Suellen-Gomes-Tese

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
INSTITUTO DE QUÍMICA 
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA 
 
 
 
 
Caracterização química dos compostos bioativos e 
obtenção de micropartículas a partir da torta da 
prensagem da Castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) 
 
Suellen Gomes Moreira 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2015 
 
 
 
 
 
 
 
Caracterização química dos compostos bioativos e 
obtenção de micropartículas a partir da torta da 
prensagem da Castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) 
Suellen Gomes Moreira 
 
 
 
 
 
 
Orientadores: Alexandre Guedes Torres 
Priscilla Vanessa Finotelli 
Marcelo Henrique Gualberto Pereira 
 
 
Rio de Janeiro 
Fevereiro, 2015. 
 
Tese de Doutorado apresentada ao Programa 
de Pós-graduação em Ciência de Alimentos, 
Instituto de Química, da Universidade Federal 
do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos 
necessários à obtenção do título de Doutor em 
Ciência de Alimentos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
G633 
 Gomes, Suellen Moreira. 
 Caracterização química dos compostos bioativos e obtenção de 
micropartículas a partir da torta da prensagem da Castanha-do-
Brasil (Bertholletia excelsa)/ Suellen Gomes Moreira. Rio de 
Janeiro: UFRJ/IQ, 2015. 
 151 f.:il. 
 
 
 Orientadores: Alexandre Guedes Torres, Priscilla Vanessa 
 Finotelli e Marcelo Henrique Gualberto Pereira. 
 
 Tese (Doutorado em Ciências) – Universidade Federal do Rio 
de Janeiro. Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação em 
Ciência de Alimentos, 2015. 
 
 
 1. Torta da castanha-do-Brasil. 2. Compostos bioativos. 3. 
Microencapsulação. 4. LC-HRMS. I. Torres, Alexandre Guedes. 
(Orient). II. Finotelli, Priscilla Vanessa. (Orient). III. Pereira, 
Marcelo Henrique Gualberto. (Orient). IV. Universidade Federal do 
Rio de Janeiro. Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação 
em Ciência de Alimentos. V. Título 
CDD: 664.001 
 
 
 
Caracterização química dos compostos bioativos e 
obtenção de micropartículas a partir da torta da 
prensagem da Castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) 
 
Suellen Gomes Moreira 
Orientadores: Alexandre Guedes Torres 
 Priscilla Vanessa Finotelli 
 Marcelo Henrique Gualberto Pereira 
 
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos, 
Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos 
necessários à obtenção do título de Doutor em Ciência de Alimentos. 
Aprovada por: 
 
 
_______________________________________ 
Dr. Alexandre Guedes Torres 
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ 
 
______________________________________ 
Dra. Anna Paola Pierucci 
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ 
 
______________________________________ 
Dra. Mariana Costa Monteiro 
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ 
 
_______________________________________ 
Dra. Jane Mara Block 
Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC 
 
 
______________________________________ 
Dra. Renata Valeriano Tonon 
Embrapa Agroindústria de Alimentos 
 
 
Fevereiro, 2015. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ao meu exemplo de superação minha amada mãe 
Amalia e ao meu amor Vitor Moreira, por serem meu 
alicerce e estarem comigo me fortalecendo com seu 
amor a cada etapa desta longa jornada! 
AGRADECIMENTOS 
À Deus primeiramente por ter me dado essa oportunidade de crescimento pessoal e 
profissional, por me fortalecer nos momentos mais difíceis e me dá sabedoria e discernimento 
para ter realizado essa longa jornada de quatro anos; 
 
À minha mãe Amalia por me apoiar e por mais difícil que tenha sido sempre compreendeu a 
minha ausência me acolhendo sempre com seu amor incondicional; 
 
Ao meu amor Vitor Moreira, pois sem ele acredito que eu não conseguiria passar por tantos 
momentos difíceis ao longo desses anos, obrigada por seu amor, paciência, conselhos e 
compreensão que me ajudaram a chegar até aqui. 
 
À minha família em especial minha avó que me agraciava com sua benção, à minha pequena 
Fernanda, minha afilhada que mesmo sofrendo por eu estar distante me apoiou e me encheu 
do seu carinho sempre. 
 
À minha querida amiga Fabiana (Fabi), minha madrinha, pela sua amizade que nasceu no 
LBNA e que sem dúvida será para sempre! 
 
Aos amigos que o doutorado me deu companheiros de gargalhadas, choros, festas, conselhos 
e troca de experiências na bancada: Fabricio, Nivea, Vanessa Rezende, Karla Leal, Emília, 
Nathalia (Nath), Isabelle Santana (Isa), Genilton (Gê), Andressa e Ellen obrigada por fazerem 
os dias no laboratório terem sido tão divertidos e proveitosos. 
 
Aos mais novos que chegaram ao LBNA Kim, Lais, Vanessa Di Sarli, Aline, Isabelle, 
Tamirys, André obrigada pela troca de experiência e pela amizade. 
 
A Vanessa Naciuck, Juliana, Mariana e ao Prof. Daniel Perrone pela troca de experiência e 
sugestões, especialmente durante as apresentações dos seminários do LBNA. 
 
À toda família LNBA pelo companherismo e ensinamentos, por fazerem parte dessa etapa tão 
importante. 
Aos amigos que o doutorado me deu durante o desafio de aprender sobre proteômica Rosane, 
Giselle, Noemi e Wilber aprendi muito com vocês! Obrigada por toda a ajuda e carinho em 
me receberem! 
 
Ao meu orientador Alexandre Torres pelos seis anos (mestrado e doutorado) de parceria 
obrigada por toda a paciência, pelas conversas, ensinamentos e conselhos ao longo dessa 
jornada de aprendizado. 
 
À minha co-orientadora Priscilla Finotelli que me apresentou o mundo mágico da 
encapsulação, obrigada por todos os ensinamentos e conselhos. 
 
Ao meu co-orientado Henrique Pereira, obrigada pela oportunidade de trabalhar com você e 
toda a equipe, por me abrir as portas do LBCD (Laboratório Brasileiro de Controle de 
Dopagem). 
 
Ao Vinícius por ter colaborado tanto, compartilhando seu conhecimento e me ajudado 
arduamente na interpretação dos resultados do HRMS, obrigada por toda a paciência e ajuda. 
 
A Julia e ao Rafael, meus secretarios favoritos, obrigada pela amizade pela ajuda sempre que 
precisei. 
Aos parceiros que possibilitaram o desenvolvimento deste estudo Prof. Suely Freitas (Lab de 
Processamento de Matéria Primas Vegetais – EQ/ UFRJ ); Prof. Verônica Calado com o 
tratamento estatístico dos resultados; Prof Anna Paola e a Carol sua técnica pelo uso do 
Spray Dryer, Laboratório de Desenvolvimento de Alimentos para Fins Especiais e 
Educacionais – DAFEE/ INJC-UFRJ); Prof. Marcia Soares pelas análises de proteômica (Lab 
de Microbiologia Molecular e Proteômica - LaMMP –IQ/UFRJ). 
As agência financiadoras FAPERJ, CAPES e CNPq. 
Enfim foram muitas as pessoas que contribuiram para a realização deste trabalho e desta 
conquista, 
A todos muito obrigada! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Lute com determinação, abrace a 
vida com paixão, perca com classe e 
vença com ousadia, porque o mundo 
pertence a quem se atreve e a vida é 
muito bela para ser insignificante.” 
(Charles Chaplin) 
RESUMO 
Gomes, Suellen. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS COMPOSTOS BIOATIVOS E OBTENÇÃO DE 
MICROPARTÍCULAS A PARTIR DA TORTA DA PRENSAGEM DA CASTANHA-DO-BRASIL 
(BERTHOLLETIA EXCELSA). Rio de janeiro, 2015. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos). 
Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro. 
 
