2013-dis-tisoliveira

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
CENTRO DE CIÊNCIAS 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA 
LABORATÓRIO DE PRODUTOS E TECNOLOGIA EM PROCESSSOS 
 
 
 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira 
 
DESENVOLVIMENTO DE SENSORES ELETROQUÍMICOS 
PARA DETECÇÃO DE MOLINATO E ÓXIDO NÍTRICO 
 
 
Dissertação de Mestrado submetida 
à Comissão Julgadora do Curso de 
Pós- Graduação em Química da 
Universidade Federal do Ceará, 
como um dos requisitos para a 
obtenção do título de Mestre em 
Química. 
 
 
 
Orientadora: Prof. Dra. Selma Elaine Mazzetto 
 
Fortaleza – CE 
Março de 2013 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira 
 
 
 
 
 
DESENVOLVIMENTO DE SENSORES ELETROQUÍMICOS 
PARA DETECÇÃO DE MOLINATO E ÓXIDO NÍTRICO 
 
 
 
 
 
 
Dissertação de Mestrado submetida 
à Comissão Julgadora do Curso de 
Pós- Graduação em Química da 
Universidade Federal do Ceará, 
como um dos requisitos para a 
obtenção do título de Mestre em 
Química. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Orientadora: Prof. Dra. Selma Elaine Mazzetto 
 
Fortaleza – CE 
Março de 2013 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico este trabalho aos meu pais, 
Maria Elizeth da Silva Oliveira e 
João José Ribeiro Oliveira, 
Bênçãos que o Senhor escolheu para a minha acolhida ao mundo 
Com muito amor, carinho, superação e trabalho digno como 
Virtudes que tento seguir como exemplo. 
Por isso, hoje sirvo ao Deus fiel porque até aqui nos ajudou o Senhor. 
AGRADECIMENTOS 
Ao DEUS todo poderoso, fiel por toda vida e que nunca me deixou abandonar o 
barco, pois ele sempre esteve comigo pelejando, guerreando e decretando a minha 
vitoria, em nome do Senhor Jesus. 
Aos meus pais, Elizeth e João José, por todo amor, carinho e dedicação durante 
essa minha caminhada de lutas e vitorias em meio à saudade de casa, sempre estiveram 
comigo sendo guiados por Deus para me ajudar em todos os momentos e sei que todos 
os ensinamentos que me transmitiram poderei levar pela vida inteira. 
A minha irmã, Thaysmênia, que sempre será a minha menina Nena, pelo 
companheirismo em uma caminhada de muitas histórias de perseverança, amor e 
confiança onde em meio a todos os momentos, sempre estaremos unidos pela aliança 
fraternal feita pelo nosso Deus digno de toda honra e toda glória, 
A minha noiva e futura esposa, Carolina, um presente de Deus em minha vida, 
uma benção mais que especial, onde na presença do Senhor somos mais que 
vencedores e unidos sendo capacitado para sermos uma só carne em uma aliança para 
toda vida, como diz a palavra viva do Senhor e eu vou até o fim por causa deste amor... 
A Maria das Graças Bessa (Dona Graça), uma vida abençoada pelo Senhor 
para me ajudar em todas as horas, desde o momento em que a conheci no cursinho do 
colégio São José. 
A minha tia Socorro, uma benção do Senhor em minha vida, muito especial, que 
sempre me ajudou, desde o dia em que decidi enfrentar a vida na capital. 
A minha prima, Xeila Freitas, pelo amor de irmã e por todo o apoio em 
momentos muito importantes da minha vida estando sempre disposta a ajudar toda a 
família. 
A professora Dra. Selma Elaine Mazzetto, pela orientação, oportunidade, ajuda 
e confiança a mim concedida. Sempre serei grato, pois viu meus passos, conhece um 
pouco da minha história, da minha luta e pelos bons conselhos dados e por ser uma 
pessoa especial na minha vida. 
Aos professores Dr. Pedro de Lima Neto e Dra. Adriana Nunes Correia, pela 
oportunidade e confiança de realizar uma parte do trabalho no GELCORR onde 
aprendi com seus ensinamentos e sendo um agregado ao grupo sempre com o apoio 
para as discussões a cerca do trabalho. 
Aos professores Dr. Pierre Basílio Almeida Fechine e Dr. Francisco Audísio 
Dias Filho, pelos ensinamentos e a atenção no Exame Geral do Conhecimento. 
 
A professora Dra. Simone Barreira Morais, que possibilitou a minha ida á 
Portugal com muito empenho antes e durante o meu estágio no Instituto Superior de 
Engenharia do Porto (ISEP) sendo presente em todos os momentos com seu apoio e 
dedicação para a realização de um excelente trabalho. 
Aos professores e pesquisadores da EMBRAPA, Dr. Men de sá Moreira de 
Souza Filho e Dra. Morsyleide de Freitas Rosa, que me ajudaram com muito empenho 
durante meu estágio supervisionado proporcionando um crescimento científico e 
pessoal e fazendo com que se firmem excelentes parcerias para um melhor 
desenvolvimento profissional. 
A todos os integrantes do Laboratório de Produtos e Tecnologia em Processos 
(LPT) que durante esses 6 anos tive a oportunidade de conviver e crescer com a 
experiência adquirida: Mayara Oliveira, Milena Esmeraldo, André Leandro, Norberto 
Bezerra, César Barreto,Tatiane Mota, Joyce Ellen, Luan Silva, Santiago Brito, Vivian 
Romero, Ana Angélica, Diego Lomonaco, Antônio Eufrázio, Janaina Leitinho, Pérsio 
Veloso, Fernando Luiz, Renata Paiva, Viviane Gomes, Claudenilson Clemente, Jonas 
Maia e João Paulo. 
A todos os integrantes do grupo de pesquisa, GELCORR, que me acolheram 
durante o período de testes no laboratório com apoio e atenção para que tudo fosse 
desenvolvido de forma satisfatória. 
Á Vanessa pelos ensinanentos com paciência e pela dedicação e força ao 
trabalho desenvolvido no GELCORR. 
Aos integrantes do Grupo de Reações e Análises Químicas –GRAQ- e do ISEP 
que foram bastante receptivos e atenciosos ajudando-me a desenvolver a pesquisa em 
um intervalo de tempo muito pequeno, porém com muito incentivo para obter excelentes 
resultados. Em especial, aos pesquisadores Dra. Fátima Barroso e Dr. Subramanian 
Viswanathan que acompanharam o meu estágio no laboratório sempre dispostos a 
ajudar com capacidades incríveis em investigação científica para que tudo desse certo. 
Aos integrantes do Laboratório de Valorização da Biomassa, na EMBRAPA, 
que sempre me apoiaram e estão prontos a ajudar para o meu crescimento. 
Aos colegas de graduação e de pós-graduação que durante esses 6 anos de 
convivência foram bastante produtivos e promissor para que possamos futuramente 
firmar parcerias para um avanço maior em nosso meio: Silmara, Thalita, Pontes Filho, 
Josy,Helen, Patrícia,Wellington, Lair, Gisele, Willian,Estefânia, André, Artemízia, 
Milena Renato e Renata. 
Aos primeiros colegas de laboratório, Tássio Lessa, Alexsandra Rios, Andrea 
Girão, Naiara Falcão e Sarah Nascimento, que participaram deste momento inicial 
comigo e sempre estiveram dispostos a ajudar para um amadurecimento profissional. 
Ao casal, meus irmãos em Cristo Jesus, Wirley Paulino e Tatiane Ribeiro, que 
foram instrumentos usados pelo Senhor em um momento muito importante da minha 
vida onde tivemos a oportunidade de conviver em outro país, mesmo distante dos 
nossos familiares, em um companheirismo e fraternidade que só Deus nos proporciona. 
A minha tia Gorete Ribeiro, que está na gloria do Senhor Jesus, um exemplo de 
vida, uma educadora de respaldo e com uma grande contribuição para a cidade de 
Aracati, que desde cedo lutou pelos seus ideiais enfrentando lutas diante de toda a 
humildade, mas não desistiu e conseguiu muita vitorias para nossa família sendo um 
braço forte para cada um de nós e hoje só as boas lembranças são guardadas , como 
diz a palavra do Senhor, de uma pessoa tão abençoada. 
A todos os meus irmãos na fé do Ministério Guerreiros de Oração (M.G.O.), em 
nome da minha Pastora Presidente, Miramar Estevam Sampaio, e a do seu esposo, Pr. 
Hélio Rodrigues, bênçãos mais que especiais que Deus colocou na minha vida, uma 
família que o Senhor me presenteou em um momento tão especial com um chamado 
para serví-lo em espírito e em verdade, como meu único Senhor e Salvador. 
A Pra. Cleana Vanderley, uma mulher de Deus, guerreira de oração sempre 
disposta a ajudar orando, intercedendo e guerreando pela nossavida. 
Aos pastores Sérgio Santos (Portugal), Roberto Pontes e Maria de Jesus pelo 
apoio, carinho e oração como intercessores pela minha vida. 
Aos meus irmãos guerreiros de oração e do Ministério de Louvor, instrumentos 
usados para louvar e exaltar o nome do Senhor: Sônia, Regina, Jerusa, Eduardo, 
Camila, Edna, Andréa, Fátima Lucena, Mirélia, John Victor, Conceição, Joel, Renan, 
Reinaldo, Daniel, Danielle, Levi, Suellen, Cileda, Jamille, Rejane, Rayssa, Anselmo, 
Norma, Cacilda, Glaydson, Renata, Mirian, Nágila e a todos que fazem parte do 
Exército do Senhor. 
A todos os meus familiares (tios, primos e avós) que contribuíram para o meu 
crescimento com apoio, força e incentivo para vencer todos os obstáculos. 
Á Família Paulino: Rosa, Jarbas, Nilzete, Isadora, Ana Rébem, Gabriel, Ana 
Luisa, Edna, Francisca, Darcy, Renata e Sofia, pessoas especiais que Deus colocou na 
minha vida. 
Ao meu grande amigo, Samuel Cavalcante, que Deus abençoe mais e mais a sua 
vida e que continue sempre disposto a ajudar ao próximo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Por isso não temas, porque eu sou contigo; não te assombres, porque eu sou o teu 
Deus. Eu te esforço e te ajudo, e te sustento com a destra da minha justiça. Eis que 
envergonhados e confundidos serão todos os que se irritaram contra ti; tornar-se-ão 
nada e os que contenderem contigo perecerão. Buscá-los-ás, mas não acharás, e os 
que pelejarem contigo tornar-se-ão nada, e como coisa que não é nada os que 
guerrearem contigo. Pois eu sou o Senhor teu Deus, te tomo pela tua mão direita e te 
digo: Não temas, que eu te ajudo.” 
 Isaías 41: 10-13 
Eu te agradeço Deus 
Por se lembrar de mim, e pelo teu favor 
E o que me faz crescer; 
Eu vivo pela fé, e não vacilo; 
Eu não paro, eu não desisto, 
Eu sou de Deus, eu sou de Cristo. 
Você mudou a minha história 
E fez o que ninguém podia imaginar 
Você acreditou e isso é tudo 
Só vivo pra você 
Não sou do mundo,não. 
A honra, a glória, a força 
O louvor a Deus 
E o levantar das minhas mãos 
É pra dizer que te pertenço, Deus. 
Eu te agradeço, Deus 
Que no deserto não me deixou morrer 
E nem desanimar 
E como aquela mãe, que não desiste 
você não se esqueceu, você insiste... 
 
