CAROLINA-BERES

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UFRJ

Aprendendo na Universidade

06/01/2023

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Introdução à Administração

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Agradecimentos

Aos amigos por entenderem minha ausência, ou por não entenderem e brigarem comigo exigindo
minha presença. Saibam que nos momentos que fico distante sempre sofro de saudades. À minha
flor pelo incentivo, companhia e por me dar paz.
À minha mãe que se preocupa, mas finge que não, só para me dar tranqüilidade para continuar no
caminho que escolhi.
Ao Marco, meu guia, meu amigo, meu exemplo de pessoa e de profissional. Aprendo com você
nos dias bons e nos dias ruins. Obrigada por estar ao meu lado todos esses anos. E por sempre me
lembrar que tudo dá certo no final. Se não deu certo ainda é porque não chegamos nos final.
Ao Antônio, meu anjo da guarda, meu santo! Obrigada por me ouvir, me ajudar em tudo, e por
sempre chegar sorrindo acabando com qualquer possibilidade de um dia ruim.
Aos amigos do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, por me aguentarem reclamando, por
serem pessoas incríveis com quem aprendi muito e por terem cada um, uma história que os fazem
únicos nas suas particularidades.
Às Professoras Vêronica Calado e Lourdes Cabral pela orientação e compreensão ao longo desses
2 anos.
À Analy Leite (maluca!) e ao LEMM por me ajudarem na última etapa do trabalho de forma tão
atenciosa.
À Capes pela bolsa de mestrado.
Ao Programa de Ciência de Alimentos pela oportunidade.
Muito obrigada!

BERES, Carolina. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS COM POTENCIAL
TECNOLÓGICO DE UVAS VITIS VINIFERA E DESENVOLVIMENTO DE UM MEIO DE
CULTURA BASEADO NA UVA E SEUS DERIVADOS. Rio de Janeiro, 2013. Dissertação
(Mestrado em Ciências de Alimentos) – Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Rio de Janeiro, 2013.
Resumo
A vitivinicultura representa um importante segmento econômico e social no mercado. O
papel biotecnológico dos microrganismos neste processo permite novos estudos, uma vez que os
processos são intimamente dependentes de características da região produtora, assim como das
variedades de uvas utilizadas. Na produção do vinho são utilizadas culturas comerciais, que
aumentam os custos e não valorizam as particularidades encontradas em culturas nativas. Além
da participação nos processos fermentativos, há produção de enzimas como pectinases e a seleção
de estirpes probióticas, cujos produtos com estas características têm apresentado uma crescente
demanda no mercado. Desta forma este estudo teve como objetivo isolar microrganismos da
superfície de uvas que apresentem potencial de uso biotecnológico e características probióticas. E
desenvolver um meio de cultivo que tem como componente principal a uva e seus derivados, para
isolamento de bactérias láticas. Foram isolados em Agar MRS 485 microrganismos. Estes foram
caracterizados presuntivamente como: BAL (189), fungos e leveduras (202) e bastonetes Gram
negativos (69). Todos os microrganismos foram avaliados quanto à produção da enzima
pectinase, resistência a sais biliares, pH ácido e produção de atividade antimicrobiana. Destes, 94
estirpes produziram pectinase e 9 estirpes foram presuntivamente caracterizadas como potenciais
probióticas por apresentarem resistência aos sais biliares, resistência ao pH 3,5 e produzir
antimicrobiano ao mesmo tempo. As estirpes que apresentaram alguma atividade biotecnológica
de interesse foram identificadas através de técnicas moleculares. Foi realizada amplificação do
material genético por PCR, ARDRA para análise de restrição do RNAr 16S e sequenciamento
dos perfis representativos de cada espécie. Foram identificadas 12 estirpes de Paenibacillus sp., 2
de Bacillus sp., 2 Bacillus subtilis, 1 Klebsiela pneumoniae, 16 Klebsiela sp., 12 Leuconostoc e 1
Cellulosimicrobium funkei. Foi desenvolvido um meio de cultivo utilizando-se a uva Vitis
vinifera, bagaço de uva, extrato do bagaço de uva e suco de uva comercial para isolamento de
BAL. Na formulação com 50% de suco e 50% de uva foi observado o crescimento das culturas de
referência igual ou superior ao encontrado no meio comercial (MRS). O desenvolvimento de um
meio de cultura a base de uva, com desempenho comparável a um meio comercial permitirá o
isolamento de culturas a partir das uvas de uma forma mais econômica e utilizando as
particularidades das variedades de uvas de cada região.
Palavras – chave: uva, bagaço, meio de cultura, microrganismo, bactéria lática, pectinases.

BERES, Carolina. MICRORGANIMS WITH TECNOLOGICAL POTENTIAL ISOLATED
FROM THE VITIS VINIFERA GRAPE SURFACE AND CULTURE MEDIUM
DEVELOPMENT USING GRAPE AND ITS DERIVATIVES. Rio de Janeiro, 2013.
Dissertation (Master in Food Science) – Chemistry Institute, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Rio de Janeiro, 2013.
Abstract
The wine industry is an important economic and social sector. The role of microorganisms
in biotechnological process allow further studies, as the processes are critically dependent on the
characteristics of the grape varieties used. In the production of wine commercial cultures are
used, which increase costs and do not value the particularities found in native cultures. In addition
to cultures participating in fermentation processes, there are cultures that secrets enzymes such as
pectinases, and the selection of probiotic strains, whose products with these characteristics have
shown a growing demand in the market. Therefore, this study aimed to isolate microorganisms
from the surface of grapes with biotechnological and probiotic potential, and develop a culture
medium that has as main component the grape and derivatives, to isolate lactic acid bacteria.
Were isolated in MRS Agar 485 microrganisms. These were characterized as presumptively:
BAL (189), fungi and yeasts (202) and Gram negatives rod (69). These were evaluated for the
production of the enzyme pectinase, resistance to bile salts, acid pH and production of
antimicrobial activity. Among these, 94 strains produced pectinase and 9 strains were BAL
characterized as presumptively due to its resistance to bile salts, pH 3.5 and to produce
antimicrobial simultaneously. Strains that produced some biotechnological activity of interest
were identified by molecular techniques. The DNA fragment amplified by PCR technique of the
strains were used ARDRA. It was identified 12 strains of Paenibacillus sp., 2 Bacillus sp., 2
Bacillus subtilis, 1 Klebsiela pneumoniae, 16 Klebsiela sp., 12 Leuconostoc and 1
Cellulosimicrobium funkei. We developed a culture medium using the Vitis vinifera grape, grape
pomace, grape pomace extract and commercial grape juice for the isolation of BAL. In the
formulation with 50% fruit juice and 50% grape the growth in the Type cultures obtained was
equal or superior to that found in commercial medium (MRS). The development of a culture
medium based on grape, with performance comparable to a commercial medium allows the
isolation of cultures from grapes with a cheaper methodology and using the particularities of
grape varieties of each region.

Keywords: grape, pomace, culture medium, microrganism, lactic acid bacteria, pectinases.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Uva Vitis vinifera.

18
Figura 2: Produção de vinhos, sucos e derivados a partir de uvas destinadas ao
processamento no Rio Grande do Sul no ano de 2011.

19
Figura 3: Partes integrantes do cacho de uva.

21
Figura 4: Estrutura química dos polifenóis resvetrol e catequina.

23
Figura 5: Fluxograma de operação para produção de vinho tinto (Barnabé, 2006).

25
Figura 6: Estrutura primária da pectina.

37
Figura 7: Ação da pectinase na produção do suco de uva (Rizzon e Meneguzzo,
2007).

39
Figura 8: Mecanismos de ação das pectinases: (a) R=H para PG e CH3 para PMG;
(b) PE. (c) R=H para PGL e CH3 para PL. A seta indica o local onde a pectinase
reage com a substância péctica (Gogus, 2006). PMG: polimetilgalacturonase;PG:
poligalacturonase; PE: pectinesterase; PL: pectina liase.

42
Figura 9: Alegação de propriedade funcional aprovada para os alimentos
probióticos e os requisitos específicos (Brasil, 2008).

48
Figura 10: Etapas da técnica de PCR.

57
Figura 11: Atividade antimicrobiana de bactérias láticas isoladas da uva contra
Listeria innocua.

72
Figura 12 A,B,C: Atividade antimicrobiana contra S. aureus das 9 culturas
caracterizadas como bactérias láticas, isoladas da superfície das uvas. A seta indica
o controle positivo L. lactis ATCC 11454 produtor de bacteriocina.

72
Figura 13: Triagem para determinação de microrganismos com atividade
pectinolítica, a partir de revelação por vermelho de rutênio. A presença do halo foi
considerada positiva para presença da enzima.

75
Figura 14: Estirpes isoladas da uva produtoras de atividade pectinolítica. As setas
indicam dois controles positivos Candida krusei 50148 e Pichia anomala 50407.

76
Figura 15: Perfil de bandas obtidos por ARDRA após tratamento com a enzima HhaI
realizados em 9 culturas com atividade pectinolítica. As setas superiores indicam o padrão
de bandas (Kb) e a seta lateral indica a banda com 1.500 pares de base. Kb: padrão de
77

bandas; pb: pares de base.

Figura 16: Perfil de bandas obtidos por ARDRA após tratamento com a enzima
HhaI realizados em 18 culturas com atividade pectinolítica. As setas superiores
indicam o padrão de bandas (Genevuler 1Kb Plus DNA ladder) e a seta lateral
indica a banda com 1.500 pares de base. pb: pares de base.

77
Figura 17: Perfil de bandas obtidos por ARDRA após tratamento com a enzima
HhaI realizados em 9 culturas com atividade pectinolítica. As setas superiores
indicam o padrão de bandas (Genevuler 1Kb Plus DNA ladder) e a seta lateral
indica a banda com 1.500 pares de base. pb: pares de base.

78
Figura 18: (A e B) Meios elaborados com 100% e 50% de uva, respectivamente.
(C) Meio constituído de 100% de suco. (D) MRS – meio controle. Nas figuras A,
B e C, observam-se colônias com pigmentação, diferente do encontrado no MRS.