O resíduo sólido da obtenção de óleo da castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) por 
prensagem, chamado torta, apresenta alto valor energético e nutricional e compostos 
bioativos. O presente trabalho teve como objetivo obter um extrato de grau alimentício rico 
em compostos bioativos, a partir da torta da castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) e 
determinar a sua composição química e, em seguida, microencapsular por spray-drying o 
melhor extrato e determinar os componentes bioativos,visando futuras aplicações em 
alimentos. As condições de extração dos compostos bioativos da torta de castanha-do-Brasil 
foram otimizadas por planejamento experimental. Considerando fatores estatísticos, 
econômicos e ambientais, as condições mais favoráveis para a extração de compostos 
fenólicos antioxidantes foram as seguintes: etanol:água, 40:60; homogeneização com Ultra-
turrax
®
 por 2,5 min; seguida por extração com agitação orbital por 1 h, a 60 °C. Nessas 
condições, o teor de fenólicos totais, flavonóides totais e a capacidade antioxidante no extrato 
foram (média±DP), respectivamente, 181 ± 12,3 mg EAG/ 100 g; 3,05 ± 0,41 mg de EC/100 
g 520 ± 50,0 mmol Fe2+/100 g (ensaio de FRAP) e 0,399 ± 0,03 mmol ET/100 g (ensaio de 
TEAC). No extrato, foram identificados e quantificados sete compostos fenólicos por CLAE-
DAD. O perfil detalhado dos compostos bioativos no extrato e na torta de castanha-do-Brasil 
foi determinado. A composição de fenólicos foi determinada por Espectrometria de Massa de 
Alta Resolução (EMAR), tocoferóis por CLAE-Fluo, minerais por ICP-OES e ICP-MS e 
proteômica por eletroforese 2D e espectrometria de massas (MALDI-ToF/ToF). A 
identificação dos compostos fenólicos foi confirmada por CLAE-EMAR, em abordagem 
dirigida (target), e sete ácidos fenólicos foram identificados: 2,4- dihidroxibenzóico, gálico, 2, 
hidroxibenzóico, p-cumárico, p-hidroxibenzóico, protocatecuico, sinápinico e cinco 
flavonoides: (+)-catequina, (-) epicatequina, miricetina, quercetina e quercetina-3-β-D-
glucósidio. Além desses fenólicos identificados inequivocamente, trinta outros foram 
tentativamente identificados por abordagem não-dirigida (non-target), com base nos dados de 
massa exata (erro < 5 ppm) e perfil de fragmentação (MS²) dos fragmentos principais, destes 
compostos sugeridos 13 pertencem a classe dos ácidos fenólicos e 17 a classe dos 
flavonoides, incluindo alguns isômeros de posição. Os tocoferóis majoritários foram α e 
tocoferol. Diversos minerais essenciais foram identificados e quantificados na seguinte 
ordem de teores: P>K>Mg>Ca>Zn>Fe>Cu>Mn>Na>Se. O consumo de 1 g da torta contribui 
para 9% da ingestão dietética de referência do selênio. As principais proteínas identificadas 
por análise proteômica da torta de castanha-do-Brasil foram globulina 11S e a albumina 2S. 
Quanto à microencapsulação, esta ocorreu por spray-drying a partir do extrato da torta de 
castanha-do-Brasil e a melhor combinação da mistura dos agentes encapsulantes capsul
®
 e 
inulina foi determinada através das propriedades químicas, físico-químicas e de estabilidade. 
As micropartículas com capsul
®
 e inulina (1:1) apresentaram propriedades mais favoráveis 
para a estabilidade dos fenólicos totais e capacidade antioxidante durante 120 dias de 
armazenamento. Foram identificados nas microcápartículas os mesmos compostos fenólicos 
presentes no extrato da torta de castanha-do-Brasil por CL-EMAR. Todos os homólogos dos 
tocoferóis foram identificados, porém o -tocoferol foi majoritário, e além deste componente 
a micropartícula também apresentou um teor de selênio de 4.95 μg/g de pó. Portanto conclui-
se que a torta da castanha-do-Brasil e seu extrato apresentaram uma composição diversificada 
de bioativos o que favorece a sua aplicação no desenvolvimento de alimentos funcionais, 
como por exemplo, no preparo de micropartículas. 
ABSTRACT 
Gomes, Suellen.: CHEMICAL CARACTERIZATION OF BIOACTIVE COMPOUNDS AND PRODUCTION 
OF MICROCAPSULES FROM PRESSING BRAZIL NUT CAKE (BERTHOLLETIA EXCELSA). Rio de 
janeiro, 2015. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos). Instituto de Química, Universidade 
Federal do Rio de Janeiro. 
The solid by product of Brazil nut (Bertholletia excelsa) cold-pressed oil, the cake, presents 
high energy and nutritional value, and bioactive compounds. In the present work we aimed to 
get a food grade extract rich bioactive compounds from the Brazil nut cake (Bertholletia 
excelsa) and to determine their chemical composition and then microencapsulate by spray-
drying the best extract and determining the bioactive compounds, aiming future applications 
in food. Extraction of bioactive compounds from Brazil nut cake was optimized by 
experimental design. Taking into account statistical, ecconomical and environmental factors, 
the most favourable extraction conditions were as follows: ethanol:water, 40%; 
homogenization with Ultra-turrax
®
 for 2.5 min; followed by extraction in an orbital shaker (1 
hour, 60 °C). At this extraction conditions, total phenolic compounds, total flavonoids and 
antioxidant capacity in the extract were (average±DP), respectivelly, 181 ± 12.3 GAE/100 g; 
3.05 ± 0.41 mg CE/100 g 520 ± 50,0 mmol mmol Fe2+/100 g (FRAP assay) and 0.399 ± 0.03 
mmol TE/100 g (TEAC assay). Seven phenolic compounds were identified and quantified in 
Brazil nut cake extract by HPLC-PDA. The detailed profile of bioactive compounds was 
determined in the extract and in Brazil nut cake. Phenolic compounds were determined by 
high resolution mass spectrometry (HRMS), tocopherols by HPLC-FLUO, minerals by ICP-
OES and ICP-MS and proteomics by 2D electrophoresis and mass spectrometry (MALDI-
ToF/ToF). Twelve phenolic compounds were inequivocally identified in Brazil nut cake by 
LC-HRMS using targeted strategy, follows: gallic acid, p-coumaric acid, 2,4-
dihydroxybenzoic acid, p-hydroxybenzoic acid, protocatechuic acid, sinapic acid, 2- 
hydroxybenzoic acid, (+)-catechin, (-)-epicatechin, myricetin, quercetin and quercetin-3-β-D-
glucoside. Besides these, thirty other phenolic compounds were tentativelly identified by non-
targeted HRMS, based exact mass data (error < 5 ppm) and fragmentation profile (MS²) of 
major fragments. The phenolic compounds tentativelly identified were 13 suggested as 
belonging to the phenolic acids and 17 in flavonoids classes, including positional isomers. 
Major tocopherols were α and tocopherol. Several essential minerals were determined in 
the following order of contents: P>K>Mg>Ca>Zn>Fe>Cu>Mn>Na>Se. The intake of 1 g of 
Brazil nut cake would provide 9% of Recommended Dietary Allowances (RDAs) of Se. The 
major proteins identified in Brazil nut cake by proteomics analysis were 11S globulin and 2S 
albumin. Concerning micro-encapsulation of Brazil nut cake extract by spray drying, the best 
combination was capsul
®
 and inulin in a 1:1 ratio. This wall material combination presented 
high stability of phenolic compounds during storage. The microparticles presented the same 
phenolic compounds present in the Brazil nut cake extract by LC-HRMS analyses. All 
tocopherol homologs were identified in the microcapsules, however -tocopherol was the 
major. Besides tocopherols, microparticles showed 4.95 μg/ g Se. In conclusion, Brazil nut 
cake presented a diversified composition in bioactives, which favors its use in developing 
functinal foods, such as in preparation of microparticles by spray drying as a potential aditive 
to functional foods. 
LISTA DE FIGURAS 
CAPÍTULO 1 
Figura 1 Árvore da castanheira-do-Brasil (A), ouriço (fruto) (B) e as sementes 
(C) que contém a amêndoa da castanha-do-Brasil (parte comestível). 
28 
Figura 2 Estrutura química dos tocoferóis e tocotrienóis. 33 
Figura 3 Biossíntese dos compostos fenólicos (Naczk e Shahidi, 2004). 37 
Figura 4 Estrutura química básica dos ácidos fenólicos: hidroxibenzóico (a) e 
hidroxicinâmico (b) (Angelo e Jorge, 2006). 
38 
Figura 5 Estrutura química básica dos flavonoides (Balasundram et al., 2006). 39 
Figura 6 Esquema representativo do analisador Orbitrap Qexactive (Michalski 
et al., 2011). 
45 
Figura 7 Modelos das principais formas de encapsulação: microcápsula (A) e 
micropartícula(B). 
46 
Figura 8 Estrutura química do Capsul® (amido modificado pela
 
adição do 
componente octenilsuccinato na molécula). 
48 
Figura 9 Estrutura química da inulina (Barclay et al., 2010). 49 
CAPÍTULO2 
 
 
Figure 1 Response surface plots of total phenolic compounds in Brazil nut 
cake, associated with Ultra-turrax® homogenization time (right axis) 
and with: solvent content in water (A), extraction time (B), or 
extraction temperature (C). 
63 
Figure 2 Response surface plots of antioxidant capacity by FRAP assay in 
Brazil nut cake, associated with extraction temperature (left axis) and 
with: Ultra-turrax® homogenization time (A), or solvent content in 
water (B). 
66 
Figure 3 Representative chromatogram for the analysis of phenolic compounds 
in Brazil nut cake extract, by HPLC-PDA (λ= 280 nm). Gallic acid 
(1), protocatechuic acid (2), (+)-catechin (3), p-hydroxybenzoic acid 
(4), 2,4-dihydroxybenzoic acid (5), p-coumaric acid (6), sinapic acid 
(7). 
68 
 
 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO 3 
Figure 1 MS2 spectra of the phenolic compounds identified in the Brazil nut 
cake extract by LC-HRMS/ESI-Orbitrap in full scan negative mode. 
Gallic acid (1), protocatechuic acid (2), (+)-catechin (3), p-
hydroxybenzoic acid (4), (−)-Epicatechin (5), 2,4-dihydroxybenzoic 
acid (6). 
90 
Figure 2 MS2 spectra of the phenolic compounds identified in Brazil nut cake 
extract by LC-HRMS/ESI-Orbitrap in full scan negative mode. p-
coumaric acid (7), sinapic acid (8), Quercetin 3-β-D-glucoside (9), 2-
hydroxybenzoic acid (10), Myricetin (11) and Quercetin (12). 
91 
Figure 3 Representative total ion current (TIC) chromatogram, obtained in full 
scan MS mode of the phenolic compounds from Brazil nut cake 
extract by LC-HRMS. 
93 
Figure 4 Representative cromatogram of tocopherols from Brazil nut cake: α, 
β,  e δ-tocoferol by HPLC-Fluorescence (Exc 290 e Emis. 330 nm). 
98 
Figure 5 2D SDS-PAGE electrophoresis gel (IPG strip of pH 3−11) image 
revealed with Coomassie blue, representative sample of Brazil nut 
cake. Gel orientation: horizontal, isoelectric focusing (pI); vertical, 
PAGE (molecular weight kDa). Identical numbers refer to the same 
spots identificaded by MALDI ToF-ToF. The Molecular weight 
standards (kDa) of the protein are shown at the left of the images. 
103 
CAPÍTULO 4 
 
 
Figura 1 Compostos fenólicos totais nas micropartículas dos extratos da torta 
de castanha-do-Brasil, produzidas com diferentes proporções da 
mistura de material de parede (Capsul
®
 e Inulina). *Resultados 
expressos como média ± desvio padrão, n=3. Letras diferentes 
indicam diferença significativa entre as micropartículas (p< 0.05). 
119 
Figura 2 Capacidade antioxidante pelos ensaios de FRAP e TEAC nas 
micropartículas dos extratos da torta de castanha-do-Brasil, 
produzidas com diferentes proporções da mistura de material de 
parede (Capsul
®
 e Inulina). *Resultados expressos como média ± 
desvio padrão, n=3. Letras diferentes indicam diferença significativa 
entre as micropartículas (p< 0.05). 
121 
Figura 3 Morfologia das micropartículas do extrato de torta de castanha-do-
Brasil com diferentes proporções de material de parede. (A) 
Ativo:Capsul®:Inulina (1:1:2); (B) Ativo:Capsul®:Inulina (1:2:1) e 
(C) Ativo:Capsul®:Inulina (1:1:1). Com aumentos de 2000 e 5000 
vezes. 
 