 
 
 
Kleber Lucas 
 
SUMÁRIO 
 
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................16 
 1.1. LCC e seus constituintes........................................................................................17 
 1.1.1. Cardanol e suas Aplicações.................................................................................19 
 1.2. meso-Porfirinas.......................................................................................................21 
 1.3. Sensores..................................................................................................................22 
 1.4. Biossensores: Funcionamento e suas Aplicações...................................................23 
 1.5. Os pesticidas e suas aplicações...............................................................................25 
 1.5.1. Atuação ambiental no Brasil................................................................................26 
 1.5.2. Atuação dos pesticidas em Portugal.....................................................................28 
 1.5.3. Molinato...............................................................................................................29 
 1.5.4.Técnicas analíticas para a detecção de pesticidas.................................................33 
2. OBJETIVOS..............................................................................................................34 
 2.1. Objetivo geral.........................................................................................................34 
 2.2. Objetivos específicos ..............................................................................................34 
 3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.................................................................35 
3.1. Obtenção da meso-porfirina base livre.....................................................................35 
3.1.1. 1-(2-bromo-etoxi)-3-pentadecilbenzeno..............................................................35 
3.1.2. 4-[2-(3-pentadecilfenoxi)-etoxi]-benzaldeído.......................................................36 
3.1.3. 5, 10, 15, 20-tetra-[4-(2-(3-pentadecilfenoxi)-etoxi)-fenil]-porfirina...................37 
3.1.4. Cu(II)5,10,15,20-tetra-[4-(2-(3-pentadecilfenoxi)-etoxi)-fenil]-porfirina...........38 
3.1.5. Caracterização dos compostos..............................................................................39 
3.2. Modificação da Superfície do Eletrodo de Ouro.....................................................40 
3.3. Construção do Biossensor.......................................................................................42 
3.3.1. Metodologia Empregada na Construção do Biossensor.......................................43 
3.3.2. Ensaios Enzimáticos.............................................................................................44 
3.3.3. Preparação do Biossensor Baseado na GST..........................................................44 
3.3.4. Medidas Eletroquímicas.......................................................................................45 
3.3.5. Análise das Amostras de Águas Contaminadas de Arrozais................................46 
 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................48 
 4.1. Caracterização dos Precursores..............................................................................48 
 4.1.1. Cardanol (3-n-PDF)............................................................................................48 
 4.1.2. 1-(2-bromo-etoxi)-3-pentadecilbenzeno (Composto 1)......................................51 
 4.1.3. 4-[2-(3-pentadecil-fenoxi)-etoxi]-benzaldeido (Composto 2)............................52 
 4.1.4. Meso-porfirina base livre (H2Pp)........................................................................54 
 4.1.5. Cu
II 
– meso – porfirina (CuPp). ..........................................................................58 
 4.2. Modificação da Superfície do Eletrodo de Ouro pela Cu
II
-meso-porfirina 
e aplicação como sensor para NO..................................................................................61 
 4.3. Obtenção do biossensor.........................................................................................74 
 4.3.1. Avaliação da atividade da GST e Caracterização eletroquímica do 
GCE/APTES/GDA/GST...............................................................................................74 
 4.3.2. Quantificação de Molinato em amostra de água contaminada de arrozais......77 
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................................83 
 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................84 
 ANEXOS....................................................................................................................90 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
O presente trabalho ilustra o desenvolvimentode uma rota sintética para a 
obtenção de uma meso-metaloporfirina, a partir de uma meso-porfirina base livre, 
macromolécula derivada do Líquido da Casca da Castanha de Caju (LCC), subproduto 
do agronegócio do caju. A obtenção dessas espécies seguida de estudos preliminares da 
modificação da superfície do eletrodo de ouro com a meso-metaloporfirina de cobre 
com aplicação para sensor de NO (Óxido Nítrico) também compõe os objetivos desse 
trabalho. A partir do processo de metalação,foi sintetizada uma meso-metaloporfirina 
utilizando Cu (II) como centro metálico, a partir da macromolécula base livre, e testes 
voltamétricos foram realizados utilizando o eletrodo de ouro, em meio de diclorometano 
e PTBA 0,1 mol L
-1
, obtido a 100 mV s
-1
.Estudos foram realizados a cerca do 
comportamento eletroquímico dos filmes formados em presença de NO em meio aquoso 
de Na2SO4 0,5 mol L
-1
 obtendo o voltamograma cíclico para o eletrodo de ouro 
modificado com a porfirina de cobre(II) na detecção de NO e foi observado no 
voltamograma para NO sobre uma intensidade de corrente 7,6 vezes maior comparada à 
do pico observado para o mesmo processo do NO na superfície de ouro não modificado 
demonstrando elevado potencial para aplicação como sensor eletroquímico. Outra 
metodologia eletroanalítica foi desenvolvida para a obtenção de um biossensor, baseado 
em uma enzima, glutationa-S-transferase (GST), para determinação do pesticida 
molinato, um herbicida pré-emergente, em amostras reais de água de campos de arrozais 
da cidade do Porto, em Portugal. A construção deste biossensor baseou-se a 
imobilização de GST em um eletrodo de carbono vítreo (GCE), através da ligação 
covalente glutaraldeído-amino-silano (APTES/GA). O princípio deste biossensor 
consistiu no processo de inibição da GST promovida pelo molinato. A curva de 
calibração foi obtida por meio da técnica de voltametria de pulso diferencial (VPD) 
variando a concentração do pesticida entre 1,01x10
-6
 – 4,20x10
-5
 mol L
-1
 apresentando 
um limite de detecção (LD) de 0,064 mg L
-1
. O biossensor baseado na GST foi aplicado 
para quantificar o molinato nas amostras de água das lavouras de arrozais. Os resultados 
obtidos com este biossensor foram comparados com aqueles obtidos por HPLC e não 
houve diferenças estatisticamente significativas comprovando, então, que a metodologia 
desenvolvida foi precisa no nível de concentração estudada. 
Palavras-chave: LCC, Meso-metaloporfirina, Eletrodo de ouro, Sensor de NO, 
Biossensor, glutationa-S-transferase, molinato. 
ABSTRACT 
This study illustrates the development of synthetic route will be obtaining meso-
metalloporphyrin, from porphyrin meso-free base macromolecule derived from Shell 
Liquid Cashew Nut (CNSL), byproduct of cashew agribusiness. Obtaining these species 
followed by preliminary studies of surface modification of gold electrode with copper 
meso-metalloporphyrin with application to sensor of NO (Nitric Oxide) also composed 
the objectives of this work. From metalation process, was synthesized by meso-
metalloporphyrin using Cu (II) the a metal to center, from the macromolecule free base, 
and voltametric tests were carried out using the gold electrode in the middle of 
dichloromethane and TBAP 0,1 mol L
-1
, obtained at 100 mV s
-1
. Studies have been 
conducted about the electrochemical behavior of the films formed in the presence of NO 
in aqueous Na2SO4 0,5 mol L
-1
 the cyclic voltammogram obtained will be the gold 
electrode modified with porphyrin to copper (II) the detection of NO and 
voltammogram was observed in about one NO to current intensity 7,6 times larger 
compared to the peak observed for the same process of NO in unmodified gold surface 
showing high potential for application as an electrochemical sensor. Electroanalytical 
another methodology was developed will be obtaining the biosensor, based on an 
enzyme, glutathione-S-transferase (GST), will be determining the pesticide molinate, 
the real daily pre-emergent herbicide in samples of to water of paddy fields City Porto, 
in Portugal. The construction of this biosensor was based on the immobilization of GST 
in glassy carbon electrode (GCE) by covalent glutaraldehyde-amino-silane 
(APTES/GA). The principle of this biosensor consisted of the process promoted by 
inhibition of GST molinate. The calibration curve was obtained by the technique of 
differential pulse voltammetry (DPV) varying the concentration of the pesticide 
between 1,01 x10
-6
 to 4,20 x10
-5
 mol L
-1
 having a limit of detection (DL) of 
0,064 mg L-
1
. The biosensor based on GST was applied to quantify the molinate in 
water samples of paddy crop. The results obtained with this biosensor were compared 
with those obtained by HPLC and no statistically significant differences proving 
therefore that the developed methodology has been studied in terms of concentration. 
Keywords: CNSL, Meso-metalloporphyrin, gold electrode, sensor of NO, biosensor, 
glutathione-S-transferase, molinate. 
 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1: Corte longitudinal da amêndoa de castanha de caju e sua estrutura .............. 18 
Figura 2: Estruturas dos constituintes do LCC ............................................................ 19 
Figura 3: Cardanol Hidrogenado (ou 3-n-Pentadecilfenol)........................................... 20 
Figura 4: Estrutura base de uma porfirina do tipo meso ou 5,10,15,20: (A) Base livre; 
(B) Metalada. .................................................................................................................. 21 
Figura 5: Representação esquemática de um biossensor ............................................. 24 
Figura 6: Estrutura química do molinato. .................................................................... 29 
Figura 7: Transferência do molinato para o meio ambiente ......................................... 30 
Figura 8: Mecanismos da degradação do molinato nas plantas e solos ........................ 32 
Figura 9: Processo sintético para obtenção do derivado bromado (composto1) .......... 36 
Figura 10: Processo sintético para obtenção do derivado aldeídico (Composto 2)..... 37 
Figura 11: Processo sintético de obtenção da meso-porfirina (Composto 3 = H2Pp) .. 38 
Figura 12: Processo sintético para a obtenção da Cu
II
-meso-porfirina. ........................ 39 
Figura 13: Células eletroquímicas: (a) eletropolimerização e (b) análise dos 
interferentes (NO2
-
, dopamina e serotonina) .................................................................. 41 
 Figura 14: Potenciostato utilizado nas determinações voltamétricas..... ..................... 42 
Figura 15: Ilustração esquemática do conjunto de três eletrodos.................................. 43 
 Figura 16: Representação da preparação do biossensor usado nesse trabalho. ........... 45 
 Figura 17: Espectro CG-EM do 3-n-PDF. .................................................................. 48 
 Figura 18: Espectro de RMN – 
1
H para o 3-n-PDF. ................................................... 49 
Figura 19: Espectro de expansão 1 de RMN – 
1
H para o 3-n-PDF ............................... 50 
Figura 20: Espectro de expansão 2 de RMN – 
1
H para o 3-n-PDF . ............................. 50 
Figura 21: Espectros de CG-EM para o composto 1. .................................................. 51 
Figura 22: Espectro de RMN – 
1
H para o composto 1 ................................................. 52 
Figura 23: Espectro de CG-EM do Composto 2. ........................................................ 53 
Figura 24: Espectros de RMN – 
1
H para o composto 2 ................................................ 54 
 Figura 25: Espectro ESI-MS para a H2Pp. ................................................................... 55 
Figura 26. Espectros de RMN – 
1
H para a H2Pp.. ........................................................56 
Figura27: Espectros na região do UV-Visível para H2Pp em diclorometano. ............ 57 
 Figura 28: Espectro na região do UV-Vísivel da Cu
II
-meso-porfirina, 2,5x10
-6
molL
-1
 
