Fran-Cardenas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE FISICA
Estudo das propriedades mecânicas e viscoelásticas
de eritrócitos
Fran Stewart Gómez Cárdenas
Tese de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em F́ısica do Instituto de F́ısica da Univer-
sidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do t́ıtulo de Mestre em
Ciências (F́ısica).
Orientador: Nathan Bessa Viana
Coorientador: Bruno de Almeida Carlos de Carvalho Pontes
Rio de Janeiro
Abril de 2016
ii
P555 Cárdenas, Fran Stewart Gómez
Estudo das propriedades mecânicas e viscoelásticas dos
eritrócitos / Fran Stewart Gómez Cárdenas - Rio de Janeiro:
UFRJ/IF, 2016.
xxx, 123f.
Orientador: Nathan Bessa Viana
Coorientador: Bruno de Almeida Carlos de Carvalho Pon-
tes
Dissertação (Mestrado) - UFRJ / Instituto de F́ısica /
Programa de Pós-graduação em F́ısica, 2016.
Referências Bibliográficas: f. 87-93
1. Eritrócitos 2. Tensão superficial 3. Constante de flexão
4. Pinças Óticas 5. Reologia 6. Formação de amarras. I. Viana,
Nathan Bessa II. Pontes, Bruno de Almeida Carlos de Carvalho III.
Universidade Federal de Rio de Janeiro, Instituto de F́ısica, Programa
de Pós-graduação em F́ısica IV. Estudo das propriedades mecânicas
dos eritrócitos.
iv
Resumo
Estudo das propriedades mecânicas e viscoelásticas
de eritrócitos
Fran Stewart Gómez Cárdenas
Orientador: Nathan Bessa Viana
Coorientador: Bruno de Almeida Carlos de Carvalho Pontes
Resumo da dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em F́ısica do Instituto de F́ısica da Universidade Federal do Rio de
Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do t́ıtulo de
Mestre em Ciências (F́ısica).
O sangue contém uma variedade de células sangúıneas, entre elas, os glóbulos verme-
lhos, também chamados eritrócitos ou hemácias, os quais têm forma de disco bicôncavo
que possuem um diâmetro ao redor de 8 µm. Elas transportam oxigênio às células do
corpo humano por meio das veias, artérias e capilares. Os capilares possuem diâmetros
internos de 3 µm a 10 µm, por isso, algumas vezes as hemácias são forçadas a mudar
de forma para passar dentro destes estreitos tubos, recuperando a forma de disco quando
saem. Eritrócitos são estudados buscando-se entender as causas desta grande flexibilidade
não presente em outro tipo celular do corpo humano.
Nesta dissertação, pinças óticas são usadas no estudo de propriedades elásticas de
eritrócitos através de duas técnicas. A primeira delas é a extração de amarras, empregada
para conhecer a tensão superficial e a rigidez de flexão da membrana celular. A segunda
técnica é a técnica de reologia, utilizada para caracterizar o módulo viscoelástico da célula
a partir da aplicação de uma perturbação oscilatória sobre a amostra.
v
Avaliamos as propriedades mecânicas das amostras de eritrócitos saudáveis em três
situações diferentes. Na primeira delas mudamos a concentração salina da amostra para
avaliar como a forma dos eritrócitos influencia as propriedades f́ısicas da membrana celu-
lar. Na segunda mudamos as velocidades de deslocamento da amostra no experimento de
extração de amarras para as hemácias imersas em meio isotônico. E na terceira empre-
gamos hemácias infectadas com um tipo de parasita da malária, chamado Plasmodium
falciparum, na fase trofozóıta.
A técnica de reologia consiste em perturbar a amostra com um movimento oscilatório
a uma frequência e a uma amplitude definidas, assim podemos encontrar o módulo viscoso
e o módulo elástico, que determinam como é a resposta da célula ao est́ımulo externo.
De acordo as caracteŕısticas estruturais das células, pode-se considerar que o complexo
membrana-citoesqueleto tem um comportamento similar ao de materiais moles, como
espumas, emulsões e pastas.
Com os resultados de extração de amarras para todas as condições durante o tempo
da medida observamos que a força antes da formação da amarra, é uma força crescente
à medida que a hemácia afasta-se da microesfera que está grudada a ela e aprisionada
pela pinça ótica, chegando à força máxima Fm exatamente quando começa a formação da
amarra. Rapidamente a força cai um valor Fa, que é a força transitória de amarra, a qual
mantém-se praticamente constante até que o estágio do microscópio, onde está a amostra
fica em repouso. A força nesse ponto, Fv, é levemente maior do que Fa mas sem diferença
estat́ıstica significativa. Após a interrupção de movimento do estágio a força começa
a decair exponencialmente e para tempos muito maiores que o tempo caracteŕıstico do
decaimento encontramos a força de equiĺıbrio de amarra, F0.
No caso da variação das concentrações salinas, por meio da análise de significância
estat́ıstica e usando como condição controle para todos os casos de extração de amarras
a hemácia saudável em um meio isotônico com uma velocidade de extração de amarra de
vi
1 µm/s, encontramos a mesma relação entre a força aplicada da hemácia e o tempo de
medida. Além disso a força do “plateau” mantém-se constante, indicando que a força de
extração de amarra é constante. Também encontramos que a rigidez de flexão e a tensão
superficial não tem diferenças significativas, mas para a rigidez elástica de membrana
celular, km, encontramos diferença significativa apreciável.
Quando muda-se a velocidade de extração da amarra, encontramos a mesma relação
entre a força aplicada da hemácia e o tempo de medida, mas a força do “plateau” é
aumentada, mantendo-se Fa ≈ Fv. Usando a condição controle obtemos que a força
de equiĺıbrio da amarra, a rigidez de flexão e a tensão superficial não tem diferença
significativa no caso da velocidade de 0,5 µm/s, mais tem no caso de 0,2 µm/s, enquanto
para km não tem diferença significativa em ambas velocidades.
A dependência de força de extração da amarra com a velocidade de extração está
relacionada com o deslizamento da membrana sobre o citoesqueleto e de uma folha de
membrana sobre a outra com uma viscosidade efetiva superficial de 38 ± 4 pNs/µm, em
acordo com resultados da literatura.
No estudo das hemácias infectadas com Plasmodium falciparum encontramos que o
parasita influi na força para formar e manter a amarra, também em km, porque a diferença
é significativa com a condição controle. Usando o raio da amarra em meio isotônico
obtemos os valores de rigidez de flexão e de tensão superficial e encontramos que para
este caso não tem diferenças significativas.
Com os resultados de reologia encontramos que o citoesqueleto de um eritrócito saudável
imerso em um meio isotônico tem um comportamento mais próximo do estado ĺıquido,
porque de acordo com o modelo de materiais v́ıtreos moles o exponente de lei de potência
que define os módulos elásticos é αc = 0.64± 0.02. Conhecendo αc, encontra-se um valor
de temperatura efetiva ζc ∼ 1,7, indicando um citoesqueleto se encontra mais próximo do
estado ĺıquido, o que pode estar relacionado com a facilidade de escoamento das mesmas
vii
no sangue, por capilares de diâmetros menores que o seu próprio.
Palavras-chave: 1. Eritrócitos 2. Tensão superficial 3. Rigidez de flexão 4. Pinças
Óticas 5. Reologia 6. Extração de amarras 7. Membrana celular 8. Citoesqueleto. 9.
Plasmodium Falciparum
viii
Abstract
Study of the mechanical and viscoelastic properties
of erythrocytes
Fran Stewart Gómez Cárdenas
Advisor: Nathan Bessa Viana
Coadvisor: Bruno de Almeida Carlos de Carvalho Pontes
Abstract da Tese de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em F́ısica do Instituto de F́ısica da Universidade Federal do Rio de Janeiro -
UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do t́ıtulo de Mestrado
em Ciências (F́ısica).
Blood contains several blood cells,including the red blood cells (RBCs), also called
haematids or erythrocytes. Red blood cells have the form of biconcave disc with a diameter
around 8 µm, they carry oxygen to human cells through veins, arteries and capillaries.
Capillaries have internal diameters between 3 µm and 10 µm, so sometimes RBCs are
forced to change the shape to move within these narrow tubes, recovering disk shape
when they leave them. Erythrocytes are studied to understand the causes of this great
flexibility, for this reason, RBCs are the most deformable cell in the human body.
In this dissertation, optical tweezers are used to study elastic properties of red blood
cells using two techniques. The first is the extraction of tethers, used to know the surface
tension, bending stiffness of the cell membrane. The second technique, that is the rhe-
ology technique is used to characterize the viscoelastic modulus of the cell obtained by
application of an oscillatory movement on the sample.
ix
We evaluated the mechanical properties of samples of healthy erythrocytes in three
different situations. In the first we changed the salt concentration of the sample, to
evaluate how the erythrocyte form influences the physical properties of the cell membrane.
In the second we changed the sample displacement speed the tether extraction experiment
for the red blood cells immersed in an isotonic medium. And in the third we employed
erythrocytes infected with Plasmodium falciparum in the trophozoite phase.
With the rheology technique we can find the viscous and elastic moduli, which deter-
mines the cell response to external stimuli. According to the structural characteristics
of the cell, it can be considered that the membrane-cytoskeleton complex has a behavior
similar to that of soft materials such as foams and emulsions.
With the tether extraction experiments we observed that the force prior to forming
the tether increases as the red blood cells moves away from the microsphere which is
glued to it and trapped by the optical tweezers, reaching the maximum force Fm exactly
when begins the tether formation. Quickly the force drops to a value Fa, the transient
tether force, which remains practically constant until the microscope stage stops. The
force value when the microscope stops, Fv, is slightly higher than Fa, without statistical
significant difference. After the stage motion leaves the force decay exponentially and for
much longer times than the characteristic time decay found the ultimate tether force F0
is reached.
