeras pesquisas (TEIXEIRA, 2002), as quais estão relacionadas à produção de
biomassa como fonte de compostos químicos de interesse, como clorofila, carotenóides,
ficobiliproteínas, polissacarídeos e outros metabólitos biologicamente ativos, com uma
diversidade de aplicações (BECHER et al, 2005; GARCÍA-GONZALEZ et al, 2005; LIMA-
ARAUJO et al, 2006; DAYANANDA et al, 2007).
Aspectos de crescimento desses organismos no ambiente natural, assim como nos
cultivos, é resultado da interação entre fatores biológicos, físicos e químicos. Os fatores
biológicos estão relacionados às próprias taxas metabólicas da espécie cultivada, bem como
com a possível influência de outros organismos sobre o desenvolvimento. Quanto aos
fatores físico-químicos, são principalmente reportados estudos sobre iluminação,
temperatura, salinidade e disponibilidade de nutrientes (YONGMANITCHAI; WARD, 1991;
COSTA; COLLA; DUARTE FILHO, 2004; KEHOE; GUTU, 2006; MISHRA et al, 2012).
Esses organismos podem ser cultivados em diversos sistemas de produção, os
comumente empregados são pouco sofisticados, uma vez que muitas empresas
desenvolvem cultivos a céu aberto, sob condições naturais de iluminação e temperatura, e
com baixo ou nenhum controle destes parâmetros ambientais. (BOROWITZKA, 1999). Os
cultivos também têm sido desenvolvidos em equipamento específico, denominado
fotobiorreator, visando alcançar elevada produtividade, além de minimizar o risco de
contaminação (LUO; AL-DAHHAN, 2004; ZIJFFERS et al, 2008).
Muitas das substâncias sintetizadas e acumuladas pelas cianobactérias e microalgas
são também encontradas nas plantas, as quais evoluíram das algas verdes ou clorófitas
(RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2007). Entretanto, a produção desses micro-organismos
pode ser justificada por apresentar diversas vantagens, dentre as quais podem ser
destacadas: o cultivo microbiano é um sistema biológico eficiente na utilização da energia
solar para a produção de matéria orgânica, sendo que muitas espécies crescem mais
rapidamente do que as plantas terrestres, fato que possibilita maiores rendimentos anuais
de biomassa, logo, maior produtividade; sua natureza unicelular assegura uma biomassa
com mesma composição bioquímica, o que não ocorre com as plantas terrestres que
apresentam substâncias localizadas em partes específicas: nos frutos, folhas, sementes ou
raízes; por manipulação das condições ambientais de cultivo, como luz, temperatura e
nutrientes, muitas espécies podem ser induzidas a sintetizar e acumular altas concentrações
de proteínas, carboidratos e lipídios, que apresentam elevado valor comercial, e são
24
organismos que podem crescer bem em regiões com extremas condições climáticas
(RICHMOND, 1988; DANESI et al, 2011).

3.1.2 Principais características de cianobactérias

As cianobactérias possuem elevada diversidade morfológica, estrutural e fisiológica,
necessária para adaptação a uma ampla gama de parâmetros ambientais (MUNDT et al,
2001). Esses organismos apresentam membrana celular lipoprotéica, ribossomos, material
genético, parede celular, membrana tilacóide, ficobiliproteínas, clorofila a e carotenoides,
dentre outros componentes. Podem viver em condições inóspitas desde águas de fontes
termais até lagos gelados, e apenas não sobrevivem em águas ácidas (LEE, 1980; RAVEN;
EVERT; EICHHORN, 2007).
As cianobactérias constituem um grupo diverso de micro-organismos procarióticos
fotossintetizantes que realizam a fotossíntese com utilização de oxigênio, mediante um
mecanismo bastante similar ao utilizado por plantas superiores. A fotossíntese requer a
ação coordenada dos fotossistemas I e II (PSI e PSII, do inglês photosystem I e
photosystem II) para gerar o potencial eletroquímico necessário à extração de elétrons da
água, produzindo o oxigênio (FLORES; HERRERO, 2010), sendo que as cianobactérias são
o único grupo procarionte fotossintético que apresenta ambos os fotossistemas (NISBET;
SLEEP, 2001).
A estrutura básica do PSI e PSII é semelhante e combinados promovem a
transferência de elétrons coordenada da água para ferredoxina para gerar equivalentes
redutores e trifosfato de adenosina (ATP, do inglês adenosine triphosphate) para a fixação
de CO2. Na fotossíntese oxigênica, o PSII oxida a água no lado do lúmen e reduz
plastoquinona no lado citoplasmático da membrana tilacóide. Já o PSI oxida plastocianina
ou citocromo c6 no lado do lúmen e reduz ferredoxina no lado citoplasmático (WATANABE
et al, 2011).
Em cianobactérias há dois tipos de sistemas-antena, responsáveis pela captação da
luz, um constituído pelas ficobiliproteínas e o outro constituído por moléculas de clorofila a
associadas a complexos protéicos de membrana. As ficobiliproteínas estão organizadas em
uma estrutura chamada de ficobilissoma (PBS, do inglês phycobilisome), complexos
protéicos que se encontram ligados à membrana tilacóide e possuem a função de captação
de luz. Essa estrutura em contato com o PSII forma o complexo PBS-PSII, para onde
transfere a maior parte da sua energia de excitação (BALD; KRUIP; RÖGNER, 1996).
Nos tilacóides, os pigmentos fotossintéticos do PSI e do PSII absorvem energia
luminosa, impulsionando um fluxo acíclico de elétrons no qual a água é o doador primário de
25
elétrons e o NADP+ é o aceptor final, adicionalmente ao fluxo cíclico de elétrons. Alguns
componentes da cadeia transportadora de elétrons fotossintética são compartilhados com a
cadeia transportadora de elétrons respiratória. Desta forma, elétrons provenientes de
coenzimas reduzidas (NADPH), gás hidrogênio (H2) ou succinato, fluem conjuntamente com
os elétrons provenientes do PSII através das plastoquinonas, do citocromo b6f e daplastocianina, sendo finalmente doados para o PSI ou para a oxidase terminal, sendo que
esses eventos resultam na redução de NADP+ ou O2, respectivamente (PAUMANN et al,
2004) (Figura 1).