em diclorometano (A) e (B) expansão do espectro. ....................................................... 59 
Figura 29: Espectro APCI-MS para a Cu
II
-meso-porfirina em diclorometano ............. 60 
Figura 30: Perfil voltamétrico da meso-porfirina base livre (0,05mg.mL
-1
) em 
diclorometano e PTBA 0,1mol L
-1 
obtidos a 100 mV.s
-1
. .............................................. 62 
 Figura 31: Perfil voltamétrico da CuPp (0,05mg.mL
-1
) em diclorometano e PTBA 
0,1mol L
-1 
obtidos a 100 mV.s
-1
. .................................................................................... 62 
 Figura 32: Perfis voltamétricos do eletrodo de ouro: ( ) não modificado e ( ) 
modificado na presença de uma solução de 2,85x10
-5
 mol L
-1
 NO em meio de Na2SO4 
0,5 mol L
-1
. ..................................................................................................................... 63 
Figura 33: Curvas analíticas para os eletrodos de Au e Au/CuPp obtidos em solução de 
0,2 mol L
-1
 Na2SO4 contendo NO no intervalo de concentração 
de 2,85 x 10
-6
 mol L
-1 
- 2,82 x 10
-5
 mol L
-1
 e usando com os seguintes parâmetros: f = 
100s
-1
, a = 50 mV e ΔEs = 2 mV, na Voltametria de Onda Quadrada (VOQ) ............... 64 
Figura 34: (A) Voltamogramas de onda quadrada para o NO em Na2SO4 em função da 
concentração de NO usando como sensor o eletrodo de ouro modificado com a CuPp. 
A expansão (B) ilustra a curva analítica média da intensidade de corrente de pico versus 
a concentração de NO. .................................................................................................... 67 
Figura 35: Voltamogramas de onda quadrada para o NO em Na2SO4 em função da 
concentração de NO em presença de (A) dopamina, (B) serotonina, (C) ambas as 
moléculas na concentração 1x 10
-4
 mol L
-1
 e (D) a curva analítica média. ................... 68 
Figura 36: Reações químicas do processo de desaminação de duas aminas naturais ... 70 
Figura 37: Voltamograma de onda quadrada para o NO na presença de NO2
-
, usando 
como sensor o eletrodo modificado com Cu
II
-meso-porfirina. (A concentração de NO de 
cada voltamograma está identificada pelos algarismos de I a X, ao lado da Figura). .... 72 
Figura 38: Curvas analíticas dos interferentes NO2
- 
+ NO e dopamina + serotonina + 
NO comparando-as com a curva do NO ......................................................................... 73 
Figura 39: Gráfico da absorvância em função do tempo a 340nm. Representa a reação 
entre diferentes volumes da enzima GST na presença do seu substrato [1,0x10
-3
 mol.L
-1 
CDNB, 1,0x10
-3
 mol.L
-1
 glutationa reduzida e 0,1 mol.L
-1
 PBS ( pH 6,0)] .................. 74 
Figura 40: Comportamento eletroquímico do eletrodo enzimático modificado em 
1x10
-3
 mol L
-1
 de GSH, 1x10
-3
 mol L
-1
 CDNB e 1x10
-3
 mol L
-1
 [Fe (CN) 6]
4- 
como 
mediador de elétrons ....................................................................................................... 76 
 Figura 41: Voltamogramas de pulso diferencial obtido com concentrações crescentes 
de molinato em 1x10
-3
 mol. L
-1 
GSH, 1x10
-3 
mol. L
-1
 CDNB e 1x10
-3 
mol. L
-1 
[Fe 
(CN)6]
4-
 como mediador de elétrons.. ............................................................................. 78 
Figura 42: . Relação entre a Intensidade de corrente de pico (Ip) e a concentração de 
molinato .......................................................................................................................... 79 
 Figura 43: Curva de calibração de percentagem de inibição (IR, %) da atividade da 
GST versus o logaritmo da concentração de molinato. .................................................. 80 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
Tabela 1: Classificação dos Pesticidas quanto ao organismo alvo ................................ 26 
Tabela 2: Comparação entre os VMP de alguns agrotóxicos regulamentados pela 
Portaria MS nº 518/2004 e a normatização internacional (OMS), em μg L
-1
 ................ 27 
Tabela 3: Vendas de produtos fitofarmacêuticos em 2010. .......................................... 29 
Tabela 4: Propriedades Físicas e Químicas do Molinato .............................................. 31 
Tabela 5: Condições experimentais para a realização dos ensaios voltamétricos no 
eletrodo de carbono vítreo. ............................................................................................. 46 
Tabela 6. Os valores de λ e log ε para a meso-porfirina base livre ............................... 57 
Tabela 7: Bandas de absorção B e Q para as macromoléculas obtidas ........................ 59 
Tabela 8: Valores de razões m/z para a meso-porfirina base livre e metalada com Cu 
(II) com suas respectivas abundâncias relativas ............................................................. 61 
Tabela 9: Parâmetros analíticos obtidos das curvas analíticas para a determinação de 
NO sobre os eletrodos de Au e Au / CuPp utilizando a VOQ ....................................... 65 
Tabela 10: Figuras de mérito para a determinação eletroanalítica de NO na presença de 
dopamina e serotonina em excesso ................................................................................. 70 
Tabela 11. Figuras de mérito para a determinação eletroanalítica de NO na presença de 
NO2
- 
em excesso ............................................................................................................. 72 
Tabela 12. Determinação de molinato em amostra de água de campos arrozais usando o 
biossensor e o método do HPLC- UV ............................................................................ 81 
Tabela 13. Comparação de diferentes métodos analíticos para a determinação do 
molinato .......................................................................................................................... 82 
 
 
17 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
A Química tem evoluído a níveis inquestionáveis em todas as suas áreas de 
atuação, colaborando principalmente para os avanços tecnológicos atuais, com diversos 
produtos fundamentais à sociedade. O aperfeiçoamento de processos mais inofensivos 
ao meio ambiente pode ser observado constantemente devido à grande preocupação que 
a sociedade e autoridades governamentais vêm demonstrando no assunto. 
Todavia, essa evolução também acarreta em preocupações. O aumento das 
atividades produtivas na área de Química é um exemplo, tornando-se um dos potenciais 
causadores da poluição,uma vez que manipula substâncias muitas vezes tóxicas e 
inflamáveis que, após processos químicos, frequentemente, geram um “lixo 
tóxico”(resíduo) que precisa ser tratado
.[1]
 
Neste sentido, a busca por produtos e processos menos impactantes ao meio 
ambiente tem se tornado o objeto de muitas pesquisas. 
[2]
 É dentro deste contexto que se 
insere a Química Verde, definida como a invenção, o desenvolvimento e a aplicação de 
produtos e processos químicos para redução e/ou eliminação do uso e/ou a geração de 
substâncias perigosas. 
[3]
 
No Brasil, essa temática ainda é incipiente, entretanto, a comunidade científica 
já começa a reconhecer a filosofia da Química Verde como uma estratégia importante 
no que se refere ao problema do meio ambiente, não só nas pesquisas, como também na 
inserção deste conceito nos cursos de graduação.
[3]
 Essa conscientização também vem 
crescendo no sentido da utilização de rejeitos e subprodutos obtidos dos mais diversos 
processos industriais. 
De acordo com as novas diretrizes que regem as legislações ambientais a 
utilização de novos produtos/processoscapazes de aproveitar ou minimizar os impactos 
provocados por esses materiais é vista como uma contribuição muito positiva sob todos 
os aspectos, econômico, social e ambiental. 
Assim sendo, o trabalho em questão objetivou a obtenção de uma 
macromolécula (Cu
II
-meso-porfirina), derivada do subproduto obtido da 
agroindustrialização das amêndoas de castanha de caju, denominado de Líquido da 
Casca da Castanha de Caju (LCC), através do seu componente majoritário (cardanol), 
18 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
matéria-prima regional, renovável e abundante, do semiárido nordestino. A referida 
molécula será sintetizada, caracterizada e aplicada como um sensor eletroquímico para 
detecção de óxido nítrico (NO). 
A partir dos fundamentos estabelecidos na vertente de Química Verde, o 
trabalho também contemplou o desenvolvimento de uma metodologia eletroanalítica, a 
construção de um biossensor eletroquímico enzimático (Glutationa-S-transferase – 
GST) e sua aplicação na determinação do pesticida Molinato em águas de arrozais da 
cidade do Porto, em Portugal. 
 