84
Figura 19: Diagrama de caixa para o Lactobacillus delbrueckii ATCC 7830, usando
Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 5 minutos. L: Lactobacillus; Log
UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau
Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.

86
Figura 20: Diagrama de caixa para o Lactobacillus GG rhamnosus ATCC 53103,
usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 5 minutos. L: Lactobacillus; Log
UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau
Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.

86
Figura 21: Diagrama de caixa para o Lactobacillus casei ATCC 393, usando Agar
Uva com pH 5,5 e autoclavado por 5 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL:
logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius;
Mean: média; SD: desvio-padrão.

87
Figura 22: Diagrama de caixa para o Lactobacillus sake CECT 906, usando Agar
Uva com pH 5,5 e autoclavado por 5 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL:
logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius;
Mean: média; SD: desvio-padrão

87
Figura 23: Diagrama de caixa para o Lactobacillus GG rhamnosus ATCC 53103,
usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 15 minutos. L: Lactobacillus; Log
UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau
Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.

88
Figura 24: Diagrama de caixa para o Lactobacillus delbrueckii ATCC 7830, usando
Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 15 minutos. L: Lactobacillus; Log
UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau
Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.

Figura 25: Diagrama de caixa para o Lactobacillus casei ATCC 393 usando Agar
Uva com pH 5,5 e autoclavado por 15 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL:
logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius;
Mean: média; SD: desvio-padrão.

89
Figura 26: Diagrama de caixa para o Lactobacillus sake CECT 906, usando Agar
Uva com pH 5,5 e autoclavado por 15 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL:
logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius;
Mean: média; SD: desvio-padrão.

89
Figura 27: Gráfico das Médias para L. GG rhamnosus ATCC 53103 Log UFC/mL:
logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; oC: grau Celsius; pH:
potencial de hidrogênio.

90
Figura 28: Gráfico das Médias para L.delbrueckii ATCC 7830. Log UFC/mL:
logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; oC: grau Celsius; pH:
potencial de hidrogênio.

91
Figura 29: Gráfico das Médias para L.casei ATCC 393. Log UFC/mL: logaritmo de
unidade formadora de colônia por mililitro; oC: grau Celsius; pH: potencial de
hidrogênio.

92
Figura 30: Gráfico das Médias para L. sakei CECT 906. Log UFC/mL: logaritmo
de unidade formadora de colônia por mililitro; oC: grau Celsius; pH: potencial de
hidrogênio.

93
Figura 31: Comparação entre meios de cultivo com 100% ou 50% de suco em
relação ao crescimento de colônias das estirpes analisadas. Log UFC/mL:
logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro.

94
Figura 32: Comparação entre meios de cultivo com 100% ou 50% de uva quanto ao
crescimento de colônias das estirpes analisadas. Log UFC/mL: logaritmo de
unidade formadora de colônia por mililitro. L: Lactobacillus.

95
Figura 33: Comparação entre meios de cultivo com 100% de uva e meio MRS.
Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; L:
Lactobacillus, MRS: de Man, Rogosa and Sharpe.

96
Figura 34: Comparação entre meios de cultivo formulados com uva e suco de uva
e meio MRS. Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por
mililitro; MRS: de Man, Rogosa and Sharpe, pH: potencial de hidrogênio; min:
minutos.
97

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Produção (em toneladas) de uvas para processamento e para consumo
in natura, no Brasil.

19
Quadro 2: Composição da uva (Vitis vinifera L.) por 100 gramas de parte
comestível.

22
Quadro 3: Conteúdo fenólico de sucos e vinhos.

24
Quadro 4: Principais aplicações do bagaço de uva na indústria.

26
Quadro 5: Microrganismos encontrados como fitopatógenos em uvas

32
Quadro 6: Efeitos benéficos à saúde, atribuídos pelos probióticos e seus
respectivos mecanismos de ação.

46
Quadro 7: Substratos de origem vegetal utilizados como veículo de
microrganismos probióticos.

49
Quadro 8: Aplicação de microrganismos probióticos em produtos no Brasil.

50
Quadro 9: Meios de cultura comumente empregados para isolamento e
identificação de bactérias láticas de interesse.

52
Quadro 10: Meios de cultura comumente empregados para isolamento e
identificação de leveduras de interesse.

54
Quadro 11: Composição do meio de cultura para pesquisa de microrganismos
pectinolíticos.

54
Quadro 12: Composição do Agar MRS.

63
Quadro 13: Resultado da contagem de colônias para as corridas do planejamento.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Culturas-padrão usadas nos experimentos.

59
Tabela 2: Planejamento de Misturas Simplex-Lattice com Pontos Interiores.

67
Tabela 3: Planejamento fatorial fracionário 22 e 3 pontos centrais.

69
Tabela 4: Caracterização morfotintorial das estirpes isoladas das uvas em diferentes
condições.

71
Tabela 5: Resistência de bactérias láticas isoladas de uva ao pH 3,5.

73
Tabela 6: Viabilidade celular das culturas isoladas da superfície da uva em Caldo
MRS suplementado com 0,3% de bile.

74
Tabela 7: Relação entre as estirpes isoladas e o perfil de bandas obtidos no ARDRA.

78
Tabela 8: Identificação molecular por sequenciamento das cepas com perfil de
bandas distintos.

79
Tabela 9: Melhores condições de pH, temperaturade incubação, tempo de
autoclavação e formulação do meio para o crescimento de bactérias láticas.

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

µL: microlitros
16S rRNA: subunidade 16S do RNA ribossomal
a.C.: antes de Cristo
ANOVA: Analysis of Variance, Análise de variância
ARDRA: Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis, Análise de Restrição do DNA
Ribosomal Amplificado
ATCC: American Type Culture Colection
BAA: bactéria ácido acética
BAL: bactéria ácido lática
BHI: Brain Heart Infusion, infusão de cérebro e coração
DNA: Deoxyribonucleic, Ácido desoxirribonucléico
dNTP: Deoxynucleotide Triphosphate, Desoxiribonucleotídeo Tri-fosfato
FAO: Food and Agriculture Organization
GC: conteúdo Guanina e Citosina
GRAS: Generally Recognaze as Safe
g/L: grama por litro
h: horas
Kb: padrão de bases
KDa: quilo Dalton
L: litros
LDH: desidrogenase lática
log: unidade logarítmica
MgCl2: cloreto de magnésio
mL: mililitros

MRS: Man, Rogosa and Sharpe
NAD: nicotinamida adenina dinucleotídeo
NADH: nicotinamida adenina dinucleotídeo
oC: graus Celsius
PCR: Polimerase Chain Reaction, Reação em Cadeia da Polimerase
pH: potencial de hidrogênio
SO2: ácido sulfúrico
TAE: tris acetato EDTA
TBE: tris borato EDTA
UFC: unidade formadora de colônias
UFRJ: Universidade Federal do Rio de Janeiro
UV: ultravioleta
WHO: World Health Organization

SUMÁRIO

1. Introdução 14
2. Justificativa 16
3. Objetivos 17
3.1. Objetivo geral 17
3.2. Objetivos específicos 17
4. Revisão Bibliográfica 18
4.1. Uva e resíduos da vitivinicultura 18
4.2. Variedade de uva para produção de vinho 20
4.3. Produção de vinho e suco de uva 24
4.4. Resíduos agroindustriais 27
4.5. Microbiota da uva 29
4.5.1. Fatores que afetam a microbiota da uva 29
4.5.2. Principais microrganismos da microbiota da uva 29
4.5.3. Microrganismos fitopatogênicos 30
4.6. Presença de microrganismos de interesse industrial na uva 33
4.6.1. Levedura 33
4.6.2. Bactérias ácido láticas 34
4.7. Microrganismos pectinolíticos 36
4.7.1. Pectina 37
4.7.2. Definição e nomenclatura da enzima pectinase 37
4.7.3. Importância prática, econômica e aplicação industrial 38
4.7.4. Mecanismos de ação das pectinases 40
4.8. Microrganismos com potencial probiótico 42
4.8.1. Microrganismos probióticos 42
4.8.2. Mecanismos de ação de microrganismos probióticos 44
4.8.3. Legislação para probióticos 46
4.8.4. Aplicação de microrganismos probióticos 49
4.9. Seleção e isolamento de microrganismos de interesse 51
4.9.1. Métodos tradicionais 51
4.9.2. Métodos recentes 55
4.9.2.1. Técnicas moleculares 55
5. Material e métodos 59
5.1. Seleção de microrganismos com interesse tecnológico para a indústria de uvas
e vinhos
59
5.1.1. Origem das uvas 59
5.1.2. Culturas padrão 59
5.1.3. Isolamento e estocagem dos microrganismos da superfície da uva 60
5.1.4. Seleção de bactérias láticas produtoras de substâncias antimicrobianas 60
5.1.5. Seleção de bactérias láticas com potecial probiótico 61
5.1.5.1. Resistência ao pH ácido 61
5.1.5.2. Resistência a sais biliares 62

5.1.5.3. Análise estatística 62
5.1.6. Seleção de microrganismos pectinolíticos 62
5.1.7. Identificação molecular dos microrganismos isolados que apresentaram
propriedades tecnológicas de interesse
64
5.1.7.1. Extração do DNA das culturas analisadas 64
5.1.7.2. Amplificação do gene codificador do RNAr 16s por PCR 64
5.1.7.3. Análise de restrição do DNA ribossomal amplificado (ARDRA) 65
5.1.7.4. Purificação do material genético 65
5.1.7.5. Identificação molecular por seqüenciamento 66
5.2. Desenvolvimento do meio de cultivo para isolamento de bactérias láticas de
interesse para vitivinicultura
66
5.2.1. Planejamento de misturas 67
5.2.1.1. Obtenção dos componentes analisados no planejamento de misturas 68
5.2.2. Planejamento fatorial fracionário (23-1) 69
6. Resultados 71
6.1. Isolamento de microrganismos com interesse tecnológico para indústria de
uvas e vinhos
71
6.1.1. Isolamento e caracterização morfotintorial de microrganismos isolados 71
6.1.2. Seleção de estirpes produtoras de substância antimicrobiana semelhante à
bacteriocina
71
6.1.3. Determinação de características probióticas das culturas isoladas 72
6.1.4. Pesquisa de presença da enzima pectinase 75
6.1.5.Identificação molecular dos microrganismos isolados com interesse
tecnológico
76
6.2. Desenvolvimento de meio de cultura para isolamento de bactérias láticas de
interesse na vitivinicultura
79
6.2.1. Meios de cultura 79
7. Discussão 98
8. Conclusão 105
9. Referências bibliográficas 106