 
124 
Figura 4 Percentual de perdas dos compostos fenólicos (CFT) (A) e 
capacidade antioxidante total (CAT) pelos ensaios de FRAP (B) e 
TEAC (C), devido à influência das diferentes proporções dos 
materiais de parede nas micropartículas do extrato de torta de 
castanha-do-Brasil durante o armazenamento por 120 dias. 
128 
Figura 5 Correlação entre o conteúdo de fenólicos totais e a capacidade 
antioxidante pelos ensaios de FRAP (azul) e TEAC (vermelho) das 
micropartículas (1:1:1; 1:2:1; 1:1:2, ativo:Capsul:inulina, 
respectivamente) durante o armazenamento por 120 dias. 
129 
Figura 6 Cromatograma representativo da análise de tocoferóis nas 
micropartículas do extrato de torta de castanha-do-Brasil por HPLC-
FL (exc. 290, em. 330 nm). 
132 
Figura 7 Comparação dos tocoferóis nas micropartículas e na torta de 
castanha-do-Brasil por HPLC-FL (exc. 290, em. 330 nm) em base 
seca. 
133 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
CAPÍTULO 1 
 
 
Tabela 1 Conteúdo de vitamina E de algumas oleaginosas (USDA, 2004). 
 
34 
CAPÍTULO 2 
 
 
Table 1 
 
Full factorial design with center points to optimize extraction of 
phenolic compounds from Brazilnut cake. 
57 
Table 2 
 
Calibration curves* of phenolic compounds from Brazil nut cake 
extract analyzed by HPLC-DAD. 60 
 
 60 
Table 3 
 
Experimental design for optimized extraction of total phenolic 
compounds from Brazil nut cake with acetone:water or 
ethanol:water. 
 
61 
Table 4 Experimental design for optimized antioxidant capacity of 
Brazil nut cake extracts, obtained with ethanol:water. 
 
64 
Table 5 Factors’ effects on antioxidant capacity (TEAC and FRAP assays) in 
Brazil nut cake extract. 
66 
 
Table 6 
 
Phenolic compounds in Brazil nut cake extract by HPLC-PDA 
analysis (λ=280 nm). 
 
69 
 
CAPÍTULO 3 
Table 1 Standard phenolic compounds analyzed by LC-HRMS 78 
Table 2 
 
Proximate composition of whole Brazil nut and Brazil nut cake 
(g/100 g). 
84 
Table 3 Antioxidant components from Brazil nut cake extract by 
spectrophotometric methods. 
86 
Table 4 Phenolic compounds identified in Brazil nut cake extract by targeted 
LC-HRMS analysis, based on retention time and exact mass error (< 
5ppm). 
89 
Table 5 Phenolic compounds tentatively identified in the Brazil nut cake 
extract by LC-HRMS / ESI-Orbitrap analysis. 
 
94 
Table 6 Tocopherols contents (mg/100 g) from Brazil nut cake by HPLC-
Fluo. 
98 
Table 7 Minerals composition in Brazil nut cake by ICP-MS and ICP-OES 
analyzed. 
 
100 
Table 8 Analysis protein from the Brazil nut cake by MALDI – ToF-ToF 104 
 
CAPÍTULO 4 
 
 
Tabela 1 Combinação de diferentes proporções do material encapsulante 
(Capsul® e inulina) para obtenção das micropartículas, com base no 
teor de sólidos totais do extrato. 
 
112 
Tabela 2 Recuperação do processo de atomização e retenção dos fenólicos 
totais das diferentes micropartículas do extrato de torta de castanha-
do-Brasil. 
 
120 
Tabela 3 Propriedades físicas e físico-químicas das micropartículas do extrato 
da torta de castanha-do-Brasil usando diferentes proporções de 
material de parede. 
 
122 
Tabela 4 Influência da proporção de material de parede na estabilidade das 
micropartículas de extrato da torta de castanha-do-Brasil: compostos 
fenólicos totais e capacidade antioxidante pelos ensaios de FRAP e 
TEAC 
 
126 
Tabela 5 Identificação dos compostos fenólicos na micropartícula de extrato 
da torta de castanha-do-Brasil por CL-EMAR. 
131 
 
 
SUMÁRIO 
 
1. INTRODUÇÃO GERAL 22 
2. OBJETIVOS 25 
2.1 Objetivos Geral 25 
2.2 Objetivos Específicos 25 
CAPITULO 1 REVISÃO DE LITERATURA 27 
1. A castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) e seus co-produtos 28 
1.1 Composição nutricional e funcional da castanha-do-Brasil e seus 
co-produtos 
30 
2. Compostos bioativos em nozes e castanhas 33 
2.1 Tocoferóis 
 
33 
2.2 Selênio 35 
2.3 Compostos Fenólicos 36 
3. Capacidade antioxidante 41 
4. Espectrometria de Massas de Alta Resolução (CL-EMAR) na 
determinação de compostos fenólicos 
 
43 
5. Encapsulamento 45 
5.1 Agente encapsulante 47 
5.2 Spray Drying 50 
CAPITULO 2 Optimized extraction of polyphenolic antioxidant compounds 
from Brazil nut (Bertholletia excelsa) cake, and identification of 
polyphenols 
 
52 
1. INTRODUCTION 54 
2. EXPERIMENTAL 55 
2.1 Chemicals 55 
2.2 Samples: Brazil nuts and preparation of Brazil nut cake 56 
2.3 Experimental design 56 
2.4 Extraction of phenolic compounds from Brazil nut cake 57 
2.5 Determination of Total Phenolic Compounds (TPC) 58 
2.6 Determination of antioxidant activity 64 
2.7 Phenolic compounds profile by HPLC 59 
2.8 Statistical analysis 60 
3. RESULTS AND DISCUSSION 60 
3.1 Total phenolic compounds60 
3.2 Antioxidant capacity 64 
3.3 Phenolic compounds profile in Brazil nut cake extract by HPLC-
PDA 
 
67 
4. CONCLUSIONS 70 
CAPITULO 3 Brazil nut cake is a rich source of phenolic compounds, 
tocopherols, selenium and proteins determined by high resolution 
analytical methods 
71 
1. INTRODUCTION 73 
2. MATERIALS AND METHODS 74 
2.1 Chemical 74 
2.2 2.2 Samples: Brazil nuts and preparation of Brazil nut cake 75 
2.3 Extraction of phenolics compounds from Brazil nut cake 75 
2.3.1 Total Phenolic Compounds 75 
2.3.2 Total flavonoids 76 
2.3.3 Identification of phenolic compounds in Brazil nut cake extract by 
LC-HRMS 
 
76 
2.3.4 Antioxidant Capacity 78 
2.4 Brazil nut cake composition 79 
2.4.1 Proximate composition 79 
2.4.2 Tocopherols in Brazil nut cake by HPLC 79 
2.4.3 Proteomics 80 
2.4.3.1 Extraction and determination of total proteins in Brazil nut cake 80 
2.4.3.2 Protein profile by 2D electrophoresis 80 
2.4.3.3 In-gel digestion and peptides extraction 81 
2.4.3.4. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization and Sequential 
Time-of-Flight (MALDI-ToF/ToF) mass spectrometric analysis 
81 
2.4.4 Determination of metals in Brazil nut cake by ICP-MS and ICP-
OES 
82 
2.7 Statistical Analysis 83 
3 RESULTS AND DISCUSSION 84 
3.1 Proximate composition of Brazil nut cake 84 
3.2 Total phenolic compounds, total flavonoids and antioxidant 
capacity from Brazil nut cake extract by spectrophotometric 
methods 
 
85 
3.3 Detailed characterization of the phenolic compounds in Brazil nut 
cake extract by LC-HRMS 
 
88 
3.3.1 Identification of phenolic compounds in Brazil nut cake extract by 
targeted LC-HRMS 
 
88 
3.3.2 Tentative identification of phenolic compounds in Brazil nut cake 
extract by non-targeted LC-HRMS 
 
92 
3.4 Tocopherol from Brazil nut cake by HPLC 97 
3.5 Minerals composition of the Brazil nut cake by ICP-OES and 
ICP-MS 
 
100 
3.6 Analysis of Proteins from Brazil nut cake by MALDI/ ToF-ToF 102 
4. CONCLUSION 106 
CAPÍTULO 4 Microencapsulação do extrato da torta da Castanha-do-Brasil 
(Bertholletia excelsa) por spray drying 
 
107 
1. INTRODUÇÃO 109 
2. MATERIAL E MÉTODOS 111 
2.1 Amostra 111 
2.2 Obtenção da torta e do extrato da castanha-do-Brasil 111 
2.3 Encapsulação do extrato da torta de castanha-do-Brasil 112 
2.4 Influências das diferentes proporções de encapsulantes na 
composição das micropartículas do extrato da torta de castanha-
do-Brasil 
113 
2.4.1 Rendimento da microencapsulação e retenção de compostos 
fenólicos 
 
113 
2.4.1.1 Análise dos compostos fenólicos 113 
2.4.1.2 Capacidade antioxidante 114 
2.4.2 Caracterização física e físico-química das micropartículas 114 
2.4.2.1 Análise de umidade e atividade de água 114 
2.4.2.2 Morfologia e tamanho das partículas 114 
2.4.3 Estabilidade das micropartículas 115 
2.5 Caracterização dos componentes fenólicos, tocoferóis e selênio 115 
2.5.1 Determinação dos compostos fenólicos por CLAE-DAD e 
CL-EMAR 
 
115 
2.5.2 Tocoferóis por CLAE-Fluorescência nas micropartículas 116 
2.5.3 Determinação de Selênio por ICP-MS 117 
2.6 Análise estatística 118 
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 118 
3.1 Influências do encapsulante nas características químicas, físico-
química e estabilidade das micropartículas do extrato da torta de 
castanha-do-Brasil 
 
118 
3.1.1 Compostos fenólicos total e capacidade antioxidante das 
micropartículas 
 
119 
3.1.2 Caracterização física e físico-química das micropartículas 121 
3.1.3 Influência da proporção de material de parede na estabilidade das 
micropartículas de extrato da torta de castanha-do-Brasil 
 
125 
3.2 Caracterização dos componentes bioativos nas micropartículas do 
extrato de torta de castanha-do-Brasil (1:1:1,ativo; 
Capsul®:inulina): compostos fenólicos, tocoferóis e selênio 
 