In case of variation in salt concentration, using statistical significance analysis and
using as a control condition for all cases of tethers healthy red blood cell extraction in a
medium isotonic with a tether extraction rate of 1 µm/s, we find the same relationship
between the force applied to the red cell and the time of measurement. Furthermore
the force of the ”plateau”remains constant, indicating that the tether extraction force is
constant. We also found that κ and σ do not have significant differences, but the elastic
stiffness cell membrane km, we found significant difference.
x
When changes to the tether extraction speed, we find the same relationship between
the force applied to the red cell and the measurement time, but the force of the value of
the “plateau” force is also increased, keeping Fa ≈ Fv. Using the control condition we
obtain that F0, κ and σ no significant difference when the rate of 0,5 µm/s, is more in
case of 0,2 µm/s, while for km is no significant difference in both speeds.
The dependence of the tether extraction force with the extraction speed is related to
the sliding of the membrane over the cytoskeleton and of a membrane sheet over the other
with a effective viscosity surface value of 34 ± 4 pNs/mum, in agreement with reported
results.
In the study of red blood cells infected with Plasmodiumfalciparum we found that
the parasite affects the force to form and maintain tether, also in km, because the difference
is significant with the control condition. Using tether radius in isotonic medium get the
bending stiffness values and surface tension and found that in this case do not have
significant differences.
The results of rheology found show that the cytoskeleton of healthy erythrocytes im-
mersed in a isotonic medium has a behavior closer to the liquid state, according to the
model of soft glassy materials the power law exponent which defines the elastic modulus
is αc = 0,64 ± 0,02. Effective temperature value in this case is ζc ∼ 1,7 indicating a
cytoskeleton closer to the liquid state, which can be related to the ease of flow of red
blood cells in the bloodstream by capillaries smaller than their diameters.
Keywords: 1. Erythrocytes 2. Surface Tension 3. Bending Stiffness 4. Optical Twe-
ezers 5. Rheology 6. Extraction tether 7. Cell Membrane 8. Cytoskeleton 9.Plasmodium
Falciparum.
xi
Agradecimentos
Aproveito para agradecer em primeiro lugar a minha famı́lia, a meus tios, primos, mas
especialmente a minha mãe Maŕıa Olga e minha avó Elóısa, que contribúıram em minha
formação pessoal e que de maneira constante estão me dando motivação para continuar
estudando. Muito obrigado, Diana por sua compreensão, por seus conselhos e por seu
tempo para que eu pudesse compartilhar este trabalho.
Eu quero agradecer ao meo orientador, Nathan Bessa Viana por me ter dado a opor-
tunidade de trabalhar no Laboratório de Pincas Óticas da UFRJ, também por me ter
ensinado os detalhes da calibração da pinça ótica, assim como das técnicas da extração
de amarras e de reologia, pela paciência na condução desta dissertação, pelos tempos de
discussão dos modelos empregados nesta tese e na análise dos resultados das medições.
Agradeço também meu coorientador, Bruno Pontes por me ter ensinado os detalhes da pre-
paração das amostras para usar a pinça ótica e a trabalhar com o microscópio eletrônico
de varredura (MEV), pelas recomendações necessárias para realizar as medições assim
como o tempo para discutir os dados obtidos.
Agradeço também aos integrantes do laboratório de pinças óticas, especialmente ao
professor Moyses Nussenzveig, ao Lúıs Pires e ao Diney Soares, porque tanto seus con-
selhos como suas contribuções foram importantes para dar forma a esta dissertação.
Também às pessoas pertencentes ao Laboratório de Morfogênese Celular, do Instituto
de Ciências Biomédicas da UFRJ por disponibilizar a sua estrutura para a preparação
das hemácias saudáveis.
xii
Muito obrigado ao Laboratório de Bioqúımica e Sinalização Celular pela preparação
das hemácias infectadas com Plasmodium Falciparum. A todos os professores da UFRJ
que contriburam na minha formação profissional durante estes dois anos. Por fim, agradeço
as agências CAPES pelo primeiro ano da bolsa de mestrado e FAPERJ pelo financiera-
mente de meu estudo no tempo restante de mestrado.
xiii
Há homens que lutam um dia e são bons, há outros que lutam um ano e são melhores,
há os que lutam muitos anos e são muito bons. Mas há os que lutam toda a vida e estes
são imprescind́ıveis. Bertolt Brecht.
xiv
Sumário
Sumário xiv
Lista de figuras xvi
Lista de tabelas xxv
Lista de Śımbolos e Abreviaturas xxviii
1 Introdução 1
2 Eritrócitos 6
2.1 O sangue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.1.1 Hematopoiese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.2 Os eritrócitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.3 Estrutura da membrana celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.3.1 Membrana celular de eritrócitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.3.2 Eritrócitos e Malária . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.4 Propriedades mecânicas de eritrócitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.5 Extração de amarras . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.6 Reologia de eritrócitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3 Materiais e Métodos 42
3.1 Preparação das amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
xv
3.2 Pinças Óticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.2.1 Montagem experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.2.2 Calibração da pinça ótica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.3 Extração de amarras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.4 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.5 Significância Estat́ıstica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.6 Reologia de eritrócitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
4 Resultados e Discussão 63
4.1 Calibração da pinça ótica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
4.2 Extração de amarras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
4.2.1 Extração de amarras em eritrócitos saudáveis . . . . . . . . . . . . 65
4.2.2 Extração de amarras em eritrócitos infectados com Plasmodium Fal-
ciparum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
4.3 Módulo viscoelástico de eritrócitos saudáveis . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
5 Conclusões e perspectivas 85
Referências Bibliográficas 87
xvi
Lista de Figuras
2.1 Eritropoiese (Hematopoiese de eritrócitos). A partir das células-tronco
BFU-E e CFU-E se origina o proeritroblasto (1) que tem um grande núcleo
que representa quase todo o volume da célula. Por mitose o proeritroblasto
muda em eritroblasto basófilo (2), logo a eritroblasto policromatófilo (3) e
depois a normoblasto (4), como se observam estas fases no quadro branco.
Nestas fases o proeritroblasto apresenta diminuição de volume do núcleo
e da célula, mudando ao mesmo tempo sua cor a rosa devido ao ińıcio da
sintese da hemoglobina. Depois do quarto dia, o normoblasto já não tem
núcleo (5) e adquire a cor avermelhada e logo o reticulócito (6) fica na
médula óssea 48 horas para depois sair à corrente sangúınea e acabar o
processo de maturação para finalmente criar um novo eritrócito (7). Mo-
dificado de [42]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.2 Dimensões dos eritrócitos. a) Seção superior b) Seção transversal. Modifi-
cado de [35]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
xvii
2.3 Tipos de hemácias devido à mudança de concentração da amostra. As se-
tas indicam a direção do fluido para cada caso. a) A hemácia conserva
sua forma de disco quando é posta em PBS 1,0x/BSA 1mg/1mL, devido
a que forma-se um meio isotônico a quantidade de fluido que entra é a
mesma que sai da hemácia. b) A hemácia diminui seu volume quando é
colocada em PBS 1,5x/BSA 1mg/1mL, devido a que forma-se um meio
hipertônico e a concentração salina é maior fora da hemácia, os fluidos
da hemácia delocam-se fora da célula. c) A hemácia aumenta seu volume
quando é colocada em PBS 0,5x/BSA 1mg/1mL, devido a que a concen-
tração salina dentro da hemácia é maior do que o meio, formando assim um
meio hipotônico, o fluido deloca-se de dentro para fora da célula podendo
provocar o estouro da mesma. Modificado de [13]. . . . . . . . . . . . . . . 13
2.4 Membrana celular de uma célula eucariótica animal. Segundo o modelo do
mosaico fluido, a membrana celular como bicamada liṕıdica, possui carboi-
dratos na camada superior e protéınas distribúıdas assimetricamente. No
interior da membrana contém as caudas dos fosfoliṕıdios e protéınas inte-
grais. As cabeças dos fosfoliṕıdios estão no exterior da membrana (cinza)
e no interior as caudas (amarelo). Retirado de [13]. . . . . . . . . . . . . . 15
2.5 Molécula de um fosfoliṕıdio. O fosfoliṕıdio é unidade fundamental da mem-
brana plasmática, tem uma cabeca hidrof́ılica (polar) e duas caudas hi-
drofóbicas (não polar), uma delas tem uma ligação dupla cis, por isso
possui uma cauda dobrada. Figura modificada de [1]. . . . . . . . . . . . . 17
2.6 a) Esquema da membrana celular e citoesqueleto de eritrócitos com a dis-
tribução das protéınas. b) A esfera vermelha, A, representa o filamento
curto de actina que tem contato com os extremos da cadeia de espectrina,
representada com esferas verdes. As esferas cinzas, B, são unidades da
cadeia de espectrina. Figura modificada de [39]. . . . . . . . . . . . . . . . 19
xviii
2.7 Ciclo biológico da malária. Retirada de [20]. . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.8 Para descrever a flexão da membrana considera-se um ponto da membrana
que define um vetor normal desta superf́ıcie que por sua vez define um
plano. Desenha-se uma circunferência sobre o plano, que tem a mesma
curvatura que a membrana nesse ponto. O raio da circunferência é um raio
principal de curvatura R1. Para encontrar o raio principal de curvatura
R2, usa-se o mesmo ponto da membrana e procura-se o plano ortogonal
ao plano usado para encontrar R1, assim pode-se desenhar a circunferência
correspondente. Depois encontra-se o valor das curvaturas principais sa-
bendo que os raios principais cumprem as relações C1 = 1/R1 e C2 = 1/R2.