1. INTRODUÇÃO
A agricultura gera quantidades significativas de resíduos que, podem em alguns casos ser
considerados não perigosos, mas possuem um alto conteúdo de matéria orgânica, que causam
impactos no ambiente. O fato de sua produção ser concentrada em épocas específicas do ano
representa um potencial poluidor. O uso eficiente de resíduos industriais é importante não só para
diminuir o impacto ambiental, mas também para aumentar a rentabilidade. A matéria orgânica
apresenta potencial como fonte renovável de energia ou como substrato para a formulação de
outros produtos. Uma indústria que produz uma quantidade significativa de resíduos é a
vitivinicultura, que constitui uma parte importante da economia de diversas regiões no mundo, de
acordo com a FAO a cultura de uva produz mais de 60 milhões de toneladas anualmente (Ping et
al., 2011).
Durante o processamento e elaboração do vinho e do suco de uva alguns microrganismos
participam de forma efetiva. As bactérias ácido láticas (BAL) apresentam papel importante na
produção de vinho, onde seu crescimento e metabolismo podem ter efeitos positivos e negativos
no vinho. A transformação do ácido málico em ácido lático na fermentação malolática é positivo
para o vinho já que diminui a acidez e permite a formação de uma série de produtos, além da
remoção de ocratoxina A. Entretanto podem levar a formação de compostos com propriedades
sensoriais negativas como β – D- glucanas, ácido acético e formação de aminas biogênicas. Além
dessa característica, as bactérias ácido láticas podem ser aplicadas em melhorias no produto
devido seu potencial probiótico trazendo, portanto benefícios à saúde do consumidor e ação
contra patógenos devido a presença de substâncias antimicrobianas (Holzapfel, 2006; Terrade et
al., 2009).
Os microrganismos pectinolíticos, principalmente fungos e bactérias, são importantes na
indústria pela sua ação hidrolítica na molécula de pectina. Sendo assim, tais microrganismos
podem ser relevantes por permitirem a clarificação do suco de uva e facilitarem a extração,
aumentando o rendimento da produção (Benoit et al., 2012).
O isolamento e identificação de microrganismos da microbiota da superfície de cascas de
uvas podem revelar microrganismos com potencial tecnológico para o beneficiamento da
15

vitivinicultura, além de reduzir o uso de microrganismos comerciais, prática que frequentemente
aumenta os custos do processamento.

2. JUSTIFICATIVA
O aumento do consumo de sucos de frutas naturais, impulsionado pela busca por hábitos
mais saudáveis e o reconhecimento da qualidade do vinho brasileiro, elevam o seu consumo pela
população. Desse modo, a cultura de uva e vinho no Brasil é crescente, representando um
importante segmento da economia nas regiões sul e nordeste do país.
No processamento da uva, normalmente são utilizados microrganismos de uso comercial,
aumentando assim o custo da produção. A aplicação de microrganismos isolados da superfície da
uva no processamento dos seus derivados, permite uma ação mais específica, visto que as
variedades de uvas influenciamsuas características nutricionais e tecnológicas, assim como sua
microbiota. Poucos estudos avaliam a utilização de microrganismos da uva no processamento e
beneficiamento do suco e do vinho. A microbiota da uva é complexa e formada principalmente
por leveduras e bactérias. As bactérias desempenham funções importantes na vitivinicultura,
entretanto são menos estudadas que as leveduras. Além de atuar nos processos fermentativos, as
bactérias produzem enzimas importantes em etapas do processamento, além de uma possível
utilização nos resíduos agroindustriais.
O processamento industrial da uva resulta em uma produção alta de resíduos. Apesar de
estudos que buscam alternativas de uso para estes resíduos, ainda há uma quantidade significativa
de matéria orgânica com destino inadequado. Desse modo, a utilização de microrganismos para a
sua degradação é relevante. As bactérias pectinolíticas e celulolíticas adaptadas à superfície da
uva são importantes nessa utilização por aumentarem o rendimento dessa reação. Além da
possível degradação do bagaço, os microrganismos pectinolíticos isolados da uva podem atuar de
forma mais específica na etapa de clarificação da produção do suco.
Na literatura atual poucos estudos abordam o papel das bactérias láticas como produtoras
de pectinase. A sua aplicação na produção de suco de uva é vantajosa por unir as ações probiótica
e pectinolítica, em um microrganismo. Além disso, a presença de bactérias láticas com potencial
probiótico no suco permite a valorização do produto e o crescente mercado de produtos
probióticos indica a importância de avanços nessa área.
17

3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Isolar microrganismos produtores de substâncias de interesse tecnológico, a partir da
superfície de uvas Vitis vinifera, usadas na vitivinicultura no sul do Brasil e desenvolver um meio
de cultivo baseado na uva Vitis vinifera e seus derivados.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Isolar microrganismos produtores de substâncias antimicrobianas semelhantes às bacteriocinas;
- Isolar microrganismos com potencial probiótico;
- Isolar microrganismos produtores de enzima pectinase;
- Identificar os microrganismos isolados por métodos moleculares;
- Desenvolver um meio de cultura sólido não seletivo composto de uva e seus derivados para
isolamento de microrganismos selvagens de interesse para indústria da uva.

4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1 Uva e resíduo da vitivinicultura
A cultura da uva (Vitis sp.) é a segunda maior cultura no mundo depois apenas da laranja.
Dentre as espécies mais cultivadas encontra-se a Vitis vinifera (Figura 1), usada para produção de
vinho. A uva é uma fruta não climatérica que pode ser consumida in natura ou desidratada.
Também pode ser usada na elaboração de geléias, suco, vinagre e vinho. Aproximadamente 71%
das uvas no mundo são usadas para produção de vinho, 27% como fruta fresca e 2% como fruta
desidratada (Arvanitoyannis e Varzakas, 2008; Demiral e Ayan, 2011).

Figura 1: Uva Vitis vinifera
No Brasil, a vitivinicultura é uma atividade importante para sustentabilidade de pequenas
propriedades, tendo apresentado no ano de 2011 um aumento de 12,97% na produção de uvas. Na
vitivinicultura brasileira, parte da uva é destinada ao consumo in natura e parte é processada
(Quadro 1), destas 60,9% são destinadas à produção de vinho, enquanto 37,3% para produção de
suco de uva, como se pode observar na figura 2 (Embrapa Uva e Vinho, 2010; Mello, 2012).

Quadro 1: Produção (em toneladas) de uvas para processamento e para consumo in natura, no
Brasil.
Discriminação/ano

2007 2008 2009 2010
Processamento

637.125 708.042 678.169 557.888
Consumo in natura

717.835 691.220 667.550 737.554
Total

1.354.960 1.399.262 1.345.719 1.295.442
Fonte: Embrapa Uva e Vinho, 2010.

Figura 2: Produção de vinhos, sucos e derivados a partir de uvas destinadas ao processamento no Rio
Grande do Sul no ano de 2011.
A uva é um dos alimentos mais antigos da humanidade, originário da Ásia, da região
árida do Cáucaso, existindo há cerca de 6.000 anos a.C. No Brasil o desenvolvimento da
vitivinicultura só ocorreu no século XIX, após a chegada dos imigrantes portugueses e italianos.
A uva é produzida pela videira e atualmente são conhecidas mais de 10.000 variedades
encontradas em todos os continentes, predominantemente em climas temperados. As uvas podem
ser cultivadas em várias regiões onde cada variedade se adapta a diferentes tipos de solo e clima
(Pereira et al., 2008; Vedana et al., 2008; Ferrari et al., 2010).
Vinho mesa
Vinho fino
Suco de uva integral
Suco concentrado
Outros derivados
20

4.2. Variedade de uva para produção de vinho
Em torno de 60% das uvas destinadas ao processamento, são utilizadas na elaboração do
vinho. As uvas da categoria Vitis vinifera são usadas para produção de vinhos finos e Vitis
labrusca, Vitis bourquina e híbridos para produção de vinhos comuns. A variedade Vitis vinifera
produz vinho de melhor qualidade; no entanto, seu cultivo está limitado a algumas regiões
brasileiras, como Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Região do Vale do São Francisco, pois as
condições de clima e solo são mais favoráveis. As uvas destinadas à produção de vinhos de mesa,
sucos e derivados para consumo in natura são, na sua maioria, da variedade Vitis labrusca
(Aquarone et al., 2001; Camargo et al., 2007).
No Brasil, as variedades de uvas cultivadas para o vinho são (Aquarone et al., 2001):
a) Vitis vinifera
• Tintas: Cabernet Sauvignon, Merlot, Cabernet Franc, Pinot Noir, Bonarda,
Sangiovese, Canaiolo, Syrah e Tannat;
• Brancas: Riesling Renano, Riesling Itálico, Chardonnay, Gewürztraminer,
Malvasia, Pinot Blanc, Trebbiano, Peverella, Moscatel Flora, Sauvignon Blanc e
Semillon;

b) Vitis labrusca
• Tintas: Isabel, Concord, Tercy, Bordô, Folha de Figo e York Madeira;
• Brancas: Niagara;

c) Vitis bourquina
• Tintas: Hebermont e Jaques;

d) Híbridas
• Tintas: Seibel 2, Seibel 10.096, IAC 138-22, Pignoletta e Couderc;
• Brancas: Seyve Villard 5.276, IAC 116-31, IAC 21-14.

O cacho de uva é composto por engaço que possui os pedúnculos e as almofadas. Estes
sustentam o cacho formado pelas bagas, também chamadas de grãos. A baga é composta
principalmente por casca (6-12%), semente (2-5%) e polpa (85-92%) (Figura 3). A uva é
composta basicamente por açúcares, ácidos, pectinas, gomas, compostos aromáticos e compostos
fenólicos (Peixoto, 2000; Souza, Lima e Vieites, 2010). A composição nutricional da polpa está
discriminada no Quadro 2.