130 
4. CONCLUSÕES 134 
 CONSIDERAÇÕES FINAIS 135 
 REFERENCIAS 137 
 
21 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Introdução 
 
22 
 
1. INTRODUÇÃO GERAL 
 
O consumo de nozes e castanhas aumentou na última década, especialmente por sua 
associação na prevenção de doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2 e certos tipos de câncer 
(Fernández-Montero et al, 2014; Vadivel et al, 2012; Kornsteiner et al, 2006; Nishi et al, 
2014). A castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) destaca-se entre as oleaginosas por sua 
composição de nutrientes e compostos bioativos, tais como o selênio, tocoferóis, ácidos 
graxos insaturados, proteínas, aminoácidos, fibras e compostos fenólicos (Yang, 2009). A 
castanheira-do-Brasil é nativa da região amazônica e sua forma de manejo é extrativista. O 
fruto, conhecido como castanha-do-Brasil, possui um papel socioeconômico fundamental, 
pois é um dos principais produtos de exportação da região amazônica (40.357 toneladas por 
ano) (IBGE, 2010; Wadt et al, 2008). 
Além da comercialização da amêndoa integral, a extração do óleo também possui 
aplicações na indústria alimentícia e cosmética. O processo de prensagem a frio é o mais 
utilizado para a obtenção do óleo, e esta extração resulta em um co-produto sólido chamado 
de torta, com elevado valor energético e nutricional. As aplicações mais convencionais da 
torta de castanha-do-Brasil são como constituinte da ração animal, além do enriquecimento de 
grande variedade de alimentos como produtos de panificação, farinhas, snacks, cereais, 
biscoitos, embutidos, sorvetes, chocolates, bebidas, laticínios, entre outros alimentos 
(Menezes e Souza, 2004; Santos et al., 2013). No entanto, estas aplicações não investem 
diretamente no potencial dos componentes bioativos hidrofílicos, tais como os compostos 
fenólicos da torta de castanha-do-Brasil. 
O consumo de alimentos ricos em compostos fenólicos antioxidantes (Fukuda et al, 
2003; Wijeratne et al, 2006) tem sido associado com potenciais benefícios à saúde, 
especialmente quanto à atividade anti-inflamatória, antimutagênica e anticarcinogênica (Chen 
e Blumberg, 2008; Colpo et al, 2014). É possível que esses componentes sejam extraídos da 
torta, levando à formação de extratos com teores de compostos bioativos, tais como fenólicos, 
tocoferóis, proteínas solúveis e selênio (Yang, 2009). No entanto, estudos mais detalhados dos 
componentes bioativos da torta de castanha-do-Brasil são relevantes, como a caracterização 
dos compostos fenólicos por abordagens metabolômicas, e a determinação da composição de 
proteínas por abordagens proteômicas para permitir um conhecimento mais detalhado deste 
co-produdo. O conhecimento da composição bioativa da torta da castanha-do-Brasil 
23 
 
possibilitará a obtenção e aplicação dos extratos como potencial aditivo com bioatividade na 
indústria de alimentos. 
Dentre estas aplicações destaca-se o uso da tecnologia de encapsulamento, que visa 
promover a estabilidade, proporcionar a liberação controlada dos componentes ativos e 
conservar as propriedades fitoquímicas de compostos bioativos (Saenz et al., 2009; Çam et al., 
2014). A aplicação desta tecnologia nos extratos alimentícios concentrados extraídos da torta 
da castanha-do-Brasil é uma alternativa para o reaproveitamento deste resíduo, uma vez que 
pode preservar propriedades químicas dos extratos de castanha-do-Brasil, podendo 
potencializar a bioatividade de seus componentes. Além disso, a encapsulação permite o 
desenvolvimento de um novo produto, o qual poderá ser aplicado como aditivo, contendo os 
compostos bioativos do extrato de castanha-do-Brasil, em uma maior variedade de produtos 
alimentícios. A investigação desses processos, com base no conhecimento químico detalhado 
dos componentes da torta da castanha, pode contribuir para a elaboração de alimentos 
funcionais e com isto agregar valor à castanha-do-Brasil. 
 
ESTRUTURA DA TESE 
 
O desenvolvimento da tese foi dividido em um capitulo de revisão da literatura e três 
capítulos no formato de artigos científicos dos quais dois estão em língua inglesa,de acordo 
com as temáticas investigadas. No primeiro capítulo apresentamos uma breve revisão da 
literatura sobre a castanha-do-Brasil e seus co-produtos. Abordamos os compostos bioativos 
que foram investigados ao longo do estudo e algumas das principais técnicas aplicadas, além 
do processo de microencapsulação e fatores que influenciam na obtenção das micropartículas. 
No segundo capítulo, abordamos a otimização das condições de extração para obtenção 
dos extratos hidroetanólicos contendo os compostos fenólicos da torta de castanha-do-Brasil. 
Trabalhou-se com o planejamento de experimento fatorial completo com pontos centrais para 
avaliar as variáveis independentes (tipo de solvente, tempo de extração, tempo de 
homogeneização, temperatura de extração e proporção do solvente) tendo como variáveis de 
resposta a composição de fenólicos totais e capacidade antioxidante. Este artigo foi submetido 
ao Journal of Science of Food and Agriculture. 
A seguir, o terceiro capítulo foi dedicado à caracterização química detalhada dos 
compostos bioativos no extrato e na torta de castanha-do-Brasil. Devido há escassez de dados 
24 
 
publicados quanto à caracterização e quantificação desses componentes na torta da castanha-
do-Brasil. A maior parte das investigações científicas publicadas a respeito da composição 
química da torta da castanha-do-Brasil bem como da forma in natura estão relacionadas com 
os benefícios gerados pelo consumo do selênio e pouco se tem investigado a respeito de 
outros componentes bioativos presentes na torta. Em nosso estudo foram utilizadas técnicas 
hifenadas como cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas de alta resolução 
(LC-HRMS) para investigar os compostos fenólicos, essa analise foi realizada de dois modos: 
analise qualitativa dirigida (targeted), com o uso de padrões comerciais de compostos 
fenólicos para realizar a identificação e analise qualitativa não-dirigida (non-targeted) onde os 
compostos fenólicos dos quais não obtinhamos padrões comerciais foram tentativamente 
identificados com o uso de uma estratégia de identificação. Foi realizada ainda através do uso 
de técnicas cromatográficas a determinação de tocoferóis (CLAE-FL), selênio (por ICP-MS e 
ICP-OES) e proteínas por proteômica (MALDI-ToF-ToF) na torta da castanha do Brasil. 
Em seguida no quarto capítulo o extrato da torta de castanha-do-Brasil foi 
microencapsulado por spray drying, e a influência de diferentes proporções dos materiais de 
parede (Capsul
® 
e inulina) no conteúdo de fenólicos totais, capacidade antioxidante e 
características física, físico-química e estabilidade das micropartículas foram avaliadas, além 
de caracterizar através de técnicas cromatográficas os compostos bioativos da formulação que 
tenha apresentado maiores teores de compostos fenólicos, capacidade antioxidante e 
estabilidade. 
 
 
25 
 
2. OBJETIVOS 
2.1 Objetivo Geral 
 
Obter um extrato de grau alimentício rico em compostos bioativos, a partir da torta da 
castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) e determinar a sua composição química e, em 
seguida, microencapsular o melhor extrato e determinar os componentes bioativos, visando 
futuras aplicações em alimentos. 
 
2.2 Objetivos Específicos 
 
Capítulo 2: 
 
a) Determinar as melhores condições de extração de compostos fenólicos da torta 
de castanha-do-Brasil, pela aplicação do planejamento experimental investigando os 
fatores: solvente, proporção do solvente: água, tempo de extração, temperatura de 
extração e tempo de homogeneização; para a obtenção de extratos com teores 
relevantes de compostos fenólicos e capacidade antioxidante. 
 
Capítulo 3: 
 
b) Caracterizar os compostos bioativos presentes no extrato da torta da castanha-
do-Brasil, por meio da determinação dos teores de fenólicos e flavonoides totais por 
analises espectofotometricas; perfil de compostos fenólicos por cromatografia líquida 
acoplada a espectrometria de massas de alta resolução (LC-HRMS) e capacidade 
antioxidante in vitro. 
 
c) Determinar os teores e perfil de tocoferóis por HPLC, minerais por ICP-OES e 
ICP-MS e proteínas por abordargens proteômicas na torta da castanha-do-Brasil. 
 
 
 
 
26 
 
Capítulo 4: 
 
d) Encapsular por spray-drying o extrato da torta de castanha-do-Brasil utilizando 
como material de parede Capsul
® 
e inulina, com vistas à aplicação em alimentos. 
 
e) Investigar a influência da proporção da mistura de material de parede (Capsul® 
e inulina) sobre características químicas e físico-químicas, assim como aestabilidade 
dos compostos bioativos microencapsulados durante o armazenamento por 120 dias. 
 
f) Caracterizar as micropartículas obtidas a partir da melhor formulação 
(melhores características químicas, físico-químicas e estabilidade), quanto aos 
compostos bioativos: fenólicos, tocoferóis e selênio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Capítulo 1 
Revisão de Literatura 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
1. A castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) e seus co-produtos 
 
A castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa H.B.K.) pertence à família lecythidaceae, é 
uma oleaginosa nativa da região Amazônica. A castanheira é uma árvore que chega a atingir 
até 60 m de altura com uma base de até 2 m de diâmetro médio. Seu fruto é conhecido como 
ouriço, possui forma esférica ou capsular, com cerca de 20 cm de diâmetro, com casca 
lenhosa bastante rígida e rugosa (Muller et al., 1995). No seu interior apresenta cerca de 10 a 
24 sementes que são altamente nutritivas. As sementes da castanha também são envolvidas 
por uma casca dura e rugosa em formato triangular-anguloso de cor marrom escuro que 
envolve a amêndoa, que é a parte comestível da castanha-do-Brasil (Figura 1) (Muller et a., 
1995). A amêndoa da castanha-do-Brasil também é conhecida como castanha-do-pará ou 
castanha-da-amazônia, castanha, castanheira, castanha-verdadeira, castanheiro, amendoeira-
da-américa, castanha-mansa e castanha-do-Brasil (Muller et a., 1995). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1: Árvore da castanheira-do-Brasil (A), ouriço (fruto) (B) e as sementes (C) que contém a 
amêndoa da castanha-do-Brasil (parte comestível). 
 