Modificado de [8]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.9 Alongamento de uma haste ciĺındrica. Modificado de [61]. . . . . . . . . . . 32
2.10 Fluxo laminar de cisalhamento de um ĺıquido. Modificado de [61]. . . . . . 33
2.11 Representação de a) uma mola e de b) um amortecedor sob a ação da tensão
de cisalhamento que têm comportamento de sólido e ĺıquido respectivamente. 36
2.12 Modelos viscoelásticos de a) Maxwell e de b) Kelvin-Voigt. . . . . . . . . . 37
2.13 Modelo empregado pelas hemácias. Retirado de [37]. . . . . . . . . . . . . 38
2.14 Modelo empregado para hemácias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
xix
3.1 A armadilha ótica depende da relação entre o ı́ndice de refração da micro-
esfera (ne) e o ı́ndice de refração do meio (nmeio) e também da contribução
dos raios refletidos e refratados pela microesfera, aqui só são mostrados os
efeitos da força de gradiente. a) Quando o centro da esfera coincide com a
região horizontal de intensidade máxima do feixe, a força de gradiente vai
na direção contrária à direção de propagação do feixe. Neste caso temos
equiĺıbrio entre a força de gradiente e a força de espalhamento, gerando
assim estabilidade de forças na esfera. b) Quando o centro da esfera não
coincide com a região horizontal de intensidade máxima do feixe, a força
de gradiente levará a esfera para a região de maior intensidade. Modificado
de [38]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.2 Diagrama de forças resultantes da interação entre os raios iniciais 1 e 2
com a mesma intensidade e uma microesfera que obedece o tratamento da
ótica geométrica. A força de reflexão, FR, é devida à pressão de radiação,
que empurra à microesfera na direção de propagação do laser. A força de
refração Fr se deve à diferença de momento linear total dos raios, que em-
purra a microesfera na direção oposta à de propagação do laser. Modificado
de [52]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
xx
3.3 O laser segue por um cabo de fibra ótica (1) que é colocado em um suporte
(2) fixo à mesa ótica. Em seguida o laser sai da fibra ótica, passa por uma
placa de meia onda (3) e depois por um divisor de feixe polarizado (5) que
separa o laser em duas partes. Uma delas é absorvida por um atenuador (4)
enquanto a outra parte segue para o microscópio, passando por espelhos (6)
até incidir em um espelho dicróico (8), entrar na objetiva (9) e ser focalizadona amostra (10). A amostra é movimentada com o estágio piezoelétrico (10)
conectado a um computador (CPU). Para saber o que ocorre na amostra
usa-se uma fonte luminosa (12) cuja iluminação, ao atravessar a amostra,
é focalizada por uma lente (7) e uma imagem da amostra é coletada com
a câmera Hammamatsu C11440-10C (Hammamatsu, Japão). Imagens são
obtidas e digitalizadas utilizando o software HCImage (Hammamatsu, USA). 50
3.4 Esquema da amostra empregada no processo de calibração. Uma micro-
esfera é mantida fixa usando uma pinça ótica, quando o laser (vermelho)
entra pela lamı́nula inferior (cinza), enquanto a água destilada passa pela
microesfera devido ao movimento controlado do estágio que está em con-
tato com a lamı́nula inferior fazendo com que a força de arrasto (F ) seja
equilibrada com a força da pinça (Fp) e que a microesfera varie sua posição
em ∆ρ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.5 Onda triangular de frequência 2 Hz e amplitudes crescentes de 30 µm, 40
µm, 50 µm, 60 µm e 70 µm, usada para mover a amostra. . . . . . . . . . 53
xxi
3.6 Foto de uma régua micrométrica obtida pela câmera Hammamatsu C11440-
10C, com uma objetiva Nikon Plan Fluor (aumento de 100X e NA = 1,4),
que possui espaçamento entre duas linhas de 10 µm. Medindo a distância
em pixel nessa régua é posśıvel determinar a constante de calibração do
sistema de detecção, ou seja, a relação entre pixel e outra unidade de
distância. Nessa foto a constante obtida foi (13,68 ± 0,01) pxl/µm. A
incerteza é obtida pelo erro padrão da média de uma série de dez medidas. 54
3.7 Experimento de Reologia. Um movimento oscilatório com amplitude ξ0 é
produzido no estágio do microscópio invertido, x indica a deformação da
célula é ρ é a variação de posição da microesfera presa a pinça ótica. . . . . 59
3.8 Medida da altura da hemácia h
′
. a) Vista lateral. Com a câmera Hamma-
matsu C11440-10C, grava-se o deslocamento do estágio (preto) com velo-
cidade constante no eixo z, Vz, para identificar duas imagens nas quais se
encontrem em um mesmo plano objeto o centro da microesfera que está na
lamı́nula (1) e a microesfera que está na hemácia (2). Conhecendo o raio
das microesferas a e a distância entre o centro da esfera e a parte superior
do estágio para os dois casos, a e h, determina-se h
′
. b) Vista das esferas e
da hemácis de cima. Analisa-se o ńıvel de cinza das imagens, identificando
quando uma imagem que mostra a microesfera grudada na lamı́nula (1)
tem o mesmo ńıvel de cinza no centro da esfera do que uma microesfera
aderida à hemácia (2). Sabendo qual é a taxa de captura da câmera e
usando Vz, encontra-se h
′
e h. Barra de escala 5 µm. . . . . . . . . . . . . 62
xxii
4.1 a) Onda triangular que desloca a amostra de amplitudes A = 30 µm, 40
µm, 50 µm, 60 µm e 70 µm com frequência f = 2 Hz. b) Posição do centro
de massa de uma microesfera aprisionada na pinça ótica quando o estágio é
deslocado com 4 repetições do movimento indicado em a). c) Ajuste linear
da relação entre a variação de posição da microesfera e as velocidades do
estágio, realizado a partir da equação 3.3 com coeficiente angular de τp. . . 64
4.2 Extração de amarras para as hemácias. a) 1. A pinça ótica tem presa uma
microesfera, logo se move o estágio do microscópio manualmente procu-
rando uma hemácia grudada na lamı́nula para deixar a microesfera sobre
ela. 2-5. É deslocado o estágio de forma controlada a uma velocidade
constante, quando sai a microesfera do eritrócito se forma uma amarra que
se vai estendendo enquanto o estágio se move. b) A amarra é muito fina
em comparação com a célula e a microesfera. Barra de escala 5 µm. c)
Relação de força aplicada à microesfera pela célula no tempo, alcança a
máxima força Fm quando a microesfera está proxima a sair, logo decai de
repente à força transitória de amarra Fa até chegar a uma força Fv que
indica que o estágio ficou parado. No repouso a força decai até F0. . . . . . 66
4.3 Determinação do raio da amarra usando MEV. a) Uma amostra de hemácia
com uma amarra formada com uma microesfera de poliestireno é previa-
mente preparada para obter a imagem no MEV, para analisar os ńıveis de
cinza da imagem. Barra de escala 2 µm. b) Ampliação de a). Barra de
escala 1 µm. c) Ajuste da função g(y). A partir do ajuste de g(y) pela
equação 3.5, obtem-se o raio da amarra. Barras de escala 5 µm. . . . . . . 67
xxiii
4.4 Medindo Xinf para encontrar km. a) A hemácia sem esticar contém uma
microesfera presa na pinça ótica, b) logo a célula se estica formando uma
amarra e a microesfera fica no repouso. A diferença entre os comprimen-
tos da hemácia esticada é não esticada é Xinf , este dado é utilizado para
encontrar o valor de km, usando a equação 4.2. Barra de escala 5 µm. . . . 68
4.5 Tipos de hemácias devido à mudança de concentração da amostra. A
hemácia é crenada quando se usa PBS 1,5x/BSA 1mg/mL , é normal
quando se usa PBS 1,0x/BSA 1mg/mL e é turgida quando se usa PBS
0,5x/BSA 1mg/mL. Barra de escala 5 µm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
4.6 Ajuste linear para encontrar a viscosidade efetiva superficial ηeff , onde ηeff
= 38 ± 4 pNs/µm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.7 a) Relação de deslocamento da microesfera antes da formação de amarra
quando o estágio desloca-se com uma velocidade de 1 µm/s. b) Relação
de força feita pela hemácia antes da formação de amarra quando o estágio
desloca-se com uma velocidade de 1 µm/s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.8 Modelo mecânico a partir da análise da deformação da hemácia sem formação
de amarra. As propriedades mecânicas e viscosas são conformadas por km
é a rigidez elástica da membrana que está em paralelo com a viscosidade de
célula βc em série com rigidez elástica da célula kc e κp é a rigidez elástica
da pinça ótica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4.9 Extração de amarra de uma hemácia infectada com Plasmodium falciparum
na fase trofozóıta usando uma microesfera de poliestireno. Barra de escala
5 µm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
xxiv
4.10 Medida do módulo viscoelástico da hemácia. a) Uma microesfera de poli-
estireno, previamente aderida à lamı́nula em uma região fora da célula mas
próxima a ela, é usada como referência para o movimento real da amos-
tra. Uma outra microesfera presa na pinca ótica é aderida á célula. b)
Exemplo das oscilações induzidas na célula para caracterizar suas propri-
edades viscoelásticas. Um movimento senoidal formado por um conjunto
de oscilações de amplitude constante para cada uma das frequências é apli-
cado na hemácia. c) Relação de deslocamentos das microesferas grudadas
na hemácia e na lamı́nula para um ciclo de 1 Hz, 14 Hz e 35 Hz, assim
podemos identificar a diferença de fase existente entre os deslocamentos. . 81