Figura 1. Principais complexos fotossintéticos da membrana tilacóide de cianobactérias.
PSI: Fotossistema I; PSII: Fotossistema II; Pe: Ficoeritrina; Pc: Ficocianina; Ap: aloficocianina.
Fonte: Adaptado de Sözer (2011).

A energia para os processos metabólicos é fornecida pela fosforilação de difosfato
de adenosina (ADP, do inglês adenosine diphosphate) via enzima ATP sintase, bem como a
redução de NADP+ devido ao transporte de elétrons fotossintético e respiratório (KRANZ;
EICHNER; ROST, 2011). Cianobactérias geralmente utilizam CO2 como principal fonte de
carbono (QIU; GAO, 2001). O mecanismo de fixação de CO2 é baseado em experimentos
com cianobactérias de espécies Synechoccoccus PCC7942 e PCC6803, Synechocystis e
Synechococcus PCC7002. Central ao funcionamento deste mecanismo está o
carboxissoma, um micro-compartimento de proteína no interior da célula que contém a
enzima 1,5-bifosfato carboxilase/oxigenase (Rubisco) e a anidrase carbônica. A função da
anidrase carbônica é converter o HCO3
- acumulado no citosol em CO2, dentro do
carboxissoma, sendo necessários transportadores específicos localizados nas membranas
26
plasmática e tilacóide. A Rubisco, então, realiza a fixação do CO2. (ESPIE; KIMBER, 2011;
PRICE, 2011).
A clorofila a que está presente nas cianobactérias até 2005 era considerada como o
único tipo de clorofila nestes micro-organismos, quando então Larkum e Kühl (2005)
descreveram a ocorrência de clorofila d na cianobactéria marinha Acaryochloris marina. A
clorofila a está presente no centro de reação fotossintética, integrando a antena de captação
de energia luminosa e participando do processo fotoquímico (LONDE; NOVO; CALIJURI,
2005; SEKAR; CHANDRAMOHAN, 2008).
As ficobiliproteínas são compostos formados por uma fração protéica associada a um
cromóforo denominado bilina (BOLD; WYNNE, 1985). As bilinas são cadeias de tetrapirróis
que estão covalentemente ligadas a uma apoproteína por ligações tioéter a resíduos de
cisteína. Nas cianobactérias foram identificados quatro tipos diferentes de bilinas:
ficocianobilina, ficoeritrobilina, ficourobilina e ficoviolobilina. As biliproteínas absorvem
radiação em regiões do espectro visível onde a clorofila a tem baixa absorção. Quando a
energia absorvida pelas biliproteínas dos ficobilissomas alcança o centro de reação do PSII,
ocorre a conversão da energia de excitação para energia química. É importante que as
biliproteínas absorvam fótons em uma vasta faixa de energias (MACCOLL, 1998).
Nas cianobactérias, a aloficocianina (azul) e a ficocianina (azul) estão sempre
presentes e a ficoeritrina (vermelha) é encontrada em apenas algumas. A energia luminosa
absorvida pela ficoeritrina migra em seguida para a ficocianina, e depois para a
aloficocianina e finalmente para a clorofila a. As estruturas das ficobiliproteínas são similares
na maioria das cianobactérias. A ficocianina é o principal constituinte dos ficobilissomas
enquanto que a aloficocianina funciona como pigmento ponte entre os ficobilissomas e
lamelas fotossintéticas (PRASANNA et al, 2010).

3.1.3 Produção de substâncias/compostos de interesse por cianobactérias

Programas visando à descoberta de compostos bioativos de algas e cianobactérias
tem demonstrado que as mesmas representam recursos naturais pouco explorados, com
produção de uma variedade de metabólitos secundários, que mostram semelhanças com
produtos oriundos de animais e plantas. Nestes programas, o foco tem sido identificar
metabólitos antifúngicos, antivirais, antibacterianos, antimitóticos, antihelmínticos,
anticoagulantes, hemaglutinantes e tóxicos. Os metabólitos das cianobactérias também têm
sido avaliados como compostos bioativos, empregados em farmacologia ou em diagnósticos
(PRASANNA et al, 2010), como é o caso das ficobiliproteínas, pigmentos fluorescentes, que
são estudados atualmente por suas atuações como corantes naturais, como agentes
fluorescentes em sistemas de detecção (por exemplo, citrometria de fluxo) e quanto às suas
27
ações farmacológicas. As ficobiliproteínas comercializadas possuem preços que podem
variar de 5.000 a 33.000 dólares por grama (SEKAR; CHANDRAMOHAN, 2008).
As cianobactérias têm sido identificadas como um dos mais promissores grupos de
organismos para descoberta e identificação de produtos naturais biologicamente ativos
(SINGH; KATE; BANERJEE, 2005), pois produzem metabólitos secundários com distintas
atividades biológicas, como as que já foram citadas anteriormente. A presença de
substâncias com atividade antioxidante em cianobactérias foi confirmada nos trabalhos de
Lima Araújo et al (2006), Wang et al (2007) e Pandey e Pandey (2008).
Portanto, esta constitui uma área relativamente inexplorada, uma vez que o número
de espécies de cianobactérias e microalgas ainda é desconhecido, entretanto, são
encontradas citações relatando que podem existir alguns milhões de representantes destes
grupos e esta diversidade também se reflete na composição bioquímica e em uma
quantidade ilimitada de produtos metabólicos (NORTON; ANDERSEN; MELKONIAN, 1996;
PULZ; GROSS, 2004).