1.1. O LCC e seus Constituintes 
O fruto do cajueiro, popularmente conhecido como castanha de caju, é um 
aquênio de comprimento e largura variável, casca coriácea lisa, mesocarpo alveolado, 
repleto de um líquido escuro quase preto, cáustico e inflamável, chamado de Líquido da 
Casca da Castanha do Caju (LCC) ou Cashew Nut Shell Liquid (CNSL) como é 
conhecido internacionalmente. Na parte mais interna da castanha está localizada a 
amêndoa, constituída de dois cotilédones carnosos e oleosos, que compõem a parte 
comestível do fruto, revestida por uma película em tons avermelhados.
[5]
 A amêndoa 
representa cerca de 28-30% do peso do fruto enquanto a casca fica responsável pelo 
restante. Já o LCC constitui cerca de 30-35% da casca da castanha, o que significa 
aproximadamente 67% do peso bruto da mesma (Figura 1).
[4] 
Figura 1. Corte longitudinal da amêndoa de castanha de caju e sua estrutura.
[5]
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: CAMARA, C.R.S.; Dissertação de mestrado. UFC, 2010. 
19 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
O LCC é um subproduto da agroindústria do caju e uma importante fonte vegetal 
de compostos fenólicos, cujo anel aromático possui uma cadeia lateral na posição 3, 
com grau de insaturação variável, podendo ser extraído por vários métodos.
[6] 
O LCC é 
constituído por uma mistura de compostos fenólicos com cadeia alquílica de 15 átomos 
de carbono na posição meta do anel aromático, podendo ter de 0 a 3 insaturações, nas 
posições 8, 11 e 14 respectivamente (Figura 2). 
 
Figura 2. Estruturas dos constituintes do LCC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: O Autor 
 
1.1.1. Cardanol e suas Aplicações 
O LCC tem como seu principal constituinte o cardanol, uma mistura de 3-
alquilfenois produzidos pela reação de descarboxilação do ácido anacárdico a altas 
temperaturas, conseqüência do tratamento industrial durante a eclosão das Amêndoas de 
Castanha de Caju (ACC). O LCC quando destilado gera compostos com duplas ligações 
entre os átomos de carbono de cadeia lateral, localizada na posição meta do anel 
aromático.
[4]
 
A presença de insaturações na cadeia alifática do cardanol possibilita a obtenção 
de reações indesejáveis na funcionalização do produto acarretando uma redução no 
O H
C
15
H
(31 -2n)
O H
C
15
H
(31-2n)
O
O H
O H
C
15
H
(31 -2n)OH
O H
C
15
H
(31 -2n)
CH3
OH
Ácido Anacárdico Cardanol
Cardol 2- metilcardol
n = 0 
 
 
n = 1 
 
 
n = 2 
 
 
n = 3 
 
 n = número de ligações dupla. 
 
20 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
rendimento do processo. Como otimização do procedimento a utilização do cardanol 
hidrogenado, onde o produto é submetido ao processo de hidrogenação (onde o 
hidrogênio é introduzido ao meio reacional) utilizando um catalisador como, por 
exemplo, o óxido de paládio, cobre, níquel ou ainda a mistura destes (Figura 3) aumenta 
a eficiência do processo com uma maior superfície de contato para que as reações 
possam ocorrer evitando a formação de outros produtos, isto porque neste trabalho 
utiliza-se o cardanol para posteriores sínteses de obtenção de porfirina.
[7]
 
 
Figura 3. Cardanol Hidrogenado (ou 3-n-Pentadecilfenol). 
 
 
 
Fonte: O Autor 
 
O uso industrial do cardanol e seus derivados vêm sendo bastante divulgado.
[8,9]
 
Recentes pesquisas envolvendo sínteses de glocolipídeos vêm sendo explorada em um 
esforço combinando a Química Verde e Supramolecular, fazendo uso de recursos 
renováveis como material de partida para a obtenção de nanotubos orgânicos não 
covalentes, como potencial aplicação em nanofabricação, catálise, medicina, eletrônica 
molecular, armazenamento de hidrogênio e separação molecular.
[8-10] 
 
O cardanol também está sendo aplicado como material de partida em produtos e 
processos da Química Fina, particularmente nos países detentores dessa matéria-prima, 
como Índia e Brasil
[11]
, em aplicações como antioxidantes, tendo seu potencial 
comparável a produtos comerciais como o 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) e 2,6-di-
tert-butil-4-metoxifenol (DBHA).
[12] 
 
 
 
21 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
1.2. meso-Porfirinas 
A palavra porfirina tem origem do grego “porphura” que significa “da cor 
púrpura” (Figura 4A). Sua estrutura macrocíclica foi proposta pela primeira vez por 
Küster em 1912, mas só em 1929 Fischer teve sucesso na sua obtenção, a partir de 
pirrol.
[13,14]
 
Seus análogos metalados, as metaloporfirinas, são o resultado da troca de dois 
átomos de hidrogênio centrais do anel, por um cátion metálico (Figura 4B). Durante o 
processo de metalação ocorre uma mudança na simetria do anel porfirínico, diretamente 
proporcional ao tamanho do cátion, influenciando a conformação do anel e, 
conseqüentemente, a estabilidade da porfirina. Íons como o vanadilo (V
2+
) e férrico 
(Fe
3+
), por exemplo, que possuem raios de 60 e 65 pm respectivamente, são 
considerados os de tamanho ideal para a coordenação ao centro da porfirina, cujo raio é 
em torno de 62 pm.
[15]
 
 
Figura 4. Estrutura base de uma porfirina do tipo meso ou 5,10,15,20: (A) Base livre; 
(B) Metalada. 
 
 
 
 
 
 
Fonte: O Autor 
 
 
 
22 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
1.3. Sensores 
Nas últimas décadas, a obtenção de novos materiais tem despertado grande 
interesse e muito destaque devido à possibilidade de formação de interfaces para 
sensores analíticos. 
Como definição, sensor é um dispositivo que transforma a informação química 
como característica inerente á concentração molecular de um determinado composto em 
um sinal analiticamente utilizável. Sensores eletroquímicos possuem alta sensibilidade, 
resposta rápida e requerem pequenas quantidades de material para sua fabricação. 
[12] 
A aplicabilidade destes novos materiais vem crescendo a partir de estudos 
científicos visando novas descobertas, como na área de macromoléculas associada à 
utilização de porfirinas e metaloporfirinas, com ênfase em estudos eletroquímicos na 
determinação de moléculas biológicas.
[10]
 As porfirinas e metaloporfirinas formam 
filmes estáveis e bastante homogêneos sobre a superfície de vários substratos, como o 
óxido de estanho dopado com flúor (FTO), o óxido de estanho dopado com fluor e índio 
(ITO), carbono vítreo e outros. 
[16-19]
 
A eletrodeposição desses compostos sobre as superfícies metálicas como a de 
ouro (Au), platina (Pt) ou carbono vítreo (GCE) fazem com que suas propriedades 
sejam transferidas para a superfície do eletrodo tornando-ospassíveis de serem usado 
como sensores analíticos na detecção de moléculas biológicas, em especial o óxido 
nítrico (NO). 
O NO é uma molécula que possui a capacidade de ser benéfica ou 
potencialmente tóxica, dependendo da concentração empregada. Entretanto, monitorar a 
concentração de NO é difícil devido ao seu curto tempo de vida, baixas concentrações 
para detecção e alta reatividade com outros componentes biológicos, gerando 
rapidamente as formas nitrito ( 
2
NO ) e nitrato ( 
3
NO ).
[20] 
A vantagem no uso de sensores eletroquímicos na determinação da concentração 
de NO baseia-se na sua rapidez, simplicidade e sensibilidade. Assim, o uso de sensores 
pode permitir a análise de NO in vivo e em tempo real.
[20]
 Uma consideração importante 
deve ser levada em conta ao se construir um sensor eletroquímico para a determinação 
23 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
de NO: ele deve ser capaz de determinar NO na presença de íons interferentes como 

2
NO e neurotransmissores.
[21] 
 
1.4. Biossensores: Funcionamento e Aplicações 
O uso de enzimas para fins analíticos vem crescendo desde a década de 60, 
quando Clark e Lyons (1962) vislumbraram a idéia de usar uma enzima aliada a um 
eletrodo para determinação de glicose no controle de diabetes.
[22] 
Neste caso, um sensor 
foi desenvolvido baseado na oxidação de glicose em ácido glicônico, envolvendo 
consumo de oxigênio e formação de peróxido de hidrogênio, por ação da enzima glicose 
oxidase, de forma que o oxigênio ou peróxido consumido poderiam ser detectados. 
 Posteriormente, os dispositivos criados a partir da junção de uma enzima com 
um eletrodo receberam o nome de “Eletrodos Enzimáticos”. Contudo, com o 
desenvolvimento pela busca de novos sensores físico-químicos, em especial utilizando 
reações enzimáticas variadas, foi introduzido um termo mais genérico e abrangente, 
“Biossensor”.
[23]
 