4.11 Ajuste linear da relação das componentes real K
′
e imaginária K
′′
da cons-
tante elástica complexa, com km = 7,3 ± 0,7 pN/µm e β = 1,84 ± 0,08.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
4.12 Ajuste dos valores das componentes da constante elástica complexa como
função da frequência linear f , em a) um gráfico linear e b) um gráfico log-log. 83
xxv
Lista de Tabelas
4.1 Valores das forças e o tempo de decaimento na relação força e tempo vari-
ando a concentração da amostra, movendo a amostra a velocidade constante
de 1 µm/s, sendo n o número de medidas feitas para cada concentração. . 70
4.2 Significância estat́ıstica para as forças e o tempo de decaimento na relação
força e tempo, variando as condições da amostra, usando como amostra
de controle a hemáciano meio isotônico com uma velocidade de extração
de amarra de 1 µm/s, sendo n o número de medidas feitas para cada
concentração. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
4.3 Ausência de significância estat́ıstica das forças de “plateau” Fa e Fv para
a extração de amarras mudando a concentração salina do meio. . . . . . . 71
4.4 Valores da tensão superficial σ, rigidez de flexão κ e a constante elástica
da membrana km variando a concentração da amostra, sendo n o número
de medições feitas para cada concentração. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.5 Significância estat́ıstica para a tensão superficial σ, a rigidez de flexão κ
e a constante elástica da membrana km variando a concentração de sal na
amostra, sendo n o número de medições feitas para cada concentração de sal. 72
4.6 Valores das forças e do tempo de decaimento na relação força e tempo
variando a velocidade de extração de amarra para hemácias normais, sendo
n o número de medidas feitas para cada velocidade. . . . . . . . . . . . . . 72
xxvi
4.7 Significância estat́ıstica para o tempo de decaimento na relação força e
tempo variando a velocidade de extração de amarra para hemácias normais,
sendo n o número de medidas feitas para cada velocidade. Os resultados
com Vt = 1 µm/s, foram considerados o grupo controle no teste estat́ıstico. 72
4.8 Significância estat́ıstica das forças de “plateau” Fa e Fv para a extração de
amarras mudando a velocidade de extração. . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.9 Valores da tensão superficial σ, rigidez de flexão κ e constante elástica da
membrana km variando a velocidade de extração da amarra, sendo n o
número de medições feitas para cada velocidade. . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.10 Valores da tensão superficial σ, rigidez de flexão κ e constante elástica da
membrana km variando a velocidade de extração da amarra, sendo n o
número de medições feitas para cada velocidade. . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.11 Valores das forças e do tempo de decaimento na relação força e tempo
para hemácias infectadas com Plasmodium falciparum, sendo n o número
de medidas feitas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.12 Significância estat́ıstica das forças e do tempo de decaimento na relação
força e tempo, variando as condições da amostra, usando como amostra de
controle a hemácia no meio isotônico com uma velocidade de extração de
amarra de 1 µm/s, sendo n o número de medidas realizadas. . . . . . . . . 78
4.13 Significância estat́ıstica de Fv e Fa, não tem uma diferença significativa, a
extração de amarra se realiza aproximadamente a força constante . . . . . 79
4.14 Valores da tensão superficial σ, rigidez de flexão κ e constante elástica da
membrana km com uma velocidade de extração de 1 µm/s, para hemácias
infectadas com Plasmodium falciparum, sendo n o número de medidas feitas. 79
xxvii
4.15 Significância estat́ıstica da tensão superficial σ, rigidez de flexão κ e a
constante elástica da membrana km variando a concentração da amostra,
movendo a amostra a velocidade constante de 1 µm/s sendo n o número
de medições feitas para cada concentração. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
xxviii
Lista de Śımbolos e Abreviaturas
a: Raio da microesfera de poliestireno
Aa: Área superficial da amarra
BSA: Albumina do soro bovino
BFU-E: Unidade formadora de colônia de eritrócitos grandes
CFU-E: Unidade formadora de colônia de eritrócitos pequenos
CW : Modo cont́ınuo do laser
C0: Curvatura espontânea da membrana
C1, C2: Curvaturas principais da membrana
NIH3T3: Linhagem de células de fibroblastos
LPO: Laboratório de Pinças Óticas
d: Espessura da membrana celular
DNA: Ácido desoxirribonucleico
E: Módulo de Young
Em: Energia livre de Helfrich-Canham
FeCNK: Ferricianeto de potássio
f0: Frequência de escala na equação de amortecimento estrutural
F : Força de arrasto
F0: Força de equiĺıbrio da amarra
Fa: Força de extração de amarra
Fd: Força de decaimento
FD: Força de tração
Ff : Fator de forma
Fm: Força máxima de extração de amarra
Fp: Força da pinça ótica
Fr: Força da refração
xxix
FR: Força de reflexão
g(y): Função que ajusta com o ńıvel de cinza do comprimento da amarra
G: Módulo de cisalhamento
Gc: Curvatura gaussiana da membrana
Gm: Módulo de cisalhamento da membrana celular
G∗(ω): Módulo de cisalhamento complexo no domı́nio de frequências
G
′
: Módulo de cisalhamento elástico
G
′′
: Módulo de cisalhamento viscoso
G0: Rigidez da célula como parâmetro de escala da equação de amortecimento estrutural
h: Altura da célula sob a microesfera
H: Módulo de compressibilidade
Ha: Energia livre de amarra
Hc: Curvatura média da membrana
K: Rigidez de flexão de membrana
kB: Constante de Boltzmann
Kc: Rigidez elástica da hemácia
K∗c : Rigidez elástica complexa da célula
km: Rigidez elástica de membrana celular
La: Comprimento da amarra
MEV : Microscopia eletrônica de varredura
ne: Índice de refração da microesfera
nmeio: Índice de refração do meio em que está imersa a microesfera
NA: Abertura Numérica da objetiva
PBS: Tampão fosfato salino
pH: Potencial hidrogeniônico
PE: Potência de entrada na objetiva
R: Raio da amarra
RNA: Ácido ribonucleico
R0: Raio da amarra
SGR: Soft Glassy Rheology - Reologia de materiais moles
Va: Volume da amarra
Vt: Velocidade de extração de amarra
α: Nı́vel de significância
βs: Coeficiente de fricção de Stokes
xxx
γ: Deformação de tração
∆ρ: Deslocamento da microesfera de sua posição de equiĺıbrio
∆A: Variação de áreas entre as monocamadas
∆A
′
: Diferença de área entre as monocamadas
∆p: Diferença de pressão entre o interior e exterior da veśıcula
�̇: Taxa de quantidade de cisalhamento
ζ: Temperatura efetiva
η: Viscosidade do meio
ηeff : Viscosidade efetiva superficial
κ: Rigidez de flexão da membrana
κp: Constante elastica transversal da pinça ótica
κ: Módulo de curvatura não local
λ: Comprimento de onda
µ: Razão de Poisson
ξ0: Amplitude do movimento senoidal do estágio
ρ(t): Amplitude da microesfera grudada na hemácia
ρ0(v = 0): Posição de equiĺıbrio da microesfera presa na pinca ótica
ρ(v): Mudança da posição de equiĺıbrio da microesfera presa na pinca ótica
σ: Tensão superf́ıcial da membrana
τ : Tempo caracteŕıstico definido segundo a relação do módulo de Young
τp: Tempo de decaimento de extração de amarra
φ: Ângulo de fase
ω: Frequência angular
1
Caṕıtulo 1
Introdução
O intercâmbio de substâncias de forma seletiva entre a célula com o ambiente cir-
cundante mantendo sua estrutura é a chave para seu desenvolvimento e sobrevivência.
A membrana celular estabelece limites entre o ambiente e as organelas que compõem a
célula. Sua estrutura é formada por uma bicamada liṕıdica de 5 nm de espessura [1], a
qual é responsável por impedir que o conteúdo da célula seja disperso.
Além disso, a membrana também permite que processos como a endocitose e a exoci-
tose nos macrófagos e a sinapse nos neurônios sejam possivéis, tendo como caracteŕıstica
especial a mudança de sua área superficial, o que permite regular a formação de veśıculas
que vão desde a membrana até o núcleo como resposta de um est́ımulo externo e também
em sentido contrário podendo descartar substâncias que a célula não precisa[3]. Quando
a tensão da membrana celular aumenta se produz exocitose. Caso contrário a endocitose
é estimulada [3].
Estes fenômenos biológicos são de grande interesse porque permitem observar a relação
entre os est́ımulos mecânicos com os est́ımulos biológicos e qúımicos, sendo objeto de
estudo entender como a membrana celular transforma est́ımulos mecânicos em respostas
biológicas e como os processos da célula que usam qualquertipo de sinalização podem
produzir forças mecânicas na membrana celular.
2
Um método para conhecer a resposta mecânica da membrana celular a est́ımulos ex-
ternos é estudar o grau de deformabilidade dos glóbulos vermelhos, chamados também
eritrócitos ou hemácias. Os eritrócitos possuem caracteŕısticas importantes que fazem dos
mesmos um excelente modelo para o estudo de propriedades mecânicas.
Diferentemente de outras células, os eritrócitos não possuem núcleo, possuem um
citoesqueleto simplificado, membrana celular e citosol composto de hemoglobina. Em
consequência sua estrutura é muito simples, e suas propriedades mecânicas e viscoelásticas
são devidas principalmente às propriedades f́ısicas da membrana celular e do citoesqueleto.