3.1.4 Gênero Athrospira

O gênero Arthrospira (ordem Oscillatoriales) constitui o grupo de cianobactérias
filamentosas caracterizadas por uma cadeia de células na forma de espiral ou helicoidal
(Figura 2) e envolvidas por uma bainha fina, cujas paredes transversas podem ser vistas
sob microscopia ótica (GUGLIELMI; RIPPKA; TANDEAU DE MARSAC, 1993; MORAES et
al, 2013). Embora o gênero Arthrospira tenha sido oficialmente incluído no Bergey’s Manual
of Systematic Bacteriology em 1989 (CASTENHOLZ, 1989), as espécies Arthrospira maxima
e Arthrospira platensis, as duas espécies mais importantes, que são cultivadas em nível
industrial em diversas regiões do mundo, são frequentemente referidas como Spirulina
maxima e Spirulina platensis, e a biomassa destas cianobactérias é comercializada com a
denominação de ‘spirulina’ (LIMA ARAÚJO; FACCHINETTI; SANTOS, 2003). Esta
designação é adotada, de fato, sem consideração do sentido taxonômico, e tem significado
prático e tradicional. Portanto, deve-se sempre ter em mente que o produto comercial, e que
é utilizado como suplemento alimentar, trata-se na verdade da biomassa cultivada de
cianobactérias do gênero Arthrospira, que difere do gênero Spirulina. O posicionamento de
separação em dois gêneros distintos é adotado por vários autores (ANAGNOSTIDIS;
KOMAREK, 1988; GUGLIELMI; RIPPKA; TANDEAU DE MARSAC, 1993; RIPPKA;
WATERBURY; STANIER, 1981; SCHELDEMAN et al, 1999).

Figura 2. Filamentos helicoidais ou espirais da Arthrospira platensis.
Fonte: Henrikson (1989).

O gênero Arthrospira apresenta as seguintes características morfológicas: arranjo
dos seus tricomas cilíndricos multicelulares, com seções perpendiculares bastante visíveis e
com formato helicoidal característico por toda a extensão dos filamentos. Os filamentos ou
tricomas, envoltos numa espécie de capa, demonstram algumas constrições, comprimento
próprio que varia de 2 a 10 μm e 5 a 6 μm de diâmetro, formando uma hélice que pode
variar de 30 a 70 μm de raio num comprimento do filamento de aproximadamente 200 – 300
μm. A propósito, o formato helicoidal é bastante influenciado pelos fatores ambientais,
tomando um aspecto espiralado principalmente em meio sólido (VONSHAK, 1997; SPILLER
et al, 2001).
A fissão binária de suas células vegetativas ou fragmentação caracterizam sua
reprodução, possuindo flutuação livre e uma estrutura celular típica de organismos
procariontes, ou seja,com seu núcleo desprovido de membrana, sendo preenchida por
citoplasma que contém grânulos de poliglicanos e vacúolos gasosos. Ainda podem ser
encontradas fibrilas e pequenas porções lipídicas. As membranas tilacóides estão na região
periférica e central do citoplasma, arranjadas paralelamente entre si e o sentido longitudinal
do filamento. As áreas sem tilacóides, além da baixa densidade eletrônica, possuem
ribossomos e fibrilas de DNA (VONSHAK, 1997).
As espécies de gênero Arthrospira podem ser cultivadas autotrofica, bem como
heterotroficamente. As temperaturas ideais para o cultivo são 32 a 45°C. Elas também
podem sobreviver a temperaturas de 60 a 70°C, mas o crescimento não foi observado a
temperaturas menores que 18°C e, devido a isso, o cultivo dessas cianobactérias só é
possível em regiões tropicais e subtropicais, ou em tanques com sistema de
controle/regulação de temperatura (MIKLASZEWSKA, WALERON; WALERON, 2008).
As cianobactérias do gênero Arthrospira são alcalófilas, o pH ótimo para o seu
crescimento fica em torno de 8,5 a 10,5. A alta alcalinidade do meio ambiente é favorável
para manter a pureza microbiológica durante o seu cultivo comercial. Outro fator importante
29
é uma composição química apropriada de meio de crescimento, é reconhecida a
necessidade de que são essenciais elevadas concentrações de íons sódio e carbonato
(VONSHAK; TOMASELLI, 2000).
Além disso, a intensidade luminosa também é essencial, sendo considerada ótimo
para crescimento uma intensidade de 120 a 200 μMol fótons.m2.s-1, o que corresponde de
10 a 15% do total de intensidade da radiação solar em comprimentos de onda de 400 a 700
nm (MIKLASZEWSKA, WALERON; WALERON, 2008).
Durante séculos, os povos tribais colheram A. platensis do Lago Chade na África e
Texcoco Lake no México para uso como fonte de alimento (VONSHAK, 1997), assim como