A ciência dos biossensores é uma área multidisciplinar que justifica as várias 
formas de definição de um biossensor, mas de forma geral, trata-se de uma ferramenta 
analítica que combina biomoléculas imobilizadas com transdutores químicos ou físicos 
para criar uma superfície que permita a medição direta, possivelmente contínua, de um 
analito específico. 
Assim, um biossensor combina a especificidade de um componente biológico 
ativo para o analito de interesse com a sensibilidade de um transdutor para conversão do 
sinal biológico em elétrico, proporcional à concentração do analito.
[24] 
Um biossensor 
deve ser claramente diferenciado de um sistema bioanalitico, o qual requer etapas 
adicionais de processamento, como a adição de reagentes e o componente biológico não 
estar necessariamente ligado diretamente ao detector. 
Uma característica dos biossensores que os diferencia dos sensores químicos é a 
sua especificidade da análise. As divisões da química analítica e físico-química da 
IUPAC (União Internacional de Química Pura e Aplicada, em português) propuseram 
uma definição para biossensores: “um biossensor é um dispositivo que é capaz de 
24 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
fornecer informação analítica ”especifica”, quantitativa ou semi-quantitativa usando 
um elemento de reconhecimento biológico (receptor bioquímico) o qual está em contato 
espacial direto com um elemento de transdução”.
[25]
Então, de um modo geral, um 
biossensor é formado de duas partes: o componente biológico e o transdutor. O 
componente biológico faz o reconhecimento da substância de interesse por meio de uma 
reação química, gerando um sinal que pode resultar de uma variação na concentração de 
prótons, liberação de gases, emissão ou absorção de luz, emissão de calor, variação de 
massa, mudança de estado de oxidação, etc. O transdutor converte este sinal em uma 
resposta mensurável, como corrente, potencial, variação de temperatura etc. 
[24] 
 
O funcionamento de um biossensor, de uma forma geral, envolve a 
especificidade e alta sensibilidade do componente biológico com o substrato de 
interesse. Em seguida, como produto desta interação, variações de um ou mais 
parâmetros físico-químicos são convertidos em um sinal elétrico quantificável e 
processável pelo uso de um transdutor adequado (Figura 5).
[26]
 
 
Figura 5. Representação esquemática de um biossensor.
[26]
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: ARYA, S.K.; DATTA, M.; MALHOTRA, B.D.; Biosensors and Bioelectronics, 23 
(2008) 1083. 
Os biossensores enzimáticos, como o próprio nome indica, recorrem às enzimas. 
Estas atuam como catalisadores biólogicos e reagem com o analito ou com o substrato, 
produzindo um sinal detectável por este processo de bioreconhecimento. Um exemplo é 
o uso de enzimas que atuam especificamente para converter uma molécula reativa em 
25 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
um determinado produto. Algumas enzimas mostram uma sensibilidade específica para 
uma molécula em particular (substrato). 
Os sensores eletroquímicos podem ainda ser classificados como sendo 
voltamétricos 
[27-30]
, potenciométricos
[29-30]
, impedimétricos
[31]
 e biossensores 
eletroquímicos (baseados em enzimas).
[32-33]
 
As vantagens dos biossensores em relação às técnicas convencionais não se 
limitam à sensibilidade e seletividade, mas ao fato da rapidez nas análises e dos gastos 
mínimos de reagentes adequando-se aos princípios da Química Verde e, assim, 
proporcionando agilidade na obtenção dos resultados e redução no custo. 
Os biossensores são aplicados no meio ambiente, como no monitoramento de 
pesticidas onde geralmente empregam a acetilcolinesterase como enzima imobilizadora 
e monitoram a ocorrência de inibição da enzima por organofosforados e carbamatos, 
pois tais substâncias ligam-se ao centro ativo da enzima, impedindo a reação de 
hidrólise da acetilcolina em colina e acetato.
 [23]
 
 
1.5. Os pesticidas e suas aplicações 
A capacidade atual dos países desenvolvidos em produzir e colher grandes 
quantidades de alimentos em áreas relativamente pequenas, com participação reduzida 
de trabalho humano, tem sido possível graças ao uso de pesticidas, descritos como 
substâncias que podem matar diretamente um organismo indesejável ou controlá-lo de 
alguma maneira. Todos os pesticidas apresentam em comum a propriedade de bloquear 
processos metabólicos vitais nos organismos para os quais são tóxicos, podendo ser 
classificados quanto ao organismo alvo (Tabela 1).
[34] 
 
 
 
 
26 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
Tabela 1. Classificação dos Pesticidas quanto ao organismo alvo. 
[35]
 
Fonte: TOMLIN, C.D.S.; The Pesticide Manual, 11 ed. Surrey, UK, British Crop Protection 
Council, 1997. 
 
1.5.1. Atuação ambiental no Brasil 
No Brasil, a demanda por pesticidas vem se acentuando anualmente, destacando-
se como um dos maiores consumidores mundiais. Recentemente, o estado do Rio 
Grande do Sul (RS) foi responsável por 10,4% do consumo Nacional de pesticidas, 
devido à intensa atividade agrícola, com destaque ao molinato para o cultivo de arroz 
irrigado.
[36] 
A atual legislação brasileira de potabilidade de água, portaria do Ministério da 
Saúde (MS) nº 518/2004, regulamenta 54 substâncias químicas que representam riscos à 
saúde humana, dentre as quais 22 são agrotóxicos.
 
Na Tabela 2 estão relacionados os 
agrotóxicos regulamentados e os valores médios permitidos (VMP) correspondentes, 
estabelecidos pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como por exemplo, o 
molinato onde os VMP são de 6 μg L
-1
 (em destaque na Tabela 2). 
Tipos de pesticida Organismo alvo Tipos de pesticida Organismo alvo 
Acaricida Ácaros Larvicida 
 
Larvas de insetosAlgicida Algas 
 
Bactericida Bactérias 
Avicida Pássaros 
 
Nematicida Nematóide 
 
Herbicida Plantas Piscicida 
 
Peixes 
 
Fungicida Fungos 
 
Raticida Roedores 
Desinfetante Microorganismos Inseticida Insetos 
 
27 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
Tabela 2. Comparação entre os VMP de alguns agrotóxicos regulamentados 
pela Portaria MS nº 518/2004 e a normatização internacional (OMS), em μg L
-1
. 
[37]
 
 
 Fonte: BRASIL, Ministério da Saúde: Portaria MS nº 518, de 25 de março de 2004. 
Brasília: Ministério da Saúde, p.455, 2005. 
 
No Ceará, por busca por maiores produtividades, o uso de fertilizantes e 
agrotóxicos na agricultura tem se intensificado consideravelmente. Considerado o maior 
do Nordeste e quarto do Brasil, em 2011, por quantidade de estabelecimentos que usam 
agrotóxicos, o Ceará dobrou, em cinco anos, a venda de veneno e ampliou em 963,3% a 
venda de ingredientes ativos para os venenos. O dado faz parte de estudo coordenado 
pela Universidade Federal do Ceará (UFC), consta de pesquisa de doutorado na 
Universidade de São Paulo (USP) e foi extraído do Censo Agropecuário do Instituto 
Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE).
[38]
 
Diante desse quadro, a identificação e a avaliação de perigos ambientais e riscos 
à saúde se tornam importantes ferramentas para contribuir para o controle e a prevenção 
da exposição da população à esses resíduos tóxicos, com uma estatística preocupante 
onde mais de um bilhão de litros de venenos foram jogados nas lavouras em 2010, de 
 Parâmetro/ 
 Pesticidas 
Portaria MS nº 518 
( μg L
-1
) 
Guias OMS 
 ( μg L
-1
) 
Alacor 20 20 
Aldrin\ Dieldrin 0,03 0,03 
Atrazina 2 2 
Clordano (isômeros) 0,2 0,2 
DDT (isômeros) 2 1 
Glifosato 500 - 
Metalacloro 10 10 
Molinato 6 6 
Pendimetalina 20 20 
Pentaclorofenol 9 9 
Simazina 2 2 
Trifluralina 20 20 
28 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
acordo com dados do Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa Agrícola 
(SINDAG).
[39] 
O consumo de agrotóxicos cresce de forma correspondente ao avanço do 
modelo do agronegócio, que concentra a terra e utiliza grande quantidade de venenos 
para para garantir a produção em escala industrial.
[38,39]
 
 
1.5.2. Atuação dos pesticidas em Portugal 
De acordo com a Direção Geral da Proteção das Culturas (DGPC), o consumo 
de Pesticidas em Portugal no ano de 2010 foi de aproximadamente 14 000 
toneladas.
[40]
A Tabela 3 apresenta o volume de vendas de produtos fitofarmacêuticos 
relativamente ao ano de 2010. O grupo “Outros” inclui além de outros produtos 
fitofarmacêuticos, o óleo vegetal e dazomete (3,5-dimetil-1,3,5-tiadiazina-2-tiona).
[41]
 
Os riscos para o meio ambiente resultantes da aplicação de pesticidas são 
dependentes das suas propriedades físicas e químicas, dos processos de dissipação e 
degradação, e ainda, de outros fatores como grau de toxicidade, quantidade de pesticida 
aplicada, formulação utilizada, método e tempo de aplicação e a extensão do seu uso.
[42]
 
Atendendo à dimensão territorial, Portugal, relativamente a outros países é um 
dos grandes consumidores de pesticidas na Europa. Embora exista alguma controvérsia 
em torno destes dados, pela dificuldade em obter informações fidedignas e coerentes 
neste domínio, a análise comparativa do consumo de pesticidas em Portugal e nos 
outros países da União Europeia (UE), o coloca em lugar de destaque, comparando-se 
aos outros países da União.
[40-42]
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
29 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
Tabela 3. Vendas de produtos fitofarmacêuticos em 2010. 
[41] 
Função Quantitativo Vendido (Kg) 
Fungicidas 9 475 374 
Herbicidas 2 042 283 
Insecticidas e Acaricidas 370 935 
Moluscicidas 18 375 
Reguladores de Crescimento 7 987 
Rodenticidas 530 
Óleo Mineral 542 247 
Fumigantes de Solo 1 316 414 
Outros 21 104 
Total 13 795 249 
Fonte:Diagnóstico ambiental sobre os pesticidas. Disponível 
em: < http://www.drapc.minagricultura.pt/base/documentos/vendafitofarm2010.pdf>. Acesso 
em: 31 jan. 2013. 
 