A hemácia tem forma de disco bicôncavo, o que facilita a determinação de sua área
superficial e de seu volume, além disso, sua forma bem determinada ajuda na criação de
modelos teóricos e também no desenvolvimento de simulações que permitem estudar a
sua deformabilidade e influência da mesma na microcirculação do sangue [16]. A hemácia
tem a função exclusiva de entregar oxigênio às células e receber dióxido de carbono,
diferentemente das células com núcleo, que realizam mais funções como divisão celular,
endocitose, exocitose, podendo estes processos celulares afetar o comportamento mecânico
das mesmas.
A deformabilidade das hemácias é a capacidade que elas têm para mudar de forma de-
vido a forças externas sem que possam ficar estoradas quando passam através dos capilares
que têm um diâmetro menor do que as hemácias ou simplesmente pelas forças mecânicas
no fluxo do sangue. Além disso, estes corpos elásticos voltam a sua forma de disco depois
de soportar as forças externas. Sabendo que os eritrócitos em seu citosol contêm prin-
cipalmente solução de hemoglobina, suas propriedades elásticas são determinadas pela
estrutura formada pela membrana celular.
A deformabilidade da membrana celular das hemácias é estudada a partir de três de-
formações fundamentais [35]. A expansão ou contração de área da membrana indica qual
é a quantidade de energia necessária para esticar ou contrair a superf́ıcie da membrana.
3
A deformação por cisalhamento que indica a quantidade de energia necessária para mover
a membrana a partir da tensão cisalhante. A flexão da membrana celular mostra quanta
energia precisa-se para mudar a curvatura.
Também a deformação das hemácias pode ser estudada a partir da caracterização
de sua viscosidade, definida como a viscosidade da membrana celular e a viscosidade do
citosol [35].
Usando modelos fenomenológicos que relacionam o material que constituiem as hemácias
com os materiais v́ıtreos moles [9], é posśıvel criar um modelo reológico, que é empregado
para analisar os dados experimentais obtidos pela técnica de reologia e encontrar o módulo
viscoelástico das hemácias.
Sabendo isto, utilizamos instrumentos que permitam a aplicação de forças controladas
para caracterizar as propriedades elásticas e viscosas das hemácias. Assim podemos gerar
uma condição de referência ou de controle, que posteriormente será usada como ferramenta
de comparação para outras condições de estudo, com a finalidade de identificar os efeitos
da nova condição na hemácia.
Segundo Nash [49], utilizando micropipetas de aspiração e com a condição de controle
de hemácias saudáveis, ele observou nas hemácias infectadas com Plasmodium falciparum
uma diminução em sua deformabilidade devido a um ligeiro endurecimento na membrana
celular e uma diminução na relação da área/volume celular, devido a que as hemácias se
tornam mais esféricas, conservando o mesmo valor de área superficial [57].
Além das micropipetas de aspiração, outro instrumento já foi utilizado para carac-
terizar células como fibroblastos NIH3T3 [8], cones de crescimento de neurônios [30],
células microgliais, macrófagos [52], células ciliadas externas [40], eritrócitos [16], [29]
são as armadilhas óticas, chamadas também pinças óticas. As pinças óticas permitem
manipular part́ıculas dielétricas em um intervalo de tamanho que varia de nanômetros
a micrômetros, como por exemplo, microesferas de poliestireno, usando um feixe de luz
4
altamente focalizado.
O objetivo principal desta dissertação é estabelecer uma metodologia de estudo para
conhecer as propriedades mecânicas e viscoelásticas de eritrócitos utilizando a pinça ótica
e as técnicas de extração de amarras e reologia variando as condições de estudo da amostra.
No caṕıtulo 2 desta dissertação é apresentado o modelo celular uitilizado, os eritrócitos,
conhecendo primeiro a composição do sangue humano, depois como se originam e como é o
processo de maturação das células sangúıneas. Despois são apresentados os fundamentos
teóricos das técnicas de extração das amarras e de reologia. A partir dos conceitos de
reologia é proposto um modelo mecânico para o comportamento das hemácias. Ao final
do caṕıtulo, é discutido como o Plasmodium falciparum invade os eritrócitos, discutindo
também as fases da malária e os efeitos da malária nas células.
No caṕıtulo 3 são apresentados os materiais e métodos utilizados. Entre eles os
prinćıpios f́ısicos que envolvem as pinças óticas, mostrando a montagem experimental,
assim como o processo de calibração feito antes das medições. Também são apresentados
os detalhes da preparação das amostras incluindo as condições das células usadas nas
técnicas de extração de amarras e de reologia com a finalidade de conhecer os procedi-
mentos feitos para obtenção dos resultados experimentais. Além disso, é mostrado como
o valor do raio da amarra é medido por microscopia eletrônica de varredura, MEV.
No caṕıtulo 4 são mostrados os dados, os resultados e a discussão, tanto da calibração
como das técnicas antes descritas, como os valores da tensão superficial, a rigidez de
flexão, a constante elástica da membrana celular e cada uma das variáveis envolvidas na
relação da força com o tempo na extração de amarras, para todas as condições de estudo
que são a mudança da concentração salina, a mudança da velocidade de extração e a
hemácia infectada pelo Plasmodium falciparum na etapa trofozóıta. Para a análise feita
com reologia mostramos a constante viscoelástica complexa e as variáveis que ajudaram
5
a obtê-la, somente para as condições de hemácias saudáveis.
Finalmente, no caṕıtulo 5 apresentamos as conclusões e perspectivas desta dissertação.
6
Caṕıtulo 2
Eritrócitos
2.1 O sangue
O desenvolvimento e sobrevivência da célula estão baseados no intercâmbio de substâncias
com o ambiente ao seu redor. No ambiente em que vive, a célula não se encontra isolada.
Ela pode fazer parte de um grupo de células ou de tecidos e órgãos, a fim de executar
funções espećıficas que em geral não podem ser obtidas por uma única célula.
As células, os tecidos e órgãos trabalham em plena coordenação, gerando novos nu-
trientes prontos para serem usados em outras áreas do corpo. Por esta razão, é essencial
usar um meio de transporte efetivo de nutrientes para garantir o bom funcionamento de
todo o corpo e ao mesmo tempo eliminar as substâncias que não são necessárias.
Precisamente o sistema circulatório, além de manter a temperatura do corpo, pro-
move este intercâmbio eficiente porque o sangue é bombeado pelo coração a uma média
de 80 latidos por minuto e vai pelos diferentes vasos sangúıneos (veias, artérias e ca-
pilares) transportando oxigênio, reśıduos celulares, hormônios, entregando ou recebendo
substâncias dependendo das necessidades das células.
Em geral o sangue interage com as células de quatro formas, a primeira quando o
sangue é enviado a partir do lado direito docoração através das artérias pulmonares para
7
os pulmões, troca o dióxido de carbono por oxigênio, para logo viajar dentro das veias
pulmonares para o lado esquerdo do coração. A partir desta zona, o sangue oxigenado vai
pelas artérias principais tais como a aorta, passando por todo o corpo (exceto os pulmões)
liberando oxigênio e recebendo o dióxido de carbono, conduzindo o sangue de volta para
o lado direito do coração, através das veias cava superior e inferior.
A segunda ocorre quando os alimentos são digeridos e seus nutrientes entram no san-
gue, que é responsável pela entrega dos mesmos ao organismo para a restauração e criação
de células. Outra forma é quando as células estão sendo atacadas por ant́ıgenos, então o
sistema imunológico entra em ação para identificá-los e eliminá-los do corpo. Finalmente,
quando o sangue se extravasa devido a danos nos vasos sangúıneos, ele também contribui
para a reparação dos vasos danificados.
Estes processos são posśıveis, devido à composição do sangue, que é um tecido ĺıquido
que tem duas fases, um ĺıquido formado pelo plasma (55 % do sangue), tem um aspecto
amarelado constitúıdo principalmente por sais minerais e água, também tem protéınas
como as globulinas, albumina e o fibrinogênio, este último é responsável pela coagulação
do sangue, e de hormônios que controlam processos tais como o uso de alimentos e cres-
cimento.
Os reśıduos produzidos pelas células chegam ao plasma, reśıduos que são lançados nos
rins para ser descartados. Os rins também regulam o ńıvel de sal e água no organismo e
o f́ıgado remove produtos qúımicos que são prejudiciais para o corpo.
A fase sólida (composta por 45 % do sangue) contém as células sangúıneas compostas
por plaquetas, leucócitos e eritrócitos. As plaquetas tem forma irregular, e possuem
diâmetros entre 2 µm e 3 µm, a concentração no sangue varia entre 1,5 x 104 e 5 x 104
por µL [55]. Sua vida média é de 10 dias aproximadamente.
As plaquetas tem a função de evitar a perda de sangue devido a algum dano nas
artérias, veias ou capilares. Elas viajam livres pela corrente sangúınea e aderem-se às
8
paredes do vaso sangúıneo afetado formando parte dele. Com um grande número de
plaquetas forma-se um tampão, produzindo assim um inchaço na área afetada, evitando
perda do sangue. O inchaço desaparece quando o tecido está completamente recuperado.
As células brancas do sangue ou leucócitos, são células nucleadas que são produzidos
pela medula óssea e no sistema linfático. A concentração de leucócitos no sangue situa-se
entre 4 x 103 e 12 x 103 por µL [55], estes têm uma forma esférica de diâmetro entre 10
µm e 15 µm. Sua vida média é do menos de 1 dia.
Eles são também as mais variadas células sangúıneas (são compostos de basófilos,
neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos), são responsáveis pela detecção e eliminação
de organismos invasores, tais como fungos, infecções parasitárias e bacterianas localizados
em qualquer parte do corpo. Eles são capazes de penetrar as paredes dos vasos sangúıneos
para levar a cabo suas funções.