em várias partes do mundo, como China, Índia, América do Norte, Peru, Japão e outros
(MORAES et al, 2013), fato que significa que Spirulina merece uma atenção especial, como
uma fonte de proteína unicelular e por causa de suas propriedades nutracêuticas. Esta
cianobactéria também foi utilizada em programas espaciais, sendo recomendada pela
National Aeronautics and Space Administration (NASA) como suplemento alimentar primário
durante as missões (KARKOS et al, 2008). O gênero Arthrospira é considerado pela FDA
(Food and Drug Administration) como seguro (GRAS, do inglês Generally Recognized as
Safe), o que permite seu uso em alimentos sem risco para a saúde (FDA, 2003; MORAES;
BURKERT; KALIL, 2010). No Brasil, pesquisas estão sendo conduzidas para sua utilização
como aditivo alimentar em diferentes produtos (MORAIS; MIRANDA; COSTA, 2009; PEREZ
et al, 2007) e ainda na merenda escolar, devido a um projeto de pesquisadores do Sul, com
parcerias entre os setores público e privado (MORAIS; MIRANDA; COSTA, 2009).
A biomassa de cianobactérias do gênero Arthrospira (spirulina), contém
aproximadamente 60 a 70% de proteína, caracterizada como proteína de alta qualidade
contendo aminoácidos essenciais para nutrição humana: histidina, isoleucina, leucina, lisina,
metionina, fenilalanina, triptofano, treonina e valina (BELAY, 2008). Estudos nutricionais
mostram que estes micro-organismos têm um dos mais altos teores de proteína já
encontrado, de alto valor nutricional, boa digestibilidade, e todos os aminoácidos essenciais
nas proporções recomendadas pela Food and Agriculture Organization (FAO), com exceção
de metionina (LEON et al, 2010). Apesar do elevado valor biológico, existe uma
preocupação em relação à ingestão de biomassa microbiana – o alto teor de ácidos
nucleicos, que no caso de Arthrospira é de no máximo 6% como citado no trabalho de Lima
Araújo, Facchinetti e Santos (2003). De acordo com a Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (Anvisa), a ingestão máxima diária de purinas de fontes não convencionais deve
ser de 2 g (BRASIL, 2008); considerando que Spirulina teria 6 % de ácidos nucleicos, a
quantidade máxima dessa cianobactérias que poderia ser ingerida por dia seria 30 g, o que
equivale a 3 colheres de sopa.
30
Os carboidratos e lipídios compõem, respectivamente, 8 a 16% e 4 a 9% da matéria
seca (BECKER, 2007). Cianobactérias pertencente ao gênero Arthrospira também são uma
rica fonte de numerosos microelementos, tais como cálcio, ferro, fósforo, iodo, magnésio,
zinco, selênio, cobre, manganês, cromo, potássio, e sódio. Também foi demonstrado que
Arthrospira platensis é uma fonte rica em vitaminas hidrossolúveis do complexo B, em
particular B12 e vitaminas lipossolúveis D, A, E (ESTRADA; BESCÓS; FRESNO, 2001).
Além disso, essas cianobactérias contem quantidades significativas de ácidos graxos
insaturados, incluindo os ácidos linolênico (ω-3) e linoleico (ω-6), particularmente benéficos
para a saúde humana (BELAY, 2008). Outros compostos importantes da biomassa dessas
cianobactérias são pigmentos (ficocianinas, clorofilas, carotenoides, principalmente β-
caroteno) (DESMORIEUX; DECAEN, 2005), compostos fenólicos, tocoferol, todos estes
reconhecidos por fortes propriedades antioxidantes (ANDRADE; CAMERINI; COSTA, 2008;
COLLA; FURLONG; COSTA, 2007).
Alguns aspectos técnicos da produção de Arthrospira (spirulina) têm vantagens em
relação a outros micro-organismos fotoautótrofos, tais como a sua fácil colheita do meio de
cultura, devido à sua forma em espiral e ao maior tamanho (diâmetro de 10 μm e
comprimento de dezenas a centenas de μm). A produção de biomassa pode variar de
acordo com o meio de cultura utilizado e as condições do meio ambiente externo
(REINEHR, 2001). A extração dos compostos nutricionalmente ativos na forma pura é cara,
mas o consumo direto da biomassa como um alimento nutracêutico é uma alternativa viável.
Condições de cultivo otimizadas para produção de biomassa e produtividade são
normalmente utilizadas na produção comercial de Arthrospira (spirulina) sem considerar a
composição química da biomassa, mas as concentrações mais elevadas de compostos
potencialmente úteis também podem ser obtidas por manipulação das condições de cultivo
(COLLA et al, 2007).