 
1.5.3. Molinato 
O molinato, nome cientifico S-etilo-N,N-hexametileno-tiocarbanato, é um 
exemplo de herbicida seletivo sistêmico, pertencente à família dos tiocarbamatos, o qual 
é adsorvido pelas raízes dos infestantes inibindo o crescimento das pragas emergentes, 
através da sua rápida absorção radicular e transporte até às folhas.
[43]
 A fórmula química 
do molinato é C9H17NOS e a sua estrutura encontra-se representada a seguir (Figura 6). 
 Figura 6. Estrutura química do molinato. 
 
 
 
 
 
Fonte: O autor. 
http://www.drapc.minagricultura.pt/base/documentos/vendafitofarm2010.pdf
30 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
Não há indícios da propagação do molinato no Brasil como causador de poluição 
ambiental. Em Portugal, ele é um dos pesticidas mais estudados, isolado ou associado a 
outros pesticidas, em formulações líquidas ou granulares, nos vales dos rios Guadiana, 
Mondego, Tejo e Vouga. Após ser aplicado no campo de cultivo, o molinato é dissipado 
sob evaporação. Este fenômeno ocorre em grande escala devido aos extensos lençóis 
freáticos que cobrem os arrozais associado 
[44]
 Uma pequena fração do molinato é ainda 
adsorvida pelas plantas e o restante eliminado por fotodegradação (Figura 7). 
Figura 7. Transferência do molinato para o meio ambiente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: O Autor 
 
Na Tabela 4 encontram-se algumas das características do molinato quanto as suas 
propriedades físicas e químicas. 
 
 
 
 
 
Volatilização 
Fotodegradação 
Degradação 
Química 
Absorção 
Adsorção 
Colheita 
Escoamento 
Degradação 
Microbiana 
Lixiviação 
31 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
Tabela 4. Propriedades Físicas e Químicas do Molinato.
[45]
 
Propriedade Valor 
Pressão de Vapor (mPa) 746 (a 25ºC) 
Constante de Henry (atm mol
-1
 m
3
) 1,6x10
-5
 
Adsorção (Koc) 190 (25ºC) 
Bioacumulação (Kow) 2,88 
Massa Molecular (g mol
-1
) 187,32 
Massa Específica (g cm
-3
) 1,065 
Ponto de Ebulição (ºC) 202 
Solubilidade em Água (mg L
-1
) 800 (a 20ºC) 
Fonte: HOLDEN, L.R.; GRAHAM, J.A.; WHITMAN, R.W.; ALEXANDER, W.J.; 
PRATT,R.W.; et al. Environmental Science and Technology, 26 (1992) 935. 
 
Os mecanismos propostos
 [46-48]
 para a degradação do molinato no solo e nas 
plantas podem ser obtidos por três rotas (Figura 8) descritas a seguir. 
Rota 1: O átomo de enxofre é oxidado a sulfóxido de molinato e, 
posteriormente, a sulfona de molinato; o primeiro pode ser convertido em compostos 
conjugados e o segundo em hexametilenoimina (hexahidroazepina); 
Rota 2: Os carbonos C2 do anel são oxidados a derivados hidroxila (2-
hidroximolinato ou 4-hidroximolinato), posteriormente transformados em oxo derivados 
(2-oxo-molinato ou 4-oxo-molinato); 
Rota 3: A oxidação do carbono S-etila origina derivados hidroxila e carboxila, 
como o álcool (molinatol) e ácido de molinato (ácido molinatóico). 
 
 
 
 
 
 
 
 
32 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
Figura 8. Mecanismos da degradação do molinato nas plantas e solos.
[48]
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: Adaptado de CAMPBELL, A.; Regulatory Toxicology and Pharmacology, 53 (2009) 
200. 
 
Segundo vários autores, a última rota descrita (Rota 3) corresponde ao 
mecanismo preferencial da degradação do molinato. 
[40,46,48]
 Estudo recente mostraainda que a Glutationa–S–Transferase é a principal responsável pelas reações de 
destoxificação do sulfóxido de molinato (Figura 8).
[49]
 Tendo em vista que o molinato é 
um potencial contaminante das águas superficiais, aquíferos e solos, com a agravante de 
ser tóxico formando metabólitos por rotas químicas, físicas e biológicas com grau de 
toxicidade ainda maior
[44]
, várias metodologias têm sido desenvolvidas de modo a 
quantificar e detectar molinato ou seus metabolitos em amostras ambientais. 
Sulfonato de Molinato 
Hexahidroazepina 
Glutationa-S- Transferase 
Glutationa - Molinato 
Mercapturato de Molinato 
Sulfóxido de Molinato 
Rota 1 
Molinato Molinatol 
C2 
(2) – 4- oxo - Molinato 
Rota 2 
(2) – 4-OH - Molinato 
Rota 3 
Ácido 
Molinatóico 
33 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira INTRODUÇÃO 
 
1.5.4. Técnicas analíticas para a detecção de pesticidas 
Nos últimos anos, um grande número de publicações voltadas à análise de 
pesticidas e dos seus produtos de degradação vem sendo publicadas.
[40,46,48]
 Como 
conseqüência, se verifica um avanço considerável no desenvolvimento de metodologias 
capazes de dosar estes compostos nas mais diversas matrizes. 
Dentre as metodologias existentes, as técnicas cromatográficas (cromatografia 
gasosa-CG e a cromatografia líquida de alta eficiência- HPLC) apresentam bons limites 
de detecção e reprodutibilidade, porém apontam a desvantagem de serem dispendiosas e 
poluentes. 
[50-52] 
Por esta razão, têm surgido métodos alternativos para quantificação de 
pesticidas, baseados em técnicas voltamétricas que além de serem econômicas, rápidas e 
não poluentes podem ser realizadas in situ.
[53] 
34 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira OBJETIVOS 
 
2. OBJETIVOS 
 
2.1. Geral 
 
Desenvolver uma metodologia eletroanalítica para determinação de NO a partir 
da modificação de um eletrodo de ouro utilizando Cu
II
-meso- porfirina, visando sua 
potencialidade de aplicação como sensor na presença de moléculas biológicas que 
interagem com o NO. Outro objetivo deste trabalho é obter um biossensor eletroquímico 
enzimático (Glutationa-S-Transferase) capaz de determinar o pesticida molinato em 
amostras ambientais. 
 
 
 
2.2. Específicos 
 
 Desenvolver uma rota sintética para a obtenção de uma CuII-meso- porfirina, a 
partir da meso-porfirina base livre; 
 
 Modificar a superfície do eletrodo de ouro pela CuII-meso-porfirina para 
obtenção de um sensor capaz de determinar NO; 
 
 Verificar a influência de interferentes como NO2
-
, dopamina e serotonina na 
detecção de NO em meio de Na2SO4; 
 
 Desenvolver uma metodologia para a obtenção de um biossensor eletroquímico 
enzimático, baseado na Glutationa-S-Transferase (GST); 
 
 Investigar o potencial de aplicação do biossensor na quantificação de molinato 
em amostras de águas contaminadas de arrozais da cidade do Porto, em 
Portugal. 
35 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
O Cardanol hidrogenado foi obtido através de destilação sob pressão reduzida e, 
posteriormente, submetido a um processo de hidrogenação catalítica em presença de 
paládio como catalisador, obtendo-se o derivado 3-n-pentadecilfenol (3-n-PDF), 
material de partida para os procedimentos sintéticos, de acordo com mostra a rota 
sintética a seguir. 
 
 3.1. Obtenção da meso-porfirina base livre 
 
 3.1.1. 1-(2-bromo-etoxi)-3-pentadecilbenzeno
[54] 
Em um balão de fundo redondo adicionou-se 4,0 g de cardanol (13,16 mmol) 
em 15 mL de dibromoetano. A mistura foi mantida sob agitação constante e refluxo e, 
após completa dissolução, adicionou se 2,2 g de hidróxido de potássio a solução 
(39,21 mmol). A seguir, deixou-se a mistura reagir por cerca de 8 horas e a partir daí 
não mais se observou mudança significativa na intensidade da mancha característica do 
produto ou material de partida (cardanol hidrogenado). O produto foi submetido à 
extração por solvente através de 3 sucessivas lavagens de 100mL cada, em funil de 
separação, utilizando solução de HCl 5%. O composto foi seco com Na2SO4 anidro, 
filtrado e rotaevaporado para remoção total do solvente. O material obtido foi 
purificado em coluna cromatográfica (diâmetro de 40 mm) empregando acetato de etila 
e hexano como eluentes em proporções crescentes (3:7; 4:6; 6:4; 8:2), respectivamente. 
O produto foi eluído na primeira fração da coluna, um óleo amarelo, de massa molar 
366,5 g mol
-1 
com o rendimento de 70% (Figura 09). 
 
 
 
 
 
 
36 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
Figura 09. Processo sintético para obtenção do derivado bromado (composto 1). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: O Autor 
3.1.2 4-[2-(3-pentadecilfenoxi)-etoxi]-benzaldeído
[54] 
Em um balão de fundo redondo, sob agitação constante, adicionou-se 3,0 g 
(8,2 mmol) do composto (1); 1,33g (10,9 mmol) do 4-hidroxibenzaldeído em 15 mL de 
acetona. Após 40 minutos de reação adicionou-se lentamente 3,03 g (21,9 mmol) de 
carbonato de potássio e a reação foi realizada por cerca de 48 horas; a partir daí não 
mais se observou mudança significativa na intensidade da mancha característica do 
material de partida (composto 1) e o surgimento de uma nova mancha correspondendo 
ao composto (2). O produto reacional foi filtrado para remoção do precipitado 
formado, rotaevaporado e purificado em coluna cromatográfica (diâmetro 40mm), 
utilizando-se uma mistura éter etílico e éter de petróleo 3:7 como fase móvel. Obteve-
se um sólido branco, eluído na segunda fração da coluna. O composto apresentou uma 
massa molar de 452,67 g mol
-1
 e um rendimento de 50% (Figura 10). 
 
 
Composto 1 
C23H39BrO 
Massa molar: 411,46 gmol
-1
 
Rendimento: 70,0% 
Cardanol Hidrogenado (3-n-PDF) 
C21H36O 
Massa molar: 304,51gmol
-1
 
O H
C 15 H 31
Br
Br
KOH
70ºC
6h
O
H 31 C 15
Br
37 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
Figura 10. Processo sintético para obtenção do derivado aldeídico (Composto 2). 
 