Um mecanismo de eliminação de ant́ıgenos utilizado é a fagocitose pelos neutrófilos
e monócitos, também é o mecanismo utilizado para destruir os glóbulos vermelhos que
perdem sua flexibilidade, a fagocitose acontece no baço, na médula óssea e no f́ıgado. Esse
mecanismo é conhecido como hemólise, eritrócitos são fagocitados quando tem ao redor
de 120 dias de vida.
A corrente sangúınea tem principalmente células vermelhas do sangue (eritrócitos ou
hemácias). Elas são as células mais numerosas, seu número está entre 4,1 e 5,7 milhões
por µL para as mulheres e entre 5 e 6,3 milhões por µL para os homens [55], isto significa
que, para cada glóbulo branco temos ao redor de 700 células vermelhas.
2.1.1 Hematopoiese
Devido a vida das células sangúıneas ser curta, o corpo humano deve garantir a produção
cont́ınua de células novas para substituir as que estão velhas ou danificadas controlando
9
ao mesmo tempo sua população. O processo de formação, desenvolvimento e maturação
das células sangúıneas é conhecido como hematopoiese.
A localização dos órgaõs ou tecidos hematopoiéticos formadores de células-tronco he-
matopoiéticas permitem classificar a hematopoiese em três fases. A primeira é a fase
mesoblástica, nesta fase as células hematopoiéticas estão em grupos pequenos estabeleci-
dos no saco vitelino a partir da segunda semana de vida fetal, estes formam eritroblastos
primitivos que maturam em eritrócitos com núcleo.
As células hematopoiéticas alteram gradualmente sua localização para o f́ıgado, assim
começa a fase seguinte, a fase hepática, ao redor do terceiro mês da vida do feto. Nesta
fase, o f́ıgado começa a produção de eritroblastos dando origem a hemácias que não têm
núcleo e ao final desta fase o baço produz eritrócitos. Para o sétimo mês do feto, a
atividade de produção do f́ıgado e baço decai, mas aumenta na médula óssea, esta é a
última fase, a fase medular, que desde esse momento fica encarregada de fornecer células
sangúıneas ao corpo até a morte do indiv́ıduo.
A médula óssea contém o tecido hematopoiético que é formado pelas células sangúıneas
em maturação e os diferentes tipos de células-tronco hematopoiéticas. Entre elas estão as
células-tronco pluripotentes, recebem este nome porque destas células geram-se todos os
tipos de células hematopoiéticas e sangúıneas.
O ciclo celular das células-tronco pluripotentes tem quatro fases [54], a primeira é uma
fase de crescimento, G1, (G por gap em inglês), onde a célula aumenta de tamanho, é
preparada para produzir as protéınas necessárias para a śıntese de DNA, também sintetiza-
se protéınas e RNA. A seguinte fase é de śıntese, S, onde é duplicado o DNA que está
contido no núcleo da célula assim quando a célula se divide, cada uma das células possui
uma cópia exata do DNA.
Em seguida vem a segunda fase de crescimento G2, onde continua a sintese de protéınas
e RNA. A célula aumenta de tamanho devido ao incremento de organelas e protéınas do
10
citoplasma, esta fase é uma preparação para a fase de divisão celular, fase de mitose, M .
Nesta fase ocorre separação de cromosomos, divisão do núcleo e divisão do citoplasma
[34].
Existem dois tipos de mitose, simétrica onde as duas células filhas conservam o mesmo
potencial biológico da célula original e assimétrica quando só uma filha conserva as pro-
priedades da célula original, a outra filha é uma célula-tronco diferenciada ou multipo-
tente que não pode-se auto renovar, mais da origem aos diferentes linhagems sangúıneos.
Então quando na divisão celular obtem-se cópias idênticas à original se pode falar de
auto-renovação nas células-tronco pluricelulares [55].
Após mitose, dependendo da necessidade do corpo humano, a célula-tronco pluricelular
pode seguir com a fase G1 ou pode sair do ciclo celular ficando em uma fase G0, neste
caso as células não crescem nem dividem-se, ficam inativas por um peŕıodo indefinido de
tempo, até que sejam estimuladas a sair de G0 para continuar com a fase G1 iniciando
um novo ciclo de divisão.
Outra caracteŕıstica das células-tronco é que não podem ser identificadas através de
sua forma, só observando sua capacidade de formar colônias. As células-tronco multipo-
tentes são de duas classes, a classe linfóide e a classe mielóide, elas geram células-tronco
unipotentes para cada tipo de célula sangúınea. A classe linfóide forma os linfócitos T
e B e a classe mielóide forma plaquetas, eritrócitos e alguns tipos de leucocitos, como
neutrófilos, basófilos, eosinófilos e monócitos [55].
A formação espećıfica de eritrócitos, ou seja, a eritropoiese, veja Figura 2.1, começacom a formação da célula-tronco unipotente que é chamada a unidade formadora de
colônias, BFU-E, que logo produz a célula-tronco unipotente CFU-E, sendo a última
célula-tronco do processo que origina o primeiro eritroblasto chamado proeritroblasto
com diâmetros entre 16-20 µm [21], e possui um grande núcleo que ocupa quase todo o
interior desta. Por mitose a célula passa a ser um eritroblasto basófilo, que é menor do
11
Figura 2.1: Eritropoiese (Hematopoiese de eritrócitos). A partir das células-tronco BFU-E
e CFU-E se origina o proeritroblasto (1) que tem um grande núcleo que representa quase
todo o volume da célula. Por mitose o proeritroblasto muda em eritroblasto basófilo (2),
logo a eritroblasto policromatófilo (3) e depois a normoblasto (4), como se observam estas
fases no quadro branco. Nestas fases o proeritroblasto apresenta diminuição de volume do
núcleo e da célula, mudando ao mesmo tempo sua cor a rosa devido ao ińıcio da sintese
da hemoglobina. Depois do quarto dia, o normoblasto já não tem núcleo (5) e adquire a
cor avermelhada e logo o reticulócito (6) fica na médula óssea 48 horas para depois sair
à corrente sangúınea e acabar o processo de maturação para finalmente criar um novo
eritrócito (7). Modificado de [42].
que o proeritroblasto, e seu núcleo nesta fase continua diminuindo de tamanho.
Novamente por mitose as células maturam à fase de eritroblasto policromatófilo. Nesta
fase começa a acumulação de ferro para a formação da hemoglobina. Logo esta célula por
mitose muda a normoblasto, que tem uma cor rosa devido à hemoglobina que contém. O
normoblasto possui um pequeno núcleo localizado no centro da célula, ainda menor do
que na fase anterior, logo o núcleo é expulso, formando-se assim o reticulócito [21].
O reticulócito possui algumas mitocôndrias e ribossomos para terminar de sintetizar a
hemoglobina, fazendo isto, os reticulócitos tardam dois dias na médula óssea e logo vão à
corrente sangúınea. Os reticulócitos são 1% das hemácias do corpo humano. Depois de um
dia indo por todo o corpo, perdem por completo os ribossomos e mitocôndrias, passando
à última fase, eritrócitos maduros, completando assim todo o processo de maturação em
7 dias.
12
2.2 Os eritrócitos
Os eritrócitos também chamados hemácias são células em forma de disco bicôncavo com
diâmetro que pode variar entre 6 µm e 8 µm e uma espessura de 2 µm a 3 µm, como está
representado na Figura 2.2. Essas células não têm organelas, sua cor vermelha é devido
à presença da hemoglobina, que fica mais intensa quando têm oxigênio. A hemácia tem
um volume de 90 fL (1 fL = 10−15L) e uma área superficial de 136 µm2 [35], [36].
Figura 2.2: Dimensões dos eritrócitos. a) Seção superior b) Seção transversal. Modificado
de [35].
A principal função dos eritrócitos é transportar oxigênio dos pulmões aos tecidos e
dióxido de carbono dos tecidos para os pulmões circulando por veias, artérias e capilares,
que em alguns casos têm um diâmetro interno de 3 µm.
Além de realizarem esse intercâmbio de gases, também têm que manter um meio
interno para proteger a hemoglobina de sua oxidação, em um potencial hidrogeniônico
(pH) próximo a 7,4 e equilibrar sua concentração para manter um meio isotônico. Os
eritrócitos mudam de forma por meio de grandes deformações para passar através de
capilares muito finos e o mais interessante é que depois de atravessar os pequenos capilares
voltam a sua forma original.
Para suportar as tensões, o eritrócito conta com uma estrutura composta pela mem-
13
brana celular, o citosol que contém água, ı́ons, enzimas e hemoglobina que representa 33%
do seu peso total. Além disso, um eritrócito resiste à turbulência das válvulas card́ıacas
e quando entram em contato com outras células vermelhas não se aderem entre si.
Figura 2.3: Tipos de hemácias devido à mudança de concentração da amostra. As setas
indicam a direção do fluido para cada caso. a) A hemácia conserva sua forma de disco
quando é posta em PBS 1,0x/BSA 1mg/1mL, devido a que forma-se um meio isotônico
a quantidade de fluido que entra é a mesma que sai da hemácia. b) A hemácia diminui
seu volume quando é colocada em PBS 1,5x/BSA 1mg/1mL, devido a que forma-se um
meio hipertônico e a concentração salina é maior fora da hemácia, os fluidos da hemácia
delocam-se fora da célula. c) A hemácia aumenta seu volume quando é colocada em PBS
0,5x/BSA 1mg/1mL, devido a que a concentração salina dentro da hemácia é maior do
que o meio, formando assim um meio hipotônico, o fluido deloca-se de dentro para fora
da célula podendo provocar o estouro da mesma. Modificado de [13].