É distribuída em toda a Floresta Amazônica incluindo os estados de Rondônia, Acre, 
Amazonas, Pará, Roraima, Tocantins e Mato Grosso, bem como na Venezuela, Colômbia, 
Fonte: © Zig Koch/WWF-Brasil 
 
Fonte: comida.ig.com.br 
Fonte: Coleção Viva Saúde – Hipertensão 
 
A B 
C 
29 
 
Peru, Bolívia e Guianas (Souza et al., 2006). A castanha-do-Brasil é o produto vegetal 
extrativo mais importante da Amazônia em valor ecológico, social, econômico e alimentar. 
Por ser um produto extrativista, a produção da castanha-do-Brasil é considerada orgânica e 
sua extração ambientalmente correta. Suas amêndoas são de grande valor comercial no 
mercado internacional, e representam uma alternativa de renda para os seringueiros da 
Amazônia (Souza et al., 2006). 
A produção brasileira de castanha concentra-se principalmente nos estados do 
Amazonas, Pará e Acre, responsáveis por 80% do volume produzido. A maior parte da 
castanha brasileira é exportada in natura principalmente para a Alemanha, Inglaterra e 
Estados Unidos e os países concorrentes são a Bolívia e o Peru (Enriquez, 2009; Silvertown, 
2004). O Brasil era considerado até 1990 o líder no mercado mundial com uma produção de 
cerca de 50 mil toneladas de castanha com 80% do comércio, porém este quadro econômico 
mudou e atualmente a Bolívia passou à liderança com uma produção anual de cerca de 50 mil 
toneladas (CONAB, 2009; IBGE, 2010). 
No entanto, a produção mundial vem sofrendo queda desde a década de 1980 devido ao 
desmatamento sofrido pela floresta amazônica, ocasionando a redução dos castanhais nativos. 
Este problema colocou as castanheiras-do-Brasil na “ListaOficial de Espécies da Flora 
Brasileira Ameaçadas de Extinção” definida pela Instrução Normativa MMA n°6, de 23 de 
setembro de 2008 (Peres et al., 2003, IBAMA, 2008). Fatores como preço baixo na 
comercialização da castanha-do-Brasil, mercado pouco atrativo, falta de incentivo para 
agregar valor ao produto e falta de uma política de incentivo à produção também tem 
contribuído para a redução da produção (Souza et al., 2006). 
Outro fator que tem impacto na comercialização das castanhas-do-Brasil são as 
condições inadequadas de manipulação durante a colheita, que favorece a contaminação por 
fungos produtores de aflatoxinas, e representa uma forte limitação na comercialização do 
produto especialmente no mercado externo. As aflatoxinas são produzidas geralmente pelo 
fungo Aspergillus flavus, quando expostas a condições favoráveis como umidade e 
temperatura elevadas, e produzem as toxinas com efeitos carcinogênicos nocivos à saúde 
humana (Pacheco e Scussel, 2007). 
Contudo, estratégias para diminuir este impacto negativo na produção de castanha vêm 
sendo adotadas. Uma parceria ente a Embrapa (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária) 
e os produtores extrativistas de castanha tem gerado medidas para minimizar os problemas de 
30 
 
contaminação, através da aplicação de Boas Práticas no manejo da castanha aplicando 
procedimentos que começam no momento da coleta, dentro da floresta, e se estende até a fase 
de beneficiamento do produto. As Boas Práticas agregam valor ao produto e ajudam a 
estabelecer preços mais justos no mercado. 
Além disto, devido às características nutricionais desta oleaginosa e a sua importância 
econômico-social para a região Amazônica, tem aumentado o interesse na busca por 
alternativas que beneficie não só a comercialização da castanha in natura, mas seus co-
produtos. A diversidade de componentes nutricionais e funcionais da castanha do-Brasil tem 
aumentado o interesse em pesquisas na sua composição com o intuito de agregar valor a esta 
oleaginosa pelo aproveitamento de seus componentes bioativos e seus co-produtos 
possibilitando maiores aplicações na indústria alimentícia e cosmética (Yang et al., 2009, 
Kornsteiner et al., 2006). 
Os principais co-produtos da castanha-do-Brasil são o óleo e a torta, que é o resíduo 
sólido obtido após a extração da fração lipídica. O óleo da castanha-do-Brasil é rico em 
vitamina E, e ácidos graxos insaturados como o oléico e o linoléico (Santos et al., 2013). Tem 
crescido a demanda pelo seu uso particularmente devido ao aumento do uso de produtos 
naturais como insumos para a indústria cosmética tanto no mercado nacional quanto 
internacional, além da sua aplicação na indústria alimentícia por ser um óleo considerado 
gourmet. Com este maior consumo de óleo de castanha-do-Brasil tem aumentado a produção 
da torta, porém poucas aplicações tem sido dadas a este co-produto. 
 
1.1 Composição nutricional e funcional da castanha-do-Brasil e seus co-produtos 
 
A amêndoa da castanha-do-Brasil apresenta elevado valor nutritivo com uma rica 
composição em macronutrientes e compostos bioativos. Cerca de 60% de sua composição são 
de lipídios e 17% de proteínas, além de fibras, vitaminas e minerais (Yang et al 2009). A 
castanha-do-Brasil é uma boa fonte de ácidos graxos composta principalmente dos ácidos 
linoleico (37%), oleico (33%), palmítico (14%) e esteárico (11%) (Santos et al., 2013). 
A castanha-do-Brasil tem uma composição vasta em micronutrientes, como os minerais. 
Comumente eles são encontrados na seguinte ordem crescente de abundância Mg> Ca> Fe> 
Cu> Cr> As> Se; esses elementos agem como cofatores para muitas funções fisiológicas e 
metabólicas no organismo humano (Pacheco e Scussel, 2007; Comineti et al., 2012). O 
31 
 
selênio é um importante antioxidante da dieta e a castanha-do-Brasil é considerada uma das 
principais fontes alimentares deste mineral. No entanto a quantidade de Se varia 
consideravelmente entre as amêndoas, principalmente devido à concentração encontrada no 
solo (Pacheco e Scussel, 2007). O elevado conteúdo de proteínas nas amêndoas de castanha-
do-Brasil colabora para o alto conteúdo de aminoácidos sulfurados (em especial metionina e 
cisteína) que favorecem a absorção do selênio e outros minerais no organismo (Sun et al., 
1987; Strunz et al., 2008). 
O consumo de castanha-do-Brasil tem sido associado com inúmeros benefícios para a 
saúde, especialmente com a redução do risco de doenças cardiovasculares relacionadas com a 
redução das frações de Lipoproteína de Baixa Densidade (LDL) e de Muito Baixa Densidade 
(VLDL), responsáveis pelo aumento do colesterol sérico (Jenkins et al., 2002). Estes efeitos 
benéficos são provenientes da sua composição em componentes bioativos como os compostos 
fenólicos na sua forma livre e ligada, os tocoferóis, fitoesteróis e o selênio. Estes compostos 
possivelmente apresentam efeitos benéficos à saúde devido as suas propriedades 
antioxidantes, antiproliferativos, anticarcinogenico e antimutagenicas (Wu et al, 2004; 
Kornsteiner et al., 2006). No entanto, os dados quantitativos de alguns destes compostos na 
castanha-do-Brasil e nos co-produtos, como os fenólicos, ainda são limitados (Yang, 2009; 
John e Shahidi, 2010). 
A castanha-do-Brasil foi aprovada como um alimento que apresenta declaração de 
saúde qualificada pela FDA (Food and Drug Administration) com a seguinte declaração para 
as nozes e castanhas, incluindo a castanha-do-Brasil: “Evidências científicas sugerem, mas 
não provam, que a ingestão de 1,5 gramas de castanhas por dia, para a maioria das nozes 
como parte de uma dieta baixa em gordura saturada e colesterol, pode reduzir o risco de 
doenças cardiovasculares” (FDA, 2008). 
Estudos têm reportado os efeitos benéficos à saúde pelo consumo de nozes e castanhas, 
incluindo a castanha-do-Brasil. Yang et al (2009) investigou a atividade antiproliferativa de 
diferentes nuts na inibição da proliferação de células humanas de câncer HepG2 e Caco-2. As 
células apresentaram significativa inibição em um padrão dose-dependente, após a exposição 
aos extratos das nuts. A atividade antiproliferativa pode estar relacionada ao conteúdo de 
compostos fenólicos presentes nos extratos um fenólico específico ou uma classe de 
compostos fenólicos presentes nas nuts. Os compostos fenólicos podem agir sinérgica e/ou 
32 
 
antagonicamente com outros compostos bioativos, como tocoferóis e selênio presentes na 
castanha-do-Brasil que também exercem atividade antioxidante. 
No entanto, além dos beneficios a saúde conhecidos da castanha-do-Brasil em sua 
forma in natura, especialmente pela sua composição em selênio, as castanhas podem dar 
origem a co-produtos que possuem características nutricionais e funcionais específicas. O 
processamento das amêndoas desta oleaoginosa, especialmente daquelas que sofreram algum 
tipo de injúria mecânica durante o descascamento ou que não apresentam as características 
adequadas para comercialização pelo mercado externo, são alternativamente utilizadas para 
extração de óleo, devido à seu alto teor lipídico. 
O óleo obtido por prensagem das amêndoas da castanha-do-Brasil é um dos principais 
co-produtos desta oleaginosa, o óleo obtido retém as propriedades originais da castanha-do-
Brasil e, por isso, apresenta elevador valor agregado. Ele apresenta cerca de 80% de ácidos 
graxos insaturados e teores de β-tocoferol e β-sitosterol (Costa et al 2010; Chunhieng et al., 
2008). O β-tocoferol apresenta elevada ação antioxidante e pode contribuir para a estabilidade 
química do óleo, prevenindo a rancidez. Por outro lado, os fitoesteróis, além de apresentarem 
atividade antioxidante, conferem à castanha interessantes propriedades de inibição da 
absorção do colesterol, que ajuda na prevenção de hiper-colesterololemia e doenças 
cardiovasculares (Chunhieng et al., 2008). O óleo da amêndoa da castanha-do-Brasil é 
límpido, apresentacoloração amarelada e odor agradável, com potencial para uso em 
preparações gourmet e nas formulações de cosméticos. 
A extração do óleo da amêndoa da castanha-do-Brasil por prensagem fornece como co-
produto, um resíduo sólido chamado de torta, que apresenta elevado valor energético e 
nutricional. As aplicações mais convencionais desse co-produto são variadas, tais como 
enriquecimento de grande variedade de alimentos como produtos de panificação, farinhas, 
snacks, cereais, biscoitos, embutidos, sorvetes, chocolates, bebidas, laticínios, entre outros 
alimentos (Menezes e Souza, 2004). A torta de castanha do Brasil apresenta cerca de 50% de 
proteínas, tendo um conteúdo proteico maior do que a carne de gado (26 a 31% de proteínas). 
A proteína da castanha é rica em aminoácidos essenciais com elevado teor dos sulfurados 
(metionina e cisteína). Além de apresentar conteúdos de selênio e fibra maiores do que os 
encontrados na castanha in natura (Strunz et al., 2008; Yang et al,. 2009). 
 