 
Fonte: O Autor 
3.1.3 5, 10, 15, 20-tetra-[4-(2-(3-pentadecilfenoxi)-etoxi)-fenil]-porfirina.
[54] 
Em um balão de fundo redondo adicionou-se 1,0 g do composto 2 (2,22 
mmol) em 50 mL do solvente (0,8% de etanol e 99,2% de clorofórmio). Após 
dissolução adicionou-se o pirrol (2,22 mmol) e o NaCl (55,5 mmol), iniciando o fluxo 
de gás inerte na reação. Esperou-se 10 minutos para a seguir adicionar o trifluoreto de 
dietil - eterato de boro (0,73 mmol) e, em seguida DDQ (2,3,5,6-
tetraclorobenzoquinona) (1,66 mmol). Deixou-se a mistura reagir por cerca de 1 hora e, 
a partir daí, não mais se observou mudança significativa na intensidade da mancha 
característica do material de partida (composto 2). Para purificação, foi realizado um 
pré-tratamento utilizando uma mistura de N, N-Dimetilformamida (DMF) e etanol na 
proporção de 7:3. A mistura foi submetida á agitação constante por aproximadamente 
3 horas e fez-se uma filtração a vácuo obtendo um composto violeta no fundo do funil 
de placa sinterizada. Após este procedimento foi realizada uma separação em coluna 
cromatográfica (diâmetro de 40 mm) do material, utilizando-se uma mistura de 
diclorometano e hexano (1:1; 6:4; 7:3; 8:2; 9:1), respectivamente, ao longo da 
separação. O composto obtido apresentou massa molar 2000,92 g mol
-1
 com o 
rendimento de 26% (Figura 11). 
 
 
Composto 2 
C30H44O3 
Massa molar: 452,67 gmol
-1
 
Rendimento: 50,0% 
Composto 1 
 
O
H 31 C 15
Br CHO
OH
K 2CO 3
acetona
24h
refluxo
O
H 31 C 15
CHO
O
38 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
O O
H 31 C 15
N
NH
N
NH
O
O
H 31 C 15
OO
C 15 H 31
OO
C 15 H 31
N
H
O
H 31 C 15
CHO
O
I) BF 3 .OEt 2
CHCl 3
10 min
II) DDQ
60 min
CHCl 3
Figura 11. Processo sintético de obtenção da meso-porfirina (Composto 3 = H2Pp). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: O Autor 
 
3.1.4. Cu(II) 5, 10, 15, 20-tetra-[4-(2-(3-pentadecilfenoxi)-etoxi)-fenil]-porfirina.
[54]
 
Em um balão de fundo redondo adicionou-se 100 mg (0,05mmol) de H2Pp em 
50 mL de diclorometano e 910 mg (5mmol) de acetato de cobre em 50 mL de N, N-
dimetilformamida (DMF). A mistura permaneceu à temperatura de 70 ºC, sob agitação 
magnética constante e atmosfera de N2 por um período de três horas. O produto foi 
então concentrado por rotaevaporação, filtrado em funil de placa sinterizada para 
separação do excesso de sal de cobre em solução. O filtrado foi transferido para um 
funil de separação onde fez-se 3 sucessivas lavagens com 100 mL de água destilada 
para a remoção do acetato de cobre. A seguir, o composto foi rotaevaporado para 
redução do conteúdo reacional de solvente e submetido a purificação em coluna 
cromatográfica de sílica gel (fase estacionária), empregando como fase móvel uma 
mistura de diclorometano e hexano em diferentes proporções ao longo da separação 
(7:3 9:1). O composto foi obtido na primeira fração eluída da coluna, de cor 
avermelhada, massa molar 2064,4 g mol
-1
 e rendimento de 93% (Figura 12). 
Composto 2 
 
 Composto 3 = H2Pp 
C136H182N4O8 
Massa molar: 2000,92 gmol
-1
 
Rendimento: 26,0% 
39 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
Figura 12. Processo sintético para a obtenção da Cu
II
-meso-porfirina (Composto 4 = 
CuPp). 
 
 
 
 
Fonte: O Autor 
 
 3.1.5. Caracterização dos compostos 
Após as sínteses, os compostos foram purificados e caracterizados com as 
técnicas de Cromatografia Gasosa acoplada ao Espectrômetro de Massa (CG-EM), 
Espectrometria de absorção na região do UV-Visível (UV-Vis), Ressonância Magnética 
Nuclear de prótio (RMN-
1
H), Ionização por Electrospray acoplada ao Espectrômetro de 
Massa (ESI-MS) e Pressurização Atmosférica por Ionização Química (APCI-MS) desde 
o precursor das etapas sintéticas, 3-n-PDF (3-n-Pentadecilfenol) até as macromoléculas 
obtidas. 
 
 
 
Cu(CH 3 COO) 2
CH 2 Cl 2
O O
H 31 C 15
N
N
N
N
O
O
H 31 C 15
O
O
C 15 H 31
OO
C 15 H 31
Cu
O O
H 31 C 15
N
NH
N
NH
O
O
H 31 C 15
O
O
C 15 H 31
OO
C 15 H 31
H2Pp CuPp 
 
H2Pp Composto 4 = CuPp 
C136H180N4O8Cu 
Massa molar: 2064,4 g mol
-1
 
Rendimento: 93% 
40 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
3.2. Modificação da Superfície do Eletrodo de Ouro 
Foram estudados vários eletrólitos para a modificação da superfície do eletrodo 
de ouro (Au), com destaque para o Perclorato de Tetrabutilamônio (PTBA), um sal de 
amônio, que apresentou o melhor resultado para os estudos posteriores. 
A modificação da superfície do eletrodo de ouro pela Cu
II
-meso-porfirina foi 
realizada através da técnica de voltametria cíclica (VC). Os filmes foram formados em 
25 ciclos utilizando um intervalo de potencial de 0,00 a 1,45V, a uma velocidade de 
varredura de 100 mV s
-1
, na presença de um eletrólito de suporte de solução 0,1 mol L
-1 
PTBA (perclorato de tetrabutilamônio) contendo uma solução 0,05 mg mL
-1 
de 
porfirina. O eletrodo de referência foi o Ag/AgCl em CH2Cl2 + 0,1 mol L
-1
 PTBA e 
contra-eletrodo de Pt com 1 cm
2
 . Os perfis voltamétricos foram obtidos a partir de um 
potenciostato/galvanostato da AUTOLAB PGSTAT 30 interfaceado a um computador 
com o programa GPES 4.0. 
A solução de NO utilizada para a detecção pelo sensor foi preparada de acordo 
com procedimentos da literatura
[55,56]
, pelo gotejamento de H2SO4 de um funil de 
separação para um kitassato contendo NaNO2. O NO provém da reação entre H2SO4 e 
NaNO2, que fornece espécies NOx gasosas como produto. Esse gás passa por uma 
solução saturada de NaOH que permite que apenas o gás NO seja obtido e, finalmente, é 
lavado em água Milli-Q (Millipore, Inc.). O NO obtido é coletado em um recipiente 
selado contendo eletrólito suporte previamente desaerado por 30 minutos com argônio 
de alta pureza. A saturação da solução ocorre em 30 minutos. Essa solução saturada 
mantida sob atmosfera de NO apresenta uma concentração de 2,0x10
-3
 mol L
-1
, como 
recomendado pela literatura.
[57-59]
 
Para a preparação das soluções de NO diluídas, utilizou-se uma seringa 
Hamilton de 100 µL (Aldrich) para adicionar as alíquotas de 10 µL de solução estoque 
de NO á célula eletroquímica. O volume dessa célula foi de 7 mL, aferido com a adição 
de eletrólito suporte Na2SO4 0,2 mol L
-1
 previamente desoxigenado com N2 por 1 
minuto. 
A solução estoque de dopamina e de serotonina utilizadas para o estudo de 
interferentes na detecção eletroquímica de NO tinham concentração igual a 
41 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
1,0x10
-4
 mol L
-1
. Elas foram preparadas em eletrólito suporte Na2SO4 0,2 mol L
-1
 e 
foram mantidas sob refrigeração em torno de 5 ºC. 
A solução estoque de nitrito (NO2
- 
) 1,0x10
-2
 mol L
-1
, também utilizada no 
estudo de interferentes, foi preparada em eletrólito suporte Na2SO4 0,2 mol L
-1
. Desta 
solução foi retirada uma alíquota de 70 µL, que foi eluida em 6,30 mL de eletrólito 
suporte, obtendo, assim, a concentração final de 1,0x10
-4
 mol L
-1
. Essa solução também 
foi mantida sob refrigeração em torno de 5 ºC. 
A detecção de NO foi realizada utilizando o eletrólito contendo uma solução de 
Na2SO4 (0,5 mol L
-1
), com 6 replicatas. A aplicabilidade deste eletrodo modificado 
como sensor de NO foi avaliada pela técnica de voltametria de onda quadrada (VOQ) 
utilizando os seguintes parâmetros: freqüência de pulso de potencial (f) de 100 s
-1
, 
amplitude do pulso (a) de 50 mV e incremento de varredura (Es) de 2 mV. Utilizou-se 
o eletrodo de ouro como o de trabalho, eletrodo de referência Ag/AgCl saturado em KCl 
(3,0 mol L
-1
) e contra-eletrodo de Pt com 1cm
2
 em solução de Na2SO4 (0,2 mol L
-1
) 
como eletrólito (Figura 13). 
Figura 13. Células eletroquímicas: (a) eletropolimerização e (b) análise dos 
interferentes (NO2
-
, dopamina e serotonina). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: O Autor 
ELETROPOLIMERIZAÇÃO ÁNALISE DOS INTERFERENTES 
(a) (b) 
42 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
 
3.3. Construção do Biossensor 
A escolha da enzima foi realizada através de estudos exploratórios em trabalhos 
publicados na literatura a cerca dos biossensores aplicados ao meio ambiente.
[36,43,50]
A 
enzima escolhida foi a Glutationa-S-Transferase (GST) que desempenha um papel 
importante na resposta do estresse causado pelos herbicidas nas plantas. Ela é 
considerada uma enzima de desintoxicação por metabolizar grande variedade de 
compostos xenobióticos, por meio da conjugação destes com glutationa reduzida 
(GSH), formando substâncias de baixa toxicidade. 
[44] 
 