A forma de disco bicôncavo, ou seja, de discocito, é mantida se o eritrócito está em
um meio isotônico, isto é, meio que possui a mesma concentração salina que o interior da
célula. Se as condições do ambiente são alteradas, duas outras formas são obtidas para
a hemácia, as quais são equinócito ou hemácia crenada que é caracterizada por uma ou
mais protuberâncias exteriores ou esṕıculas. As hemácias crenadas são formadas usando
um meio com substâncias catiônicas anfipáticas, um meio com baixo pH, um meio de
baixa concentração salina ou por depleção de colesterol da membrana [23].
A segunda é o estomatócito ou hemácia turgida. Nesta situação as hemácias podem
14
exibir invaginações em forma de taça. As hemácias turguidas são formadas usando um
meio com substâncias aniônicas anfipáticas, um meio com alto pH, um meio de alta
concentração salina ou por adição de colesterol na membrana [23].
Para esta dissertação estudamos as hemácias mudando a concentração salina com
tampão fosfato salino (PBS) e albumina do soro bovino (BSA) para preservar a composiçaõ
qúımica das células e criar as três formas de hemácias, apresentadas na Figura 2.3. Este
processo é posśıvel pelo fenômeno f́ısico da osmose, devido ao fato da água difunde-se
pela membrana celular, passando do meio com menor concentração salina a outro com
maior concentração salina, com a finalidade de igualar a concentração salina e a pressão
osmótica em ambos meios. A hemácia é dita normal, é aquele que conserva sua forma de
disco bicôncavo quando se usa PBS 1,0x/BSA 1mg/mL, é crenada quando se usa PBS
1,5x/BSA 1mg/mL e é turgida quando se usa PBS 0,5x/BSA 1mg/mL.
2.3 Estrutura da membrana celular
A membrana celular ou membrana plasmática é uma estrutura que separa o interior
da célula do ambiente externo, permitindo de forma selectiva a passagem de compostos
moleculares para dentro e fora da mesma.
A membrana plasmática é constitúıda por uma bicamada liṕıdica de 5 nm de es-
pessura, que representa aproximadamente 50% de sua massa, o peso restante é quase
todo em protéınas [1]. Segundo o modelo do mosaico fluido, proposto por Nicholson
e Singer, mostrado na Figura 2.4, as protéınas e os liṕıdios estão dispersos na mem-
brana plasmática e encaixam seus domı́nios hidrofóbicos com as regiões hidrofóbicas dos
fosfoliṕıdios. As moléculas proteicas ajudam a membrana no transporte de moléculas
espećıficas através dela. Também ligam o citoesqueleto com a membrana plasmática e
recebem sinais qúımicos, que são transformados em respostas fisiológicas.
A bicamada liṕıdica possui um grande número de uma unidade estrutural chamada
15
Figura 2.4: Membrana celular de uma célula eucariótica animal. Segundo o modelo
do mosaico fluido, a membrana celular como bicamada liṕıdica, possui carboidratos na
camada superior e protéınas distribúıdas assimetricamente. No interior da membrana
contém as caudas dos fosfoliṕıdios e protéınas integrais. As cabeças dos fosfoliṕıdios estão
no exterior da membrana (cinza) e no interior as caudas (amarelo). Retirado de [13].
fosfoliṕıdio, representada na Figura 2.5, por uma pequena esferae uma cauda dupla. Os
fosfoliṕıdios são moléculas anfipáticas, isto é, eles têm uma cabeça hidróf́ılica ou polar,
isto indica que têm atração pela água e duas caudas hidrocarbonadas hidrofóbicas ou
apolares, ou seja, que têm repulsão pela água. As duas caudas são ácidos graxos, uma
é insaturada porque tem uma ou mais ligações duplas cis e a outra insaturada porque
não possui essa ligação. Seu comprimento varia dependendo da quantidade de átomos de
carbonos que possua, geralmente tem de 14 a 24 átomos [1].
Dessa forma quando estas moléculas são dissolvidas em água, suas partes hidrofóbicas
tendem a estar associadas para evitar o contato com o solvente, o que resulta na estrutura
em forma de bicamadas. As cabeças dos fosfoliṕıdios ficam na parte exterior da membrana
plasmática e as caudas formam a parte interna da bicamada.
16
O modelo do mosaico fluido também considera que a bicamada liṕıdica tem o com-
portamento de um fluido no qual os fosfoliṕıdios podem-se deslocar por difusão lateral,
mudando de lugar com seu vizinho mais próximo na mesma camada. Também podem
girar tendo como eixo de rotação a cauda mais longa e podem mudar de camada por um
fenômeno chamado flip-flop.
A fluidez da membrana é determinada pela difusão lateral, propriedade que muda
pelas diferenças de comprimento das cadeias de ácidos graxos, porque quanto mais curtas
tem menor superf́ıcie para formar ligações de Van Der Waals entre elas, em comparação
com as caudas longas.
Outro fator muito importante na fluidez da membrana é a saturação dos ácidos graxos,
porque as caudas insaturadas tem ligações menos estáveis do que as caudas saturadas,
por isto, os ácidos graxos insaturados ocupam mais espaço, fazendo que os fosfoĺıpidios
não estejam tão empacotados comparados com caudas saturadas.
As membranas celulares eucarióticas possuem quantidades altas de colesterol reforçando
a permeabilidade da bicamada liṕıdica. Ele encontra-se inserido na bicamada colocando
sua cabeça polar formada de grupos de hidroxilas com as cabeças dos fosfoliṕıdios e os
anéis de esteróides que formam o colesterol interagem e imobilizam parte das caudas
próximas às cabeças polares dos fosfoliṕıdios, deixando as caudas restantes mais livres.
O colesterol tem diferentes efeitos sobre a fluidez da membrana, quando a hemácia está
a uma temperatura de 37 oC, limita o movimento dos fosfoliṕıdios, assim a membrana
é mais ŕıgida. A baixas temperaturas mantem a fluidez evitando o empacotamento das
caudas de ácidos graxos. Por fim, o colesterol participa ativamente da sinalização celular,
modulando as propriedades f́ısicas da membrana [1].
O aumento da temperatura provoca um aumento na fluidez da membrana, assim os
fosfoliṕıdios ficam com mais liberdade de movimento, devido ao rompimento de ligações
de Van Der Waals existentes entre ácidos graxos saturados, mas na maioria dos casos o
17
Figura 2.5: Molécula de um fosfoliṕıdio. O fosfoliṕıdio é unidade fundamental da mem-
brana plasmática, tem uma cabeca hidrof́ılica (polar) e duas caudas hidrofóbicas (não
polar), uma delas tem uma ligação dupla cis, por isso possui uma cauda dobrada. Figura
modificada de [1].
colesterol evita o aumento de fluidez por esta causa.
As protéınas da membrana celular estão distribúıdas assimetricamente entre as duas
camadas e de acordo com sua localização são classificados três tipos de protéınas. O
primeiro tipo são as protéınas integrais [21], recebem este nome porque só é possivel
extrair a protéına usando métodos que causem dano à membrana. Elas são moléculas
anfipáticas, penetrando a membrana completamente e mantém contato com os meios
extracelular e intracelular ao mesmo tempo. Suas partes hidrófobicas estendem-se na
bicamada liṕıdica sem carga e fora da bicamada estão as partes hidrof́ılicas com carga.
As protéınas integrais estão ancoradas na membrana celular com os aminoácidos da
parte hidrofóbica que interagem com os ácidos graxos dos fosfoliṕıdios. Estes aminoácidos
18
se sobressaem em um ou em ambos os lados da bicamada, formando um canal aquoso.
Estes domı́nios hidrof́ılicos são as partes de uma protéına integral que podem interagir
com sustâncias hidrosolúveis na superf́ıcie da membrana ou dentro do canal. Por isto,
as protéınas integrais representam a base estrutural dos mecanismos de transporte es-
pećıficos e receptores que têm relação com a membrana. O segundo tipo são as protéınas
periféricas, são moléculas hidrof́ılicas localizadas fora da bicamada. São protéınas unidas
às cabeças dos fosfoliṕıdios ou a outras protéınas de membrana mediante ligações fracas
não covalentes [21].
Por fim, as protéınas unidas por liṕıdios estão localizadas fora da membrana biliṕıdica,
só que neste caso tem ligações covalentes com liṕıdios da bicamada, por exemplo, um
oligossacaŕıdeo. Este, por sua vez, está unido a uma molécula de glicofosfatidilinositol
integrada á camada externa, esta molécula funciona como uma âncora. Outras protéınas
da membrana estão ligadas mediante cadeias de hidrocarbonetos integradas á camada
interna da bicamada liṕıdica [21].
2.3.1 Membrana celular de eritrócitos
Devido ás hemácias não possuirem organelas nem núcleo, mas terem forma de disco
bicôncavo, elas são o tipo de célula mais deformável do corpo humano. Considera-se a
hemácia como modelo primário para estudar a membrana celular tendo como objetivo
comprender o comportamento de células mais complexas. A membrana celular de uma
hemácia é formada por uma bicamada liṕıdica, o citoesqueleto e protéınas integrais só
que tem uma composição e distribução de protéınas diferente de qualquer outra célula
animal.
A bicamada liṕıdica possui em seu interior fosfoliṕıdios, protéınas integrais e colesterol.
Segundo o modelo do mosaico fluido a bicamada comporta-se como um fluido, por esta
razão a bicamada liṕıdica confere ás hemácias as propriedades viscosas.