Figura 3: Partes integrantes do cacho de uva.

Quadro 2: Composição da uva (Vitis vinifera L.) por 100 gramas de parte comestível.
Componentes
Quantidade/100g parte
comestível
Umidade 81,6g
Proteínas 0,6 g
Lipídios 0,7 g
Glicídios 16,7 g
Fibra 1,1 g
Cinzas 0,4 g
Cálcio 12 mg
Fósforo 15 g
Ferro 0,9 mg
Potássio 185 mg
Magnésio 6 mg
Manganês 0,06 mg
Vitamina A (retinol) 7,3 mg
Vitamina B1 (tiamina) 0,09 mg
Vitamina B3 Niacina 0,3 mg
Vitamina B5 (ácido pantotênico) 0,02 mg
Vitamina B6 (piridoxina) 0,11 mg
Vitamina C (ácido ascórbico) 10,8 mg
Vitamina B2 (riboflavina) 0,06 mg
Fonte: Tabela de alimentos em composição química e medidas caseiras – 2003. Estudo Nacional
da Despesa Familiar – 1999. g – grama; mg – miligrama.

Um dos componentes mais estudados da uva são os polifenóis, metabólitos secundários
da via pentose-fosfato em plantas, sendo considerado o grupo de fitoquímicos mais encontrados,
com importância fisiológica e morfológica para plantas, como funções antialérgicas,
antiarterogênica, antiinflamatória, antimicrobiana, antioxidante, antitrombótica, cardioprotetora e
vasodilatadora. O potencial antioxidante é consideradoo mais importante em determinar as suas
características benéficas, vinculadas ao consumo de frutas e hortaliças. Estruturalmente consistem
de um anel aromático com moléculas de hidroxilas, normalmente conjugados com mono ou
polissacarídeos. O possível benefício à saúde depende da absorção dos polifenóis pelo organismo.
São polifenóis: quercitina, taninos, antocianinas, flavonóides, resveratrol, catequinas,
proatocianinas, ácido hidroxibenzóico e resviratrol (Figura 4) (Baydar, Özkan e Sagdiç, 2004;
Balasundram, Sundram e Samman, 2006; Baydar, Özkan e Yasar, 2007).
23

Figura 4: Estrutura química dos polifenóis resvetrol e catequina.

Os antioxidantes são compostos químicos que diminuem os efeitos maléficos ao
organismo, pois possuem capacidade de reagir com os radicas livres, sendo inibidores dos
processos oxirredutores. Os polifenóis são exemplos de antioxidantes não enzimáticos, assim
como vitaminas e ácido úrico (Pimentel et al., 2005; Dani, 2006; Vedana, 2008).
Os radicais livres são moléculas altamente reativas produzidas naturalmente no
metabolismo. Entretanto quando em excesso podem ser prejudiciais à saúde, causando oxidação
das células, facilitando o desenvolvimento de diversas patologias (Perin e Schott, 2011).
Os antioxidantes possuem mecanismo de ação variado, inativação dos radicais livres,
redução de hidroperóxidos e complexação de íons metálicos, podendo agir sobre radicais livres
tornando-os menos reativo. Os antioxidantes endógenos, ou seja, produzidos pelo organismo,
apresentam eficiência parcial, sendo necessária a ingestão de antioxidantes exógenos, por meio da
dieta, que podem ser encontrados nas plantas, principalmente nas frutas. Além disso, os
antioxidantes naturais têm a possibilidade de melhorar a estabilidade e qualidade dos alimentos,
trazendo consigo beneficio a saúde humana (Pimentel et al., 2005; Vedana, 2008).
Dentre as frutas, as uvas são consideradas uma das maiores fontes de compostos
fenólicos. Desse modo, os produtos derivados do seu processamento, como suco e vinho,
apresentam alto conteúdo fenólico (Quadro 3) (Balasundram, Sundram e Samman, 2006; Abe et
al., 2007).
24

Quadro 3: Conteúdo fenólico de sucos e vinhos.
Bebidas Conteúdo fenólico total
(mg ácido gálico /L)
Sucos comerciais
Maçã 339 ± 43
Uva 535 ± 11
Laranja 755 ± 18
Suco fresco
Uva 1.728
Laranja 382-1.147
Vinho tinto
Argentino 1.593-1.637
Brasileiro 1.947-1.984
Chileno 2.133
Californiano 1.800-4.059
Vinho branco
Argentino 216
Brasileiro 256-353
Californiano

220-306
Adaptado de Balasundram, Sundram e Samman, 2006. mg- miligrama; L – litro.

4.3. Produção de vinho e suco de uva
O vinho é uma bebida proveniente exclusivamente da fermentação alcoólica de uva
madura e fresca ou suco de uva fresca (Brasil, 1973). A definição bioquímica do vinho seria:
bebida proveniente da fermentação alcoólica dos açúcares de suco de uva pelas leveduras ou
pelas bactérias láticas (Aquarone et al., 2001). O processo de elaboração do vinho está
exemplificado no fluxograma da figura 5.

Figura 5: Fluxograma de operação para produção de vinho tinto (Barnabé, 2006).

O processamento da uva para elaboração do suco e do vinho gera o bagaço de uva como
resíduo agroindustrial. O bagaço é definido como o produto resultante da prensagem de uvas
frescas, fermentado ou não, constituído pelas partes sólidas das uvas e pelo mosto (Regulamento
CE, 1999). Normalmente, o bagaço é usado como ração animal ou fertilizante orgânico. Assim
como a uva, o bagaço é rico em polifenóis. Desse modo, o resíduo agroindustrial da
vitivinicultura pode ser usado como fonte de polifenóis (Quadro 4). Há uma necessidade por
antioxidantes naturais derivados de frutas e plantas, já que antioxidantes sintéticos são
considerados tóxicos e carcinogênicos aos humanos (Ferrer et al., 2001; Arvanitoyannis e
Varzakas, 2008; Demiral e Ayan, 2011).
Quadro 4: Principais aplicações do bagaço de uva na indústria.
Uso do resíduo agroindustrial da
vitivinicultura
Adequação do resíduo Referência
Antioxidantes para conservação de
alimentos
Extração por Soxhlet
Bayden, Ozkan e
Sagdiç, 2004
Antioxidantes para conservação de
alimentos
Ausente
Balasunndam,
Sundann e
Sammam, 2006
Produção de ácido glucônico Processo fermentativo Sing e Sing, 2006
Antioxidante para conservação de
alimentos
Extração por filtração
Baydan, Ozkan e
Yasar, 2007
Absorção de metais Secagem
Farinella, Matos e
Arruda, 2007
Produção de ácido lático e
biossurfactantes
Hidrólise química Rivera et al., 2007
Produção de biodisel e
compostagem
Ausente
Arvanitoyamis e
Varzakas, 2008
Atividade antimicrobiana em
alimentos
Concentração por rotavapor Serra et al., 2008
27

Produção de celulose e
hemicelulose
Hidrólise química
Spino, Pizzoro e
Farrei, 2008
Absorção de cobre e níquel Ausente
Bhatnagan e
Sillarpcia, 2010
Produção de celulose bacteriana Extração aquosa Carreira et al., 2011
Produção de biocombustível para
aquecimento e gerador de
eletricidade
Pirólise
Demiral e Ayan,
2011
Imobilização de células para
fermentação em estado sólido
Ausente
Genisheva et al.,
2011
Elaboração de farinha para
produção de biscoito
Maceração
Perin e Schott,
2011.
Fonte de lignina, celulose e
hemicelulose
Lavagem e diluição em ácido
sulfúrico ou oxidação
Ping et al., 2011

4.4. Resíduos agroindustriais
Estudos demonstram possíveis finalidades para o bagaço de uva, principalmente como
substrato fermentativo para produção de substâncias com elevado nível comercial. O substrato
normalmente usado é a glicose comercial, entretanto o uso do bagaço além de representar uma
diminuição do resíduo agroindustrial é uma opção mais barata para indústria (Singh e Singh,
2006; Demiral e Ayan, 2011).
O bagaço da uva representa aproximadamente 20% do peso de uva colhida. Atualmente,
pouca quantidade desse subproduto é reaproveitada. Todos os dias toneladas de frutas e derivados
sofrem decomposição inapropriada e são descartadas em ambientes abertos causando sérios danos
ao meio ambiente. A bioconversão desse material pode ser parte do controle de poluição do meio
ambiente pelo produtor, além de proporcionar a produção com menor custo comercial de outros
produtos. O bagaço de uva contém alta concentração de açúcar e é facilmente disponível,
podendo ser considerado um bom substrato (Singh e Singh, 2006; Arvanitoyannis e Varzakas,
2008).
28

De acordo com o Decreto-Lei n.o 239/97, de 9 de Setembro, resíduo é qualquer
“substância ou objeto de que o detentor se desfaz ou tem intenção ou obrigação de se desfazer,
nomeadamente os previstos em portaria dos Ministérios da Economia, da Saúde, da Agricultura,
do Desenvolvimento Rural e das Pescas e do Ambiente, em conformidade com o Catálogo
Europeu de Resíduos, aprovado por decisão da Comissão Européia”.
De acordo com o Ministério do Meio Ambiente (Brasil, 2011), dentre os resíduos
sólidos, os resíduos agrícolas foram os que apresentaram maior potencial de geração de energia
elétrica, principalmente o bagaço de cana de açúcar. Entretanto sabe-se que a maior parte do
resíduo agrícola é utilizada para alimentação animal, alimentação humana e fertilizante orgânico,
praticas estas consideradas como nobres. Não é possível estimar as quantidades utilizadas de
resíduo agrícola, entretanto esta é considerada relevante. O crescimento dos setores agrícolas
indica que a geração de resíduos continuará aumentando, porém a legislação vigente não
apresenta exigências quanto ao destino dos resíduos. Sendo assim a Lei 9.795 de 27 de abril de
1999 (Brasil, 1999) é utilizada como referência, na qual define educação ambiental como “os
processos por meio dos quais o indivíduoe a coletividade constroem valores sociais,
conhecimentos, habilidades, atitudes e competência voltadas para a conservação do meio
ambiente, bem de uso comum do povo, essencial à sadia qualidade de vida e sua
sustentabilidade” (Brasil, 2011).
De acordo com a diversidade das possíveis aplicações, confirma-se que o aproveitamento
de resíduos materiais das indústrias agrícolas gera um impacto positivo para a indústria
correspondente e a economia local e nacional. O uso do resíduo pode diminuir o valor do produto
final, além de agregar valor ao resíduo, através da sua utilização e processamento para obtenção
de outros produtos, como meios de cultivo. As características nutricionais dos resíduos gerados
na vitivinicultura são determinantes na elaboração de meio de cultura específico para cultura de
microrganismo de interesse deste setor.