A determinação da atividade da enzima estudada (GST) foi verificada por meio 
do espectrofotômetro Shimadzu 160-A a 220nm com célula de quartzo e percurso 
óptico de 1,0 cm. A GST (ref. n º G6511, fígado equino) e os substratos 1-cloro-2,4-
dinitrobenzeno (CDNB) e glutationa-S-reduzida (GSH) (ref. nº G4251), molinato 
(pureza>99,6%), 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES), (ref. nº A3648), 
K4[Fe (CN)6] (hexacianoferrato de potássio) e glutaraldeído (GA) foram adquiridos da 
Sigma-Aldrich Company. Outros produtos químicos (Merck) pró-análise, foram 
utilizados sem purificação prévia. 
As soluções de enzima GST (0,5 mg mL
-1
) e do substratoGSH (0,1 mol L
-1
) 
foram preparadas diariamente e armazenadas a 4 ºC. O substrato CDNB (0,1 mol L
-1
) 
foi preparado em etanol absoluto e congelado. A solução de GA (grau I, 2 % de solução 
aquosa) foi preparada no momento da realização das análises. 
As determinações voltamétricas foram realizadas em um equipamento 
semelhante ao utilizado para a obtenção do sensor para NO (Figura 14). Os ensaios 
voltamétricos foram realizados em uma célula de vidro constituída por eletrodos 
(Metrohm) (Figura 15). 
Figura 14. Potenciostato utilizado nas determinações voltamétricas. 
 
 
 
 Fonte: O Autor. 
43 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
Conjunto de três 
eletrodos 
Eletrodo de trabalho 
Eletrodo de carbono 
vítreo de 3mm de 
diâmetro (GCE) 
Eletrodo de referência 
Ag/AgCl/KCl 
(3mol dm-3) 
 
Eletrodo auxiliar 
Platina (2mm de 
diâmetro) 
Figura 15. Ilustração esquemática do conjunto de três eletrodos. 
 
 
 
 
Fonte: O Autor 
As medidas foram utilizadas empregando 0,1 mol L
-1
 de fosfato de L-1 salino 
tamponado (PBS) (pH 7,0), à temperatura ambiente (25 ºC). Todas as soluções foram 
preparadas com água deionizada (18,0 MΩ cm) Tipo I, obtida a partir de um sistema de 
purificação de água Simplicity 185 (Millipore) . 
Todas as medidas eletroquímicas foram realizadas com a utilização de solventes 
menos tóxicos tornando-se uma das grandes vantagens em termos de sustentabilidade, 
comparada á técnica de HPLC. 
 
3.3.1. Metodologia Empregada na Construção do Biossensor 
O GCE foi limpo mecanicamente por meio de polimento com γ-Al2O3 (0,3 pm e 
0,05 uM) até a obtenção de uma superfície espelhada, e lavado com água. 
Posteriormente, o GCE foi imerso em uma solução piranha (H2O2: H2SO4, 1:3, v/v) 
durante 10 min. Para a ativação eletroquímica da superfície (criar os grupos funcionais - 
COOH e-OH sobre o eletrodo) o GCE foi varrido entre - 0,2 a 1,6 V em solução de 
H2SO4 0,5 mol L
-1
 a 50 mV s
-1
. 
A quantificação de molinato foi verificada pelo método comparativo em 
cromatógrafo em fase líquida de alta eficiência (Knauer), equipado com um detector de 
UV/VIS K-2501 (Knauer) operando a 220 nm e um LiChroCART
 
250-4 Lichrospher

 
44 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
100 RP-18 (5 m coluna) (Merck), protegido por uma coluna de guarda LiChroCART

 
4-4 (Merck). A fase móvel foi uma mistura de metanol:água (80:20 v/v) a um fluxo de 
0,8 mL min
-1
.
[60]
 
 
3.3.2. Ensaios Enzimáticos 
Considera-se que uma unidade da enzima GST é definida como a quantidade de 
material que irá conjugar 1,0 µmol de CDNB com GSH reduzida por minuto, a pH 6,5 e 
25 ° C.
 
A atividade de GST foi medida espectrofotometricamente de acordo com o 
procedimento descrito na literatura.
[49] 
Em uma cubeta de quartzo foram misturados, 
1500 µL de concentração 0,1 mol L
-1 
de uma solução de PBS (pH 6,5), 15 µL de 
solução de GSH (1 mmol L
-1
) e 15 uL de solução etanólica CDNB (1 mmol L
-1
). Em 
seguida, a reação foi iniciada pela adição de 20 µL de solução GST. A atividade de GST 
foi monitorada a 340 nm com um tempo de varredura de 10 s durante 3 min. 
 
3.3.3. Preparação do Biossensor empregado na GST 
Para realizar a modificação química da superfície do GCE, este foi 
primeiramente lavado com diclorometano (CH2Cl2) e seco sob uma corrente de gás 
nitrogênio (N2) . Em seguida, o GCE foi imerso em uma solução de APTES (10 % em 
CH2Cl2) durante 12h. O aminosilano-GCE foi enxaguado com diclorometano e o 
eletrodo modificado foi imerso em uma solução de GA (2 % solução aquosa) durante 30 
min. A seguir, o eletrodo quimicamente modificado foi lavado com PBS (pH 7,0) e 
imerso em PBS (pH 8,0) por 5 minutos (tempo estimado) para bloquear todo o GA que 
não reagiu. Finalmente, o material foi seco sob uma corrente de N2. 
Seguindo a preparação do GCE, a imobilização da enzima GST foi iniciada pela 
injeção de 40 µL de uma solução 0,5 mg mL
-1
 para GCE/APTES/GA durante 18 h. O 
GCE/APTES/GA/GST foi armazenado em solução PBS a 4ºC (temperatura ideal para 
manter o biossensor) (Figura 16). 
 
 
45 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
2% GDA 
Tratamento 
efetuado em 
30min 
Oxidação 
Eletroquímica 
Figura 16. Representação da preparação do biossensor usado nesse trabalho. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: O Autor 
 
3.3.4. Medidas Eletroquímicas 
Todas as medidas de Voltametria Cíclica (VC) e Voltametria de Pulso 
Diferencial (VPD) foram realizadas à temperatura ambiente em uma célula 
eletroquímica de vidro contendo 0,1 mol L
-1
 de PBS (pH 7,0). Os voltamogramas 
cíclicos foram registrados pela varredura do potencial entre - 0,2 a 0,6 V com uma 
velocidade de varredura de 50 mV s
-1
. Medições de VPD foram realizadas aplicando um 
intervalo de potencial estudado entre - 0,2 a 0,6 V e pulso de 10 s (Tabela 5). Todos os 
ensaios foram realizados usando [Fe(CN)6]
4-
 como indicador eletroativo. Após cada 
adição, as medições foram registradas a partir de VPD, em uma faixa de potencial 
de - 0,2 a 0,6 V. 
Associando as vantagens das técnicas eletroquímicas à necessidade de 
desenvolver um biossensor para a quantificação do molinato em água, a capacidade de 
oxidação e de redução do molinato foi aperfeiçoada usando a voltametria cíclica e a 
46 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
voltametria de pulso diferencial. O objetivo foi controlar o potencial ao longo do tempo 
e obter uma resposta proporcional à concentração na solução. 
 
Tabela 5. Condições experimentais para a realização dos ensaios voltamétricos no 
eletrodo de carbono vítreo. 
Fonte: O Autor 
 
3.3.5. Análise das Amostras de Águas Contaminadas de Arrozais 
Amostras de água contaminadas foram coletadas em uma lavoura de arroz 
irrigada, na fazenda experimental "Bico da Barca", de Direção Regional de Pescas 
Agrícolas eletrônicos do Centro (DRAP - Centro), localizado no vale do rio Mondego, 
Montemor-o-Velho, centro de Portugal. Este arroz de campo é utilizado em agricultura 
convencional e, no momento da recolha da amostra, continha resíduos de molinato, 
resultado da aplicação de seis anos consecutivos de aplicação do produto. As amostras 
foram recolhidas 5 horas após a aplicação do Ordram (formulação comercial do 
molinato) e armazenadas a – 20 °C até a análise.
 [61] 
 
Técnica 
 
Ensaios 
 
Faixa de 
Potencial/V 
 
 Eletrólito usado 
 
Velocidade 
varredura / V.s
-1
 
 
 
Voltametria 
Cíclica (VC) 
Limpeza 
eletroquímica/ 
Oxidação 
 
[- 2,0 a 1,6] 
 
H2SO4 0,5mol L
-1 
 
0,100 
Estudos 
Molinato 
[- 0,2 a 0,6] Tampão fosfato 
0,1 mol L
-1
 
 
0,050 
Voltametria 
de Pulso 
Diferencial 
(VPD) 
 
Estudos 
Molinato 
 
[- 0,2 a 0,6] 
Tampão fosfato 
0,1 mol L
-1
 com 
K4[Fe(CN)6] 0,1 mol L
-1
 
e GSH 0,1 mol L
-1
 
 
0,050 
47 
Túlio Ítalo da Silva Oliveira PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
Para a quantificação de molinato (HPLC-UV), alíquotas de 20 mL da amostra 
contaminada foram extraídas duas vezes com um volume de n-hexano usando cicloato 
(ciclohexiletiltiocarbamato de etila) 5 mg L
-1
 (Riedel-de Haen, Seelze, Alemanha) como 
padrão interno. Os extratos de hexano foram secos sob vácuo, dissolvidos em 1mL de 
metanol e analisadas por HPLC-UV.
[61,62]
 
A determinação eletroanalítica do molinato em água contaminada de arrozal por 
meio do biossensor com base na GST foi realizada utilizando o método de adição de 
padrão. Um volume de amostra de água do ambiente foi transferido para a célula 
eletroquímica que contém o eletrólito de suporte (0,1 mol L
-1
 de PBS pH 7,0), o 
substrato (1 mmol L
-1
 de GSH e 1 mmol L
-1
 de CDNB), o mediador de elétrons