19
O citoesqueleto das hemácias é baseado na espectrina, que lhe fornece estabilidade
e a capacidade de deformação, que lhe permite resistir a tensões e grandes deformações
quando passa através dos capilares estreitos. Por esta razão o citoesqueleto confere às
hemácias suas propriedades mecânicas. Além disso, o citoesqueleto restringe a mobili-
dade lateral das protéınas integrais, para obter uma distribução homogênea das mesmas,
evitando regiões sem protéınas, que dessa forma poderiam ser aderidas a outras células
com as quais a hemácia tem contato.
Figura 2.6: a) Esquema da membrana celular e citoesqueleto de eritrócitos com a dis-
tribução das protéınas. b) A esfera vermelha, A, representa o filamento curto de actina
que tem contato com os extremos da cadeia de espectrina, representada com esferas ver-
des. As esferas cinzas, B, são unidades da cadeia de espectrina. Figura modificada de
[39].
Uma das principais protéınas dos eritrócitos é a espectrina, que é a protéına periférica
mais abundante do citoesqueleto, ela é responsável pela forma de disco bicôncavo da
hemácia e sua integridade estrutural, assim como de regular a mobilidade lateral das
protéınas integrais na membrana celular [48]. A espectrina está presente com 2,5 x 105
cópias por célula e constitui 25% da massa total das protéınas associadas à membrana [1].
20
É um heterod́ımero longo, flex́ıvel e fibrilar constitúıdo por duas cadeias polipept́ıdicas
α e β com peso molecular de 240 e 220 kDa, respectivamente (1 kDa = 1,66 x 10−24
kg). Os heterod́ımeros estão auto-associados em suas cabeças, formando tetrâmeros de
200 nm de comprimento.
As caudas dos tetrâmeros são ligadas a filamentos curtos de 12 moléculas de actina,
cada molécula desta protéına tem um peso molecular de 33kDa. A cadeia de actina está
associada a outras proteinas do citoesqueleto, como aproteina 4.1, aducina e tropomio-
sina formando assim um complexo juncional, mostrado na Figura 2.6a). Este complexo
fortalece a ligação da actina com a espectrina [48]. Quando unem-se todos os comple-
xos juncionais, a rede de espectrina possui forma triangular caracteŕıstica nas hemácias,
veja a Figura 2.6b). O resultado deste conjunto de protéınas é uma rede deformável que
estende-se pela superf́ıcie interior da membrana celular, como se observa na Figura 2.6a).
A protéına que é a responsável por manter unido o citoesqueleto com a membrana da
célula é a protéına integral conhecida como anquirina, esta protéına tem peso molecular de
434 kDa e está representada em um número de 105 cópias por célula. Estas estão ligadas
à subunidade β da espectrina e ao domı́nio citoplasmático da protéına transmembranar
banda 3. A anquirina liga algumas moléculas banda 3 com a espectrina, ligando a rede de
espectrina à membrana, também reduz significativamente a taxa de difusão das moléculas
banda 3 na bicamada liṕıdica.
O citoesqueleto de espectrina também junta-se com a bicamada liṕıdica através de
outra protéına dependente da protéına 4.1. A protéına 4.1 possui peso molecular de 97
kDa e está presente em número de 2 x 105 cópias por célula. Essa protéına que se liga à
espectrina e à actina, também se liga ao domı́nio citoplasmático da banda 3 e à glicoforina,
uma protéına transmembranar que é numerosa nos eritrócitos. As glicoforinas possuem
receptores de membrana e ant́ıgenos que participam do reconhecimento entre células na
21
extremidade externa e ajudam na estabilização do citoesqueleto através de ligações com
a protéına 4.1 [48].
A glicoforina é uma glicoprotéına transmembranar de passo único, ou seja, que atra-
vessa a membrana só uma vez. Ela possui a maior parte da sua massa na superf́ıcie
externa da membrana, onde está localizada sua cauda amino terminal hidrófilica. Nesta
região da protéına estão ligados a grande maioria dos hidratos de carbono, representando
60% da massa total da molécula.
A banda 3 é considerada a principal protéına integral da membrana e seu peso mole-
cular é de 102 kDa. Representa de 25% a 30% de todas as protéınas da membrana e tem
em torno de 106 cópias por hemácia. A protéına banda 3, é uma protéına transmembra-
nar mas atravessa a membrana celular várias vezes, aparentemente a protéına atravessa a
membrana 14 vezes [1]. Uma hemácia tem um milhão de cadeias polipept́ıdicas banda 3,
que formam d́ımeros na membrana. A banda 3 é fundamental para ajudar os eritrócitos
a transportar dióxido de carbono CO2 desde os tecidos até os pulmões, regulando assim
também o transporte de ânions de bicarbonato HCO−3 ou cloreto Cl
− entre o interior e
o exterior da célula. Além disso, regula o metabolismo da glicose, mantém a morfologia
eritrocitária e remove células que começam a envelhecer.
Quando a membrana celular da hemácia é deformada, o citoesqueleto sofre um reor-
denamento em seus componentes devido a que as moléculas de espectrina são capazes de
dobrar-se e desdobrar-se. O grau da deformação da célula é determinado pelas associações
moleculares existentes entre o citoesqueleto e a membrana celular [45]. Se a membrana
e o citoesqueleto possuem um grande número de ligações entre si, então, a hemácia terá
um sistema membrana-citoesqueleto mais compacto, em consequência as moléculas de es-
pectrina perdem a capacidade de ordenamento estrutural, indicando que a hemácia perde
sua flexibilidade.
Em conclusão, a vida de uma hemácia e sua deformabilidade dependem das carac-
22
teŕısticas estruturais da bicamada liṕıdica, que estão relacionadas com a geometria do
citoesqueleto e as ligações existentes no sistema membrana-citoesqueleto.
2.3.2 Eritrócitos e Malária
A malária é uma doença de áreas tropicais que é produzida por um parasita protozoário
da famı́lia dos Plasmodium. Diversas espécies causam a malária em seres humanos como
Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, as
três primeiras têm ampla incidência no continente americano, a quarta está presente
em regiões restritas do continente africano. Os principais sintomas são dor de cabeça,
dor nas articulações, calafrios, sudorese, vômitos, ciclos de febre intensa que duram de
48 horas a 72 horas, febres que podem chegar a 41 oC. Se a doença não for tratada,
ela pode se desenvolver causando anemia, convulsões e a morte. No caso da malária
causada pelo Plasmodium falciparum ela apresenta a particularidade de afetar o corpo
humano produzindo insuficiência renal aguda, edema pulmonar agudo e hipoglicemia. Na
natureza a malária propaga-se em dois tipos de hospedeiros, mosquitos que são hospedeiros
definitivos e o homem que é intermediário.
O ciclo biológico da malária se divide no ciclo exo-eritrocitário, ciclo eritrocitário e ciclo
esporongônico, como observa-se na Figura 2.7. O ciclo exo-eritrocitário começa quando
a fêmea do mosquito anofeles infectado de malária suga o sangue de um ser humano.
Enquanto ela se alimenta, esporozóıtos saem das suas glândulas salivares, entram na
corrente sangúınea e invadem as células do f́ıgado. A invasão é tão rápida que ao redor de
30 minutos depois da picada do mosquito, a corrente sangúınea não tem esporozóıtos [20].
Um esporozóıto é a primeira fase do parasita, nesta fase ele infecta novos hospedeiros.
Os esporozóıtos são formados pela divisão múltipla de um zigoto e cada fragmento deste
gera um esporozóıto.
Nas duas semanas seguintes, os esporozóıtos iniciam o ciclo exo-eritrocitário no f́ıgado,
23
Figura 2.7: Ciclo biológico da malária. Retirada de [20].
eles invadem as células hepáticas, dentro delas sofrem multiplicação assexuada conhecida
como esquizogonia. Durante esta multiplicação, o núcleo divide-se várias vezes e cada
parte quando a célula estoura, obtém um fragmento do citoplasma. As células-mães
denominam-se esquizontes e as células-filhas, merozóıtos.
Esta fase diferencia o Plasmodium falciparum e Plasmodium malariae do Plasmodium
vivax e Plasmodium ovale. Para as quatro espécies é observada a multiplicação assexuada,
mas no caso do Plasmodium vivax e do Plasmodium ovale os esporozóıtos podêm passar
por uma fase de espera antes de iniciar a multiplicação assexuada. Esta fase é conhecida
como hipnozóıto e pode permanecer meses antes de começar a divisão assexuada.
Após o estouro das células hepáticas quando os esquizontes atingem sua maturidade,
24
os merozóıtos entram na corrente sangúınea, invadindo os eritrócitos, iniciando assim o
ciclo eritrocitário. Considera-se que a protéına banda 3 é a receptora para o Plasmodium
falciparum [32]. Estando na hemácia, os merozóıtos passam por mais uma etapa de
multiplicação produzindo de 12 a 16 merozóıtos por esquizonte. Nestas etapas o merozóıto
se torna trofozóıto em forma de anel, depois o anel divide-se formando células esquizontes
que compartilham um mesmo saco. Um trofozóıto é a fase vegetativa do parasita que
se alimenta das protéınas contidas no eritrócito e o processo de alimentação danifica
os eritrócitos. Por fim, os esquizontes separam-se, rompendo os eritrócitos, para sair e
infectar novas células [48].
A duração deste estágio eritrocitário depende da espécie do parasita, sendo de 48 horas
para Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, e Plasmodium ovale e de 72 horas para
Plasmodium malariae [20]. As febres e os calafrios, estão relacionados com a ruptura sin-
cronizada dos eritrócitos infectados. No caso de Plasmodium falciparum ocorre sequestro
de eritrócitos, isto é, a partir da maturação do trofozóıto, o eritrócito gera substâncias na
membrana celular, moléculas de adesão que não são produzidos em condições saudáveis,
fazem com que as hemácias fiquem