3.1.5 Utilização e consumo de cianobactérias

Nos países desenvolvidos e em desenvolvimento, suplementos dietéticos e/ou
alimentos naturais estão se tornando cada vez mais populares, na crença de que eles
podem complementar a dieta normal ou compensar a ingestão alimentar deficiente. Dentre a
grande variedade de suplementos alimentares disponíveis, aqueles que contêm as
cianobactérias são bem conhecidos devido a benefícios à saúde relatados por fabricantes e
vendedores (RELLÁN et al, 2009). Além disso, as características nutricionais de
cianobactérias têm sido reconhecidas por algumas populações há bastante tempo, quer
para consumo humano ou animal (SPOLAORE et al, 2006), sendo utilizadas como alimento
31
ou medicamento pelo homem em países da Ásia, África e América do Sul durante séculos
(QIU; LIST; KOPCHICK, 2005; JOHNSON et al, 2008).
Cianobactérias têm sido amplamente estudadas por vários motivos, dentre as quais
a produção de biomassa como fonte de compostos químicos de interesse, como clorofila,
carotenoides, ficobiliproteínas, polissacarídeos e outros metabólitos biologicamente ativos,
com aplicação em estudos de descoberta de novos fármacos (BECHER et al, 2005;
DAYANANDA et al, 2007; GARCÍA-GONZALEZ et al, 2005). No que se refere à produção
de substâncias com aplicação como aditivos em tecnologia de alimentos, atenção especial
deve ser dada às ficobiliproteínas e aos compostos com ação antioxidante, presentes na
biomassa de diversas cianobactérias (LIMA-ARAUJO et al, 2006).
Para a nutrição humana, cianobactérias podem ser comercializadas na forma de
tabletes, cápsulas ou líquidos. Elas podem ser incorporadas em massas, biscoitos, balas ou
gomas e embebidas. Cianobactérias do gênero Arthrospira são as mais comumente
utilizadas na alimentação humana. Os principais países que produzem alimentos contendo
Arthrospira são China e Índia e os produtos são vendidos para, aproximadamente, 20 países
do mundo (SPOLAORE et al, 2006). Na África e na América do Sul, as cianobactérias do
gênero Arthrospira tem sido usadas por milhares de anos e ainda são consumidas. No
Chade, país do centro-norte da África, estas cianobactérias são colhidas diretamente de
lagos locais (por exemplo, Lago Kossorom), secas ao sol e depois vendidas nos mercados
como bolos secos ou como Dihé, um molho à base de Spirulina, salsa e pimenta, utilizado
para acompanhar preparações à base de milho, carnes e peixes (ABDULQADER;
BARSANTI; TREDICI, 2000; BERTOLDI; SANT’ANNA; BARCELOS OLIVEIRA, 2008;
HABIB et al, 2008). A. platensis (S. platensis) é a espécie de cianobactéria mais comumente
usada para consumo humano e, alegadamente tem propriedades antioxidantes,
antiinflamatório e hipolipemiante (TINIAKOS; VOS; BRUNT, 2010).
A cianobactéria do gênero Nostoc sp. também tem sido usada como produto
alimentar não processado por mais de mil anos na China, onde é comercializado em sua
forma seca. Além de ter qualidades nutricionais, Nostoc tem valor ''medicinal", bem como
''espiritual" reconhecido por seus consumidores (RELLÁN et al, 2009). A espécie Nostoc
commune var. sphaeroides Kützing, também tem uma longa história de consumo humano
para fins medicinais, citando-se propriedades como hipocolesterolêmico e anti-inflamatório,
contra cegueira noturna, facilitadora da digestão, e como auxilio na melhora da fadiga
crônica (QIU et al, 2002). Nostoc commune é rica em fibras e proteínas, podendo
desenvolver um papel importante, fisiológico e nutricional, na dieta humana (ABED;
DOBRETSOV; SUDESH, 2009).
Nas montanhas do Peru, colônias de Nostoc commune são coletadas nos lagos
pelos povos indígenas, sendo chamadas llullucha. São consumidas localmente, negociadas
32
por milho, ou vendidas, eventualmente, nos mercados populares de Cusco e de outras
cidades vizinhas. Ao longo do planalto peruano, Nostoc commune é altamente importante
como um item sazonal da dieta, sendo consumido sozinho, ou em picante - um ensopado
local - e diz-se ser altamente nutritivo, tradicionalmente é servido com arroz como uma
refeição matinal. Quando adicionado a pratos cozidos, Nostoc é adicionado nos 5 minutos
finais do cozimento, e quando cru é consumido com sal ou em saladas com sementes de
tarwi cozido e ervas (JOHNSON et al; 2008). Também na China, Nostoc commune, é
consumido desde o século III d.C., sendo chamado pelos chineses de Ge-Xian-Mi, é
vendido de 70 a 120 dólares por quilo de peso seco como um aditivo para sopas ou um
prato principal para ser frito com carne, especialmente pato (QIU et al, 2002).