4.5. Microbiota da uva
A microbiota encontrada na casca da uva é variada e numerosa, a presença de cera na
superfície da casca permite a retenção da mesma. Entre os microrganismos presentes na uva,
existem os úteis e os indesejáveis (Aquarone, 2001).
O conhecimento da microbiota da uva é importante para produção de um vinho com
melhor qualidade e atributos desejáveis. As uvas apresentam uma complexa ecologia microbiana
que inclui fungos filamentosos, leveduras e bactérias, com diferentes características fisiológicas e
efeitos na produção do vinho. A microbiota residente apresenta interações dinâmicas, e estas vão
determinar a ecologia microbiana da superfície da uva no tempo de colheita e a comunidade
microbiana transferida para o vinho e o suco de uva (Bae, Fleet e Heard, 2004; Li et al., 2010;
Barata, Malfeito-Ferreira e Loureiro, 2012).

4.5.1. Fatores que afetam a microbiota da uva
Alguns microrganismos são encontrados apenas nas uvas, outros têm capacidade de
sobreviver no vinho. A proporção desses microrganismos depende do estágio de maturação da
uva e da viabilidade de nutrientes. Condições climáticas como temperatura, exposição aos raios
ultravioleta (UV), chuvas e ventos, e os vetores encontrados influenciam na microbiota da uva
(Bae, Fleet e Heard, 2004; Chiotta et al. 2009; Barata, Malfeito-Ferreira e Loureiro, 2012).

4.5.2 Principais microrganismos da microbiota da uva
Nos estudos envolvendo a microbiota da uva, as leveduras são mais estudadas do que as
bactérias sendo encontradas frequentemente, pois exercem papel fundamental na fermentação
alcoólica. Leveduras dos gêneros Kloeckera, Metschnikowia, Torulaspora, Issatchenkia,
Candida, Dekkera, Brettanomyces, Kluyveromyces e Pichia são encontrados na superfície das
uvas, sendo a Hanseniaspora uvarum e Candida zemplinina as mais comuns. As leveduras não
pertencentes ao gênero Saccharommyces, normalmente encontrada em menor concentração
30

durante a fermentação alcoólica, complementam a ação da Saccharomyces cerevisiae já que são
responsáveis por causar impacto positivo no aroma do vinho, reduzindo a acidez volátil e o
conteúdo de ácido málico (Bae, Fleet e Heard, 2004; Zott et al., 2010; Barata, Malfeito-Ferreira e
Loureiro, 2012).
Dentre as bactérias são encontradas frequentemente na uva as acéticas, destacando-se os
gêneros Gluconobacter spp., Acetobacter spp. e Gluconoacetobacter spp. Além destes, as
bactérias láticas podem aumentar a produção de compostos sensoriais responsáveis pelas
características sensoriais, a formação de aminas biogênicas e fenóis voláteis. As bactérias ácido
láticas, principalmente Oenococcus oeni são responsáveis pela fermentação malolática, que
melhora o equilíbrio ácido, o flavour e a estabilidade microbiana do vinho. Dentre as bactérias
láticas, o gênero lactobacilos e suas aplicações no alimento são mais estudados, tendo importante
papel na conservação, produção e alteração de alimentos. O Lactobacillus spp. e o Pediococcus
spp. são responsáveis por processos de fermentação espontânea na uva, com produção de vinho.
Algumas espécies de lactobacilos são comumente encontradas em uvas, e podem crescer em suco
e vinho. Algumas espécies novas foram isoladas recentemente de uvas, como por exemplo
Lactobacillus kunkeei, L. nagelii, L. bobalius e L. vini. (Bae, Fleet e Heard, 2004; Manes-Lazaro,
2008; Orduna, 2010; Barata, Malfeito-Ferreira e Loureiro, 2012).

4.5.3. Microrganismos fitopatogênicos
Os fitopatógenos são microrganismos que causam danos às plantas, principalmente frutas
e vegetais que são mais susceptíveis por apresentarem uma maior concentração de água (Duarte e
Ramirez, 2006). No Brasil, as doenças pós colheita causadas por microrganismos fitopatogênicos
constituem um grave problema e apresentam prejuízos em torno de 80% do valor total da
produção de frutas (Camargo et al., 2011). Desse modo é necessário o uso de fungicidas, o que
aumenta o nível de contaminantes no produto final (Coelho, Hoffmann e Hirooka, 2003).

Os mecanismos de ataque dos fitopatógenos podem ser por meio de:
Enzimas – desintegram componentes estruturais das células do hospedeiro. Por exemplo,
as exoenzimas do tipo cutinases, que são esterases que degradam a cutícula, camada lipídica
contínua que recobre a epiderme de folhas, frutos e talos jovens. A cutícula tem como principal
função evitar a difusão de água e nutrientes para o ambiente externo, protegendo a planta contra
efeitos adversos. Outra exoenzima prejudicial às plantas é a celulase que causa colapso das
células resultando na formação de lesões, ou alteração do fluxo normal de água devido o bloqueio
de elementos vasculares;
Fitotoxinas – alteram a permeabilidade das membranas. As fitotoxinas são substância de
baixo peso molecular (<1.000 daltons) ativas em concentrações fisiológicas e podem ser
peptídeos, glicopeptídeos ou derivados de aminoácidos. Estas substâncias alteram a
permeabilidade e o potencial de membranas, causando mudanças no equilíbrio iônico, perda de
eletrólitos, inibição ou estímulo de enzimas, aumento na respiração e na biossíntese de etileno;
Alteração hormonal – alteram a divisão e crescimento celular. Desequilíbrio hormonal de
auxinas que levam a um aumento da plasticidade da célula e alongamento celular, de ciocininas
alterando a divisão celular e do etileno, que gera uma desfolha e inibição do crescimento;
Ação mecânica – capacidade de atravessar a parede celular causando degradação
(Coelho, Hoffmann e Hirooka, 2003).
Micotoxinas - metabólitos secundários tóxicos provenientes de vias biossintéticas
comuns em fungos que proliferam em produtos agrícolas destinados a alimentação humana e
animal. Estas substâncias são consideradas toxinas naturais de difícil controle aliada a
termorresistência perante o processamento industrial. Portanto, as micotoxinas são consideradas
um dos pontos críticos de controle decisivos no comércio internacional de produtos agrícolas
(Coelho, Hoffmann e Hirooka, 2003).
O consórcio microbiológico do vinho (leveduras, bactérias acéticas e bactérias lácticas)
não é responsável por doenças na uva. Entretanto há microrganismos patogênicos que causam
doenças à uva (Quadro 5), prejudicando a produção de suco e vinho, como os fungos
32

filamentosos Botrytis cinerea, Penicillium sp. e Aspergillus sp., conhecidos por sua capacidade de
deteriorar as uvas antes da colheita. A presença da micotoxina ocratoxina A, encontrada em
vinhos indica contaminação principalmente por Aspergillus carbonarius e Aspergillus nigri
durante o cultivo. A presença dessa substância é um risco para o homem já que possui potencial
carcinogênico (Bae, Fleet e Heard, 2004; Chiotta et al., 2009; Barata, Malfeito-Ferreira e
Loureiro, 2012).
Quadro 5: Microrganismos encontrados como fitopatógenos em uvas
Microrganismos Espécies fitopatogênicas isoladas Referência
Fungos Alternaria alternata, Aspergillus niger,
Cladosporium herbarum, Penicillium
expansum, Lasiodiplodia theobromae,
Rhizopusstolonifer
Camargo et al., 2011
Botrystis spp; Penicillium spp.; Rhizopus spp. Coelho, Hoffmann e
Hirooka, 2003

Botrytis cinera, Uncinula necator, Plasmopara
viticola
Rajo, Coello e Rodríguez,
2002
Plasmopara viticola Leite et al., 2011
Botrytis cinera, Aspergilluis niger,
Cladosporium cladosporoides, Alternaria
alternata, Mucor racemosus, Penicillium
expansum
Estay, 2006
Bactérias ácido
acéticas
Acetobacter aceti Estay, 2006

As leveduras que causam danos aos vinhos são encontradas no material de vinificação e
dentro de recipientes vinários, como adegas de conservação. As leveduras deterioradoras
possuem ação oxidativa, que consiste na oxidação do álcool etílico a acetaldeído, gerando um
odor muito forte no vinho. Dentre as principais leveduras deterioradoras encontram-se Candida
mycoderma, Hansenula, Pichia ou Bretanomyces. Para evitar esse tipo de levedura, deve-se
manter o recipiente de armazenamento do vinho cheio, diminuindo a quantidade de oxigênio
(Aquarone, 2001).
33

Outro dano ao vinho provocado por microrganismos é denominado azedia, que consiste
no aumento da acidez volátil, é provocada por bactérias acéticas que pertencem ao gênero
Acetobacter, sendo mais frequentes as espécies A. rancens e A. ascendens (Aquarone, 2001).

4.6. Presença de microrganismos de interesse industrial na uva
4.6.1. Leveduras
No processo de fermentação alcoólica de açúcares os principais produtos como, álcool
etílico e gás carbônico, são produzidos em quantidades equimolares (Equação 1). Também são
produzidos acetaldeído, glicerol, 2,3 butilenoglicol, ácido lático, ácido succínico, ácido cítrico,
que contribuem para o aroma e sabor do vinho (Lerma e Peinado, 2011).
C6H12O6 → 2 CH3CH2OH + 2 CO2
Equação 1: Reação química exotérmica de fermentação alcoólica.