 
33 
 
2. Compostos bioativos em nozes e castanhas 
 
2.1 Tocoferóis 
 
A vitamina E é representada por um grupo de oito compostos com semelhanças 
estruturais, os tocoferóis e tocotrienóis e seus homólogos α, β, γ e δ-tocoferol, são 
componentes característicos dos óleos da maioria das oleoaginosas. 
Os tocoferóis são derivados do 6-cromanol, assim como os tocotrienóis. Apresentam 
uma estrutura química formada por um anel fenólico (cromanol) e um heterocíclico, além de 
uma cadeia lateral isoprenóide de 16 carbonos saturada ligada ao carbono 2 e se diferem pelo 
número e posição dos grupos metil no anel cromanol formando os homólogos α, β, γ e δ-
tocoferol (Figura 2) (Wong et al., 2014). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2: Estrutura química dos tocoferóis e tocotrienóis. 
 
Os tocoferóis são encontrados em vegetais, principalmente em sementes oleaginosas 
(Tabela 1) como em óleos de grãos, nozes, gérmen de trigo, folhas e partes verdes das 
plantas. São encontrados em menor quantidade em alimentos de origem animal, 
principalmente gema de ovo e fígado. Os homólogos γ e o α-tocoferol são os mais abundantes 
Tocoferol/ tocotrienol R1 R2 
α CH3 CH3 
β CH3 H 
 H CH3 
δ H H 
34 
 
na maioria dos alimentos. O α-tocoferol concentra-se, principalmente, nos cloroplastos de 
células vegetais, enquanto β, γ, δ-tocoferol são normalmente encontrados fora dessas 
organelas (Costa et al., 2010). 
 
Tabela 1: Conteúdo de vitamina E de algumas oleaginosas (USDA, 2004). 
Diferentes nuts Teor de Vitamina E 
 (mg/ 100 g) 
Sementes de girassol 56,5 
Amêndoas 26,2 
Avelã 15,2 
Amendoim 7,8 
Castanha-do-Brasil 7,6 
Noz-pecã 4,0 
 
A atividade antioxidante dos tocoferóis esta relacionada ao grupo hidroxila do anel 
cromanol, principalmente em sua habilidade de atuar como doador de elétrons ou aceptor de 
radicais livres (Nogala et al., 2004). Nos óleos, os tocóis reagem rapidamente com os radicais 
livres e inibem por competição a oxidação dos ácidos graxos insaturados, retardando 
especialmente a etapa de propagação. Portanto, apresenta importante papel na proteção de 
óleos vegetais contra oxidação (Nogala et al., 2004). 
A atividade antioxidante dos homólogos de tocoferóis apresenta a seguinte ordem de 
eficácia: δ > γ = β > α. Todavia, esta ordem pode sofrer interferência de diversos fatores, tais 
como temperatura, disponibilidade de oxigênio, exposição à luz, interações entre os 
compostos antioxidantes e com outros componentes do meio, como ácidos graxos 
quimicamente ligados a fosfolipídios ou triacilgliceróis (Chun et al., 2006). 
Alguns estudos indicam que o α-tocoferol é considerado o mais potente em sua ação 
antioxidante, as diferentes atividades biológicas das diversas formas do α-tocoferol não são 
devido somente a sua habilidade em sequestrar o radical livre, mas também na específica 
afinidade do α-tocoferol com a proteína transferase (α-TTP). A α-TTP é uma proteína que 
especificamente incorpora o α-tocoferol na partícula lipoprotéica das células do fígado para o 
plasma (Birringer et al.,2001; Azzi et al., 2002). 
35 
 
O α-tocoferol está presente em maior concentração no plasma humano, o que leva a sua 
maior bioatividade como vitamina E. O alto consumo de α-tocoferol tem sido associado com 
a diminuição do risco de doenças cardiovasculares, diabetes tipo II, hipertensão e Alzheimer 
(Schwartz et al., 2008). No entanto, relata-se que apesar das baixas concentrações 
plasmáticas, outras formas de tocoferóis também são capazes de exercer atividades 
antioxidantes e biológicas em humanos. O γ-tocoferol, por exemplo, tem apresentado 
importantes efeitos benéficos no organismo humano como agente quimio preventivo e um 
potente agente na prevenção de doenças cardiovasculares (Campbell et al., 2003; Mishima et 
al., 2003). 
Os tocoferóis (vitamina E), a vitamina C, o β-caroteno, o selênio e os compostos 
fenólicos fazem parte de um grupo denominado nos últimos anos de antioxidantes 
alimentares. A ingestão destes componentes tem sido frequentemente associada à prevenção 
de doenças neurodegenerativas, aterosclerose, inflamação crônica, câncer e envelhecimento 
precoce. Alimentos como as nozes, amêndoas e castanhas são ricos nesses compostos 
bioativos e a sua ingestão tem sido associada com alguns efeitos benéficos à saúde (Halvorsen 
et al, 2006; Kaliora et al, 2006). Os efeitos de combater os radicais livres dos tocoferóis foram 
relacionados à prevenção das condições associadas com processos degenerativos mediados 
por radicais livres, tais como o envelhecimento, o desencadeamento de algumas formas de 
carcinogênese, artrite e agregação plaquetária (Freedman & Keaney, 2001). 
 
2.2 Selênio 
 
O selênio (Se) é um mineral essencial para o organismo e apresenta potencial ação 
antioxidante. Acredita-se que sua ação redutora ocorra por meio da ligação covalente a 
proteínas, formando as selenoproteínas, como a glutationa peroxidase e a tioredoxina 
redutase, que possuem propriedades antioxidantes similares (Santos et al., 2013). A glutationa 
peroxidase é uma selenoproteína que atua como uma enzima antioxidante no plasma, e esta 
relacionada com a diminuição do processo de envelhecimento, estimulação do sistema 
imunitário e a proteção contra a doença cardíaca e determinadas formas de câncer (Yang 
2009). O selênio esta presente nos alimentos na forma de Se inorgânico ou ligado a 
aminoácidos livres. A maior parte do Se liga-se covalentemente com aminoácidos sulfurados 
36 
 
formando o complexo selenometionina e selenocisteína (Kannamkumarath et al., 2002; 
Chunhieng et al., 2004). 
 A dose de ingestão diária recomendada é 55 μg/dia de selênio para homens e mulheres 
adultos, é baseado na quantidade necessária para maximizar a síntese da selenoproteína 
glutationa peroxidase no organismo. Entretanto, o consumo de doses elevadas desse mineral 
pode promover efeitos nocivos à saúde como o risco de selenose (toxicidade crônica). Frente 
a isto, foi imposto um limite de ingestão máxima tolerável (UL) de 400 μg/dia de selênio para 
adultos (IOM, 2000). 
 O teor de selênio encontrado nos alimentos é influenciado pela quantidade desse 
mineral no solo onde o alimento esta sendo cultivado. Diferentes concentrações de selênio 
(8,0-69,7 μg.g
-1
) foram encontradas na castanha-do-Brasil de acordo com diferentes regiões 
da Amazonia de onde foram originadas (Pacheco e Scussel 2007). Outro fator que afeta o teor 
de selênio nos alimentos é o teor de lipídio, pois com a redução dos lipídios ocorre o aumento 
das proteínas e consequentemente o aumento na composição de selênio, já que o seu conteúdo 
é associado com a fração de proteína na forma de selenometionina e selenocisteína (Santos et 
al, 2010). 
As funções biológicas do Se incluem defesa contra estresse oxidativo, regulação da ação 
dos hormônios da tireoíde e regulação do potencial redox da vitamina C e de outrasmoléculas. Os efeitos benéficos à saúde pelo consumo regular de castanha-do-Brasil têm sido 
relacionados com a composição em macronutrientes, micronutrientes e compostos funcionais, 
especialmente o selênio (Yang, 2009; Santos et al., 2013). Devido à alta quantidade de 
proteínas ricas em aminoácidos presentes em sua composição o selênio tem maior facilidade 
para formar um complexo orgânico, aumentando a sua biodisponibilidade. Com isto devido a 
composição da castanha-do-Brasil ela é considerada uma das principais fontes de selênio, 
especialmente por apresentar elevados teores deste mineral (Moodley et al., 2007;. Santos et 
al., 2013; Yang, 2009). 
 
2.3 Compostos Fenólicos 
 
Os compostos fenólicos são originados do metabolismo secundário das plantas 
produzidos como resposta a situações de estresse que são submetidas, como raios UV e 
patógenos, entre outros (Ignat et al., 2011). Estes compostos apresentam considerável 
37 
 
importância fisiológica e morfológica em plantas, pois atua no crescimento, reprodução, 
proteção contra agentes patogénicos e predadores (Bravo, 1998). Além disso, apresentam 
importantes funções nas características sensoriais, como nas cores, de frutas e vegetais 
(Alasalvar et al., 2001). Do mesmo modo, apresentam funções biológicas no organismo 
humano, onde seu consumo tem sido relacionado com inúmeros efeitos benéficos à saúde. 
Existem mais de cinco mil compostos fenólicos os quais englobam desde moléculas 
simples até moléculas com alto grau de polimerização. Químicamente são compostos 
fitoquímicos derivados da fenilalanina e tirosina que possuem anel aromático com um ou mais 
substituintes hidroxílicos, incluindo seus grupos funcionais (Nack e Shahidi, 2004; 
Balasundram et al., 2006). A fenilalanina amônia-liase (PAL) é a enzima chave na regulação 
da via metabólica de fenilpropanóides convertendo a L-fenilalanina em ácido trans-cinâmico 
e iniciando a biossíntese de fenólicos (Figura 3). Fatores genéticos irão determinar quais 
classes e subclasses desses compostos serão sintetizadas (Nack e Shahidi, 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3: Biossíntese dos compostos fenólicos (Naczk e Shahidi, 2004). 
38 
 
Os compostos fenólicos são classificados devido às diferenças em sua estrutura 
química, de acordo com o número de anéis fenólicos e grupamentos que os ligam. As 
principais classes de compostos fenólicos são os ácidos fenólicos, flavonóides, taninos 
(hidrolisáveis e condensados), ligninas e estilbenos (Ignat et al, 2011). 
Os ácidos fenólicos constituem cerca de um terço dos compostos fenólicos em 
alimentos, os quais podem estar presentes nas plantas, nas formas livres ou ligadas, por 
ligações éster, éter ou acetal (Robbins, 2003; Zadernowski et al., 2009). Consistem em dois 
subgrupos, os ácido hidroxibenzóico e os ácido hidroxicinâmico (Figura 4). Os ácidos 
hidroxicinâmicos têm a característica de ser compostos antioxidantes mais ativos do que os 
ácidos benzóicos, devido à dupla ligação presente na molécula dos derivados do ácido 
cinâmico participar da estabilidade do radical por ressonância de deslocamento do elétron 
desemparelhado, enquanto que os derivados do ácido benzóico não apresentam essa 
característica (Balasundram et al., 2006). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4: Estrutura química básica dos ácidos fenólicos: hidroxibenzóico (a) e hidroxicinâmico (b) 
(Angelo e Jorge, 2006). 
 