3.1.6 Sustâncias/compostos produzidos por cianobactérias com atividade biológica

Muitas pesquisas têm sido realizadas nesta área, nas quais novas substâncias foram
identificadas, distintas atividades encontradas a partir do estudo de diferentes espécies de
cianobactérias, inclusive espécies do gênero Arthrospira. Alguns desses trabalhos são
sucintamente apresentados neste tópico.
Estudos realizados com a cianobactéria Nostoc flagelliforme mostraram que essa
espécie produz nostoflan, um polissacarídeo que apresenta eficiente atividade antiviral
contra 6 espécies de vírus, entre eles os vírus de Influenza e Herpes (KANEKIYO et al,
2005; 2007). Uma outra pesquisa apontou uma nova lectina, extraída da cianobactéria
Microcystis aeruginosa PCC 7806, denominada microvirin, que apresenta estrutura
molecular similar a cianovirina-N com propriedade antiviral contra o vírus da AIDS, e seu uso
combinado a outros antivirais sintéticos poderá ser uma opção de proteção e tratamento em
um futuro próximo (HUSKENS et al, 2010). Descoberta em 1997, a cianovirina-N é uma
proteína produzida pela cianobactéria Nostoc ellipsosporum que apresentou atividade
antiviral contra o vírus da SIDA (BOYD et al, 1997), eficiente atividade contra diferentes tipos
de vírus da Influenza (O’KEEFE et al, 2003; SMEE et al, 2008), além de atividade antiviral
contra o vírus da hepatite C (HELLE et al, 2006) e contra o vírus Herpes simplex -tipo 1
(TIWARI; SHUKLA; SHUKLA, 2009).
Substâncias produzidas por diferentes cianobactérias têm demonstrado atividade
anticâncer por mecanismos distintos. Criptoficina, substância produzida por Nostoc sp.
apresentou para diferentes tipos de câncer atividade antineoplásica, citotóxica, antimitótica,
sendo esta última comparada a outras drogas antineoplásicas sintéticas e, em alguns casos,
criptoficina apresentou melhor eficiência (KESSEL; LUO, 2000). Um pigmento isolado de
cianobactérias marinhas Stigonema sp. denominado scitonemina foi descrito pela primeira
33
vez como molécula inibidora da pólo-quinase 1, uma enzima regulatória do ciclo celular,
sendo caracterizado como um agente antiproliferativo não tóxico, e com estrutura química
suscetível a modificações para desenvolver novos produtos terapêuticos no tratamento de
desordens hiperproliferativas (STEVENSON et al, 2002). Pesquisas realizadas com as
espécies Nostoc PCC 7120 e Nostoc punctiforme PCC 73102 identificaram a produção de
três diferentes sesquiterpenos: β-elemeno, germacremo D, (E, E)-germacradiene-11-ol que
também apresentam atividade antiparasitária, incluindo atividade antimalarial (AGGER et al,
2008).
Um lipopolissacarídeo (CyP) produzido pela cianobactéria Oscillatoria planktothrix
FP1 apresentou atividade antiinflamatória, caracterizada por sua ação antagonista seletiva a
lipolissacarídeos bacterianos gram-negativos que provocam sepse, sendo considerado
pelos resultados do estudo, um agente terapêutico capaz de modular resposta imune inata e
adaptativa, ressaltando o seu potencial terapêutico (MACAGNO et al, 2006). Um extrato
lipídico de Nostoc commune revelou capacidade inibitória da biossíntese de colesterol e
ácidos graxos, efeito que pode ser benéfico quando este micro-organismo é consumido, pois
reduz o risco de desenvolvimento de doenças cardíacas (RASMUSSEN et al, 2008).
A atividade antioxidante do extrato metanólico de Spirulina maxima foi determinada
in vitro em células de cérebro homogeneizadas e in vivo em plasma e fígado de ratos. A
partir dos resultados pôde-se concluir que o extrato é capaz de proteger contra a oxidação,
tanto in vitro quanto in vivo (MIRANDA et al, 1998).
Estrada, Bescós e Fresno (2001) em num estudo sobre purificação e caracterização
do extrato protéico de Spirulina platensis demonstraram a propriedade antioxidante frente ao
radical hidroxil deste extrato e, com seus resultados ratificaram a capacidade antioxidante
apresentada pelas ficobiliproteínas, principalmente a ficocianina extraída de S. platensis. O
extrato proteico de Spirulina maxima, contendo principalmente ficocianina, foi estudado e
analisou-se sua capacidade de proteção contra teratogenia induzida por hidroxiuréia em
embriões de camundongos. De acordo com os resultados, o extrato protéico pôde prevenir a
incidência das alterações provocadas por hidroxiuréia, que interfere no desenvolvimento
cranofacial e formação do tubo neural, provocando um desenvolvimento anormal do
embrião. Essa proteção está relacionada à propriedade antioxidante do extrato protéico, que
possui como principal componente a ficocianina (VÁZQUEZ-SÁNCHEZ et al, 2009).
Recentemente, o potencial clínico de Spirulina, como fonte de ficocianobilina foi
investigado e verificou-se que a ficocianorubina, cuja forma reduzida é a depicocianobilina, é
um antioxidante importante e pode ser um potencial agente terapêutico no tratamento de
doenças oxidativas induzidas pelo estresse. Ficocianorubina pode inibir a formação de
radicais O2
•- por NADPH oxidase e desempenhar outras funçõesde proteção através da
redução da produção de ERO no corpo (RICHA et al, 2011).
34
Ravi et al (2010) ressaltaram, entre outros efeitos da Spirulina, a estimulação da
produção de citocinas e anticorpos, a promoção da atividade de macrófagos, linfócitos T e
B, incluindo principalmente as células Natural killer (NK). Dados expostos pelo mesmo
trabalho relataram que o pigmento ficocianina exerceu atividade modulatória do sistema
imune por meio de um efeito inibitório sobre a liberação de histamina pelos mastócitos
durante a resposta alérgica. Além disso, esse pigmento também suprimiu o crescimento de
células tumorais, promovendo a atividade das células NK e induzindo linfócitos do baço a
produzirem o fator de necrose tumoral TNF-α.
Um estudo de investigação sobre Spirulina fusiformis (S. platensis) quanto suas
propriedades biológicas, especialmente atividade antiinflamatória, avaliou o efeito da
administração oral em camundongos com artrite induzida (estabelecida como modelo de
artrite reumatóide). A administração oral de S. fusiformis alterou as condições físicas
(volume da pata e peso corporal) e bioquímicas (marcadores bioquímicos específicos)
observadas nos camundongos com artrite, apresentando valores próximos às condições
normais do grupo controle. S. fusiformis foi capaz de suprimir as mudanças causadas pela
artrite induzida e a atividade antiinflamatória, segundo os autores, foi atribuída as
propriedades antioxidantes de β-caroteno, vitaminas C e E e outros micronutrientes
presentes na biomassa de que S. fusiformis (RASSOL; SABINA; LAVANYA, 2006).
Um estudo investigou a capacidade de Spirulina sp. proteger a atividade proliferativa