As leveduras são agentes de fermentação alcoólica. Existe um grande número de espécies
de leveduras que se diferenciam pelo seu aspecto, suas propriedades, sua forma de reprodução e
também pela maneira de transformar o açúcar em álcool, através de processo fermentativo. As
leveduras encontradas na vinificação podem apresentar as formas: elíptica ou oval, alongada,
esférica e apiculada; e dois modos de reprodução: vegetativa por brotamento e por formação de
esporos. As leveduras se encontram na superfície da uva madura no momento da colheita e são
transportadas para a cuba ou recipiente de vinificação. Normalmente, as leveduras são
encontradas no solo em camadas superficiais, no verão são transportadas para superfície das uvas
pela poeira e sobretudo pelos insetos (Aquarone, 2001).
As leveduras apiculadas, como Kloeckera apiculata ou Hanseniaspora uvarum são
geralmente responsáveis pelo início da primeira fase da fermentação alcoólica, já que se encontra
na uva em estado ativo. Nas uvas danificadas, a fermentação pode ser iniciada com a Torulopsis
bacillares capaz de produzir álcool pelo processo de fermentação, entretanto pouco resistente ao
34

anidro sulfuroso, fase na qual as Saccharomyces entram em ação e as leveduras iniciais são
inibidas. Na fase final de uma fermentação alcoólica, as espécies dominantes são S. ellipsoideus e
S. bayanus, sendo esta última mais alcoogênica (Zott et al., 2010).
A sulfitação (adição de ácido sulfúrico) é importante na produção de vinho como agente
antioxidante e protetor. Um objetivo essencial é paralisar o desenvolvimento de microrganismos
existentes naturalmente no mosto, em particular os indesejáveis. Esses microrganismos não são
destruídos, permanecem somente em seu estado latente. Desse modo as leveduras naturalmente
presentes e melhor adaptadas podem tornar-se as predominantes (Li et al., 2010).
A adição do inóculo contendo leveduras selecionadas ou desejadas em plena atividade,
tem como objetivo eliminar as selvagens. Entretanto algumas vezes ocorre falha na seleção da
levedura e dificuldade na operação. A seleção da levedura deve levar em consideração
características fisiológicas como rendimento da produção de álcool, poder alcoogênico,
resistência à temperatura elevada, grande produtora de glicerol, pequena produção de ácido
acético, produção de aroma particular e degradação de ácido málico (Aquarone, 2001).
As vantagens do emprego de leveduras, quando bem realizado são:
• Início da fermentação rapidamente;
• Fermentação regular, com conclusão mais rápida, gerando um aumento no
rendimento da produção de álcool;
• Boa conservação do vinho, sendo mais seco e isento de açúcares fermentáveis
(Aquarone, 2001, Li et al., 2010).
4.6.2. Bactérias ácido láticas
Durante séculos observou-se que após o término da fermentação alcoólica, determinados
vinhos tintos de mesa turvavam e liberavam pequenas bolhas de gás. Esse fenômeno não
ocasionava prejuízo à qualidade, ao contrário parecia contribuir para a melhoria do vinho.
Posteriormente verificou-se que se tratava de transformação biológica ocasionada por bactérias, e
denominou-se fermentação malolática (Aquarone, 2001).
35

A fermentação malolática consiste essencialmente na descarboxilação bacteriana do
ácido málico em ácido lático, com liberação de gás carbônico. Esse fenômeno ocorre
naturalmente em muitos vinhos tinto de mesa. Essa reação é importante na maioria das regiões
vinícolas do mundo, particularmente naquelas como as brasileiras, onde os vinhos apresentam
acidez elevada. A fermentação malolática pode ocorrer durante, logo em seguida, após meses ou
um ano após a fermentação alcoólica, sendo então considerada tardia. Para que ocorra a
fermentação malolática é necessário que o vinho esteja armazenado em ambiente de temperatura
amena, com adição moderada de ácido sulfúrico, pH elevado devido uso de carbonato de cálcio,
ou adição de borra de vinho que tenha concluído a fermentação malolática. A inoculação de
bactérias láticas apropriadas pode influir favoravelmente na fermentação malolática. Existem
bactérias láticas comerciais para o emprego na produção de vinho tinto ou branco (Rodas, Ferrer
e Pardo, 2003; Cañas et al., 2008).
A bactéria lática Oeneococcus oeni é a espécie predominantemente responsável pela
fermentação malolática, entretanto outras espécies têm sido descritas com o mesmo potencial. As
bactérias determinadas como responsáveis pela fermentação malolática além de O. oeni são do
gênero Lactobacillus, Leuconostoc e Pediococcus (Ruiz et al., 2010).
A fermentação malolática apresenta três efeitos no vinho:
• Reduz a acidez fixa;
• Estabiliza o vinho assegurando que a fermentação malolática não ocorra quando
engarrafado;
• Aumenta o aroma do vinho (Hernández-Orte et al., 2009).
O metabolismo do ácido málico pelas bactérias láticas pode ser realizado de duas
maneiras:
1) Bactérias que possuem a enzima málica, transformam o ácido málico inicialmente em
ácido pirúvico e gás carbônico na presença da co-enzima nicotinamida adenina
dinucleotídeo (NAD). Em seguida o ácido pirúvico é imediatamente reduzido a ácido
36

lático pela desidrogenase lática (LDH) com associação de nicotinamida difosfato reduzida
(NADH);
2) Enzima trans-hidrogenase málica transforma os ácidos málicos e pirúvico em ácidos
oxalacético e lático (Aquarone, 2001).
Outra aplicação das bactérias láticas na indústria do vinho é sua capacidade de alterar
frações voláteis do vinho liberando compostos aromáticos como fenóis voláteis, terpenos e
lactonas a partir de precursores encontrados na uva (Cañas et al., 2008; Hernandez-Orte et al.,
2009).
4.7. Microrganismos pectinolíticos
Aproximadamente 10% dos microrganismos do solo são pectinolíticos. Os fungos
Kluyveromyces, Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Penicillium e Fusarium são conhecidos
como bons produtores de pectinases, podendo ser utilizados em escala industrial, pois cerca de
90% das enzimas produzidas podem ser secretadas no meio de cultura. Dentre as bactérias a
produçãode pectinase é mais encontrada nos gêneros: Achromobacter, Aeromonas, Arthrobacter,
Agrobacterium, Enterobacter, Bacillus, Clostridium, Erwinia, Flavobacterium, Pseudomonas e
Xanthomonas. A atividade pectinolítica não é comum em bactérias láticas, mas há estudos que
mostram a ocorrência em Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
casei, Lactobacillus plantarum e Lactococcus lactis (APHA, 2001; Uenojo e Pastore, 2006;
Benoit et al., 2012).
O método básico de detecção de organismos pectinolíticos é o crescimento dos
organismos em meio de cultura sólido com adição de pectina. A produção da enzima pelo
organismo pode ser observada por depressões no meio ou pela revelação com substância que
faça deposição do substrato pectina. Desse modo ao redor da colônia produtora de pectinase será
formada uma zona clara onde o substrato foi degradado, enquanto as colônias não produtoras
permanecerão opacas (APHA,2001).

4.7.1. Pectina
A pectina é um dos maiores e mais complexos componentes da lamela média das paredes
primárias de células de vegetais superiores, com função estrutural. Pertence a uma família de
polissacarídeo composto por 17 monômeros com mais de 20 ligações glicosídicas do tipo α-1,4
parcialmente esterificados por grupos metil-éster (Figura 6). A pectina é composta por 6
estruturas covalentemente ligadas formando um esqueleto com cadeias laterais. A pectina é
classificada em protopectina, a forma nativa unida com outros constituintes das células vegetais,
insolúvel em água e totalmente metoxilada; ácido péctico, composto de resíduos de ácido
poligalacturônico coloidal completamente desmetoxilada; e pectina e ácido pectínico que
possuem um grau variável de metoxilação e, em condições adequadas, são capazes de formar géis
com ácidos e açúcares (Uenojo e Pastore, 2006; Benoit et al., 2012).

Figura 6: Estrutura primária da pectina.
4.7.2. Definição e nomenclatura da enzima pectinase
Enzimas são compostos bioativos que regulam mudanças em tecidos vivos. As
pectinases pesam em torno de 30-80 KDa (quiloDaltons) e são um grupo heterogêneo de enzimas
que hidrolisam as substâncias pécticas presentes principalmente em plantas. De acordo com seu
sítio de ação, são classificadas e recebem sua nomenclatura (Sharma, Rhatore e Sharma, 2012):
- Poligalacturonase PG (EC 3.2.1.15);
- Pectinaliase PNL (EC 4.2.2.10);
- Pectatoliase PL (EC 4.2.2.2);
- Pectina esterase PE (EC3.1.1.11).
38

4.7.3. Importância prática, econômica e aplicação industrial
As enzimas pectinolíticas ou pectinases são usadas principalmente na extração de suco
de frutas e sua clarificação, tratamento de fibra têxtil e extração de óleo vegetal. Elas hidrolisam
as substâncias pécticas, sob diferentes mecanismos de ação. Essas enzimas são classificadas em
pectinoesterase que promovem a desesterificação da cadeia de pectina e despolimerase que são
responsáveis pela quebra desta cadeia. Dentre as despolimerases, a poligalacturonase é a enzima
com função hidrolítica principal. Para maioria das finalidades industriais, as poligalacturonases
produzidas por fungos são úteis por sua atividade ótima em pH baixo, servindo para grande parte
das aplicações em processos com frutas e vegetais.
Países como Estados Unidos e Japão produzem pectinases e preparação comerciais de
pectinases. Atualmente essas enzimas correspondem a cerca de 25% do mercado mundial de
enzimas, com valor de vendas estimado em 1 bilhão de dólares (Dinu et al., 2007; Santos et al.,
2008; Benoit et al., 2012).
A hidrólise enzimática da pectina apresenta vantagens sobre a hidrólise química, já que
atua em sítios específicos da molécula, enquanto a química é pouco especifica. Esse fator é
importante quando a hidrólise parcial é necessária para produção de oligossacarídeos específicos.
Para atender esse requerimento, misturas de enzimas pectinolíticas são produzidas. Diferentes
microrganismos produzem diferentes enzimas que hidrolisam a molécula de pectina em pontos
específicos, formando oligossacarídeos distintos. A maior parte das enzimas é produzida por
fungos filamentosos (Benoit et al., 2012).
Os sucos de uva possuem alto teor de pectinase sendo, portanto difíceis de espremer e
prensar. No processamento das frutas para obtenção de suco (Figura 7) as frutas são
primeiramente esmagadas e aquecidas a temperaturas de 60-80ºC e as enzimas pectinases são
adicionadas para aumentar o rendimento nesse ponto do processo, além de diminuir o tempo de
prensa. Por filtração ou centrifugação, a parte líquida é separada da sólida. O líquido é, portanto
resfriado a 0oC de modo a evitar a fermentação. E então, ocorre novamente a adição de pectinases
na quantidade de 200 ppm durante 2 semanas. As enzimas permitem a floculação das partículas
em suspensão que são retiradas posteriormente por filtração. O suco finalmente é concentrado,
39

pasteurizado e engarrafado. Para produção do vinho, a enzima pode ser adicionada na etapa após
a fermentação, quando o vinho está pronto para ser engarrafado para aumentar a taxa de filtração
e a limpidez (Kashyap et al., 2001).