 A estrutura química dos flavonóides consiste em dois anéis aromáticos denominados 
anel A, derivado do ciclo acetato/malonato e B derivado da fenilalanina por meio da via do 
chiquimato, unidos por três carbonos que formam um anel heterocíclico, denominado anel C 
(Figura 5). Variações em substituição do anel C na estrutura dos flavonóides resultam em 
importantes subclasses como flavonóis, flavonas, flavanonas, flavanóis (ou catequinas), 
isoflavonas e antocianidinas. E as substituições dos anéis A e B originam diferentes 
compostos dentro de cada subclasse de flavonóides. Estas substituições podem acontecer por 
39 
 
reações de oxigenação, alquilação, glicosilação, acilação e sulfação (Balasundram et al., 
2006). 
 
 
 
 
 
 
Figura 5: Estrutura química básica dos flavonoides (Balasundram et al., 2006). 
 
Os compostos fenólicos, incluindo antocianinas, flavonóides e ácidos fenólicos, são 
conhecidos por serem responsáveis pela capacidade antioxidante dos alimentos impedindo a 
oxidação lipídica e combatendo o estresse oxidativo (Slusarczyk et al., 2009). Além disto, os 
compostos fenólicos apresentam muitas aplicações industriais, devido às suas propriedades 
como conservantes e corantes de alimentos. Os compostos fenólicos têm potenciais efeitos no 
sistema biológico, estudos têm demonstrado que quando consumidos regularmente por seres 
humanos, os compostos fenólicos têm sido associados com uma redução na incidência de 
doenças, tais como ateroclerose, obesidade, diabete tipo 2, câncer e doenças cardiovasculares 
(Luthria et al., 2006; Liu et al., 2008; Ross et al., 2009). O aumento dos efeitos benéficos a 
saúde com o aumento do consumo de compostos fenólicos tem favorecido mais pesquisas que 
caracterizem estes compostos em diferentes matrizes alimentares e investiguem a sua ação no 
organismo humano. 
As principais fontes de compostos fenólicos são as frutas, legumes e folhas, mas 
ultimamente diferentes resíduos agrícolas e industriais têm sido investigados como potenciais 
fontes destes compostos bioativos (Ignat et al, 2011; Roos et al., 2009). Os resíduos e 
subprodutos, remanescentes após o processamento de frutas e vegetais na indústria de 
processamento de alimentos, ainda contêm uma grande quantidade de compostos fenólicos 
que na maioria das vezes acabam não sendo reaproveitados. Dentre estes resíduos destacam-
se os da casca e bagaço obtidos na indústria de suco e vinhos, considerados ricas fontes de 
compostos bioativos (Lapornik et al., 2005 ), além dos coprodutos (torta) produzidos na 
indústria de extração de óleos vegetais, como de azeite e óleo de soja, que também são uma 
fonte potencial de compostos fenólicos. 
40 
 
O teor dos compostos fenólicos em muitos alimentos ainda é determinado através de 
análises espectrofotométricas, onde são investigados os teores de compostos fenólicos totais 
presentes na matriz alimentar. O método de Follin-Ciocalteu é o mais utilizado. Baseiam-se 
na redução do ácido fosfomolíbdico e fosfotúngstico pelas hidroxilas fenólicas da amostra, o 
número de grupos hidroxilas ou de grupos potencialmente oxidáveis, que forma o óxido de 
tungstênio e molibdênio em meio alcalino, responsáveis pela coloração azulada formada nas 
moléculas reduzidas (Tsao e Yang, 2003 e Lapornik et al., 2005). A intensidade da cor do 
complexo produzido é medida pela absorvância da solução em 760 nm. 
O teor de fenólicos totais é calculado geralmente utilizando uma curva de calibração de 
equivalente de ácido gálico. Porém este método espectrofotométrico não é um método 
específico, pois detecta todos os grupos fenólicos presentes na amostra, incluindo aquelas 
proteínas extraíveis. Outra desvantagem é a interferência de reduzir substâncias como ácido 
ascórbico. Estes interferentes podem levar à superestimação do conteúdo de fenólicos de 
extratos de origem vegetal, devido à sobreposição de respostas espectrais (Naczk e Shahidi, 
2004; Ignat et al., 2011). 
No entanto, técnicas mais específicas como a cromatografia líquida de alta eficiência 
(CLAE) têm sido amplamente utilizadas para a separação e quantificação de compostos 
fenólicos em alimentos. Esta técnica permite identificar e quantificar especificamente os 
componentes que estão presentes na matriz alimentar. São amplamente utilizadas na 
elucidação da estrutura quando usadas em combinação com a espectrometria de massas, bem 
como outras técnicas relevantes (Naczk e Shahidi, 2004). 
Além disto, a extração dos compostos fenólicosem alimentos vegetais é um passo 
muito importante no isolamento, identificação e aplicação. Esta etapa é influenciada pela 
natureza química dos fenólicos, o método de extração, tamanho de partícula da amostra, o 
tempo, temperatura e as condições de armazenamento, assim como a presença de substâncias 
interferentes (Bucić-Kojić et al., 2007). Embora nas duas últimas décadas tenha ocorrido um 
aumento nas pesquisas sobre a composição de fenólicos em alimentos, ainda não existe um 
procedimento padrão para preparação da amostra, extração e análise cromatográfica dos 
compostos fenólicos (Ignat et al., 2011). Portanto, existe a necessidade de desenvolver 
procedimentos analíticos mais robustos, seletivos e sensíveis para a determinação simultânea 
das importantes classes e subclasses de compostos fenólicos nos alimentos (Tsao e Yang, 
2003; Liu et al., 2008). 
41 
 
3. Capacidade antioxidante 
 
A castanha-do-Brasil devido a sua elevada composição em minerais, especialmente o 
selênio e os tocoferóis tem sido considerada um alimento com potencial efeito antioxidante 
(Chunhieng et al., 2008; Costa et al., 2010; Santos et al., 2013). Os antioxidantes são 
compostos naturais ou sintéticos que quando presentes mesmo em baixa concentração, 
comparada à concentração do substrato oxidante, previne significativamente ou atrasa as 
reações de oxidação e seus efeitos danosos aos alimentos ou organismo. Os antioxidantes 
apresentam elevada estabilidade oxidativa e possuem a propriedade de prevenir a oxidação de 
outras substâncias, como proteínas, ácidos nucléicos e lipídios (Perez-Jimenez et al., 2008). 
Os alimentos como frutas, hortaliças e vegetais são as principais fontes naturais de 
compostos antioxidantes devido a sua rica composição de compostos bioativos como os 
compostos fenólicos, vitamina E, minerais como selênio e zinco, carotenoides entre outros 
(Zuleta et al., 2009). A presença destes compostos nos alimentos tem sido relacionada com a 
prevenção do estresse oxidativo, uma das principais causa de inúmeras doenças crônicas 
como câncer, diabetes e doenças cardiovasculares. 
O estresse oxidativo é resultado do desequilíbrio entre as espécies reativas de oxigênio 
(ERO) e o sistema de defesa antioxidante presente no organismo ameaçando a função normal 
da célula ou do organismo. Inúmeros fatores colaboram para o aumento na produção das 
EROs como uma resposta do organismo durante processo inflamatório, consequência de 
doenças, por fatores externos e estilo de vida, como exposição a herbicidas, toxinas, 
tabagismo, alcoolismo, poluentes ambientais e radiação (Valkon et al., 2007). O aumento na 
produção das EROs no organismo ocorre quando o mecanismo de defesa esta comprometido 
devido a redução dos principais agentes de defesa antioxidante enzimáticos, que são as 
enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) (Gálvez, 
2010). E pela ingestão reduzida de compostos antioxidantes provenientes da dietaerro 
(Blomhoff, 2005). Causando danos moleculares e aos tecidos do organismo como no DNA, 
proteínas, lipídios e genes. E consequentemente o organismo ficar mais suscetível ao 
aumento do risco de doenças como diabetes, doenças neurodegenerativas, câncer e doenças 
cardiovascular (Gutteridge e Halliwell, 2000; Blomhoff, 2005). As principais ERO 
produzidas são hidroxila (OH•), íon superóxido (O2
-•
), alcoxila (RO•), peroxila (ROO•), 
42 
 
peróxido de hidrogênio (H2O2) e peridroxila (HOO•). Além de oxigênio singlete, complexos 
de metais de transição, radicais de nitrogênio entre outros. 
O sistema de defesa antioxidante para combater as EROs e manter o equilíbrio 
oxidativo é formado pelos antioxidantes enzimáticos como as superóxido dismutase, catalase 
e glutationa peroxidase, juntamente com os antioxidantes não enzimáticos, como as vitaminas 
C e E, carotenoides e compostos fenólicos (Blomhoff, 2005). A capacidade antioxidante dos 
compostos fenólicos esta relacionada com a sua estrutura química. O número e a configuração 
de grupamentos hidroxil doadores de hidrogênio, assim como as duplas ligações conjugadas, 
parecem ser os principais fatores estruturais a influenciar a atividade antioxidante (Wada et 
al., 2007). 
A capacidade antioxidante total (CAT) de diversos compostos nos alimentos pode ser 
mensurada através de metodologias in vitro. Os métodos químicos para determinação da 
atividade antioxidante estão divididos quanto à natureza da reação envolvida, em dois grupos 
principais, os que envolvem transferência de elétrons e os que envolvem transferência de 
átomos de hidrogênio. Eles se diferenciam quanto ao radical iniciador, à cinética da reação e 
às reações laterais. (Huang e Prior, 2005). 
Cada ensaio usado nos métodos se difere pelo grau de complexidade, sensibilidade, 
mecanismos e espécies reativas envolvidas. Dentre os métodos baseados na transferência de 
átomos de hidrogênio, estão o ORAC (oxygen radical absorbance capacity), o TRAP (total 
radical trapping antioxidant parameter) e o LDL (lipoproteína de baixa densidade). A 
maioria destas metodologias baseia-se na reação competitiva entre o antioxidante e o 
substrato para formação do radical por decomposição de compostos azo, permitindo o 
acompanhamento da reação por ultravioleta ou por fluorescência (ORAC) (Huang e Prior, 
2005). Já entre os métodos que o mecanismo de ação envolve a transferência de elétrons, 
destacam-se o ABTS expresso em TEAC (Trolox® equivalence antioxidant capacity), o 
FRAP (ferric ion reducing antioxidante parameter) e o DPPH (diphenil-1-picryhydrazyl). As 
metodologias que envolvem a transferência de elétrons baseiam-se na redução do substrato 
por ação dos componentes antioxidantes presentes na amostra, que apresentam 
comportamento espectral distinto no estado oxidado e reduzido (Re et al. 1999; Huang and 
Prior, 2005). Porém é importante destacar que a atividade antioxidante medida in vitro sugere 
a bioatividade do composto ou mistura que esta sendo analisada, não a determina. A avaliação 
de atividade antioxidante baseada em metodologias in vitro deve ser feita com cautela uma 
43 
 
vez que as mesmas não consideram fatores como biodisponibilidade, estabilidade do 
composto in vivo e retenção dos antioxidantes (Huang e Prior, 2005). Além disso, o efeito do 
composto antioxidante numa matriz alimentar pode ser significativamente diferente da sua 
atividade no extrato purificado, como geralmente é feita a medição da atividade antioxidante 
dos alimentos (Brewer, 2011). 
 