de células tronco neurais do hipocampo de uma resposta inflamatória aguda induzida por
LPS (lipopolissacarídeo bacteriano) por ativação de vias pró-inflamatórias. Ratos jovens
foram alimentados com uma dieta controle e com uma dieta experimental suplementada
com 0,1% de Spirulina sp. por 30 dias. Os resultados mostraram que Spirulina sp. foi capaz
de anular os efeitos negativos da inflamação induzida por LPS na função de células
progenitoras neurais mantendo a capacidade proliferativa dessas células na resposta
inflamatória aguda. Segundo os pesquisadores, uma dieta enriquecida com Spirulina sp.
auxilia a regulação dessa resposta inflamatória, importante para diferentes tipos de doenças
(BACHSTETTER et al, 2010).
Oropeza et al (2009), revisando o efeito dietético da spirulina na reatividade vascular,
em anéis de aortas extirpadas de ratos Wistar magros e obesos, relataram que a
cianobactéria modula a síntese e a liberação de compostos bioativos pelo endotélio,
promovendo vasodilatação pela síntese e liberação de óxido nítrico e do eicosanóide
vasodilatador prostaciclina, sobrepondo-se à síntese de eicosanóides vasoconstritores,
como prostaglandina H2 e tromboxano. No estudo de Mridha et al (2010), foi evidenciado
que ratos alimentados com 150 mg.kg-1 de spirulina apresentaram diminuição
estatisticamente significante dos níveis de glicose sanguínea após 28 dias de tratamento; o
resultado foi mais acentuado para Spirulina do que para o medicamento hipoglicemiante
35
glibenclamida. Esse resultado foi observado para dois tipos de dietas fornecidas, sendo uma
com alta quantidade de açúcar e outra uma dieta normal de laboratório.
Um estudo demonstrou que ratos alimentados com spirulina absorveram 60% mais
ferro do que os que utilizaram o suplemento sulfato ferroso (HABIB et al, 2008). Já para
humanos, o trabalho recente de Selmi et al (2011), conduzido com quarenta voluntários de
ambos os sexos, de cinquenta anos ou mais, que não possuíam histórico de doenças
crônicas, evidenciou um aumento constante dos valores médios de hemoglobina
corpuscular média em indivíduos de ambos os sexos. Além disso, o volume corpuscular
médio e a concentração de hemoglobina corpuscular média também aumentaram em
participantes do sexo masculino. As mulheres com mais idade pareceram se beneficiar mais
rapidamente da suplementação de spirulina. Os pacientes não faziam utilização de
suplemento férrico medicamentoso e foram avaliados no início e após seis e doze meses de
tratamento. O trabalho também avaliou a influência da suplementação de spirulina na função
imunológica, e teve como conclusão que a spirulina pode melhorar a anemia e
imunossenescência em indivíduos com mais idade (HABIB et al, 2008). Pesquisadores
investigaram o efeito quimiopreventivo de S. platensis contra toxicidade no fígado de rato e
carcinogênese induzida por precursores de dibutil nitrosamina (DBN) e o seu mecanismo de
ação em células de hepatocarcinoma (HepG2). O tratamento com S. platensis reduziu a
incidência de hepatocarcinoma para 20% no grupo de ratos expostos a DBN. Os resultados
demonstraram que S. platensis pode prevenir o início de desenvolvimento de tumor induzido
por DBN. Os autores afirmam que apesar dos resultados promissores mais estudos
precisam ser realizados para comprovar a eficácia do tratamento e, para que possa ser
utilizado em pacientes humanos que não tiveram bons prognósticos de hepatocarcinoma
com tratamentos convencionais (ISMAIL et al, 2009).
Um estudo de revisão realizado sobre potencial nutricional e terapêutico de Spirulina
reforça que esta cianobactéria possui diversas atividades biológicas e importância
nutricional devido à alta concentração de nutrientes naturais, afirma que extratos preparados
de Spirulina são capazes de inibir a carcinogênese devido às propriedades antioxidantes
que protegem os tecidos e reduzem a toxicidade do fígado, rins e testículos. Este estudo
ainda destaca os principais compostos de importância terapêutica oriundos de Spirulina e
seus efeitos relacionados: ficocianina (antioxidade, anticâncer, antiviral, antitóxico,
imunoestimulante, hematopoético); sulfolipídio (antiviral); cianovirina-N (antiviral);
polissacarídeo sulfatado calcium-spirulan (anticâncer, antiviral, imunoestimulante,
hematopoético); -linolênico (precusor de prostaglandinas, efeito em artrite doença cardíaca,
obesidade e depressão); -caroteno (precusor de vitamina A, antioxidade, anticâncer) e
vitamina E (antioxidade, anticâncer). Aponta que várias descobertas científicas sugerem que
Spirulina provou ser um candidato em potencial e ideal para a terapia conjunta devido ao
36
possível efeito sinérgico de muitos fitoquímicos em células íntegras. Relata que cientistas na
Índia, China, Japão, Estados Unidos e em outros países estão estudando a Spirulina como
um alimento notável, o qual já é claramente seguro e fornecendo suporte nutricional
concentrado para uma ótima saúde e bem-estar. O papel multifuncional de espécies de
Spirulina torna uma droga natural ideal com imensas propriedades profiláticas e terapêuticas
(KHAN; BHADOURIA; BISEN, 2005).
Em um trabalho de revisão sobre cianobactérias, potencial nutricional e aspectos
biotecnológicos, os autores afirmam que as cianobactérias, devido aos avanços das
pesquisas, vêm ganhando muita atenção devido a seu potencial aplicação na biotecnologia
e os trabalhos disponíveis na literatura versam principalmente sobre Spirulina e seus
componentes, que possuem uma diversidade de atividades, fazendo dela, além de um
excelente suplemento alimentar, uma fonte potencial para emprego na prevenção e no
tratamento de várias enfermidades (OLIVEIRA, W et al, 2013).
Apesar dos benefícios de saúde atribuídos às cianobactérias, uma característica
marcante desses micro-organismos é a capacidade de produzir certos metabólitos
secundários tóxicos denominados genericamente de cianotoxinas que afetam a saúde
animal e humana. Além disso, os produtos naturais extraídos de cianobactérias podem estar
contaminados com cianotoxinas, que são produzidas por cerca de 40 espécies de
aproximadamente150 gêneros conhecidos (CARMICHAEL, 1994; COX et al, 2005;
MOLICA; AZEVEDO, 2009).
Po outro lado, algumas cianobactérias já são reconhecidas como livres de toxinas e
consideradas como alimento seguro e sem efeitos colaterais/adversos pelo programa da
Organização das Nações Unidas para o Desenvolvimento Industrial (ONUDI) (SAMUELS et
al, 2002). Como mencionado anteriormente o gênero Arthrospira é internacionalmente
reconhecido como seguro (FDA, 2003; MORAES; BURKERT; KALIL, 2010).