Figura 7: Ação da pectinase na produção do suco de uva (Rizzon e Meneguzzo, 2007).
As pectinases usadas na indústria de vinho e sucos de frutas são principalmente
provenientes de Aspergillus niger. A pectina pode causar problemas na indústria de alimentos,
aumentando a turbidez e a viscosidade durante a extração, filtração e clarificação. No caso de
sucos como maçã, pêra e uva as enzimas são adicionadas para aumentar o rendimento do suco
durante o esmagamento, melhorando até 100% do rendimento e para realizar o processo de
clarificação. O uso de enzimas também permite uma diminuição do tempo de filtração em até
50%. As enzimas pectinolíticas também podem atuar na água residual de processamento em
40

indústrias de alimentos. O pré-tratamento dessa água com pectinase melhora a remoção desse
material, facilitando seu descarte (Kashyap et al., 2001; Gogus, 2006).
A pectinase disponível no mercado é produzida por fermentação em estado sólido, de
modo a diminuir o custo da produção, uma série de derivados de frutas são usados como material
para imobilização. A utilização de resíduos agroindustriais como substrato de baixo custo para a
produção microbiana de enzimas resulta em um processo econômico e promissor. Entretanto, a
etapa de purificação ainda é cara. Bactérias pectinolíticas são mais baratas e mais facilmente
disponíveis para gestão ambiental. O uso de bactérias pectinolíticas isoladas da microbiota da uva
pode potencializar a ação enzimática além de reduzir os custos e aumentar o rendimento (Heerd,
2012; Sharma, Rathore e Sharma, 2012).

4.7.4. Mecanismos de ação das pectinases
As enzimas pectinolíticas podem ser classificadas em três grandes grupos, dependendo se
o substrato alvo é a pectina, ácido péctico ou o oligo-D-galacturonato, se a pectinase atua
realizando transeliminação ou hidrólise, ou se a quebra da molécula ocorre de forma randômica
(Jayani, Saxena e Gupta, 2005).
Os 3 principais modos de ação da pectinase são (Figura 8):
a) Protopectinases – degrada a protopectina insolúvel originando uma molécula de pectina
solúvel e altamente polimerizada. Essa enzima é encontrada principalmente em leveduras
e bactérias do gênero Bacillus sp.;
b) Esterases – catalisa a desesterificação da pectina removendo metoxi-esters. A pectina-
esterases (PE) catalisa a desesterificação de metil-ester ligados ao esqueleto galacturônico
liberando moléculas de pectina ácida e metanol. As pectinases de fungos atuam desse
modo de forma randômica, removendo grupos metil de diferentes posições;
c) Depolimerase – catalisa a hidrólise da ligação α-(1,4)-glicosídica no ácido D-
galacturônico das substâncias pécticas. Estas são subdivididas em hidrolases ou liases. As
hidrolases podem ser do tipo poligalacturonase(PG) que catalisa a hidrólise do ácido
41

poligalacturônico com a adição de uma molécula de água na ligação de ponte de
hidrogênio. Estas são as mais estudas dentro das pectinases, encontradas em fungos,
bactérias e leveduras. Outro tipo de hidrolase são as polimetilgalacturonase (PMG) que
quebra a molécula de pectina pelo mecanismo de hidrólise. As liases promovem quebras
não hidrolíticas na molécula de pectina e são encontradas como: poligalacturonato liase
(PGL), que quebra a molécula de pectato por β-eliminação. A polimetilgalacturonase
liase, promove a quebra da pectina pela β-eliminação. As liases são produzidas por
bactérias e fungos, sendo a sua forma endógena mais abundante que a forma exógena
(Gogus, 2006).

Figura 8: Mecanismos de ação das pectinases: (a) R=H para PG e CH3 para PMG; (b) PE. (c) R=H para
PGL e CH3 para PL. A seta indica o local onde a pectinase reage com a substância péctica (Gogus, 2006).
PMG: polimetilgalacturonase; PG: poligalacturonase; PE: pectinesterase; PL: pectina liase.

4.8. Microrganismos com potencial probiótico
4.8.1. Microrganismos probióticos
Probióticos são “microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades
adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro” (FAO/WHO, 2006).
A maioria dos microrganismos considerados como probióticos fazem parte do grupo de
bactérias ácido láticas (BAL), que são cocos, cocobacilos ou bacilos Gram-positivos, imóveis,
43

catalase negativos, não esporogênicos, preferem condições anaeróbias, mas são aerotolerantes,
fermentadores obrigatórios e produzem ácido láctico como o principal produto final, durante a
fermentação de carboidratos. Os principais gêneros representantes probióticos das BAL são:
Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,
Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus e Weissella. Também
utilizada como probiótico, a classificação de Bifidobacterium spp. como BAL é controversa,
sendo mais considerada como uma BAL tecnológica. Existem probióticos que não são BAL,
como os gêneros Bacillus e Escherichia, assim como leveduras, sendo a Saccharomyces spp. a
mais utilizada (Axelsson, 2004; Costa, 2003; Costa, 2006). Entretanto, os principais
organismos utilizados como probióticos em alimentos são Lactobacillus spp. e Bifidobacterium
spp. (Fernandes, 2009).
O gênero Lactobacillus, pertence ao filo Firmicutes, classe bacilos, ordem
Lactobacillales e família Lactobacillaceae, encontrado em ambientes ricos em carboidratos,
Gram-positivo, não formador de esporos, catalase negativo, microaerofílico. Podem ser
homofermentativos, pela via Embden-Meyerhof-Parnas (glicolítica), onde o principal produto
final é o ácido lático, ou heterofermentativos, através da via Fosfocetolase em que são
produzidas, além do lactato, uma grande variedade de outros produtos de fermentação como
etanol, acetato, CO2, ácido fórmico, diacetil, acetoína e 2,3-butanodiol de citrato. Todos estes
compostos contribuem para as propriedades sensoriais e nutricionais dos produtos fermentados
(Vasiljevic e Shah, 2008; Oliveira et al., 2012).
O gênero Lactococcus apresenta-se como cocos Gram-positivos, microaerofílicos e
homofermentadores obrigatórios, produzindo ácido láctico. Tem sido comumente isolados de
milho, repolho, alface, abóbora, dentre outros. Geralmente, não são encontrados em material fecal
ou solo, e podem ocorrer em pequeno número na superfície do corpo da vaca e em sua saliva,
sendo comum seu isolamento em leite cru. Além disso, apresentam grande interesse pela indústria
de alimentos, visto que são empregados como culturas iniciadoras puras ou mistas para a
produção de diferentes produtos lácteos fermentados como queijos, iogurtes e manteiga (Stiles e
Holzapfel, 1997).
44

4.8.2. Mecanismos de ação de microrganismos probióticos
O uso de probióticos em alimentos tem como principal objetivo trazer benefícios à
saúde do consumidor (Holzapfel, 2006; Schmid et al., 2006). Contudo, melhorias na qualidade
do produto, como controle de patógenos (Diez-Gonzalez e Schamberger, 2006) pode ser
esperado, quando a cepa probiótica possui essa característica. Desta forma, os probióticos, em
virtude da produção de bacteriocinas e de seus metabólitos, têm sido empregados como
biopreservantes nos alimentos, o que confere maior segurança ao consumidor, que cada vez mais
prefere produtos livres de conservantes químicos e microbiologicamente seguros (Dabés, Santos
e Pereira, 2001; Holzapfel, Geisen e Schillinger, 1995).
A nisina, a única bacteriocina purificada e aprovada para alimentos em diversos países,
inclusive no Brasil, é produzida por Lactococcus lactis ssp. lactis. Essa bacteriocina foi
identificada pela primeira vez em leite fermentado e, desde então, tem sido isolada de outros
leites e produtos lácteos, bem como de vegetais e água de rio. A nisina possui importância
tecnológica, sendo empregada na indústria de lacticínios por apresentar atividade antimicrobiana
contra um amplo espectro de microrganismos Gram-positivos, além da prevenção da germinação,
dos esporos de bactérias esporogênicas, como Bacillus e Clostridium (Beasley e Saris, 2004).
As bactérias produtoras de nisina estão presentes no leite humano e, por isso, podem
proteger a lactante da mastite e o lactente da intoxicação por Staphylococcus aureus. No entanto,
os potenciais efeitos da ingestão de bactérias produtoras de nisina no trato gastrointestinal e na
sua microbiota permanecem desconhecidos. É sabido que essas bactérias sobrevivem à passagem
através do intestino, mas não, se a nisina é produzida no trato gastrointestinal (Jozala et al.,
2005).
Adicionalmente, como resultado das suas propriedades antimicrobianas, a nisina tem
sido utilizada no tratamento de úlceras de estômago e cólon (Jozala et al., 2011). Diversos países
permitem o uso da nisina em produtos lácteos como leite, queijo, além de tomates, vegetais
45