4. Espectrometria de Massas de Alta Resolução (EMAR) na determinação de compostos 
fenólicos 
 
A espectrometria de massa (EM) tem evoluído desde 1940 com a melhoria das 
tecnologias de vácuo e fontes de íons e o desenvolvimento do analisador de massa quadrupolo 
em 1953. Hoje, após um constante aprimoramento desta tecnologia um espectrômetro de 
massa passou a ser um equipamento quase que padrão em um laboratório analítico moderno, 
indispensável para a investigação científica em um nível elevado. Devido às diferentes 
características instrumentais em ionização, resolução, velocidade de digitalização e 
fragmentação MS é uma técnica versátil, com aplicações descritas a partir de estudos de 
astronomia, geofísica, biologia e medicina. 
Dentre as aplicações da espectrometria de massas destacamos a análise de metabólitos 
secundários em plantas, pois esta é uma tarefa desafiadora devido à sua diversidade química, 
geralmente baixa concentração e variabilidade, mesmo dentro da mesma espécie. A 
espectrometria de massa possibilita a identificação com elevada precisão e especificidade das 
moléculas além de possibilitar a elucidação das estruturas químicas de moléculas, tais como 
peptídeos, polifenóis e os outros compostos químicos. 
O princípio da EM consiste na ionização dos compostos químicos para gerar moléculas 
carregadas ou fragmentos de moléculas e medir sua razão massa-carga(m/z) (Sparkman, 
2000). As principais fontes utilizadas para analisar compostos fenólicos são: bombardeamento 
atómico rápido (FAB), ionização por eletrospray (ESI), ionização a pressão atmosférica (API), 
incluindo a ionização química a pressão atmosférica (APCI), pressão atmosférica foto-
ionização (APPI) e Ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) (Fulcrand et 
al., 2008 ). 
 As técnicas de cromatografia de espectrometria de massa atualmente são consideradas 
uma das melhores abordagens analíticas para estudar os polifenóis em amostras de vegetais, e 
44 
 
são a ferramenta mais eficaz no estudo da estrutura de flavonoides. A abordagem EM/EM é 
uma ferramenta muito poderosa que permite a caracterização de molécula complexas como as 
procianidinas, proantocianidinas, prodelphinidinas e taninos (Flamini, 2003). 
A aplicação da técnica de High-Resolution Mass Spectrometry (HRMS) ou no 
português Espectometria de Massas de Alta Resolução (EMAR) tem crescido nos últimos 
anos. Inicialmente suas principais aplicações eram no estudo de metabolismo de drogas com o 
intuito de controle toxicológico de medicamentos e desenvolvimento de novas substâncias, 
além do controle de doping. O EMAR é uma importante ferramenta analítica em 
metabolômica esta técnica fornece a medição de massa exata, o que é útil na discriminação de 
íons com a mesma massa nominal e fornece dados sobre a composição elementar de 
compostos para posterior identificação. Apresenta alta sensibilidade em modo de aquisição de 
varredura completa e de alta precisão em massa (Maurer et al., 2013). Com o mesmo 
instrumento pode-se realizar uma variedade de funções: target (análise qualitativa dirigida) e 
non-target (analise qualitativa não dirigida). A futura tendência no uso da EMAR é a 
realização de um procedimento sistemático onde são analisados os analitos no modo target, 
ou seja, com o uso de padrões de referência e no modo non-target onde é realizada uma 
triagem investigando compostos que supostamente podem estar presentes na amostra sem o 
uso de padrões de referência (Krauss et al., 2010). A análise non-target é bastante trabalhosa, 
difícil e demorada especialmente quando não existem bancos de dados para os compostos 
investigados. O procedimento de análise non-target é iniciado pela detecção automatizada 
pela massa exata na corrida cromatográfica, seguido pela obtenção da fórmula elementar para 
a massa exata de interesse, e posteriormente uma busca das possíveis estruturas para essa 
massa exata em bancos de dados químicos disponíveis para determinar sua fórmula elementar 
(Krauss et al., 2010). A utilização de grandes bibliotecas de espectros de massa (teórico e/ou 
empírica) podem facilitar a identificação e detecção dos possíveis compostos. 
O analisador de massa utilizado com a EMAR tem sido o Orbitrap. Este analisador 
opera por armadilha de íons em torno de um eletrodo central e mede os valores de m/z a partir 
da freqüência das oscilações harmónicas de iões (Figura 6). Este dispositivo tem alta 
resolução de massa (> 100.000 FWHM) e alta precisão de massa (<5 ppm). Sua principal 
desvantagem é a sua velocidade de varredura, que é inversamente proporcional à resolução de 
massa. Apenas uma varredura por segundo pode ser adquirida ao selecionar a resolução de 
100.000, o que afeta a reprodução do formato de pico cromatográfica. Assim é necessário 
45 
 
estabelecer um faixa ideal de trabalho entre a resolução e a faixa de varredura de m/z 
estipulada (Makarov e Scigelova, 2010; Kellman et al., 2009). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6: Esquema representativo do analisador Orbitrap Qexactive (Michalski et al., 2011). 
 
Devido ao alto poder de resolução da EMAR estudos recentes tem aplicado esta técnica 
para investigar a identidade de compostos fenólicos em amostras de alimentos. Hiffault et al. 
(2014) utilizando a EMAR sugeriu a identificação de 60 compostos fenólicos presentes em 
diferentes partes de Rosa hybrida cv. Outros estudos reportam a aplicação desta técnica na 
identificação non-target de antocianinas, taninos e outros flavonóides em amostras complexas 
de alimentos (Lin et al., 2011; Sun et al., 2012). 
 
5. Encapsulamento 
 
A encapsulação é a tecnologia utilizada para empacotar sólidos, gotículas de líquidos ou 
material gasoso com finas coberturas poliméricas, formando pequenas partículas definidas de 
acordo com o tamanho em macrocápsulas (>5000 μm), microcápsulas (0,2-5000 μm) e 
nanocápsulas (<0,2 μm) (Reineccius, 2004; Dessai and Park, 2005). As cápsulas são formadas 
pelo núcleo, também denominado material encapsulado, que pode ser uma mistura de 
substâncias ou um material puro, que é o material ativo que se deseja encapsular. Já o material 
que forma a cápsula conhecido como encapsulante, material de parede ou matriz, pode ser um 
ESI 
Quadrupolo 
HCD Collision Cell 
Lentes 
C-Trap 
46 
 
carboidrato, gomas, proteínas, polissacárideos naturais ou modificados, lipídios e polímeros 
sintéticos (Gibbs et al., 1999; Mozafari, 2006; Wandrey et al., 2009). 
Dependendo da técnica aplicada na obtenção das cápsulas e, do material de parede 
utilizado, as partículas produzidas recebem diversas classificações de acordo com a 
morfologia obtida. Dentre as morfologias mais comuns destacam-se as micropartículas, 
quando apresentam um núcleo disperso na matriz encapsulante, e as microcápsulas, quando 
apresenta um núcleo bem definido (Fang e Bhandari, 2010) (Figura 7). 
 
 
 
 
 
Figura 7: Modelos das principais formas de encapsulação: microcápsula (A) e micropartícula(B). 
 
A encapsulação é aplicada na indústria alimentícia para melhoria nas características 
sensoriais dos alimentos, desenvolvimento de novos produtos com propriedades funcionais e 
melhoria na conservação de componentes, como vitaminas e aromas (Dessai and Park, 2005). 
As cápsulas apresentam propriedades de reduzir a reatividade do núcleo com o ambiente, 
diminuir a velocidade de evaporação ou transferência do material do núcleo para o meio, 
facilitar a manipulação do encapsulado, promover a liberação controlada, mascarar odor e 
sabor desagradáveis, além de promover a diluição homogênea do material encapsulado em um 
produto alimentício (Shahidi and Han, 1993). O crescente uso da tecnologia de encapsulação 
na indústria alimentícia tem ocorrido devido às novas necessidades em desenvolver produtos 
com propriedades cada vez mais complexas nas formulações e a busca por adição de 
substâncias que promovam a saúde, como a adição de vitaminas, minerais e componentes 
bioativos que são aplicados mais facilmente pelo uso desta tecnologia (Gouin, 2004). A 
encapsulação permite melhorar a aplicação de moléculas bioativas em alimentos (por 
exemplo, antioxidantes, minerais, vitaminas, fitoesteróis, luteína, ácidos graxos, carotenoides) 
e células vivas (por exemplo, probióticos) (Wandrey et al., 2009). Estes compostos bioativos 
normalmente são instáveis e se degradam com uma maior facilidade devido às condições do 
meio como, temperatura, luz, umidade e oxigênio ou as condições gastrointestinais após a 
ingestão. O encapsulamento dessas substâncias promove uma proteção efetiva preservando 
Material de parede 
Núcleo 
Material de parede 
Núcleo 
(A) (B) 
47 
 
suas características sensoriais e funcionais, além de através da liberação controlada 
proporciona maior biodisponibilidade destes compostos no organismo e com isto, potencializa 
seus efeitos benéficos à saúde (Dessai and Park, 2005). 
 
5.1 Agente encapsulante 
 
A escolha do agente encapsulante é um dos principais critérios para definir as 
características e aplicações das partículas desenvolvidas, relacionando-se à funcionalidade e a 
estabilidade das partículas que se deseja obter. Algumas características que podemos destacar 
para escolha do material de parede são: promover uma boa formação de filme, ter baixa 
higroscopicidade,