3.1.7 Modulação das condições de cultivos

Para a produção de biomassa de culturas de cianobactérias, o uso de meios de
cultura de confiança que possam sustentar um bom crescimento da linhagem selecionada é
pré-requisito necessário. A literatura descreve a existência de muitos meios adequados para
o cultivo de espécies puras de cianobactérias. Em alguns casos, um pequeno número de
meios de cultivo é eficaz na manutenção de uma grande e diversa coleção de
cianobactérias. No entanto, eles normalmente devem ser otimizados para a produção de
culturas de massa, em especial quando uma nova estirpe é isolada (RIPPKA et al, 1979;
SILVA; CORTIFIAS; ERTOLA, 1989). Segundo Singh, Parmar e Madamar (2009), existe
37
uma necessidade de selecionar uma linhagem de alto rendimento e melhorar a produção
dos compostos de interesse através da manipulação das condições de cultivo.
As condições ambientais que influenciam a síntese de pigmentos e outras
substâncias de interesse em cultivos de microalgas e cianobactérias têm sido estudadas, e
fatores como luz incidente, composição do meio, temperatura, bem como os tipos de cultivo
têm sido caracterizados (ANDRADE; COSTA, 2008). Como destaque para fatores
estudados no presente trabalho são feitas algumas considerações sobre luz, carbono e
nitrogênio.
Em crescimento fotoautotrófico, cianobactérias usam a luz como única fonte de
energia para dirigir a fotólise da água. A energia produzida nesta reação é utilizada para
a redução de CO2 (CHOJNACKA; NOWORYTA, 2004). A velocidade específica de
crescimento desses micro-organismos pode ser muito influenciada pela fonte e intensidade
de luz (WANG; FUB; LIU, 2007).
Como a ampla faixa luminosa é a principal característica de qualquer sistema
fotossintético, deve-se considerar a correta distribuição da luz sobre o fotobioreator, bem
como considerar sua intensidade, uma vez que se aplicada em demasia sobre sua
superfície, provocará fotoinibição (crescimento limitado) e consequentemente, baixa
conversão de energia luminosa em biomassa, isto é, baixa eficiência fotossintética. A
eficiência fotossintética aumenta até o momento em que a iluminação em excesso torna-se
um fator limitante ao crescimento, e por outro lado, a produtividade é negativamente afetada
pela área central (zona de sombra) ou outras com iluminação deficiente (ERIKSEN, 2008).
Por outro lado, presume-se que a obtenção de determinados produtos desses micro-
oragnismos pode ser influenciada pela intensidade ou o comprimento de onda disponível no
meio. A faixa de intensidade luminosa mais utilizada em cultivos situa-se entre 100 e 200
Mol fótons.m-2.s-1 (8 a 16 klux) (FLETCHER, 1979; WANG; FUB; LIU, 2007).
O carbono constitui todos os compostos orgânicos, e é a principal elemento da
biomassa microalgal (incluindo cianobactérias), no valor de até 65% do peso seco. O teor de
carbono, no entanto, varia significativamente entre as espécies e as condições de cultura e
pode variar entre 17,5 e 65%, em peso seco. No entanto, a maioria das espécies contém
cerca de 50% de carbono (GROBBELAAR, 2004). O carbono é o elemento necessário em
maiores concentrações para as cianobactérias por ser constituinte de todas as substâncias
orgânicas sintetizadas pelas células (proteínas, carboidratos, ácidos nucleicos, vitaminas,
lipídeos, entre outros) (LOURENÇO, 2006).
O íon bicarbonato é a fonte de carbono mais frequentemente empregada em meios
de cultura para cianobactérias. É incorporado ativamente, gerando um gasto energético
neste processo, sendo convertido em CO2 que é empregado na fotossíntese, e em
carbonato, que é liberado para o meio extracelular aumentando o pH do cultivo (MATSUDO,
38
2006). O gênero Arthrospira necessita de grandes quantidades de bicarbonato, que além de
fonte de carbono, auxilia na manutenção da condição alcalina do meio de cultura, vital para
o cultivo deste gênero, e constitui uma barreira para o desenvolvimento de outros micro-
organismos (RAOOF; KAUSHIK; REINHER, 2006).
O nitrogênio é o segundo elemento mais abundante na biomassa de microalgas e
cianobactérias, seu teor varia de 1% até 14% (normalmente, cerca de 5 a 10%) de peso
seco (GROBBELAAR, 2004). O nitrogênio é componente fundamental de três classes de
substâncias estruturais e do metabolismo primário das células: proteínas, ácidos nucleicos e
pigmentos fotossintetizantes (clorofilas e ficobilinas) (LOURENÇO, 2006). Nitrato (NO3
-) é a
forma mais comumente utilizada de nitrogênio mineral para cultivo de microalgas e
cianobactérias em meios sintéticos. Os sais nitrato mais frequentemente utilizados são
NaNO3 e, menos freqüentemente, nitrato de potássio (KNO3) (GROBBELAAR, 2004).
Apesar da ampla utilização dos sais de nitrato, estudos mostram uma variedade de fontes
alternativas de nitrogênio. Microalgas e cianobactérias podem utilizar nitrogênio a partir de
formas orgânicas, tais como ureia, amônia e alguns aminoácidos. Ureia e aminoácidos são
transportados ativamente para dentro das células e são metabolizados no meio intracelular.
Amônia é a fonte de nitrogênio preferido para esses micro-organismos porque sua absorção
e assimilação consome menos energia em comparação com as outras fontes de nitrogênio
(PEREZ-GARCIA et al, 2011).
Se o suprimento de nitrogênio é abundante em cultivos, verifica-se tendência de
aumento nas concentrações de proteína e clorofila nas células. Já baixas concentrações
diminuem o teor destes componentes celulares, diminuindo drasticamente a taxa de divisão
celular. A concentração de ácido linolênico aumenta e o conteúdo de ácidos graxos
permanece constante. As ficocianinas são degradadas e utilizadas como fonte de nitrogênio.
Mais carotenoides e menos clorofilas são produzidas, gerando mudanças de cor que
tendem ao amarelado (COLLA; BERTOLIN; COSTA, 2004; LOURENÇO, 2006; FERREIRA,
2008).
Os meios de cultivo utilizados para a produção industrial de Arthrospira geralmente
usam como base o meio Zarrouk (BELAY, 2008). Contudo, o meio Zarrouk é bastante caro e
apresenta uma composição complexa pelo uso de muitos reagentes, o que influencia
significativamente no preço das preparações obtidas a partir da biomassa de cianobactérias
cultivadas nele. Por tal motivo, meios mais econômicos são constantemente procurados,
objetivando uma redução dos custos de produção. Algumas tentativas foram feitas para
substituir meio Zarrouk por meios reduzidos em elementos traços (por exemplo, RM6) ou
feitos a base de fertilizantes (por exemplo, superfosfato) ou fazendo uso de resíduos de
matérias-primas (por exemplo, melaço) (ANDRADE; COSTA, 2007; RAOOF; KAUSHIK;
REINHER, 2006; TARKO; DUDA-CHODAK; KOBUS, 2012).
39
Segundo Colla et al (2007) relatam em sua pesquisa com a cianobactéria S.
platensis, a extração de compostos nutricionalmente ativos em forma pura, é cara, mas o
consumo direto da biomassa de cianobactéria como um alimento nutracêutico é uma
alternativa viável. Condições de cultivo otimizadas para produção da biomassa e
produtividade são normalmente utilizados na produção comercial de cianobactérias, neste
caso de S. platensis, sem considerar a composição química, mas concentrações mais
elevadas de compostos potencialmente úteis, tais como ácidos graxos poli-insaturados,
proteínas e compostos fenólicos que podem ser obtidos