enlatados, sopas enlatadas, maionese e alimentos infantis. No Brasil, a nisina é aprovada para uso
em todos os tipos de queijo no limite máximo de 12,5 mg/kg (Oliveia, Siqueira e Silva, 2012).
Os principais benefícios atribuídos aos probióticos são aumento da tolerância e digestão
da lactose; influência positiva na microbiota intestinal; redução do pH intestinal; melhora do
peristaltismo contribuindo para a prevenção da constipação intestinal; efeitos
hipocolesterolêmico, anticarcinogênico e anti-hipertensivo; redução de compostos tóxicos;
síntese de vitaminas do complexo B como ácido fólico, cianocobalamina, biotina e ácido
pantotênico; restauração da microbiota normal após antibioticoterapia; tratamento e
prevenção de diarréia aguda por rotavírus e gastroenterite; redução da atividade ulcerativa de
Helicobacter pylori; controle da colite induzida por rotavírus e por Clostridium difficile;
imunoestimulação; diminuição do risco de doenças cardiovasculares e prevenção da obesidade,
do diabetes mellitus não insulino-dependentes e da osteoporose, em função do aumento da
biodisponibilidade de minerais como o cálcio (Buriti e Saad, 2007; Burgain et al., 2011; Costa,
2006; Prado et al., 2008; Quigley, 2010).
Os efeitos dos probióticos podem ser classificados em três modos de ação:
• Capacidade de modular as defesas do hospedeiro, incluindo o inato, bem como o sistema imune
adquirido, estando relacionado não só com a prevenção e terapia de doenças infecciosas, mas
também com o tratamento de inflamação crônica do trato digestório e à erradicação de células
neoplásicas;
• Estabelecimento de um balanço microbiano intestinal, modificando o ecossistema de
microrganismos que habitam o intestino humano, devido à competição pelos sítios de aderência,
impedindo a colonização de patógenos e estimulando osistema imune, de forma a agir na
prevenção e terapia de infecções e na restauração do equilíbrio microbiano no intestino;
• Inativação de toxinas e de desintoxicação de componentes alimentares no intestino (Paseephol e
Sherkat, 2009; Oelschlaeger, 2010).
A maioria dos mecanismos de ação destes efeitos protetores das culturas probióticas à
saúde humana ainda não foi completamente esclarecida (Quadro 6). No entanto, alguns efeitos já
46

foram comprovados cientificamente, como a prevenção da diarréia e alívio da intolerância à
lactose.
Quadro 6: Efeitos benéficos à saúde, atribuídos pelos probióticos e seus respectivos mecanismos
de ação.
Efeitos protetores Mecanismo de ação
Alívio da intolerância a lactose Sistema de enzima β-galactosidase
Prevenção e redução dos sintomas de
diarréia associada a antibiótico e por
Rotavírus
Exclusão competitiva
Melhora do sistema imune
Tratamento e prevenção de alergia (eczema
atópico e alergia alimentar)
Regulação do sistema imunológico
Redução do risco associado à
mutagenicidade e carcinogenicidade
Metabolismo de agentes mutagênicos
Alteração da microbiota e da atividade
metabólica intestinal
Imunidade intestinal aumentada
Efeito hipercolesterolêmico Desconjugação de sais biliares
Inibição da Helicobacter pylori e outros
patógenos intestinais
Exclusão competitiva
Produção de compostos antimicrobianos
Prevenção de doença inflamatória do
intestino
Exclusão competitiva
Modulação da resposta imune
Produção de compostos antimicrobianos
Decomposição de antígenos patogênicos
Estimulação do sistema imune Indução da imunidade inata adquirida
Fonte: Vasiljevic e Shah, 2008.

4.8.3. Legislação para probióticos
Um microrganismo para ser considerado como probiótico deve atender a diferentes
critérios pré-definidos que englobam aspectos de segurança, tecnológicos, funcionais e
fisiológicos desejáveis: status GRAS; história do uso seguro em alimentos; benefícios para a
47

saúde documentados; propriedades antimutagênica e anticarcinogênica; histórico de não
patogenicidade; tolerância às substâncias antimicrobianas; adesão à mucosa intestinal;
colonização, ao menos temporariamente, do trato gastrointestinal humano; capacidade de reduzir
à adesão das superfícies de patógenos; atividade antimicrobiana contra bactérias potencialmente
patogênicas através da produção de compostos como bacteriocinas, ácidos orgânicos, peróxido de
hidrogênio; ausência de genes determinantes da resistência aos antibióticos; imunoestimulação
sem efeito pró-inflamatório; tolerância ao ácido, suco gástrico humano e à bile; resistência aos
fagos; tolerância ao oxigênio e calor; atividade metabólica desejada; capacidade de crescer em
leite; boas propriedades sensoriais; permancer viável e estável durante o processamento e
estocagem de alimentos, até o momento de seu consumo (Naidu e Bidlack e Clemens, 1999;
Holzapfel, 2006; Saad, 2006).
Para se estabelecer potenciais benefícios dos probióticos a saúde, é necessário que sejam
realizados estudos in vitro antes dos ensaios in vivo. Além disso, as estirpes devem ser testadas
individualmente para cada propriedade, visto que as características atribuídas a uma estirpe
probiótica são cepa-específica (Monteagudo-Mera et al., 2012). Independentemente da forma de
introdução dos probióticos, a quantidade final de células devem obedecer à legislação vigente do
país. Segundo a legislação brasileira, a manutenção da viabilidade e estabilidade do
microrganismo probiótico durante o uso e a estocagem do produto, deve variar entre 108 e
109UFC na recomendação diária do produto, além da capacidade de sobrevivência no ecossistema
intestinal, condição necessária à promoção das alegações de saúde e propriedades funcionais de
um probiótico (Figura 9) (Brasil, 2008).
Contudo, culturas não viáveis podem exercer certos efeitos benéficos como a
imunomodulação (Ouwehand et al., 1999). No Brasil, a Comissão Tecnocientífica de
Assessoramento em Alimentos Funcionais e Novos Alimentos, instituída junto à Câmara Técnica
de Alimentos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), têm avaliado os produtos
com alegações de propriedades funcionais e/ou de saúde aprovados no país, como por exemplo os
alimentos probióticos. Para a comercialização, deve haver um registro prévio mediante a
comprovação científica da sua eficácia, a qual deve ser avaliada caso a caso, tendo em vista que
podem ocorrer variações na ação do composto bioativo, em função da matriz ou formulação do
48

produto (Brasil, 2008; Komatsu,Buriti e Saad, 2008). Estas alegações podem fazer referências à
manutenção geral da saúde, ao papel fisiológico dos nutrientes e não nutrientes, bem como à
redução de risco de doenças, não sendo permitidas aquelas que façam menção à cura ou
prevenção de doenças (Moraes e Colla, 2006).

Figura 9: Alegação de propriedade funcional aprovada para os alimentos probióticos e os
requisitos específicos (Brasil, 2008)
49

4.8.4. Aplicação de microrganismos probióticos
Os microrganismos probióticos são aplicados em uma variedade de produtos, sendo em
sua maioria de origem láctea. Entretanto estudos utilizam alimentos de origem vegetal (Quadro 7)
e origem animal para adição do caráter probiótico.
Quadro 7: Substratos de origem vegetal utilizados como veículo de microrganismos probióticos
Microrganismo Produto Referência

Enterococcus faecium CRL
183

Sorvete de “iogurte” de soja

Miguel e Rossi (2003)

Bifidobacterium lactis Bb-
12

Maçã e mamão in natura

Tapia et al. (2007)

Lactobacillus rhamnosus
GG

Maçã in natura

Alegre et al. (2011)

Lactobacillus paracasei
LAFTI® L26

Sucos de frutas

Rodrigues et al. (2011)

No Brasil a aplicação de probióticos em produtos alimentícios é crescente, como
demonstrado no Quadro 8.

Quadro 8: Aplicação de microrganismos probióticos em produtos no Brasil
Microrganismo Produto Referência
Lactobacillus acidophilus
LAC4, Bifidobacterium
longum BL04
Queijo petit-suisse Maruyama et .al. (2006)
My Bio 6 (Streptococcus
thermophilus, Lactobacillus
delbrueckii subsp.
bulgaricus, Bifidobacterium
e Lactobacillus acidophilus)
Bebida láctea Thamer e Penna (2006)
Bifidobacterium animalis
subsp. lactis BB12,
Mesophilic Aromatic
Culture (MAC CHN-22)
(Lactococcus lactis subsp.
cremoris, Lactococcus lactis
subsp. lactis, Lactococcus
lactis subsp. lactis biovar.
diacetylactis e Leuconostoc
mesenteroides subsp.
cremoris)
Bebida láctea (buttermilk) Antunes et.al. (2007)
Lactobacillus rhamnosus
(Rhodia)
Queijo prato Cichoski et al. (2008)
MyBio 6 e MyBio 2
(Streptococcus
thermophilus, Lactobacillus
delbrueckii subsp.
Bulgaricus, Lactobacillus
acidophilus e
Bifidobacterium)
Bebida láctea com pêssego Kempka et al. (2008)
Bio-Rich®(Bifidobacterium
Bb-12 e Lactobacillus
acidophilus LA-5)
Frozen yogurt de leite de
cabra
Alves et. al. (2009)
L. rhamnosus GG ATCC
53103, B. animalis ssp.
lactis DN-173 e L. lactis
ssp. lactis ATCC 11454
Glóbulos similares à ovas de
salmão e doce à base de
surimi
Guimarães (2012)
51

4.9. Seleção e isolamento de microrganismos de interesse
4.9.1. Métodos tradicionais
Métodos tradicionais são conhecidos como método “ouro” ou método padrão de escolha,
e estão envolvidos principalmente com técnicas de cultivo. Tais métodos baseiam-se na
multiplicação do organismo alvo usando meios nutritivos em ágar ou caldo para obter um
crescimento visível, e assim realizar isolamento ou contagem microbiológica (Jasson et al.,
2010).
A utilização de meios seletivos e diferenciais é aparentemente mais simples, entretanto
esses métodos são mais demorados e podem não ser representativos principalmente em análise de
microrganismos semelhantes entre si, onde a caracterização baseada em técnicas fenotípicas e
bioquímicas